Schwarz-Muche, Claudia: Molekulare Charakterisierung der -Thalassämie bei Probanden deutscher Herkunft



32

Kapitel 3. Ergebnisse

3.1. Screening auf häufige beta-Thalassämie-Mutationen der Endemiegebiete

3.1.1. Auswahlkriterien

Die Auswahl der Sonden erfolgte nach der Überlegung, den größten Teil der Allele mittels ASO charakterisieren zu können, um dadurch das Spektrum der Sequenzanalyse zur Identifikation seltener und neuer Mutationen einzugrenzen.

Mittels ASO läßt sich eine große Zahl von Proben mit relativ geringem technischen Aufwand analysieren. Im ersten Schritt wurden die Mutationen erfaßt, die bei in Deutschland lebenden homozygoten Patienten gefunden wurden [Vetter et al., 1997]. Zusätzlich wurde die Mutation -87 C rarr T in das Screening aufgenommen, die erstmalig bei einem homozygoten Deutsch-Italiener und seiner deutschen Mutter gefunden wurde [Kulozik et al., 1991 a].

Tab. 7 dokumentiert alle 11 ausgewählten Mutationen und berücksichtigt gleichzeitig deren geographische Verteilung sowie die Häufigkeit des Allels in der jeweiligen Region [Kulozik, 1991 c; Öner et al., 1990; Rosatelli et al., 1992; Baysal & Carver, 1995].

3.1.2. ASO und Restriktionsverdau

Insgesamt wurden 214 Proben untersucht. Bei allen ergaben hypochrome, mikrozytäre Erythrozytenindices verbunden mit einem erhöhten HbA2 die Diagnose einer heterozygoten beta-Thalassämie.

Der erste Schritt bestand darin, genügend Ausgangsmaterial für die Durchführung der ASO bereitzustellen. Entsprechend wurden von allen Proben jeweils 2 Amplifikate wie unter 2.2.2.2. beschrieben, hergestellt (s. Abb. 6). Das erste Amplifikat umfaßte eine Sequenz von 863 bp (Primer 1/2), die den Promotor, die 5´-UTR, das 1. und 2. Exon, das 1. Intron sowie 72 Nukleotide des 2. Introns einschloß. In diesem Bereich sind folgende Mutationen lokalisiert: -87 C rarr T, FS 6 -A, FS 8/9 +G, IVS1-1 G rarr A, IVS1-5 G rarr C, IVS1-5 G rarr T, IVS1-6 T rarr C, IVS1-110 G rarr A, NS 39 C rarr T und IVS2-1 G rarr A. Der Bereich des zweiten Amplifikates mit 623 bp (Primer 3/4) beeinhaltet dahingegen nur die Mutation IVS2-745 C rarr G. In Abb. 8 sind eben genannte Mutationen zur Übersicht in die beta-Globinsequenz eingezeichnet (die Introns sind durch kursive Schreibweise von den Exonen abgegrenzt).

Nach Bereitstellung der Amplifikate wurden je ein Wildtyp- und je ein Mutationsfilter pro Sonde angefertigt und wie unter 2.2.3. beschrieben bestückt, hybridisiert, gewaschen und detektiert. Eine Auswertung der Filter beinhaltete eine exakte Zuordnung der Proben-DNA zu einem Mutations- oder Wildtypsignal (s. Abb. 9 und 10). War eine eindeutige Zuordnung nicht möglich, wurde die Analyse wiederholt. Zum Nachweis der FS 6 -A wurde eine Restriktionsanalyse durchgeführt, wie unter 2.2.5. beschrieben (s. Abb. 7).


33

Tab. 7: ASO-Screening deutscher Heterozygoter auf häufige beta-Thalassämie-Mutationen der Endemiegebiete.

 



Mutationen

geographische Verteilung

Häufigkeit des Allels in %







NS 39 C rarr T

Mittelmeerländer



Sardinien

95 %


Spanien

64 %


Portugal

Italien

53 %

40 %


Sizilien

35 %


Bulgarien

22 %

IVS1-110 G rarr A

Mittelmeerländer



Zypern

70 %


ehem. Jugoslawien

45 %


Griechenland

42 %


Türkei

Italien

39 %

23 %


Libanon

62 %

IVS1-1 G rarr A

Mittelmeerländer



Portugal

32 %


Griechenland

13 %


Zypern

Italien

12 %

10 %

IVS1-5 G rarr T

Mittelmeerländer



Schwarzamerikaner


IVS1-5 G rarr C

Indien

22 %


China


IVS2-745 C rarr G

Mittelmeerländer



Bulgarien

Italien

10 %

5 %

- 87 C rarr T

Deutschland/Italien


IVS1-6 T rarr C

Mittelmeerländer



Sizilien

29 %


ehem. Jugoslawien

19 %


Türkei

18 %

IVS2-1 G rarr A

Mittelmeerländer



Türkei

12 %


Tunesien



Schwarzamerikaner


FS 8/9 +G

Indien

20 %


Mitelmeerländer



Türkei

6,6 %

FS 6 -A

Mittelmeerländer

Italien

1,2 %


Schwarzamerikaner






34

Abb. 6: Darstellung PCR-amplifizierter DNA auf einem Ethidiumbromid gefärbten 1,5 %igen Agarosegel.
Links: Amplifikate mit einer Länge von 863 bp (1-5), Negativkontrolle (K), Marker phiX 174 HAE III (M).
Rechts: Amplifikate mit einer Länge von 623 bp (1-3), Negativkontrolle (K), Marker phiX 174 HAE III (M).

Abb. 7: DdeI-Verdau PCR-amplifizierter DNA zum Nachweis der FS 6 -A-Mutation. Durch den Basenverlust (-A) im Kodon 6 ist die Erkennungssequenz CTNAG für das Restriktionsenzym DdeI nicht mehr vorhanden. Entsprechend entsteht ein längeres Fragment von 381 bp wie bei der Sichelzellmutation. Die Sichelzellmutation befindet sich ebenfalls im Kodon 6 des beta-Globingens, hat jedoch den Austausch des Adenins durch ein Thymin zur Folge.
A dokumentiert den relevanten Teil des beta-Globingens mit den als Winkelpfeile dargestellten PCR-Primern und den Restriktionsstellen des Enzyms DdeI (uarr). Gleichzeitig werden die Veränderungen des Restriktionsmusters durch die FS 6- A-Mutation (betaT, uarr) markiert.
B zeigt ein Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel mit DdeI verdauten PCR-Fragmenten. Die Spuren enthalten von links nach rechts: zwei heterozygote Probanden für dei FS 6 -A-Mutation (AT), die Kontroll-DNA eines Gesunden (AA), einen an Sichelzellanämie homozygot Erkrankten (SS), unverdaute DNA (U) und den Marker phiX 174 HAE III (M).


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Abb 8: DNA-Sequenz des humanen beta-Globingens einschließlich Lokalisation der 11 ausgewählten Mutationen für das ASO-Screening.


36

Auswertung der Filter

Die Wildtyp- und Mutationsfilter dienen als Kontrollen für die experimentellen Rahmenbedingungen. So muß die Wildtyp-Proben-DNA (Wt) auf dem Wildtypfilter ein positives Signal ergeben, da der Wildtypfilter mit dem Wildtyp-Oligonukleotid hybridisiert. Die Mutations-Proben-DNA (M) darf jedoch auf dem gleichen Filter kein Signal aufweisen. Im Gegensatz dazu muß die Mutations-Proben-DNA (M) auf dem Mutationsfilter ein positives Signal geben, da der Mutationsfilter mit dem Oligonukleotid hybridisiert, welches die jeweilige Mutation trägt. Die Wildtyp-Proben-DNA (Wt) darf entsprechend kein Signal hinterlassen. Eine korrekte Auswertung der Filter ist nur dann möglich, wenn diese Vorraussetzungen erfüllt sind (s. Abb. 9 A, B und Abb. 10).

DNA-Probe entspricht der Wildtypsequenz:


Wildtypfilter

- positives Signal


Mutationsfilter

- kein Signal nachweisbar

Trifft dieses Ergebnis auf eine zu untersuchende DNA-Probe zu, muß das Screening für die verbleibenden Mutationen fortgesetzt werden. Der Patient ist nicht Träger dieser Mutation. Gleichzeitig ist diese Konstellation typisch für eine Wildtyp-DNA, die als Positivkontrolle für den Wildtypfilter sowie als Negativkontrolle für den Mutationsfilter eingesetzt wird.

DNA-Probe ist homozygot für die zu untersuchende Mutation:


Wildtypfilter

- kein Signal nachweisbar


Mutationsfilter

- positives Signal

Ein Ergebnis dieser Art wurde für keinen deutschen Patienten gefunden und auch nicht erwartet, da hier klinisch und hämatologisch definierte heterozygote Probanden untersucht wurden. Eine DNA-Probe mit dieser Signalgebung wurde jedoch als Positivkontrolle für den Mutationsfilter und gleichzeitig als Negativkontrolle für den Wildtypfilter verwendet.

DNA-Probe ist heterozygot für zu untersuchende Mutation:


Wildtypfilter

- positives Signal


Mutationsfilter

- positives Signal

Beim Vorliegen dieser Konstellation ist die Mutation der entsprechenden DNA-Probe gefunden und damit die Untersuchung erfolgreich abgeschlossen. Der Patient trägt auf dem einen Allel die Mutation, das andere Allel hingegen ist gesund.


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Abb. 9: Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung zum Nachweis der Mutationen im beta-Globingen. PCR-amplifizierte beta-Globingen-Fragmente von deutschen Probanden mit einer heterozygoten beta-Thalassämie wurden als Dot-Blot auf einer Nylonmembran fixiert. Der Wildtypfilter hybridisiert mit dem Wildtyp-Oligonukleotid; der Mutationsfilter mit dem Oligonukleotid, welches die Mutation trägt. Bei "Wt" und "M" handelt es sich um Kontrollproben mit den jeweiligen Wildtypsequenzen oder Mutationen.
A: Proben 1, 2 und 6 hinterlassen jeweils ein Signal auf dem Wildtyp- und dem Mutationsfilter. Per definitionem erfüllen sie damit das Kriterium, heterozygot für die Nonsense-Mutation im Kodon 39 C rarr T zu sein.
B: Probe 1 hinterläßt jeweils ein Signal auf dem Wildtyp- und dem Mutationsfilter und ist somit heterozygot für den G rarr A-Basenaustausch an Position 110 des ersten Introns.


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Abb. 10: Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung zum Nachweis der IVS1-1 G rarr A-Mutation. PCR amplifizierte beta-Globingen-Fragmente von deutschen Probanden mit einer heterozygoten beta-Thalassämie wurden als Dot-Blot auf einer Nylonmembran fixiert. Der Wildtypfilter hybridisiert mit dem Wildtyp-Oligonukleotid; der Mutationsfilter mit dem Oligonukleotid, welches die Mutation trägt. Bei "Wt" und "M" handelt es sich um Kontrollproben mit den jeweiligen Wildtypsequenzen oder Mutationen.
Probe 6 hinterläßt jeweils ein Signal auf dem Wildtyp- und dem Mutationsfilter und ist heterozygot für den GrarrA-Basenaustausch an Position 1 des ersten Introns.

3.1.3. Häufigkeiten der Mutationen bei Probanden deutscher Herkunft

Mit Hilfe des ASO-Screenings als schnelle, gut reproduzierbare und mit hoher diagnostischer Sicherheit einhergehende Methode konnten 75,7 % der beta-Thalassämie-Gene bei autochthon Deutschen identifiziert werden. Einige Mutationen waren besonders häufig: NS 39 C rarr T; IVS1-110 G rarr A und IVS1-1 G rarr A (s. Abb. 9 A, B und Abb. 10). Wie aus Tab. 7 hervorgeht, handelt es sich dabei um Mutationen, die sehr stark in den Mittelmeerländern vertreten sind und in der deutschen Bevölkerung einen Anteil von ca. 62,6 % ausmachen. Einige Mutationen kommen in ähnlichen Häufigkeiten wie in Italien vor (NS 39, IVS1-110 G rarr A, IVS1-1 G rarr A; IVS2-745 C rarr G, FS 6 -A) wohingegen andere mediterrane Mutationen selten sind (IVS1-6 T rarr C, IVS2-1G rarr A) [Cao et al., 1989; Rosatelli et al., 1992] (s. Tab. 8).


39

Die Ergebnisse der Allel-spezifischen Oligonukleotid-Hybridisierung sind in Tab. 8 zusammengefaßt und dokumentieren im direkten Vergleich die Häufigkeiten dieser beta-Thalassämie-Mutationen in der einheimischen deutschen und in der italienischen Bevölkerung.

Tab. 8: Darstellung der ASO-Ergebnisse bei Probanden deutscher Abstammung im Vergleich zur Häufigkeit der beta-Thalassämie-Mutationen in der italienischen Bevölkerung. (1 [Rosatelli et al., 1992]; 2 ohne Angabe)

Mutation
Deutsche (n=214)
Italiener (n=914)1

n
%
%
NS 39 C rarr T
67
31,3
40,0
IVS1-110 G rarr A
51
23,8
23,0
IVS1-1 G rarr A
16
7,5
10,0
IVS1-5 G rarr C und G rarr T
10
4,7
< 0,5
IVS2-745 C rarr G
7
3,3
5,0
- 87 C rarr T
4
1,8
< 0,5
IVS1-6 T rarr C
3
1,4
9,9
IVS2-1 G rarr A
2
0,9
3,9
FS 8/9 +G
1
0,5
o. A.2
FS 6 -A
1
0,5
1,2
unbekannt
52
24,3
0,4


40

3.2. Identifikation seltener beta-Thalassämie Mutationen

3.2.1. Sequenzanalyse

Vorraussetzung für die Anwendung der Kettenabbruchmethode nach Sanger war die Amplifikation aller Proben mit biotinmarkierten Primern. Dafür wurden die Primer 1 und 3 biotinyliert und in Kombination mit Primer 2 bzw. 4 in die PCR-Reaktion eingesetzt (s. unter 2.2.2.2.). Nach erfolgreicher Amplifizierung konnten die Streptavidin-beschichteten Eisenkügelchen an das Biotin-Molekül angelagert und der sense-Strang der DNA-Doppelhelix über einen Magneten separiert und direkt in die Sequenzierreaktion entsprechend 2.2.4.3. eingesetzt werden. Die 7 Sequenzierprimer (s. Abb. 5) wurden so gewählt, daß die zu untersuchende Sequenz von 3´ nach 5´ im Abstand von 150-250 Nukleotiden so aufgearbeitet werden konnte, daß ohne Unterbrechung eine gute Lesbarkeit gewährleistet war.

3.2.2. Seltene Mutationen und ihre Häufigkeiten in der einheimischen deutschen Bevölkerung

Insgesamt wurden 52 DNA-Proben von deutschen Probanden mit einer heterozygoten beta-Thalassämie sequenziert. Mit Hilfe der Sequenzanalyse konnten 38 Proben 13 seltenen Mutationen zugeordnet werden. Tab. 9 zeigt dieses Ergebnis, wobei alle Mutationsarten und ihre Häufigkeiten in der deutschen Bevölkerung aufgelistet werden. Zusätzlich gibt sie Aufschluß über das Auftreten dieser Mutationen in den verschiedenen ethnischen Gruppen sowie deren Erstbeschreiber.

Durch die Übersicht werden zwei Mutationen akzentuiert: die Promotormutation an Position -87 C rarr G und die Frameshift-Mutation im Kodon 82/83 -G. Beide Mutationen ragen durch ihr deutlich häufigeres Auftreten in der einheimischen deutschen Bevölkerung heraus.

Die Basensubstitution an Position -87, verändert das CACCC-Promotorelement und wurde erstmals 1982 von Orkin et al. [b] publiziert. Dieses Promotorelement beeinflußt die Effizienz der Transkriptions, so daß dessen Modifikation den Phänotyp der beta++-Thalassämie bewirkt, ein Charakteristikum aller bekannten Promotormutationen (s. Abb. 11).

Die Frameshift-Mutation im Kodon 82/83 (s. Abb. 14) wurde erstmals in der aserbaidschanischen Bevölkerung nachgewiesen, die Region der ehemaligen Sowjetunion, in der die beta-Thalassämie hauptsächlich anzutreffen ist. Die Deletion resultiert in einem Stop-Kodon, welches 13 Nukleotide 3´ liegt und verursacht eine beta°-Thalassämie [Schwartz et al., 1989]. Später wurde diese Mutation auch in der tschechoslowakischen Bevölkerung gefunden; Indrak et al. identifizierten diese Mutation 1992 bei 7 Probanden, Mitglieder zweier unabhängiger Familien.

Ebenfalls bemerkenswert ist der Phänotyp der 2 Probanden mit der NS 121 G rarr T-Mutation, die bei Nord-West-Europäern mit dem Phänotyp einer dominanten beta-Thalassämie beschrieben wurde (s. Abb. 13) [Thein et al., 1990; Kazazian et al., 1992]. Die beiden hier beschriebenen Probanden zeigen typische hämatologische Befunde einer Thalassaemia minor (Hb 10,8 und 11,4 g/dl; MCH 21 und 22 pg; HbA2 4,9 und 6,0 %). Klinisch wurde bei einem dieser beiden Personen jedoch eine leichte Hepatosplenomegalie diagnostiziert.


41

Tab. 9: Mittels Sequenzanalyse identifizierte Mutationen.





Mutationstyp

ethnische Gruppe(n)

Publikation

Häufigkeiten bei autochthon Deutschen (n)

A. Transkription








- 87 C rarr G

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Orkin et al., 1982 [b]

7

B. RNA-Verarbeitung








IVS1-1 G rarr T

Inder, Chinesen

Kazazian et al., 1984

1

IVS1-2 T rarr C

Schwarzamerikaner

Gonzales-Redondo et al., 1989

4

IVS1-2 T rarr G

Tunesier

Chibani et al., 1988

1

IVS2-705 T rarr G

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Dobkin et al., 1983

1

C. RNA-Translation








Nonsense-Mutationen




NS 15 TGG rarr TAG

Inder

Kazazian et al., 1984

1

NS 121 G rarr T

Polen, Frankreich/Schweiz, Japaner,

Engländer

Kazazian et al., 1986

Fei et al., 1989

Yamamoto et al., 1992

Thein et al., 1990

2

Frameshift-Mutationen




FS 44 -C

Kurden

Kinniburgh et al., 1982

1

FS 51 -C

Ungarn

Ringelhann et al., 1993

1

FS 82/83 -G

Aserbaidschaner, Tschechen

Schwartz et al., 1989

Indrak et al., 1992

12

D. Initiations-Kodon








ATG rarr ACG

Jugoslawen

Jankovic et al., 1990

3

ATG rarr GTG

Japaner

Hattori et al., 1991

2

ATG rarr ATA

Italiener,

Schweden

Saba et al., 1992

Landin et al., 1995

2





Die nachfolgenden Abbildungen der Sequenzgele zeigen einen Vertreter pro betroffene Ebene der Genexpression der in Tab. 9 aufgeführten Mutationen.


42

Abbildung 11 präzisiert den Basenaustausch an Position -87 des beta-Globingens. Er steht als Prototyp einer Promotormutation, die unmittelbar das proximale CACCC-Promotorelement (nt 86-90 stromaufwärts des CAPs) betrifft [Orkin et al., 1982 b]. Eine Mutation in dieser Region bewirkt eine Verminderung der Transkriptionseffizienz auf 20-30 % des normalen beta-Globingens und resultiert beim Homozygoten in einer Thalassaemia intermedia [Orkin et al., 1984].

Abb. 11: Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA zur direkten Diagnose einer beta-Thalassämie. An Position -87 wird das Cytosin durch ein Guanin ersetzt. Der Basenaustausch betrifft das proximale CACCC -Promotorelement.
Die Sequenzierung zeigt hier sowohl das normale C als auch die Mutation (Pfeil), die sich nur auf einem Allel befindet. Das andere Allel ist gesund. Der Proband ist heterozygot für die Mutation an Position -87.

In Abbildung 12 wird der Basenaustausch an Position 705 des 2. Introns dokumentiert, der die Ebene der RNA-Verarbeitung betrifft. Der T zu G-Austausch kreiert eine Sequenz, die exakt einer 5´ Spleißstelle entspricht: GAGGTAAGA. Dobkin et al. zeigten 1983 anhand einer RNA-Analyse, daß diese Sequenzveränderung die Möglichkeit gibt, den Vorgang des Spleißens in zwei verschiedene Richtungen ablaufen zu lassen. Erstens kann die mutierte Position 705 als 5´ Spleißstelle in Kombination mit der normalen 3´ Spleißstelle genutzt werden. Zweitens ist auch die Verwendung eines kryptischen 3´ Spleißkonsensus an Position 580 in Kombination mit der normalen 5´ Spleißstelle möglich. Welcher Spleißmechanismus im Einzelfall bevorzugt wird, bestimmt die Konkurrenz zwischen der normalen 5´ und der neu entstandenen Spleißstelle an Position 705 des 2. Introns. Die


43

RNA-Analysen von Dobkin et al. [1983] konnten nachweisen, daß beide Spleißmechanismen auch gleichberechtigt nebeneinander genutzt werden. Diese Experimente zeigen, daß eine Mutation innerhalb des Introns zur Nutzung einer kryptischen Spleißstelle führen kann, obwohl sowohl der normale Spleißkonsensus als auch die kryptische Spleißstelle selbst nicht mutiert sind. Zum Erhalt einer Genfunktion ist demzufolge auch die Konservation von Intronsequenzen notwendig [Dobkin et al., 1983].

Abb. 12: Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA zur direkten Diagnose einer beta-Thalassämie. An Position 705 des zweiten Introns wird das Thymin durch ein Guanin ersetzt, wodurch eine neue 5` Spleißsequenz entsteht.
Die Sequenzierung zeigt hier sowohl das normale T als auch die Mutation (Pfeil), die sich nur auf einem Allel befindet. Das andere Allel ist gesund. Der Proband ist heterozygot für die IVS2-705 TrarrG-Mutation.

Abbildung 13 illustriert die Nonsense Mutation im Kodon 121. Dabei handelt es sich um eine dominant vererbbare Form der beta-Thalassämie, die gewöhnlich bei Nordeuropäern gefunden wird. Das Charakteristikum dieser Exon 3-Mutation besteht in der Existenz sogenannter Innenkörper, die man in peripheren Erythrozyten nachweisen kann. Nonsense-Mutationen, deren vorzeitige Termination Reste bis zu 72 Nukleotiden entstehen lassen (z. B. NS 15, NS 39, NS 71/72) führen normalerweise zum proteolytischen Abbau dieser verkürzten beta-Ketten. Anders verhält es sich bei der NS 121, bei der ein längerer Rest von 120 nt entsteht. Diese zwar ebenfalls verkürzten Produkte sind im Gegensatz zu den oben beschriebenen Nonsense-Mutationen in der Lage, Häm zu binden und entgehen dadurch höchstwahrscheinlich dem proteolytischen Abbau. Allerdings neigen sie zur Aggregation und bilden möglicherweise gemeinsam mit dem Überschuß an alpha-Ketten die charakteristischen Innenkörper [Weatherall et al., 1973; Thein et al., 1992].


44

Bei dieser Exon 3-Mutation handelt es sich um eine seltene Form der beta-Thalassämie, die in Anbetracht ihrer Schwere nicht dem positiven Selektionsdruck unterliegt, wie es für die rezessiven Formen typisch ist. Das erklärt auch die niedrigen Genfrequenzen in Populationen, in denen Malaria endemisch ist [Thein et al., 1990; Kazazian et al., 1989].

Abb. 13: Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA zur direkten Diagnose einer beta-Thalassämie. Durch den G zu T-Basenaustausch im Kodon 121 des beta-Globingens entsteht das Stopkodon TAA. Basensubstitutionen, die einen vorzeitigen Stop der Translation verursachen, bezeichnet man als Nonsense-Mutationen.
Die Sequenzierung zeigt hier sowohl das normale G als auch die Mutation (Pfeil), die sich nur auf einem Allel befindet. Das andere Allel ist nicht betroffen. Der Proband ist heterozygot für die Nonsense-Mutation im Kodon 121 (G rarr T).


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Die Frameshift-Mutation am Übergang von Kodon 82/83 betrifft die Ebene der RNA-Translation. Der Verlust eines Guanins verschiebt das Leseraster für die nachfolgenden Nukleotide, was zum Einbau falscher Aminosäuren und zum vorzeitigen Abbruch der Translation an einem neu entstandenen Stopkodon 13 Nukleotide stromabwärts führt. Die in Abb. 14 gezeigte Deletion wurde von Schwartz et al. [1989] in der aserbaidschanischen Bevölkerung und Indrak et al. [1992] in der tschechoslowakischen Bevölkerung nachgewiesen.

Abb. 14: Durch den Verlust eines Guanins am Übergang vom Kodon 82/83, entsteht eine Frameshift-Mutation. Hier ist das typische Nukleotidmuster eines heterozygot betroffenen Probanden festgehalten, dem nur auf einem Allel das Guanin fehlt. Dieser Umstand läßt die Nukleotidabfolge beider Allele gegeneinander verschieben, sodaß sich an manchen Positionen zwei Basen auf gleicher Höhe befinden.

Die Fotografie des Sequenzgels in Abbildung 15 zeigt den A zu G-Basenaustausch im Initiationskodon des beta-Globingens. Bei der Analyse der DNA-Proben deutscher Probanden wurden zusätzlich die T zu C- und G zu A-Substitution des gleichen Kodons registriert. Jede Mutation des Initiationskodons resultiert in eine beta°-Thalassämie, da sie die Initiation der Translation verhindert. Dadurch wird deutlich, daß es keine funktionelle Alternative für das Triplett ATG gibt. Würde das nächstgelegene ATG außerhalb des Leserahmens im Kodon 21/22 benutzt, entstände daraus ein Frameshift, dessen Terminationskodon 118 Nukleotide stromabwärts läge. Das mutmaßliche Peptid dieser Frameshift-Mutation wurde niemals gefunden.


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Bei Initiationskodon-Mutationen im alpha-Globingen sank der mRNA-Anteil um das Drei- bis Vierfache. Diese Auswirkung wird für gleichartige Mutationen im beta-Globingen erwartet [Hattori et al., 1991].

Abb. 15: Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA zur direkten Diagnose einer beta-Thalassämie. Der Ersatz eines Adenins durch ein Guanin verändert die normale Sequenz des Initiationskodons ATG. Die Initiation der Translation wird verhindert.
Die Sequenzierung zeigt hier sowohl das normale A als auch die Mutation (Pfeil), die sich nur auf einem Allel befindet. Das andere Allel ist nicht mutiert. Der Proband ist heterozygot für diese genetische Veränderung.


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3.3. Identifizierung einer seltenen und einer neuen Mutation

3.3.1. Restriktionsanalyse

Es wurde bereits unter 2.2.5. darauf hingewiesen, daß die Restriktionsanalyse hervorragend für das Screening der Sichelzellmutation geeignet ist. Die Sichelzellmutation zerstört die Restriktionsstelle des DdeI-Enzyms im Kodon 6 des normalen beta-Globingens. In Abbildung 16 A ist das beta-Globingen mit den Schnittstellen des Restriktionsenzyms DdeI (Pfeile) für das normale beta-Globingen (betaA) und für die Sichelzellmutation (betaS) schematisch dargestellt. Bei einem Probanden ohne Sichelzellmutation sind betaA-spezifische Fragmente mit einer Länge von 201, 180, 104, 89 und 88 Basenpaaren zu unterscheiden. Dahingegen läßt ein Träger der Mutation das Fragment mit einer Länge von 201 Basenpaaren vermissen, so daß zwangsläufig ein größeres Fragment mit 381 Basenpaaren entsteht. Dieses abnorm große Fragment und der gleichzeitige Nachweis von HbS durch die Hb-Elektropherese läßt die Identifikation eines Patienten mit Sichelzellanämie zu. Das typische Bild eines mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels zeigt Abbildung 16 B.

3.3.2. Darstellung eines ungewöhnlichen Restriktionsmusters nach DdeI-Verdau

Für die deutschen Probanden mit einer heterozygoten beta-Thalassämie ist ein Screening mittels DdeI-Restriktionsverdau ebenso sinnvoll, da dadurch die Frameshift-Mutation im Kodon 6 schnell entdeckt werden kann bzw. der mutierte Bereich des beta-Globingens auf wenige Basenpaare eingegrenzt wird. Dieser eingegrenzte Bereich entspricht exakt der Erkennungssequenz des DdeI -Restriktionsenzyms \|--\| CTNAG. Das Bild eines Ethidiumbromid gefärbten Agarosegels mit der Frameshift-Mutation im Kodon 6 unterscheidet sich allerdings nicht von der Darstellung des Restriktionsverdaus einer Sichelzellmutation (Vgl. Abb. 7 und 16). Daher gelingt der endgültige Nachweis der FS 6 -A erst mittels Sequenzanalyse.

Abweichendes von eben beschriebenen Restriktionsmustern für die Sichelzellmutation bzw. die FS 6 -A ist auf der Abbildung 16 B sichtbar. Neben den Spuren, die den Lauf von DNA-Proben homozygoter (SS) und heterozygoter (AS) Träger der Sichelzellmutation zeigen, beinhalten die Spuren 1-4 ein untypisches Restriktionsmuster. Den DNA-Proben dieser Spuren fehlt das Fragment mit der Länge von 381 bp, statt dessen tritt ein Fragment mit einer Länge von 289 bp in Erscheinung. Das Bild der Agarosegelelektrophorese ist wie folgt zu interpretieren: Das Restriktionsenzym erkennt die Schnittstelle am Übergang von Intron 1 zum Exon 2 nicht und läßt dadurch ein Bruchstück mit 289 bp Länge entstehen (s. Abb. 16 A: betaT,uarr = DdeI-Schnittstellen für beta-Thalassämie). Die Abbildung 17 veranschaulicht die Sequenz des beta-Globingens am Übergang von Intron 1 zu Exon 2, hebt die Schnittstelle für das DdeI-Enzym deutlich hervor und markiert dadurch den Bereich der mutierten Sequenz. Welche der 5 Basen jedoch betroffen war, legte erst die Sequenzanalyse offen.


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Abb. 16: Restriktionsanalyse PCR-amplifizierter DNA am Beispiel der Sichelzellmutation sowie zweier beta-Thalassämiemutation am Übergang von Intron 1 zu Exon 2.
A dokumentiert den relevanten Teil des beta-Globingens mit den als Winkelpfeile dargestellten PCR-Primern und Restriktionsstellen des Enzyms DdeI (uarr). Gleichzeitig werden die Veränderungen des Restriktionsmusters durch die Sichelzell-Krankheit (betaS,uarr) und der IVS1-130 G rarr C bzw. IVS1-129 G rarr A (betaT,uarr) markiert.
zeigt ein Ethidiumbromid gefärbtes Agarosegel mit DdeI-verdauten PCR-Fragmenten. Die Spuren beinhalten von links nach rechts: Marker phiX 174 HAE III (M), unverdautes PCR-Fragment (U), Kontroll-DNA eines Gesunden (AA), einen homozygoten (SS) und einen heterozygoten (AS) Träger einer Sichelzellmutation, einen heterozygoten Träger der IVS1-129 A rarr G (1), einen Homozygoten (2) und zwei Heterozygote (3, 4) für die IVS1-130 G rarr C-Mutation.

Abb. 17: Ausschnitt des beta-Globingens mit DdeI-Schnittstelle am Übergang von Intron 1 zu Exon 2 (Position IVS1-126-130).


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3.3.3. Nachweis der Mutationen mittels Sequenzanalyse

Die Sequenzanalyse demonstrierte im oben genannten Fall zwei verschiedene Mutationen. Erstere verursacht einen G rarr C-Basenaustausch an Position 130 des 1. Introns (s. Abb. 18), eine Mutation, die Öner et al. 1990 bei Türken und Yamamoto et al. 1992 bei Japanern identifizierten. Dabei handelt es sich um eine Mutation, die den kritischen Konsensus (AG) des Spleißakzeptors betrifft. Dessen Veränderung inhibiert vermutlich die RNA-Verarbeitung, da insbesondere diese Konsensussequenz für das effektive Spleißen der RNA eine essentielle Rolle spielt. So besteht die Möglichkeit, daß im Falle dieser Mutation eine kryptische Spleißstelle benutzt wird, die Intron 1, Exon 2 und Intron 2 herausschneidet und dadurch Exon 1 und Exon 3 unmittelbar miteinander verknüpft. Bei homozygot betroffenen Patienten resultiert dieser abnorme Spleißvorgang in einen beta°-Phänotyp [Yamamoto et al., 1992].

Abb. 18: Gegenüberstellung der G rarr C-Mutation an Position 130 und der A rarr G-Mutation an Position 129 des ersten Introns. Diese Mutationen beeinträchtigen über die Veränderung des AG-Spleißakzeptors die Effektivität des Spleißvorganges.
Beide Probanden tragen die dargestellten Sequenzänderungen im beta-Globingen auf einem Allel und sind somit heterozygot für die entsprechende beta-Thalassämie-Mutation.


50

Die zweite identifizierte Mutation verfälscht ebenfalls den Konsensus des Spleißakzeptors. Betroffen ist in diesem Fall die Position 129 des 1. Introns:

3.3.4. IVS1-129 A rarr G: Eine neue Mutation.

Eine Basensubstitution an dieser kritischen Position im beta-Globingen am Übergang vom ersten Intron zum zweiten Exon stellt weltweit ein Novum innerhalb der molekularbiologischen Aufarbeitung des beta-Globingens bezüglich der Erforschung der beta-Thalassämie dar. Vergleichbare Ergebnisse liegen von Antonarakis et al. [1984], Atweh et al. [1985] und Padanilam & Huisman [1986] vor, deren Veröffentlichungen Basensubstitutionen an Stelle 849 des beta-Globingens (IVS2-849) beschreiben, die ebenfalls den Spleißakzeptor mutieren lassen, jedoch am Übergang von Intron 2 zum Exon 3.

Abbildung 19 dokumentiert die neue Mutation an Position 129 des ersten Introns anhand der Fotografie eines Sequenzgels und erläutert ihre Lage im beta-Globingen durch eine graphische Darstellung.

Abb. 19: Sequenzierung PCR-amplifizierter DNA zur direkten Diagnose einer beta-Thalassämie. Der A zu G-Basenaustausch an Position 129 des ersten Introns betrifft den AG-Spleißakzeptor am Übergang von Intron 1 zu Exon 2.
Die Sequenzierung zeigt hier sowohl das normale A als auch die Mutation (Pfeil), die sich nur auf einem Allel befindet. Das andere Allel ist nicht mutiert. Der Proband ist heterozygot für diese genetische Veränderung.


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3.4. Zusammenfassung aller identifizierten Mutationen

Zur molekularen Charakterisierung der Probanden deutscher Herkunft wurden drei verschiedene molekularbiologische Methoden angewandt: die Allel-spezifische Oligonukleotid-Hybridisierung, die Sequenz- und die Restriktionsanalyse. Zusätzlich wurden die Ergebnisse einer Analyse durch die Anwendung einer zweiten unabhängigen Methode gesichert bzw. Wiederholungsuntersuchungen durchgeführt.

Insgesamt konnten 96,3 % (206/214) der Probanden genotypisch aufgearbeitet werden, wobei 75,7 % (162/214) der Ergebnisse auf dem Nachweis mittels ASO beruhen und 20,6 % (44/214) der Proben durch Sequenz- und Restriktionsanalyse charakterisiert wurden.

Bei den verbleibenden 8 Probanden (3,7 %) konnten auch nach Sequenzierung des beta-Globingens keine, die vorhandene beta-Thalassämie erklärenden Veränderungen gefunden werden. Darunter zählen auch zwei Probanden, die aufgrund unzureichender DNA-Menge nicht vollständig sequenziert werden konnten.

Nachfolgend sind die Ergebnisse tabellarisch zusammengefaßt, geordnet nach Mutationsarten, deren Auftreten in den verschiedenen ethnischen Gruppen sowie ihre Häufigkeiten in der deutschen Bevölkerung (n).

Tab. 10: Gesamtübersicht aller identifizierten Mutationen.







Mutationsart

Typ

ethnische Gruppe(n)

Publikation

n

(%)













A. Transkription


















- 87 C rarrG

beta+

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Orkin et al., 1982 [b]

7

3,3

- 87 C rarrT

beta+

Deutschland/Italien

Kulozik et al., 1991 [a]

4

1,8













B. RNA- Verarbeitung


















junction site






IVS1-1 G rarrA

beta°

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Orkin et al., 1982 [b]

16

7,5

IVS1-1 G rarrT

beta°

Inder

Kazazian et al., 1984

1

0,5



Chinesen




IVS1-2 T rarrC

beta°

Schwarzamerikaner

Gonzales-Redondo et al., 1989

4

1,8

IVS1-2 T rarrG

beta°

Tunesier

Chibani et al., 1988

1

0,5

IVS1-130 G rarrC

beta°

Türken

Öner et al., 1990

5

2,3



Japaner

Yamamoto et al., 1992



IVS1-129 A rarrG

?

Deutsche

Schwarz et al., 1997

1

0,5







IVS2-1 G rarrA

beta°

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Treismann et al., 1982

2

0,9



Tunesier

Chibani et al., 1988





Schwarzamerikaner

Wong et al., 1986




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Consensus site






IVS1-5 G rarrC

beta+

Inder

Treismann et al., 1983

3

1,4



Chinesen

Kazazian et al., 1984





Melanesen

Cheng et al., 1984



IVS1-5 G rarrT

beta+

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Atweh et al., 1987

7

3,3

IVS1-6 T rarrC

beta+

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Orkin et al., 1982 [b]

3

1,4







Intron-Substitutionen






IVS1-110 G rarrA

beta+

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Spritz et al., 1981; Westaway & Williamson, 1981

51

23,8

IVS2-705 T rarrG

beta+

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Dobkin et al., 1983

1

0,5

IVS2-745 C rarrG

beta+

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Orkin et al., 1982 [b]

7

3,3













C. RNA-Translation


















Nonsense-Mutationen

NS 39 C rarrT

beta°

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Trecartin et al., 1981

67

31,3

NS 15 G rarrA

beta°

Inder

Kazazian et al., 1984

1

0,5

NS 121 G rarrT

beta°

Polen

Kazazian et al., 1986

2

0,9



Frankreich/Schweiz

Fei et al., 1989





Japaner

Yamamoto et al., 1992





Engländer

Thein et al., 1990




Frameshift-Mutationen

FS 6 -A

beta°

Bevölkerung des Mittelmeerraumes

Kazazian et al., 1983

1

0,5



Schwarzamerikaner

Gonzales-Redondo et al., 1988



FS 8/9 +G

beta°

Inder

Kazazian et al., 1984

1

0,5

FS 44 -C

beta°

Kurden

Kinniburgh et al., 1982

1

0,5

FS 51 -C

beta°

Ungarn

Ringelhann et al., 1993

1

0,5

FS 82/83 -G

beta°

Aserbaidschaner

Schwartz et al., 1989

12

5,6



Tschechoslowaken

Indrak et al., 1992















D. Initiations-Kodon-Mutationen













ATG rarrACG

beta°

Jugoslawen

Jankovic et al., 1990

3

1,4

ATG rarrGTG

beta°

Japaner

Hattori et al., 1991

2

0,9

ATG rarrATA

beta°

Italiener

Saba et al., 1992

2

0,9



Schweden

Landin et al., 1995










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Thu Aug 12 12:53:43 1999