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Kapitel 4. Diskussion

4.1. Die -Thalassämie in der einheimischen deutschen Bevölkerung

Die -Thalassämie ist in der einheimischen Bevölkerung der Bundesrepublik Deutschland sowie in anderen Ländern Nord-West-Europas eine seltene Erkrankung. Bei der in dieser Arbeit molekular charakterisierten Gruppe von 214 Probanden deutscher Herkunft handelt es sich um ein einmalig großes Kollektiv einer nicht-endemischen Region. Es gelang die vollständige genotypische Aufarbeitung von 96,3 % der Probanden. Dabei entsprechen ca. 2/3 der identifizierten Mutationen bei autochthon Deutschen dem mediterranen Mutationsspektrum. Einige Mutationen kommen in ähnlichen Häufigkeiten wie in der italienischen Bevölkerung vor: NS 39, IVS1-110 G A, IVS1-1 G A, IVS2-745 C G und FS 6 -A (s. Tab 8). Andere mediterrane Mutationen sind in der einheimischen deutschen Bevölkerung seltener: IVS1-6 T C und IVS2-1 G A [Cao et al., 1989; Rosatelli et al., 1992]. Dieses Ergebnis deckt sich mit den Erkenntnissen von Laig et al. [1990], bei dessen Untersuchung alle charakterisierten 26 Gene (26/40) deutscher Heterozygoter typisch mediterrane Mutationen zeigten. Die Vermutung, daß die -Globingen-Mutationen in der deutschen Bevölkerung ihren Ursprung im Mittelmeerraum haben, wird anhand der vorliegenden zahlenmäßig großen Untersuchung bekräftigt. Historisch gesehen gibt es drei größere Zeiträume, die die Ansiedlung von Thalassämie-Genen in der deutschen Bevölkerung denkbar machen. Dazu gehören die römische Besatzung Nordeuropas, die Ansiedlung von italienischen Gastarbeitern um 1900 in Deutschland [Meyers, 1904] und die umfangreichen Populationsbewegungen der 60iger Jahre, die bis heute fortbestehen. Dabei wird jedoch die sogenannte "römische Hypothese" abgelehnt, da das Überleben eines Gens über 60-70 Generationen ohne Selektionsdruck unwahrscheinlich ist. Ebenfalls nicht ursächlich für das Vorhandensein von Thalassämie-Genen erscheinen die Populationsbewegungen der letzten 35 Jahre, da alle Probanden nach Befragung verwandtschaftliche Beziehungen zu Bevölkerungen der Endemiegebiete verneinten. Bei den untersuchten Probanden handelt es sich in erster Linie um ältere Erwachsene, denen direkte Vorfahren aus dem Mittelmeerraum sicher bekannt sein müßten. Diese Überlegungen machen deutlich, daß die italienischen Gastarbeiter, die um die Jahrhundertwende in Deutschland lebten, am ehesten als "Importeure der mediterranen -Thalassämie-Gene" [Laig et al., 1990) angesehen werden können.

Das übrige Mutationsspektrum setzt sich aus sehr seltenen und einer neuen Mutation zusammen. Einen besonderen Stellenwert erreicht die Frameshift-82/83-Mutation, die mit einem Anteil von 5,6 % in der einheimischen deutschen Bevölkerung gefunden wurde und vorher nur in 2 tschechoslowakischen Familien [Indrak et al., 1992] und in einer Familie aus Aserbaidschan [Schwartz et al., 1989] beschrieben wurde. Der autochthone Ursprung dieser Mutation erscheint aus diesem Grunde glaubhaft. Dies gilt höchstwahrscheinlich auch für alle die Mutationen, die nur bei kleinen Probandenzahlen oder gar Einzelpersonen gefunden wurden (s. Tab. 10).

Bei der hier neu vorgestellten Mutation handelt es sich nach aller Wahrscheinlichkeit nach um eine °-Mutation, die den AG-Spleißakzeptor am Übergang vom 1. Intron zum 2. Exon verändert. Da diese Basensubstitution

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Die restlichen 6 Fälle (nicht berücksichtigt werden die 2 Probanden, die nicht vollständig sequenziert werden konnten), bei denen keine -Globingen-Mutation nachgewiesen werden konnte, sind von beträchtlichem theoretischen Interesse. Diese Probanden könnten -Thalassämiedeterminanten tragen, die nicht mit dem -Globingen-Komplex gekoppelt sind. Familienuntersuchungen wären hilfreich, um diese Hypothese zu erhärten.

In dieser Arbeit erhobenen Daten unterstreichen die Notwendigkeit für den Kliniker, die -Thalassämie als eine Differentialdiagnose der mikrozytären, hypochromen Anämie in der einheimischen deutschen Bevölkerung zu berücksichtigen, auch dann, wenn eine Verwandtschaft mit der Bevölkerung des Mittelmeeraumes ausgeschlossen wird.

4.1.1. Vergleich zwischen dem Mutationsspektrum in der einheimischen deutschen Bevölkerung und anderen Populationen der Nicht-Endemie-gebiete

In der Literatur gibt es eine Reihe von Veröffentlichungen aus Nicht-Endemiegebieten, die anhand von Familienuntersuchungen das Auftreten der -Thalassämie in der entsprechenden Population beschreiben und diskutieren. Mit Hilfe dieser Daten ist ein Vergleich des Mutationsspektrums in unserer einheimischen Bevölkerung mit dem Mutationsspektrum der -Thalassämie in der Tschechoslowakei, Ungarn, England und Japan möglich.

Tschechoslowakei

Indrak et al. [1992] charakterisierten die -Thalassämie-Gene von 93 Mitgliedern aus 34 Familien tschechischer und slowakischer Herkunft. Alle Probanden waren heterozygote Träger der -Thalassämie mit einer milden Anämie und einem erhöhten HbA₂. Mittels ASO wurde auf das Vorhandensein von 30 häufigen Mutationen des Mittelmeerraumes, des Fernen Ostens, Indiens und Afrikas untersucht. Acht verschiedene Mutationen konnten bei 33 Familien identifiziert werden, bei einer Familie blieb die Mutation unbekannt. Über die Hälfte der untersuchten Fälle (18/34 Familien) zeigten die Mutation IVS1-1 G A, die typischerweise in den östlichen Mittelmeerländern zu finden ist [Huisman, 1990]. Die restlichen Probanden wiesen mit abnehmender Häufigkeit folgende Mutationen auf: IVS2-1 G A (4/34), NS 121 G T (3/34), IVS1-110 G A (2/34), IVS2-745 C G (2/34), FS 82/83 -G (2/34). Überraschend war das relativ häufige Auftreten der Nonsense-Mutation im Kodon 121, eine Mutation, die mit dem Phänotyp einer dominanten -Thalassämie assoziert ist und in erster Linie bei Nordeuropäern angetroffen wird. Die Blutanalyse der betreffenden Probanden ergab zwar das Bild einer Poikilozytose, Anisozytose und Mikrozytose, jedoch konnten die Innenkörper, die als Charakteristikum für heterozygote Träger dieser Mutation gelten [Stamatoyannopoulos et al., 1974; Fei et al., 1989; Thein et al., 1990], nicht nachgewiesen werden. Erstaunlich ist ebenfalls das Vorkommen der FS 82/83 -G in 2 Familien. Eine Beziehung der beiden Familien zu Aserbaidschanern, bei denen diese Mutation ursprünglich beschrieben worden war [Schwartz et al., 1989], konnte nicht hergestellt werden.

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Das Auftreten der NS 121 G T überrascht durch seine Häufigkeit, da es weltweit nur vereinzelte Fälle dieser dominanten Form der -Thalassämie gibt. Beschrieben wurde diese Mutation bei einem Mädchen griechisch-polnischer Abstammung [Kazazian et al, 1986], in einer schweizerischen Familie [Fei et al., 1989], in 3 britischen Familien [Thein et al., 1990] und in 2 japanischen Familien [Yamamoto et al., 1992]. Diese wenigen Fälle werden jetzt durch die 2 tschechoslowakischen Familien [Indrak et al., 1992] und durch eine deutsche Familie [Schwarz et al., 1997] ergänzt. Nicht überraschend ist jedoch das regionale Auftreten dieser Mutation, da sie abgesehen von der japanischen Publikation vorzugsweise in Nord-West-Europa anzutreffen ist.

Die Koexistenz der FS 82/83 -G in der tschechoslowakischen und der deutschen Bevölkerung wird durch die enge Nachbarschaft beider Populationen plausibel. Eine Verbindung der tschechoslowakischen und deutschen Probanden zu Aserbaidschanern ist nicht bekannt und eher unwahrscheinlich.

Ungarn

Ringelhann et al. [1993] identifizierten 7 verschiedene -Thalassämiemutationen bei 32 Mitgliedern aus 17 Familien. Alle Untersuchten waren heterozygot für eine -Thalassämie, mit Ausnahme zweier Waisenkinder, deren molekulare Charakterisierung eine Homozygotie für die IVS1-6 T C Mutation ergab. Alle Familien waren ungarischer Abstammung und ihre Vorfahren lebten seit mindestens einem oder mehreren Jahrhunderten in diesem Land.

Jeweils 5 Familien zeigten die IVS1-1 G A und NS 39 Mutation, gefolgt von 2 Familien mit der IVS2-1 G A Mutation und 1 Familie mit der IVS2-745 C G Mutation. Es handelt sich dabei um häufige Mutationen des Mittelmeerraumes, die in Ungarn 2/3 aller identifizierten -Thalassämie-Gene ausmachen. Die Häufigkeit im Auftreten der mediterranen Mutationen entsprechen den Ergebnissen in der tschechoslowakischen und der hier vorliegenden Studie.

Die IVS1-1 G A-Mutation war die am häufigsten erfaßte Mutation in der tschechoslowakischen und der ungarischen Population. Migration innerhalb der Österreichisch-Ungarischen Monarchie sowie die Einwanderung von Völkerstämmen aus dem Osten und Süden könnten für die Verbreitung der Thalassämie-Gene in Ungarn verantwortlich sein.

Darüber hinaus beschrieben Ringelhann et al. [1993] eine neue Frameshift-Mutation im Kodon 51, die durch den Verlust eines Cytidins entsteht. Diese Mutation wurde in einem Probanden nachgewiesen, leider war eine Familienuntersuchug nicht möglich. Auch in der vorliegenden Studie konnte dieser Frameshift an einem Probanden gezeigt werden, verwandtschaftliche Beziehungen des Probanden nach Ungarn sind nicht bekannt.

Anhand der erörterten Publikationen konnte eindeutig nachgewiesen werden, daß 2/3 der -Thalassämie-Gene durch Migration aus den Mittelmeerländern nach Mittel-bzw. Osteuropa gelangten. Gleichzeitig muß der engen regionalen Nachbarschaft der Bundesrepublik Deutschland, der Tschechoslowakei und Ungarn Rechnung

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England

22 Angelsachsen der einheimischen britischen Bevölkerung mit der Diagnose einer -Thalassämie sind im Zeitraum von 1984-1991 molekular aufgearbeitet worden [Hall et al., 1992]. Die Hälfte der Fälle war klinisch asymptomatisch und zeigte hämatologische Kriterien im Sinne einer heterozyoten -Thalassämie. Nach molekularer Analyse konnten in 8 Fällen typisch mediterrane Mutationen (NS 39, IVS1-1 G A, IVS1-6 T C, IVS1-110 G A) nachgewiesen werden. Die molekulare Charakterisierung von 3 Thalassämie-Genen gelang nicht.

Die verbleibenden 11 Probanden zeigten klinisch eine Thalassaemia intermedia. Nach molekularer Charakterisierung wurden folgenden /-Genotypen identifiziert (Tab. 11):

Tab. 11: Genotypenkonstellation der Thalassaemia intermedia in der einheimischen britischen Bevölkerung, modifiziert nach Hall et al., 1992

-Genotyp	-Genotyp	n
+IVS1-6 T C/°NS 39	/	1
°IVS1-1 G A/A	/	1
°NS 39/A	/	1
°FS 41/42 -CTTT/A	/	1
°121 G T/A	/	1
°121 G T/A	/	2
°cd 28 Leu-Arg/A	/	1
°127 C T/A	/	1
°FS 5 -CT/A	/	2

Die Genotypenkonstellation erklärt in 9 Fällen die klinische Diagnose einer Thalassaemia intermedia: ein Proband ist gemischt heterozygot für eine milde (IVS1-6 T C) und eine schwere (NS 39) Form der -Thalassämie, drei Probanden weisen neben einer rezessiven Form der -Thalassämie triplizierte -Gene auf und fünf Probanden sind an einer dominant vererbten Form der -Thalassämie erkrankt [Thein et al., 1992]. Der schwere klinische Phänotyp der zwei Probanden mit der FS 5 -CT konnte jedoch nicht erklärt werden, da normalerweise Heterozygote mit dieser Mutation asymptomatisch sind [Kollia et al., 1989].

Hall et al. [1992] erklären das Auftreten der häufigen mediterranen und der asiatischen Mutation (FS 41/41 -CTT) durch die Einwanderung von Ausländern nach Großbritannien. Dagegen diskutieren sie die Mutation im Kodon 28 als de novo bzw. die NS 121 G T und NS 127 C T als unabhängig entstandene Mutationen.

Exon 3-Mutationen unterliegen in Anbetracht ihres schwereren klinischen Phänotyps im Sinne einer Thalassaemia intermedia keinem positiven Selektionsdruck gegenüber Malaria und sind deshalb kaum in den Endemiegebieten anzutreffen. Weit häufiger sind diese seltenen Allele in Familien ethnischer Gruppen anzutreffen, in denen Malaria nicht endemisch ist [Kazazian et al., 1992]. Bei Kenntnis dieser Hintergründe überrascht das Auftreten der NS 121 G T in der britischen [Hall et al., 1992], tschechoslowakischen [Indrak

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Japan

Die Prävalenz der -Thalassämie liegt in Japan bei 0,1 % [Wakamatsu et al., 1994]. Molekulare Analysen von Japanern mit einer heterozygoten -Thalassämie ergaben folgendes Mutationsspektrum:

(a)	-31 A G	(i)	IVS2-654 C T
(b)	FS 54 +G	(j)	IVS2-1 G A
(c)	cd 90 G T	(k)	NS 121 G T
(d)	cd 110 T C	(l)	NS 15 TGG TAG
(e)	FS 123 -A	(m)	Initiationskodon ATG GTG
(f)	cd 127/128 -AGG	(n)	cd 26 GAG AAG
(g)	IVS2-848 C G	(o)	IVS1-130 G C
(h)	FS 41/42 -TTCT	(p)	cd 24 GGT GGA

Die Mutationen (a)-(g) sind bisher nur in der japanischen Population beschrieben worden und daher mit höchster Wahrscheinlichkeit autochthonen Ursprungs. Die folgenden Mutationen (h)-(i) werden typischerweise in der chinesischen Population gefunden. Ihr häufiges Vorkommen in Japan erklärt sich historisch aus dem früheren Einfluß Chinas auf Japan. Unterstützt wird diese Annahme durch eine Haplotypenanalyse, die ein kongruentes Haplotypenmuster bei Chinesen und Japanern für die FS 41/42-Mutation zeigt.

Die IVS2-1 G A wird sowohl in der mediterranen Bevölkerung als auch bei Schwarzamerikanern beschrieben. Eine Haplotypenanalyse bei Japanern mit dieser Mutation ergab ein differentes Bild zu den Haplotypen bei Erkrankten des Mittelmeerraumes und erkrankten Schwarzamerikanern. Dieses Ergebnis könnte ein Hinweis darauf sein, daß diese Mutation multiplen Ursprungs ist.

Ähnliches gilt für die Nonsense-Mutation im Kodon 15, die ein häufiges Auftreten bei Indern zeigt und deren Haplotypenmuster sich ebenfalls in beiden Populationen deutlich voneinander unterscheiden [Wakamatsu et al., 1994].

Hattori et al. publizierten 1991 eine neue -Thalassämie-Mutation im Initiationskodon (ATG GTG), die sie in zwei japanischen Familien identifizieren konnten. Diese Mutation konnte ebenfalls bei zwei Deutschen innerhalb der vorliegenden Studie nachgewiesen werden. Einen Vergleich der Haplotypen gibt es nicht, so daß eine genaue Aussage zum Ursprung dieser sehr seltenen Mutation nicht getroffen werden kann.

Ein Vergleich der -Thalassämie-Chromosomen für die IVS1-130 G C , die sowohl in der türkischen [Öner et al., 1990] als auch in der japanischen [Yamamoto et al., 1992] und deutschen [Schwarz et al., 1997] Bevölkerung beschrieben worden ist, ist ebenfalls durch das Fehlen der Haplotypenanalyse nicht möglich.

Der Vergleich der Mutationsspektren in verschiedenen Populationen der Nicht-Endemiegebiete dokumentiert das häufige Vorkommen typischer mediterraner -Thalassämie-Mutationen in Nord-West-Europa (Tschechoslowakei, Ungarn, England, Deutschland). Somit unterscheiden sich die Mutationsspektren in diesen Ländern kaum voneinander und Differenzen entstehen nur durch die unterschiedlichen Häufigkeiten in der

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4.2. Seltene -Thalassämie-Gene

4.2.1. Die Frameshift-Mutation am Übergang vom Kodon 82/83.

Der Anteil der FS 82/83-Mutation in der einheimischen deutschen Bevölkerung beträgt 5,6 %. Es handelt sich um ein seltenes -Thalassämie-Allel, welches bisher nur in 2 tschechoslowakischen [Indrak et al., 1992] und einer Familie aus Aserbaidschan [Schwartz et al., 1989] beschrieben wurde. Nach aller Wahrscheinlichkeit ist diese Mutation völlig unabhängig auf dem heutigen Gebiet der Bundesrepublik Deutschland entstanden.

Diese Hypothese wird durch die Veröffentlichung von Kimberland et al. [1995] unterstützt, die ebenfalls die FS-Mutation bei einem Deutschen identifizierten. Die hämatologischen Befunde zeigten ein erniedrigtes MCV von 67 fl und einen HbA₂-Wert von 1,7 bis 3,7 %. Eine kritische Wertung dieser Angaben ist schwer möglich, da ein HbA₂-Wert erst ab 3,5 % als pathologisch erhöht gilt und die Diagnose einer heterozygoten -Thalassämie zulässig macht. Eine verwandtschaftliche Beziehung des Deutschen mit der Bevölkerung des Mittleren Ostens konnte nicht aufgezeigt werden, so daß ein autochthoner Ursprung der Mutation als wahrscheinlich angenommen wird.

4.2.2. Die Nonsense-Mutation im Kodon 121.

Zu Beginn der 70iger Jahre wurde eine irische Familie mit einer ungewöhnlichen Thalassämie beschrieben. Der Erbgang erwies sich als autosomal dominant. Das Krankheitsbild war durch eine mittelschwere Anämie mit typischen morphologischen Veränderungen der roten Blutkörperchen, durch eine Splenomegalie und eine Knochenmarkhyperplasie gekennzeichnet. Auffallend waren große plumpe Innenkörper in den Normoblasten, deren Existenz zur Bezeichnung "Inclusion body -thalassemia trait" führte [Weatherall et al., 1973; Stamatoyannopoulos et al., 1974].

Eine besondere Form der selten dominant vererbten -Thalassämie ist die Nonsense-Mutationen im Exon 3. Interessanterweise führen Nonsense-Mutationen im ersten und zweiten Exon zum vorzeitigen Abbau der veränderten mRNA. Möglicherweise schützt dieser posttranskriptionale Mechanismus des intrazellulären Abbaus nonsense-mutierter mRNA heterozygote Träger einer -Thalassämie vor schweren klinischen Manifestationen der Erkrankung. Es resultiert ein asymptomatischer Phänotyp [Kugler et al., 1995]. Im Gegensatz dazu werden bei Nonsense-Mutationen im terminalen Exon große Mengen nicht-funktionaler mRNA des mutierten Allels produziert, da die pathologische mRNA nicht im Zellkern abgebaut, sondern ins Zytoplasma transportiert wird. Die mutierten - sowie die freien -Globinketten überlasten das proteolytische System des Zytoplasmas und zerstören nach Präzipitation die Erythrozytenmembran. Dieser Prozeß zieht eine ineffektive Erythropoese mit Hämolyse und Splenomegalie nach sich und hat somit einen klinisch schwereren Phänotyp im Sinne einer Thalassaemia intermedia zur Folge (sog. dominant negativer Effekt nicht-funktionaler -Globin-mRNA) [Beris et al., 1988; Hall & Thein, 1994; Kugler et al., 1995].

Die Nonsense 121 G T-Mutation gehört zu den Formen der -Thalassämie im Exon 3 und erlangt durch ihr gehäuftes Auftreten in der Bevölkerung Nord-West-Europas an Interesse. Tab. 12 gibt eine Übersicht über die bisher identifizierten -Thalassämie-Gene mit einer Kodon 121 G T-Mutation und den jeweiligen resultierenden Phänotyp.

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Tab. 12: Übersicht der bisher veröffentlichten NS 121 G T-Mutationen. (1 ohne Angabe; 2 nur Splenomegalie; 3 11 Mitglieder aus 3 Familien)

Publikation	Abstammung	Hb (g/dl)	MCV(fl)	MCH(pg)	HbA2(%)	HbF (%)	Innen-körper	Hepato-spleno-megalie	Transfusions-bedürftigkeit
Kazazian et al. [1986]	griechisch/polnisch	o. A.1	o. A.1	o. A.1	3,0	97,0	o. A.1	o. A.1	+
Fei et al. [1989]	schweizerisch/französisch	9,8	61,0	20,2	4,9	3,1	+	o. A.1	o. A.1
Thein et al. [1990]	britisch	11,6	77,0	26,0	5,0	3,0	+	+2	o. A.1
	britisch	9,0	64,0	19,5	4,8	1,1	o. A.1	-	o. A.1
Yamamoto et al.[1992]	japanisch	10,0	62,0	18,9	5,7	6,6	o. A.1	o. A.1	o. A.1
	japanisch	10,8	70,0	21,7	4,8	3,8	o. A.1	o. A.1	o. A.1
Indrak et al.[1992]	tschecho-slowakisch3	9,0-12,5	57,0-75,0	18,5-22,6	4,1-5,1	1,0-7,0	-	o. A.1	o. A.1
Hall et al.[1994]	angelsächsisch	12,3	77,0	26,0	5,0	5,0	o. A.1	+	+
	angelsächsisch	10,4	56,0	19,0	6,0	2,0	o. A.1	-	-
Schwarz et al.[1997]	deutsch	10,8	63,9	21,0	4,9	5,3	o. A.1	-	-
	deutsch	11,4	o. A.1	21,2	6,0	-	o. A.1	+	-

Alle in Tab. 12 aufgeführten Probanden mit der Mutation im Kodon 121 zeigen einen uneinheitlichen Phänotyp. Zwei Fälle sind regelmäßig bzw. gelegentlich transfusionsbedürftig (s. Tab 12) [Kazazian et al., 1986; Hall & Thein, 1994]. Deutlich wird auch, daß der Nachweis von Innenkörpern nicht obligat ist. Aus diesem Grund sollte man in der Nomenklatur zwischen der Innenkörper--Thalassämie und der dominanten -Thalassämie unterscheiden. Lassen sich in den Normoblasten große plumpe Innenkörper nachweisen, kann man auf den von Weatherall und Stamatoyannopoulous geprägten Begriff der Innenkörper--Thalassämie zurückgreifen. Ist das nicht der Fall, wird der Begriff dominante -Thalassämie bevorzugt.

Der hämatologische Phänotyp der beiden Deutschen mit einer NS 121 G T-Mutation entspricht einer Thalassaemia minor (s. Tab. 12), wobei der klinische Befund der Hepatosplenomegalie bei dem einen Probanden ein Hinweis auf den vermuteten dominant negativen Effekt nicht-funktionaler mRNA sein könnte. Auf das Vorhandensein von Innenkörpern sind beide Probanden nicht untersucht worden.

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4.3. Die neue IVS1-129 A G-Mutation

In der Literatur gibt es eine Reihe von Veröffentlichungen über Sequenzveränderungen im -Globingen, die die RNA-Verarbeitung empfindlich stören. Mutationen, die die hochkonservierten und invariablen Dinukleotide der 5´-Donor-Spleißstelle (GT) und der 3´-Akzeptor-Spleißstelle (AG) an der Exon/Intron bzw. Intron/Exon Grenze betreffen, nehmen darin einen großen Stellenwert ein. Untersuchungen zeigten, daß diese Konsensussequenzen absolut notwendig für einen effizienten und präzisen Spleißvorgang sind [Breathnach & Chambon, 1981; Mount et al., 1982; Shapiro & Senapathy, 1987].

So wurden bisher 6 verschiedene -Thalassämie-Gene beschrieben, deren Mutation den 5´-GT-Spleißdonor (G oder T in gleicher Weise) der IVS1 bzw. IVS2 komplett inaktivieren und damit eine normale RNA-Verarbeitung verhindern [Orkin et al., 1982 [b]; Treismann et al., 1982; Kazazian et al., 1984; Chibani et al., 1988; Gonzales-Redondo et al., 1989; Bouhass et al., 1990]. Untersuchungen ergaben, daß die Inaktivierung der hochkonservierten 5´-GT-Dinukleotide zur Aktivierung einer kryptischen Spleißstelle an anderer Lokalisation im RNA-Transkript führen. Dieses alternative Spleißen ist im Vergleich zur Nutzung des natürlichen Spleißkonsensus ineffizienter, gemessen an einer ca. 10-20fach geringeren RNA-Ausbeute [Orkin et al., 1982 [b]; Treismann et al., 1983].

In demselben Maße gibt es zahlreiche Publikationen zu Mutationen des 3´-AG-Spleißakzeptors. Dabei fällt auf, daß Mutationen dieses Spleißkonsensus am Übergang vom zweiten Intron zum dritten Exon (3´-IVS2) das Adenin [Antonarakis et al., 1984; Atweh et al., 1985; Padanilam & Huisman, 1986] bzw. Guanin [Jancovic et al., 1992; Rosatelli et al., 1992; Cürük et al., 1995] in gleicher Weise betreffen, in der 3´-IVS1 (Übergang erstes Intron/zweites Exon) jedoch nur Mutationen beschrieben worden sind, die das Guanin betreffen [Öner et al., 1990; Yamamoto et al., 1992; Deidda et al., 1990]. Aus diesem Grunde stellt der A G-Basenaustausch an Position 129 des ersten Introns ein Novum dar (s. Tab. 13).

Orkin et al. dokumentierten 1983 als erste Arbeitsgruppe eine Mutation in der kritischen Sequenz des 3´-Spleißakzeptors im -Globingen. Sie identifizierten eine 25 bp-Deletion, die einen großen 3´ gelegenen Abschnitt der IVS1 sowie das invariable AG-Dinukleotid und ein oder zwei Nukleotide des zweiten Exons einschloß. Mittels in-vitro-Analyse konnte nachgewiesen werden, daß der Defekt die Anlagerung von U1 snRNP (small nuclear ribonucleo protein particle) an die 5´ Spleißstelle verhindert. Dadurch wird die Abspaltung des Introns vom davorliegenden Exon und die typische Ausbildung der lariat formation blockiert [Reed & Maniatis, 1985] (s. Abb. 20). Das Spleißen am 3´-Speißakzeptor ist unmöglich. Im Gegensatz zu Untersuchungen anderer Thalassämie-Gene [Treismann et al, 1982 & 1983; Felber et al., 1982], fand hier kein alternativer Spleißvorgang statt. Das mutierte Gen produzierte Globin-RNA, die das gesamte Intron 1 enthielt. Interessanterweise konnten jedoch nur geringe Mengen dieser RNA nachgewiesen werden, was wohl am ehesten ihre Instabilität reflektiert oder ihren ineffizienten Transport vom Zellkern in das Zytoplasma widerspiegelt [Orkin et al., 1983].

Mutationen, die die Position 849 des 2. Introns und damit den AG-Spleißkonsensus am Übergang vom zweiten Intron zum dritten Exon betreffen, wurden von Antonarakis et al. [1984], Atweh et al. [1985] und Padanilam & Huisman [1986] ausschließlich bei Schwarzamerikanern beschrieben (s. Tab. 13). Alle aufgezeigten Mutationen blockierten die normale RNA-Verarbeitung, so daß eine alternative Spleißstelle an Position 579 (anstelle Position 849) des 2. Introns benutzt wurde. Infolgedessen entstand ein verlängertes Exon 3, da das 2. Intron nur

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Abb. 20: Modell des Spleißvorgangs, modifiziert nach Lewis, 1994.

Padanilam & Huisman [1986] gelang im Gegensatz dazu der Nachweis von mRNA anomaler Größe nicht. Ob dieses Ergebnis auf dem extrem schnellen Abbau der mutierten mRNA oder auf dem vollständigen Fehlen alternativ gespleißter mRNA beruht, bleibt offen.

Ebenso war es Jankovic et al. [1992] und Cürük et al. [1995] nicht möglich, die nicht-funktionale mRNA bei Basensubstitutionen an Position 850 des 2. Introns (s. Tab. 13) nachzuweisen. Bei den Probanden handelte es sich um heterozygote Träger einer -Thalassämie (jugoslawischer sowie englisch-schottischer Abstammung).

Publikationen zu Veränderungen der kritischen Spleißkonsensussequenz AG am Übergang vom Intron 1 zum Exon 2 betreffen nur das Guanin und wurden von Öner et al. [1990], Yamamoto et al. [1992] und Deidda et al. [1990] veröffentlicht. Eine RNA-Analyse wurde in keinem der drei Fälle durchgeführt, so daß nur hypothetische Aussagen über den Effekt dieser Mutationen vorliegen. So nehmen Yamamoto et al. [1992] an, daß der G C-Basenaustausch an Position 130 des ersten Introns eine direkte Ligation von Exon 1 und 3, unter Entfernung von IVS1, Exon 2 und IVS2 zur Folge hat. Grundvoraussetzung für diesen Vorgang wäre jedoch das Vorhandensein einer alternativen Spleißstelle.

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Tab. 13: Übersicht der bisher identifizierten Mutationen des 3´ AG-Spleißakzeptors.

Publikation	Mutationen des 3´AG-Spleißakzeptors
Orkin et al., 1983	IVS1, 25 bp-Deletion (3´-Ende)
Antonarakis et al., 1984	IVS2-849 AG
Atweh et al., 1985	IVS2-849 AG
Padanilam & Huisman, 1986	IVS2-849 AC
Jankovic et al., 1992	IVS2-850 GC
Cürük et al., 1995 Rosatelli et al., 1992	IVS2-850 GA IVS2-850 -G
Öner et al., 1990	IVS1-130 GC
Yamamoto et al., 1992	IVS1-130 GC
Deidda et al., 1990	IVS1-130 GA
Schwarz et al., 1997	IVS1-129 AG

Die neue IVS1-129 A G-Mutation reiht sich in die eben ausführlich beschriebenen Mutationen ein, die den kritischen AG-Spleißakzeptor betreffen. Das AG-Dinukleotid ist ein hochkonserviertes Charakteristikum aller Akzeptor-Spleißstellen [Breathnach & Chambon, 1981; Mount et al., 1982]. Deletionen oder Substitutionen dieser konstanten Nukleotide resultieren in einer Störung der normalen RNA-Verarbeitung. Der Austausch einer einzigen Base innerhalb des AG-Dinukleotides verhindert die Abspaltung des 3´-Endes, wohingegen die Deletion des Polypyrimidin-Traktes und des AG-Dinukleotides die Abspaltung des 5´-Endes sowie die Ausbildung des Lassos unterbindet (s. Abb. 20) [Reed & Maniatis, 1985]. Es entsteht eine nicht-funktionale, äußerst instabile mRNA, deren klinische Auswirkungen im Falle eines homozygot Erkrankten dem Bild einer °-Thalassämie entspräche.

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4.4. -Thalassämie ohne Mutation im -Globingen

In 8 von 214 Fällen gelang die molekulare Charakterisierung der -Thalassämie-Gene nicht. Alle Probanden erfüllten die hämatologischen Kriterien zur Diagnose einer heterozygoten -Thalassämie. Ein normales -Globingen nach vollständiger Sequenzierung zeigten 6 Probanden, die molekulare Aufarbeitung der restlichen 2 Probanden mußte aus Mangel an DNA abgebrochen werden. Die spätere Durchführung einer Southern blot-Analyse im molekularbiologischen Labor der Kinderklinik zum Nachweis von Deletionen im -Globingen blieb ebenfalls ohne Ergebnis.

Die Vermutung liegt nahe, daß diese Probanden -Thalassämiedeterminanten tragen, die nicht an den -Globingen-Komplex gebunden sind. Diese Hypothese wird durch eine Reihe von Publikationen unterstützt.

Semenza et al. 1984 [a] informierten das erste Mal über eine neue Kategorie von -Thalassämie-Erkrankungen am Beispiel einer albanischen Familie. In dieser Familie waren beide Kinder an einer -Thalassämie erkrankt. Die Mutter trug auf einem Allel die IVS1-1 G A-Mutation, das andere Allel war nicht betroffen. Der erhöhte HbA₂-Wert sicherte auch hämatologisch die Diagnose einer heterozygoten -Thalassämie bei der Mutter. Das -Globingen des Vaters blieb unauffällig, keine Punktmutation oder Deletion konnte nachgewiesen werden. Die einzige Auffälligkeit bot die komplexe Neuordnung der Basen an Position -530, bestehend aus einer Insertion (+ATA) und einer Deletion (-T). Diese Sequenzänderung wurde von derselben Arbeitsgruppe als neuer DNA-Polymorphismus im -Globingen-Komplex beschrieben [Semenza et al., 1984 b]. Unklar blieb der Phänotyp der Kinder dieser albanischen Familie, da die Analyse des -Globingens des Vaters einer Erklärung entbehrte. (Leider fehlten die Angaben der hämatologischen Befunde der Familienmitglieder, so daß nicht sicher von einer Thalassaemia intermedia der Kinder ausgegangen werden kann.)

Murru et al. beschrieben 1990 und 1992 bei Mitgliedern zweier italienischer Familien den Phänotyp einer Thalassaemia intermedia, konnten jedoch nur auf einem Allel eine Mutation im -Globingen nachweisen. Interessanterweise wurde auch in diesen Fällen zusätzlich die komplexe Sequenzänderung an Position -530 (+ATA -T) identifiziert. Die Rolle dieser Sequenzänderung wird kontrovers diskutiert. Ihr Vorkommen sowohl in normalen Individuen als auch in Trägern des HbS, des HbE oder einer -Thalassämie spricht am ehesten für einen DNA-Polymorphismus [Wong et al., 1989; Thein et al., 1993]. Andererseits zeigen Untersuchungen von Berg et al. [1989; 1991], daß BP 1 (Beta Protein 1) über eine Bindung an die -530-Mutation entscheidenden Einfluß auf die -Globin-Synthese nehmen kann. Berg et al. [1991] verglichen die Bindungseffizienz von BP 1 an die normale und die mutierte Sequenz (-530 +ATA -T) des -Globingens. Das verblüffende Ergebnis: Das Protein band mit einer höheren Affinität an die mutierte Sequenz. Dieses Ergebnis veranlaßte die Arbeitsgruppe, BP 1 als ein Repressorprotein zu postulieren, welches durch hohe Bindungsaffinität an die Sequenzänderung an Position -530 eine verminderte -Globin-Synthese bewirkt. Dieses Modell unterstützen Untersuchungen des indischen Haplotyps der Sichelzellanämie, der die gleiche Mutation an Position -530 aufweist. Homozygote Patienten zeigen einen milderen Phänotyp, möglicherweise erklärbar durch eine verminderte Produktion an ^S-Ketten [Elion et al., 1992]. Konträr dazu steht der Nachweis einer höheren Bindungsaffinität des Transkriptionsfaktors Sp 1 an einen mutierten -Globinpromotor, der über eine vermehrte Produktion von -Globin die Ausbildung einer HPFH zur Folge hat [Ronchi et al., 1989].

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Trotz aller Spekulationen scheint die Interaktion von cis-regulatorischen Elementen und Transkriptionsfaktoren von maßgeblicher Bedeutung zu sein. Die cis-regulatorischen Elemente und die in trans agierenden Transkriptionsfaktoren haben bekanntermaßen einen entscheidenden Einfluß auf die Expression der einzelnen Gene des -Globingen-Komplexes und spielen gleichzeitig eine wichtige Rolle im Globingen-Schaltmechanismus [De Boer et al., 1988; Orkin, 1990; Grosveld et al., 1993]. Veränderungen im Bindungsverhalten regulatorisch wirksamer Proteine könnten die -Thalassämiedeterminanten sein, die nicht an das -Globingen gekoppelt sind, jedoch den Phänotyp einer -Thalassämie verursachen [Murru et al., 1992; Thein et al., 1993].

Ein Beispiel für ein regulatorisch wirksames Protein ist der kürzlich entdeckte erythroid-spezifische Transkriptionsfaktor EKLF (erythroid Krüppel like factor). Studien demonstrierten, daß EKLF die CACCC-Box bindet und Mutationen dieses wichtigen Promotorelementes die EKLF-Bindung inhibieren [Miller & Bieker, 1993]. Weiterhin binden EKLF-Proteine mit 8fach erhöhter Effizienz an den - im Vergleich zum -Globingenpromotor. Diese Daten unterstreichen die Fähigkeit des Proteins, die menschliche -Globingen-Expression zu aktivieren und sprechen auch für die Einnahme einer wichtigen Funktion beim --Schaltmechanismus [Donze & Townes, 1995]. Eine Mutation im EKLF-Gen könnte eine Verminderung der -Globin-Synthese zur Folge haben und dadurch den Phänotyp einer -Thalassämie hervorrufen. Die Sequenzanalyse des -Globingens des Betroffenen würde in diesem Falle unauffällig sein. Untersuchungen von Perkins et al. [1995] unterstützen diese Überlegungen. Die Arbeitsgruppe inaktivierte die EKLF-Gene von Mäusen durch gene targeting und wies nach, daß der EKLF-Genverlust selektiv die -Globingen-Expression in hohem Maße verminderte. Die EKLF -/- Embryos zeigten eine normale Entwicklung während der fetalen Erythropoese, starben jedoch am 16. Tag, wenn es zum Umschalten der fetalen zur adulten Hämoglobinsynthese kam. Lim et al. [1997] führten diese Untersuchungen fort, um die Rolle des EKLF in der adulten Erythropoese zu erforschen. Dazu benutzten sie murine embryonale Stammzellen, in denen beide EKLF-Allele inaktiviert waren (EKLF -/-) und konnten nachweisen, daß der Verlust von EKLF eine Verminderung der -Globinketten-Synthese zur Folge hat. Die EKLF-/- Erythrozyten leiden an einem Mangel an -Globinketten, was in einen Überschuß an -Ketten resultiert. Die Präzipitate konnten Lim et al. [1997] als Einschlußkörperchen in den EKLF-/- Zellen nachweisen. Erythrozyten mit Innenkörpern werden schneller als normal von der Milz aus der Blutzirkulation entfernt. Aufgrund dieses bekannten Mechanismus erklärt sich die verkürzte Lebenszeit der EKLF-/- Erythrozyten, die Lim et al. [1997] dokumentierten.

Der Transkriptionsfaktor EKLF wird ebenfalls von der italienischen Arbeitsgruppe um Gasperini [1998] als potentieller Kandidat favorisiert, bei einem heterozygoten Träger der -Thalassämie den schwereren Phänotyp einer Thalassaemia intermedia auslösen zu können. Sie berichteten von 6 Mitgliedern zweier Familien aus Sardinien, die typische Zeichen einer Thalassaemia intermedia aufwiesen (mittelschwere bis schwere Anämie, erhöhtes HbF, Hepatosplenomegalie) jedoch genotypisch nur auf einem Allel die NS 39-Mutation trugen. Umfangreiche Untersuchungen schlossen triplizierte -Globingene, Mutationen der HS2 und 3 der LCR sowie

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Den Funktionsverlust eines Globingens ohne Mutation in der Globinsequenz konnten auch Wilkie et al. [1990] anhand einiger Patienten mit einer -Thalassämie in Kombination mit einer mentalen Retardierung (ATR X-Syndrom) zeigen. Die molekulare Analyse ergab einen intakten -Globingen-Komplex und ein normales -Globingen. Es handelt sich um ein X-chromosomal rezessives Leiden, das nicht an den -Globingen-Komplex gekoppelt ist. Unklar bleibt, ob diese Erkrankung direkt durch die Interaktion eines in trans agierenden Faktors mit dem einen oder anderen Globingen hervorgerufen wird oder ob es sich um einen indirekten Effekt handelt, der jedoch spezifisch für nur eines der Globingene ist.

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