Wagner , Kay-Dietrich: Thema: "Effekte von Hypoxie und Reoxygenierung auf die kontraktile Funktion von humanen Vorhoftrabekeln und Rattenpapillarmuskeln - Möglichkeiten der Protektion"

Kapitel 2. Material und Methoden

2.1. Gewinnung der Präparate

Die humanen Vorhoftrabekel stammten aus der Spitze des rechten Herzohres von Patienten, die unter Einsatz der Herz-Lungen-Maschine operiert wurden. Von insgesamt 76 untersuchten Präparaten stammten 61 von Patienten, die einen aorto-coronaren Bypass erhielten und 15 von Patienten, die sich einer Klappenersatzoperation unterzogen. Das Verhältnis von männlichen zu weiblichen Patienten war 60:16, das


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durchschnittliche Patientenalter betrug 60,3 ± 1,0 Jahre. Die Präparate wurden bei Kanülierung des rechten Atriums entnommen und sofort in ein Transportgefäß mit 25 ml Lösung folgender Zusammensetzung überführt (in mmol/l): NaCl 140,0; KCl 5,0; CaCl2 0,5, MgCl2 1,1; Tris/HCl 10,0; Glucose 11,1; 25 mU/ml Insulin; pH 7,4. Zur Senkung der Ca2+-Affinität der Myofilamente und damit der Stoffwechselaktivität während des Transportes enthielt die Lösung 25 mmol/l Butandionmonoxim (BDM) [92]. Durch vorangehende Perfusion für ca. 30 min mit 100% O2 erreichte der pO2 in der Lösung ca. 70 kPa. Der Transport zum Physiologischen Institut dauerte ca. 15 min. Die Präparation der Trabekel erfolgte bei Raumtemperatur.

Die Rattenpapillarmuskeln stammten von männlichen Albino-Wistar-Ratten. Eine Gruppe von Ratten hatte 6 Wochen vor Präparation nach Ligatur einer Koronararterie einen Myokardinfarkt erlitten (Gruppe CI, n = 10) und eine weitere war als Kontrolle zu den Infarkttieren scheinoperiert worden, ohne daß die Ligatur um die linke Koronararterie geschlossen wurde<1> (Gruppe SO, n = 9).

Thorakotomie und Herzentnahme erfolgten in tiefer Äthernarkose. Die Herzen wurden entnommen und sofort in die oben beschriebene Blutersatzlösung ohne Zusatz von BDM überführt. Danach sind die Ventrikelgewichte in den Gruppen CI und SO bestimmt worden. Die anschließende Präparation der linksventrikulären Papillarmuskeln erfolgte mittels Mikroskopierscheren.

Für die Versuche zur Prävention der hypoxie- und reoxygenierungsbedingten Schädigungen mit dem Hydroxylradikalfänger BHT (Gruppe BHTR, n = 6), dem Singlet-Sauerstoff-Fänger Histidin (Gruppe HisR, n = 6), deren Kombination (Gruppe BHR, n =6) sowie für eine Kontrollserie (Gruppe KR, n =6) wurden die Herzen ebenfalls nach oben beschriebenem Verfahren von männlichen Albino-Wistar-Ratten entnommen, aber sofort vor Entnahme der linksventrikulären Papillarmuskeln in eine auf 37 ± 0,5 0C vorthermostatierte Lösung folgender Zusammensetzung überführt (in mmol/l): NaCl 137; KCl 2,68; CaCl2 1,5; MgCl2 1,8; NaHCO3 4,9; NaH2PO4 0,42; Glucose 5,55. Diese Lösung wurde zuvor ca. 20 min mit einem Gemisch aus 95 % O2 und 5 % CO2 oxygeniert. Der pH dieser Lösung betrug ebenfalls 7,4 und der pO2 ca. 70 kPa.

Nach erfolgter Präparation der Trabekel bzw. Papillarmuskeln und Anbringen von zwei Klemmen aus Wolframdraht an den Präparatenden betrug die durchschnittliche freie Länge zwischen den Klemmen für Trabekel und Papillarmuskeln 5,0 ± 0,2 mm. Der Durchmesser der Rattenpapillarmuskeln betrug durchschnittlich 0,8 mm und der von den humanen Vorhoftrabekeln durchschnittlich 0,6 mm.


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2.2. Versuchsdurchführung

1. humane Trabekel, Ratten mit Myokardinfarkt und scheinoperierte Ratten

Das eingeklemmte Präparat befand sich horizontal in der Meßkammer. Die eine Klemme war mit dem Kraftaufnehmer (Hugo Sachs Elektronik, BRD) verbunden, die andere an einem Haken eingehängt, der beweglich mit einer Mikrometerschraube zur Einstellung der Vorlast verbunden ist. Die Meßkammer enthielt ca. 5 ml der beschriebenen Lösung. Ein Schlauchsystem verband sie mit dem doppelwandigen thermostatierbaren Vorratsgefäß (25 ml Inhalt). Die ständig kontrollierte Temperatur der Lösung in der Meßkammer betrug 31 oC. Die Perfusion der Versuchslösung erfolgte im Vorratsgefäß. Während der Normoxie wurde die Perfusionslösung mit 100% O2 perfundiert, in der Hypoxie mit 100 % N2 und zur Durchführung einer simulierten Ischämie (Kombination aus Hypoxie und Azidose) mit 95 % N2 + 5 % CO2.

2. Mit BHT und Histidin behandelte Rattenpapillarmuskeln und Kontrolle

An diesen Papillarmuskeln befand sich nur eine Klemme. Nach Einbringen in das Organbad erfolgte die Fixation des anderen Endes mit einer stationären Klemme. Die freie Klemme wurde dann zur Messung des isometrischen Kraftverlaufs und zur Kontrolle der Vorlast an einem Kraftaufnehmer (RCA-5734-Röhre, Hugo-Sachs-Elektronik) befestigt. Die Versuchskammer war ebenfalls mit ca. 5 ml der für diese Versuche oben angegebenen Lösung gefüllt. Zwei Schlauchsysteme, die mit zwei thermostatierbaren Vorratsgefäßen verbunden waren, ermöglichten die Zirkulation in getrennten Kreisläufen. Eine Pumpe gewährleistete den Transport der Lösung. Die Begasung der Lösung erfolgte in den Vorratsgefäßen. Dreiwegehähne vor und hinter der Meßkammer ermöglichten die Zirkulation von Lösungen mit unterschiedlichem pO2 und verschiedenen Pharmakazusätzen. Die Temperatur betrug bei diesen Versuchen 37 ± 0,5 0C. Sie wurde mittels eines thermoelektrischen Meßfühlers gemessen und konnte gegebenenfalls am Thermostaten nachreguliert werden. Der laufend kontrollierte pH der Lösung betrug während des gesamten Versuches 7,4. Auftretende Abweichungen konnten durch Regulierung der Begasungstärke der Lösung kompensiert werden. Für Normoxie enthielt das Gas 95 % O2 + 5 % CO2 und für Hypoxie 95 % N2 + 5 % CO2.

3. Stimulation und mechanische Messungen

Die Stimulation der Trabekel und Papillarmuskeln erfolgte über zwei in der Meßkammer parallel angeordnete Plattenelektroden aus Platin mittels spannungskonstanter Feldreizung. Die Reizfrequenz betrug in der Äquilibrierungsphase 0,25 Hz und während


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des Experiments 0,5 Hz. Als Reize (Reizgerät: Plugsys System 603, Hugo Sachs Elektronik, BRD) dienten biphasische Rechteckimpulse von 7 ms Dauer mit einer um 30 % höheren Stromstärke als zur Entwicklung der maximalen Kraft notwendig war. Für die humanen Vorhoftrabekel betrug die Reizstärke 120 - 150 mA und für die Rattenpapillarmuskeln 30 - 60 mA.

Ein mechanoelektrischer Wandler übertrug das Kraftsignal vom Kraftmeßgerät (Plugsys System 603, Hugo Sachs Elektronik, BRD) auf einen Oszillographen (Nicolet Pro 10, Nicolet, USA) sowie über einen Analog-Digital-Wandler auf einen Personalcomputer. Veränderungen in der Grundspannung während Hypoxie und Reoxygenierung wurden auf einem Schreiber aufgezeichnet. Die Aufzeichnung und Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe eines im Labor erstellten Programmes ebenfalls mit dem PC, die Speicherung der Daten von den BHT- und Histidin-behandelten Muskeln sowie von den Kontrollen mit Hilfe eines Digital-Recorders (DTR 1200, Biologic, Frankreich).

4. Das experimentelle Protokoll

1. humane Trabekel, Papillarmuskeln von Ratten mit Infarkt und scheinoperierte Ratten

In der Äquilibrierungsphase kontrahierten die Präparate dieser Gruppen isometrisch bei einer Vorlast zwischen 0,5 und 1 mN.

Bei den humanen Vorhoftrabekeln mußte zu Beginn der Äquilibrierung BDM ausgewaschen werden. Danach wurde die Ca2+-Konzentration schrittweise von 0,5 mmol/l auf 1,5 mmol/l erhöht. Bei den Rattenpapillarmuskeln konnte zu Beginn der Äquilibrierung die Ca2+-Konzentration schrittweise auf 1,5 mmol/l erhöht werden. Die Äquilibrierungsphase dauerte bis zur Erzielung konstanter Ausgangsbedingungen für die Rattenpapillarmuskeln ca. 25 min und für die humanen Trabekel ca. 60 min. Merkmal der Funktionsstabilität der Präparate war eine über längere Zeit konstante Kraft bei unveränderten weiteren Parametern des Mechanogramms. Dann folgte das experimentelle Protokoll mit der Grundreizfrequenz von 0,5 Hz. Die schrittweise mechanische Dehnung des Präparates führte zur Vorlast für die maximalen Kraftentwicklung. Die Experimente sind bei 50 % dieser Vorlast durchgeführt worden.

Während des experimentellen Protokolls sind Registrierungen der rhythmischen Kontraktionskurven unter normoxischen Bedingungen und potenzierte Kontraktionen nach Extrastimulation (Postextrastimulatorische Potenzierungen - PEP) sowie nach Reizpausen (Nachpausenpotenzierungen - NPP) und das Abklingen der Potenzierungen zur Charakterisierung der Kraft-Intervall-Beziehungen aufgezeichnet worden.

Eine Gruppe humaner Vorhoftrabekel (HK, n = 17) kontrahierte während Hypoxie und Reoxygenierung bei 5 mmol/l extrazellulärer K+-Konzentration. Zwei weitere Gruppen


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humaner Trabekel (Gruppe HH, n = 16 und Gruppe HSI, n = 16) kontrahierten zur Simulation eines weiteren Aspektes der Ischämie bei erhöhtem extrazellulären K+ von 30 mmol/l, wobei gleichzeitig die häufig auftretende Spontanaktivität verschwand. Während der schrittweisen K+-Erhöhung vor der simulierten Ischämie wurden die Kontraktionskurven registriert. Um die maximale Kontraktionskraft zu erzielen, mußte die notwendige Reizstromstärke gesteigert werden. Nach Erreichen von 30 mmol/l K+ erfolgte erneut die Charakterisierung der Kraft-Intervall-Beziehungen und danach der Übergang auf die simulierte Ischämie durch Perfusion mit 95 % O2 + 5 % CO2.

Ein Teil der Rattenpapillarmuskeln kontrahierte bei 31 °C in einer Badlösung mit 5 mmol/l K+-Konzentration (Gruppe RH, n = 15). Eine weitere Gruppe der Rattenpapillarmuskeln kontrahierte in Gegenwart von 30 mmol/l K+ zum Vergleich mit Experimenten an Humanpräparaten bei dieser K+- Konzentration und zusätzlicher Azidose während der Hypoxie (Gruppe RSI, n = 12). Das experimentelle Protokoll entsprach dem oben beschriebenen.

Die kontraktile Funktion von Papillarmuskeln der scheinoperierten Ratten (SO) und nach chronischem Infarkt (CI) ist ebenfalls anhand rhythmischer Kontraktionen und der Kraft-Intervall-Beziehung charakterisiert worden. Dabei betrug die K+-Konzentration 5 mmol/l.

Nach Charakterisierung der kontraktilen Funktion unter normoxischen Bedingungen kontrahierten die Präparate der Gruppen HH, HK und RH während einer Hypoxie von 30 min Dauer. Diese entstand durch Perfusion des Superfusates mit 100 % N2, mit einem pO2 von ca. 3 kPa. Veränderungen der Kraft-, Zeit- und Geschwindigkeitsparameter des Mechanogramms von rhythmischen Kontraktionen während der Hypoxie sind in der 1.; 2.; 3.; 5; 7.; 10.; 12.; 15.; 20.; 25.; und 30. Minute aufgezeichnet worden. Am Ende der Hypoxiephase erfolgte die Charakterisierung der Kraft-Intervall-Beziehungen.

Eine weitere Gruppe humaner Vorhoftrabekel (HSI) und eine Gruppe von Rattenpapillarmuskeln (RSI) wurde nach Beendigung der Normoxie mit einem Gemisch aus 95 % N2 und 5 % CO2 begast, um zusätzlich zu der auftretenden Hypoxie (pO2 ca. 3 kPa) durch eine Azidose (pH 6,5) einen weiteren Aspekt der Ischämie zu simulieren. Die Registrierungen des Mechanogramms erfolgten wie für die anderen Gruppen beschrieben.

Nach 30 min Hypoxie begann in allen Gruppen die Reoxygenierung mit 100 % O2-Perfusion. Die Registrierungen erfolgten zu den für die Hypoxie beschriebenen Zeiten.

Mit Butylhydroxytoluen und Histidin behandelte Rattenpapillarmuskeln und Kontrollen

Die Äquilibrierungsphase dauerte ca. 45 min. In den ersten 15 min wurde im Abstand von 5 min die Reizung für 30 s unterbrochen. Eine deutliche Pausenpotenzierung sowie


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Funktionsstabilität der Präparate galten als Auswahlkriterien für die Verwendung zum Experiment.

Bei Funktionsstabilität erfolgte die Zugabe der Pharmaka als Bolus einer Stammlösung in die Vorratsgefäße. Die Endkonzentration der Pharmaka betrug für Histidin 20 mmol/l (Gruppe RHis) und für Butylhydroxytoluen (Gruppe BHT) 0,01 mmol/l (Histidin von Sigma Chemicals, St.Louis, USA, BHT von Serva, Heidelberg, BRD). Für die Versuche bei Kombination von beiden Pharmaka (Gruppe BHR) wurden die gleichen Konzentrationen verwendet. Eine weitere Gruppe ohne Zusatz der Pharmaka diente als Kontrolle (Gruppe KR).

Nach Zugabe der Pharmaka erfolgte die Einstellung der Vorspannung auf 50 % der Last, die zur maximalen Kraftentwicklung der Präparate notwendig war. Die Reizfrequenz betrug 0,5 Hz. Danach wurden über einen Zeitraum von 15 min die rhythmischen Kontraktionskurven unter normoxischen Bedingungen im Abstand von 5 min registriert, um einen Bezugswert für Hypoxie und Reoxygenierung zu gewinnen und eventuell auftretende Einflüsse der Pharmaka auf das Mechanogramm zu erkennen.

Nach Registrierung des Mechanogramms in der 15. min der Normoxie erfolgte die Superfusion mit der hypoxischen Versuchslösung aus dem zweiten Vorratsbehälter, die ebenfalls die Pharmaka in oben angegebener Konzentration enthielt. Die Lösung wurde mindestens 20 Minuten vor Beginn der Hypoxie mit einem Gasgemisch aus 95 % N2 und 5 % CO2 begast. Dieses wurde kontinuierlich bis zum Ende der Hypoxie fortgesetzt. Der pH der Lösung betrug ebenfalls 7,4 und der pO2 ca. 3,5 kPa. Die Registrierung des Mechanogramms erfolgte in der 1.; 2.; 3.; 5.; 7.; 10.; 12.; 15; 20.; 25.; und 30. Minute.

Zwecks Reoxygenierung erfolgte das Umschalten zur normoxischen Perfusion wiederum mittels der Dreiwegeventile. Die Registrierung des Mechanogramms geschah im gleichen Zeitmuster wie während Hypoxie.

2.3. Aktionspotentialmessung

Die zelluläre elektrische Aktivität wurde unter Verwendung konventioneller elektrophysiologischer Techniken gemessen [74]. Ein Ag/AgCl-Draht in einer Glasmikropipette gefüllt mit 2,5 mol/l KCl diente als Referenzelektrode im Organbad. Die Meßelektrode gleichen Aufbaus wurde über einen Platin/Iridium-Draht mit einem Verstärker, der an ein Oszilloskop (Nicolet Pro 10, Nicolet USA), einen DAT-Rekorder (DTR-1801, Biologic, Frankreich) und einen Personalcomputer angeschlossen war, verbunden. Unter Mikroskopsicht erfolgte das Absenken der Mikroelektrode mittels Mikromanipulator ins Organbad in dem die Kompensation der Potenzialdifferenz


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zwischen den Elektroden auf Null geschah. Ein Potentialsprung auf mindestens -10 mV galt als eine mögliche Zellpenetration. Die Datenanalyse erfolgte mit im Labor entwickelter Software. Aus dem zellulären elektrischen Signal erfolgte die Auswertung der Aktionspotentialamplitude (AP-Amplitude), der Zeit vom Reizbeginn bis zum Erreichen der AP-Amplitude (TAP), der Dauer bis zu 25 % (APD25), 50 % (APD50) bzw. 90 % (APD90) der Repolarisation.

2.4. Oxalatstimulierte Ca2+-Aufnahme in das sarkoplasmatische Retikulum

Die oxalatstimulierte Ca2+-Aufnahme in das sarkoplasmatische Retikulum wurde in linksventrikulärem Myokard der Ratten in der chronischen Phase nach Myokardinfarkt (CI, n = 10) bzw. nach Scheinoperation (SO, n = 9) gemessen.<2>

1. Präparation der Homogenate

Die Präparation der Homogenate erfolgte bei 4 °C. Linksventrikuläres Myokard, das nach Bestimmung des Ventrikelgewichtes in flüssigem Stickstoff gefroren und bei -80 °C gelagert wurde, konnte in eisgekühlter Lösung folgender Zusammensetzung (in mmol/l): 250 Saccharose, 10 Histidin, 50 NaH2PO4, 10 NaF, 1 EDTA, 0,3 PMSF, 0,5 DTT (pH 7,4) geschnitten und anschließend 6mal in 15 s Intervallen mit 21000 rpm homogenisiert werden (Brinkmann Polytron PT3000, Kinematica AG, Littau/Luzern, Schweiz). Nach Filtrieren durch Polyamidgaze (150 µm, Neolab, Heidelberg, BRD) lagerte das Homogenat bis zur Messung der oxalatstimulierten Ca2+-Aufnahme ins SR abermals bei -80 °C. Die Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration erfolgte nach der von Lowry [93] angegebenen Methode mit Ovalbumin als Standard nach 30 min Inkubation der Proben in 1 mol/l NaOH.

2. Oxalat-stimulierte Ca2+-Aufnahme in das sarkoplasmatische Retikulum

Die Messung (jeweils Doppelbestimmung) erfolgte nach der von Vetter und Rupp [94] angegebenen Methode. Das Medium enthielt (in mmol/l): 40 Imidazol (pH 7,0), 100 KCl, 5 MgCl2, 5 Tris-hydroxymethyl- aminomethan (Tris)-ATP, 10 NaN3, 0,2 Ethylenglycol-bis(ß-aminoethylether)-N,N,N', N'-tetraessigsäure (EGTA), 6 Phosphocreatin, 100 K-oxalat und 0,1 45CaCl2. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37 °C ohne Zusatz des Homogenates vorinkubiert. Anschließend reagierten 10 µl Homogenat mit 240 µl des beschriebenen 45Ca2+ Mediums. Mit Hilfe einer Vakuumpumpe wurden in 30 s-Abständen 0,05 ml durch 0,45 µm Milliporefilter (Schleicher & Schüll, Dassel,


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BRD) filtriert. Das Waschen der Filter geschah mit einer eisgekühlten Lösung folgender Zusammensetzung (in mmol/l): 100 KCl, 2 EGTA, 40 Imidazol und 1,25 NaN3 (pH 7,0). Die filterassoziierte Radioaktivität ergab sich aus der Flüssigszinitilationszählung (Wallace System 1400, Pharmacia, Turku, Finnland). Die Ca2+-Aufnahme errechnete sich durch lineare Regression der Datenpunkte zu den Zeitpunkten 0,5; 1,0; 1,5 und 2,0 min. Die Messungen erfolgten in der Anwesenheit von 2 µmol/l der katalytischen Untereinheit der Proteinkinase A bzw. 10 mmol/l eines synthetischen Proteinkinaseinhibitors (GibcoBRL, Life Technology, Grand Island, N.Y., USA).

2.5. Bestimmung der Glutathionperoxidase-, der Superoxiddismutase- und Kreatinkinaseaktivität, der Kreatinkinaseisoenzymverteilung und der Lipidperoxidkonzentration<3>

Die Bestimmung der Gluthationperoxidase- (GSH-Px), der Superoxiddismutase- (SOD) und der Kreatinkinaseaktivität (CK) und der Kreatinkinaseisoenzymverteilung erfolgte in linksventrikulärem Myokard von männlichen Wistar-Ratten 6 Wochen nach experimentellem Myokardinfarkt mit vergleichbarem Alter, Körpergewicht und Ventrikelgewichten wie in Gruppe CI. Als Kontrolle dienten männliche unbeeinflußte Wistar-Ratten gleichen Alters.

Linksventrikuläres nichtinfarziertes Myokard wurde nach Exzision der Herzen in Äthernarkose in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. Die Homogenisierung für die Kreatinkinasebestimmungen, GSH-Px- und SOD-Messungen erfolgte 1/20 vol. % in eisgekühlter 100 mmol/l KCl-Lösung mit 0,01 % Butylydroxyanisol für 3 x 15 s mit 30 s Intervallen bei 75 % der Maximalgeschwindigkeit des Ultraturrax-Homogenisators.

Die Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration erfolgte nach der von Lowry [93] angegebenen Methode.

Bestimmung der GSH-Px-Aktivität

Die Bestimmung der GSH-Px-Aktivität (CI: n = 12, Kontrolle: n = 5) erfolgte nach der von Paglia und Valentine beschriebenen Methode [95]. In 0,1-0,2 mg Homogenat je ml Testvolumen (Testansatz: "RANSEL" von Randox Lab. Ltd., Nordirland) reduzierte GSH-Px mit GSH als Wasserstoffdonor Cumenhydroxid. Das gebildete oxidierte Gluthation wird durch die Gluthationreduktase in Anwesenheit von NADPH reduziert.


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Die GSH-Px-Aktivität berechnet sich indirekt durch die Abnahme der NADPH-Absorbtion bei 340 nm.

Bestimmung der SOD-Aktivität

Die Messung der SOD-Aktivität (CI: n = 12, Kontrolle: n = 5) erfolgte nach dem Verfahren von Beauchamp und Fridovich [96]. Die Hemmung der Formazan-Bildung aus 2-(4-iodopheny)-3-(4-nitro)-5-phenyltetrazolinchlorid (INT) durch Superoxidradikale aus der Xanthinoxidase/Xanthin-Reaktion unter dem Einfluß der SOD wurde mittels Testansatz "RANSOT" (Randox Lab. Ltd., Nordirland) gemessen. Die Formazan-Bildung ließ sich spektrophotometrisch (Shimadzu UV-2101 PC) bei 550 nm bestimmen. Eine 50 %-ige Hemmung der INT-Reduktion nach Zugabe von 0,01-0,02 mg Homogenat je ml Testvolumen ist definiert als 1 U SOD-Aktivität.

Bestimmung der CK-Aktivität und CK-Isoenzymverteilung

Die Gesamtaktivität der Kreatinkinase (CI: n = 7, Kontrolle: n = 6) wurde mit dem Testansatz "CK-NAC actv." (Boehringer Mannheim, BRD) bei einer Konzentration von 2 mg pro ml Testvolumen ermittelt. Das Rapid Electrophoresis System (Helena Diagnostika, BRD) lieferte unter Verwendung des "CK isoforms kit" (Boehringer Mannheim, BRD) die CK-Isoenzymverteilung nach der Methode von Laser et al. [97].

Bestimmung der Lipidperoxidkonzentration

Humane Vorhoftrabekel nach Hypoxie und Reoxygenierung (HH, n = 11), Kontrolltrabekel ohne Hypoxie und Reoxygenierung (n = 14) sowie linksventrikuläres Myokard von Ratten mit chronischem Infarkt (CI, n = 9) und linksventrikuläres Myokard von unbeeinflußten Kontrolltieren (n = 5) dienten zur Bestimmung der Lipidperoxidkonzentration. Sie wurde in Form der Konzentration von thiobarbitursäure-reaktiven Substanzen nach der Methode von Ohkawa [98] gemessen. Dazu inkubiert man 0,15 ml Homogenat in einem Reaktionsgemisch aus 1,35 mol/l Essigsäure, 0,15 mmol/l Natriumdodecylsulfat, 20 mmol/l 1-Thiobarbitursäure, pH 3,5, für 60 min bei 90 °C. Das Gesamtvolumen betrug 0,8 ml. Anschließend wurde die Mischung in Eiswasser gekühlt und dann 1 ml Butanol-Pyrimidin-Gemisch (15:1) hinzugefügt. Die Mischung wurde vorsichtig geschüttelt und zentrifugiert. Der organische Überstand diente zur Fluoreszenzmessung der thiobarbitursäurereaktiven Substanzen bei der Anregungswellenlänge von 515 nm und emittierten Wellenlänge von 553 nm. Die Konzentration an thiobarbitursäurereaktiven Substanzen ließ sich mit Hilfe eines mitgeführten Standards aus 1.1.3.3.-Tetraethoxypropan in Essigsäure berechnen.


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2.6. Parameter des Mechanogramms

Aus dem Kraftsignal und dessen 1. Ableitung dienen folgende Parameter zur Charakterisierung von Kontraktion und Relaxation (Abb. 1):

PF

:

peak force (maximale Kontraktionsamplitude der Einzelkontraktion)

TPF

:

time to peak force (Dauer des Kraftanstiegs bis zum Erreichen von PF)

RT50

:

Relaxationszeit bis zum Erreichen von 50% von PF

RT97

:

Relaxationszeit bis zur Reduktion von F um 97% von PF

dF/dtmax

:

maximale Kraftanstiegsgeschwindigkeit aus der 1. Ableitung des Kraftsignals berechnet

dF/dtmin

:

maximale Kraftabfallgeschwindigkeit aus der 1. Ableitung des Kraftsignals berechnet

T(dF/dtmax)

:

Zeit bis zum Erreichen der maximalen Kraftanstiegsgeschwindigkeit

T(dF/dtmin)

:

Zeit bis zum Erreichen der maximalen Kraftabfallgeschwindigkeit


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Weitere errechnete Parameter waren:

(dF/dtmax)/PF, (dF/dtmin)/PF und ein "Vmax-äquivalent" als Ausdruck für die maximale lastfreie Verkürzungsgeschwindigkeit der Sarkomere, was mit der Geschwindigkeit des Kreubrückenzyklus korreliert [129].

Maximale postextrastimulatorische Potenzierungen entstanden durch Extrastimulationen mit einem Extrastimulationsintervall zwischen 180 ms und 500 ms zur vorhergehenden rhythmischen Stimulation. PEPmax ist die größte Potenzierung nach Extrastimulation relativ zur vorhergehenden rhythmischen Kontraktion. Nachpausenpotenzierungen entstanden durch Unterbrechen der rhythmischen Stimulation für eine Dauer von 7,5 bis 240 s. Das schrittweise Abklingen der Potenzierung von PEPmax während der Nachfolgekontraktionen wurde gemäß [99] berechnet:

.

Das Abklingen der Potenzierung nach Reizpausen (NPP) wurde ebenfalls nach [99] berechnet:

.

wobei PF die maximale Kraftamplitude der aktuellen rhythmischen Nachfolgekontraktion nach Intervention, PFC die maximale Kraftamplitude der letzten rhythmischen Kontraktion vor Intervention, PFPEP die maximale Kraftamplitude der 1. postextrastimulatorischen Kontraktion und PFNPP die maximale Kraftamplitude der 1. Nachpausenkontraktion bedeuten.

2.7. Statistische Analyse

Zur Angabe der Daten wurden die Mittelwerte und ihr mittlere Fehler (MW ± SEM) verwendet. Die statistische Analyse für die mechanischen Messungen erfolgte mit dem Wilcoxon-Test für abhängige und unabhängige Stichproben, die Signifikanzanalyse für die biochemischen Messungen mit dem Students- T-Test für unabhängige Stichproben mit ungleicher Varianz und Signifikanztests für die mechanischen Messungen unter dem Einfluß der Radikalfänger als ANOVA-Test mit dem Dunnett-Test als post-hoc-Test (Gruppe KR als Kontrolle) nach vorhergehender Untersuchung auf Varianzinhomogenität mittels Levene-Test. Statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,05) sind in den Abbildungen und Tabellen durch * gekennzeichnet.


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Tabelle 1: Zusammenfassung der durchgeführten Versuchsserien

Bezeichnung

n

Durchführung

Fragestellung

HK

17

humane Vorhoftrabekel, 31 °C, 5 mM K+, Hypoxie und Reoxygenierung

kontraktile Funktion humanen Vorhofmyokards während Hypoxie und Reoxygenierung

HH

15

humane Vorhoftrabekel, 31 °C, 30 mM K+, Hypoxie und Reoxygenierung

Einfluß erhöhter K+-Konzentration während Hypoxie und Reoxygenierung als weiterer Aspekt der Ischämie

HSI

16

humane Vorhoftrabekel, 31 °C, 30 mM K+, simulierte Ischämie (Hypoxie+Azidose) und Reoxygenierung

Einfluß der Azidose als Aspekt der Ischämie auf die kontraktile Funktion während Hypoxie und Reoxygenierung

RH

15

Rattenpapillarmuskeln, 31 °C, 5 mM K+, Hypoxie und Reoxygenierung

kontraktile Funktion von Rattenmyokard während Hypoxie und Reoxygenierung

RSI

12

Rattenpapillarmuskeln, 31 °C, 30 mM K+, simulierte Ischämie (Hypoxie+Azidose) und Reoxygenierung

Einfluß von Azidose und erhöhter K+-Konzentration als Aspekte der Ischämie während Hypoxie auf Rattenmyokard

SO

9

scheinoperierte Ratten, 31 °C, 5 mM K+, Hypoxie und Reoxygenierung

Kontrollgruppe zu den Ratten mit chronischem Myokardinfarkt

CI

10

Ratten mit chronischem Infarkt, 31 °C, 5 mM K+, Hypoxie und Reoxygenierung

Einfluß von Hypoxie und Reoxygenierung auf die kontraktile Funktion von hypertrophiertem Myokard nach Infarkt

KR

6

Rattenpapillarmuskeln, 37 °C, 5 mM K+, Hypoxie und Reoxygenierung

Kontrollgruppe zu den Versuchen mit Radikalfängern in Hypoxie und Reoxygenierung

BHTR

6

Rattenpapillarmuskeln, 37 °C, 5 mM K+, Hypoxie und Reoxygenierung, Zusatz des Hydroxylradikalfängers BHT

Bedeutung der Hydroxylradikale für die kontraktile Funktion während Hypoxie/Reoxygenierung, mögliche Kardioprotektion

HisR

6

Rattenpapillarmuskeln, 37 °C, 5 mM K+, Hypoxie und Reoxygenierung, Zusatz des 1O2-Fängers Histidin

Bedeutung von Singlet-Sauerstoff für die kontraktile Funktion während Hypoxie/Reoxygenierung, mögliche Kardioprotektion

BHR

6

Rattenpapillarmuskeln, 37 °C, 5 mM K+, Hypoxie und Reoxygenierung, Zusatz von BHT und Histidin

Kardioprotektion während Hypoxie/ Reoxygenierung durch Kombination antiradikalisch wirksamer Pharmaka mit verschiedenen Angriffspunkten

(Hypoxie und Reoxygenierung dauerten jeweils 30 min.)


Fußnoten:
<1>

Infarktinduktion und Scheinoperation durch Herrn Dr. Stauß, Physiologisches Institut der Charité.

<2>

Messung durch Herrn Dr. Vetter aus dem Max-Delbrück-Centre für Molekulare Medizin, Berlin-Buch.

<3>

Messung durch Herrn Prof. Schimke aus der Medizinischen Klinik I der Charité.


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