Wagner , Kay-Dietrich: Thema: "Effekte von Hypoxie und Reoxygenierung auf die kontraktile Funktion von humanen Vorhoftrabekeln und Rattenpapillarmuskeln - Möglichkeiten der Protektion"

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Kapitel 3. Ergebnisse

3.1. Effekte von Hypoxie, simulierter Ischämie und Reoxygenierung auf die kontraktile Funktion von humanen Vorhoftrabekeln und Rattenpapillarmuskeln

Einfluß erhöhter K+-Konzentration auf das isometrische Mechanogramm von humanen Vorhoftrabekeln und Rattenpapillarmuskeln

Der Anstieg der extrazellulären K+-Konzentration von 5 auf 30 mM erfolgte zur Simulation eines weiteren Aspektes der Ischämie zusammen mit dem O2-Mangel. Dadurch verschwand in dieser experimentellen Phase die zeitweilige Spontanaktivität insbesondere der Vorhoftrabekel. Durch den K+-Anstieg nahm PF der isometrischen Kontraktionen der humanen Vorhoftrabekel (gemeinsame Gruppe HH und HSI) und der Rattenpapillarmuskeln (Gruppe RSI) bei der erforderlichen größeren Reizstärke signifikant zu (Tabelle 2). Ein signifikanter Anstieg der Kontraktionsgeschwindigkeit zeigte sich nur in RSI. Extrazelluläre K+-Zunahme verlangsamte in der gemeinsamen Gruppe humaner Vorhoftrabekel (HH, HSI) die Relaxation. Dabei war die späte Relaxation zwischen RT50 und RT97 besonders deutlich verzögert.

In RSI kam es dagegen bei 30 mM gegenüber 5 mM K+ zu einer signifikant schnelleren frühen Relaxation, während die Spätphase nicht signifikant beeinflußt war.

Tabelle 2: Parameter des isometrischen Mechanogramms von humanen Vorhoftrabekeln und Rattenpapillarmuskeln unter dem Einfluß erhöhter extrazellulärer K+-Konzentration

Parameter

humane Vorhoftrabekel

(n=39)

Rattenpapillarmuskeln

(n=15)

 

5 mM K+

30 mM K+

5 mM K+

30 mM K+

PF (mN)

6,11 ± 0,81

7,12 ± 0,89***

4,17 ± 0,92

5,39 ± 1,06*

(dF/dtmax)/PF (1/s)

9,53 ± 0,21

9,85 ± 0,19

12,10 ± 0,43

13,05 ± 0,39***

TPF(ms)

199,9 ± 3,4

199,3 ± 2,6

158,7 ± 5,4

145,6 ± 4,7***

(dF/dtmin)/PF (1/s)

4,53 ± 0,19

4,19 ± 0,17***

7,10 ± 0,32

7,56 ± 0,37*

RT50 (ms)

151,0 ± 4,4

160,2 ± 5,1***

100,7 ± 5,8

88,9 ± 4,4**

RT97-RT50 (ms)

227,8 ± 15,0

272,4 ± 16,4***

157,4 ± 10,0

171,6 ± 6,8

* symbolisiert signifikante Unterschiede mit * p<0,05; ** p<0,01 bzw. *** p<0,005 zwischen einem Parameter gemessen bei extrazellulärer K+-Konzentration von 5 mM und bei 30 mM.


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Abb. 2: Zeitlicher Verlauf von pH und pO2 während Hypoxie, simulierter Ischämie und Reoxygenierung (n=6)

Kontraktile Funktion von humanen Vorhoftrabekeln während Hypoxie, simulierter Ischämie und Reoxygenierung

Die humanen Vorhoftrabekel kontrahierten 30 min bei zunehmender Hypoxie (N2-Perfusion, Gruppe HH) und 30 mM K+ sowie 30 min während simulierter Ischämie, durch Kombination der Hypoxie mit extrazellulärer Acidose und 30 mM K+ (Perfusion mit 95 % N2 + 5 % CO2, Gruppe HSI). Anschließend erfolgte die schnelle Reoxygenierung in HH und HSI mit einer langsamen Korrektur der Azidose in HSI während 30 min (Abb. 2). Die insgesamt 31 Trabekel aus beiden Gruppen zeigten vor diesen experimentellen Eingriffen vergleichbare Präparatmerkmale und vergleichbare Charakteristika der rhythmischen isometrischen Kontraktionen (Tabelle 3). Deshalb konnten die in Hypoxie, simulierter Ischämie und anschließender Reoxygenierung


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auftretenden funktionellen Veränderungen auf die normoxischen Kontrollwerte (= 1) normiert werden.

Tabelle 3: Charakteristik humaner Vorhoftrabekel und deren rhythmischer isometrischer Kontraktionen unter aeroben Kontrollbedingungen.

Gruppe

HH (n=15)

HSI (n=16)

Patientenalter (Jahre)

57,07 ± 3,52

55,95 ± 2,60

Trabekellänge (mm)

5,49 ± 0,30

5,09 ± 0,30

Trabekeldurchmesser (mm)

0,65 ± 0,04

0,65 ± 0,03

Charakteristik isometrischer Kontraktionen unter aeroben Bedingungen

PF (mN)

6,89 ± 0,91

9,43 ± 1,39

(dF/dtmax)/PF (1/s)

9,49 ± 0,32

9,97 ± 0,24

TPF (ms)

199,38 ± 5,26

195,47 ± 3,27

(dF/dtmin)/PF (1/s)

3,87 ± 0,21

3,98 ± 0,24

RT50 (ms)

169,63 ± 9,54

162,00 ± 6,72

In Gruppe HH führte die Hypoxie trotz schnellem pO2-Abfall zu einem initialen Anstieg von PF, der von einem steilen Abfall von PF auf ca. 15 % der aeroben Kontrolle gefolgt war (Abb. 3A-E). Der Anstieg von (dF/dtmax)/PF bedeutet, daß PF stärker abnahm als die maximale Kontraktionsgeschwindigkeit. Der starke Abfall von PF kann teilweise durch eine verringerte Zeit für die Kraftentwicklung erklärt werden, was sich an der verkürzten TPF am Ende der Hypoxie zeigt. Nach ca. 15 min Hypoxiedauer erreichte die Relaxationsgeschwindigkeit ein Minimum sichtbar an der verminderten (dF/dtmin)/PF und an der verlängerten RT50. Zusammen mit der verlängerten TPF ergibt sich ein verzögertes Einsetzen der Relaxation, d.h. es traten Kontraktionen mit einem verlängerten mehr tonischen Kraftanstieg auf. Am Ende der Hypoxie war die Relaxation gegenüber der normoxischen Kontrolle nicht signifikant beeinflußt. Die maximale Relaxationsgeschwindigkeit war weniger verringert als PF, so daß sich bei nahezu unveränderter RT50 eine erhöhte (dF/dtmin)/PF ergab.

Humane Vorhoftrabekel (Gruppe HK) kontrahierten als Kontrolle und Vergleich gegenüber 30 mM K+ bei 5 mM K+ während identischer Hypoxie und Reoxygenierung. Die relative Änderung der kontraktilen Funktion (aerobe Kontrolle jeweils = 1) zeigte dabei keinen signifikanten Einfluß der erhöhten K+-Konzentration (nicht dargestellt), so daß die weiteren Untersuchungen an humanen Vorhoftrabekeln und Rattenpapillarmuskeln zu Hypoxie, simulierter Ischämie und Reoxygenierung bei einer extrazellulären K+-Konzentration von 30 mM durchgeführt werden konnten.


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Abb. 3: Charakteristik von isometrischen Kontraktionen humaner Vorhoftrabekel während Hypoxie (n = 15), simulierter Ischämie (n = 16) und Reoxygenierung. Die Parameter wurden auf die aeroben Kontrollwerte normiert. * symbolisiert p<0,05 zwischen den Gruppen, + symbolisiert p<0,05 gegenüber dem aeroben Kontrollwert der gleichen Gruppe.


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Nach Beginn der Reoxygenierung stieg PF kontinuierlich 15 min lang an und erreichte dann an stabiles Niveau von ca. 64 % des normoxischen Niveaus. TPF nahm zu und (dF/dtmax)/PF ab, ein Hinweis auf eine verlängerte Kontraktion entstand durch TPF-Zunahme und (dF/dtmax)/PF-Abnahme. Innerhalb weniger Minuten der Reoxygenierung entstand eine langsamere Relaxation, sichtbar an der Abnahme von (dF/dtmin)/PF und der Zunahme von RT50.

In HSI zeigten sich bei der schnellen Abnahme von pO2 und pH während Hypoxie/Acidose (simulierte Ischämie) ähnliche und auch unterschiedliche Effekte im Vergleich zu der Hypoxie in HH. Die vorübergehende Zunahme von PF vor der


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Abnahme auf ca. 6 % der Kontrolle war in keinem Experiment zu beobachten. Die Kontraktionsgeschwindigkeit verhielt sich ähnlich wie in HH, dagegen verlief die Relaxation in der mittleren Phase der simulierten Ischämie eher schneller.

Auch schnelle Reoxygenierung und die gleichzeitig verzögerte pH-Korrektur modifizierten teilweise die Effekte im Vergleich zu HH. PF erholte sich mehr verzögert, erreichte jedoch nach 20 min Reoxygenierung das Kontrollniveau. Die Kontraktionsgeschwindigkeit sank. Nach anfänglicher Zunahme blieb TPF kürzer als in HH. Die verzögerte Abnahme der Relaxationsgeschwindigkeit korrespondierte mehr mit der langsamen pH-Korrektur als mit dem schnellen pO2-Anstieg, was erst spät zu einem ähnlichen Niveau wie in HH führte.

Abb. 4. PEPmax. Die optimalen Intervalle zur Erzielung der PEPmax sind unterhalb der Säulen dargestellt. Die Potenzierung wird als Verhältnis der Amplitude der potenzierten Kontraktion zur Amplitude der vorhergehenden rhythmischen Kontraktion ausgedrückt. + symbolisiert p<0,05 vs. der aeroben Kontrolle und * p<0,05 vs. HSI.

Kraft-Intervall-Beziehungen

Um die Rolle des sarkoplasmatischen Retikulums für die Aufnahme, Speicherung und Freisetzung von Ca2+ zu charakterisieren, nutzten wir das Ausmaß von Potenzierungen nach Extrastimulation und nach Pausen sowie das Abklingen der Potenzierungen. Die maximalen postextrastimulatorischen Potenzierungen (PEPmax) entstanden nach einem Intervall zwischen vorhergehender rhythmischer Kontraktion und Extrakontraktion von 500 ms in der aeroben Kontrolle (n = 16) sowie nach Reoxygenierung in HH (n = 15) und HSI (n = 16), von 300 ms in Hypoxie (n = 15) und von 200 ms in simulierter Ischämie (n = 16, Abb. 4). PEPmax betrug in der aeroben Kontrolle 1,25. In HH nahm PEPmax während Hypoxie gegenüber dem Kontrollwert zu und kehrte nach Reoxygenierung zum Kontrollniveau zurück. Während der simulierten Ischämie trat die


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höchste PEPmax auf, während nach Reoxygenierung eine PEPmax-Verminderung zu beobachten war.

Die NPP nach Pausen zwischen 7,5 s und 120 s sind in Abb. 5 dargestellt. Sie nahmen unter aeroben Bedingungen abhängig von der Pausendauer bis zu einem Wert von ca. 1,35 nach 60 s zu. In der Hypoxie kam es nach einer Reizpause von 120 s zu einer Zunahme der NPP auf das 3,5-fache und in simulierter Ischämie sogar auf das 8-fache gegenüber der Amplitude der vorangehenden rhythmischen Kontraktion. In beiden Gruppen trat nach Reoxygenierung ein Verlust der Potenzierung in Abhängigkeit von der Pausendauer auf , was in SI schon nach kürzeren Pausen der Fall war.

Abb. 5: Nachpausenpotenzierungen in Abhängigkeit von der Pausendauer bei aerober Kontrolle, nach 30 min Hypoxie (HH) bzw. 30 min simulierter Ischämie und 30 min Reoxygenierung. Die Potenzierung wird als Verhältnis der Amplituden von Nachpausen-kontraktionen zu rhythmischen Kontraktionen vor der Pause ausgedrückt. * symbolisiert p<0.05 zwischen 2 Gruppen und + p<0.05 versus der vorhergehenden Pause der gleichen Gruppe.

Während der frühen Reoxygenierung in HH (Abb. 6A) und der späteren Reoxygenierung in HSI (Abb. 6B) beobachteten wir das Auftreten von Spontanaktivität und zeitweise ein Alternieren von PF der rhythmischen Kontraktionen, was als mechanischer Alternans beschrieben ist, verbunden mit einem temporären Anstieg der Ruhespannung und einer verzögerten Relaxation der Einzelkontraktion. Dabei war der mechanische Alternans typischerweise mit einem Alternieren der Relaxationsgeschwindigkeit gekoppelt (Abb. 6).


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Abb. 6: Originalregistrierung isometrischer Kontraktionen nach 5 min Reoxygenierung in HH (A) und 20 min Reoxygenierung in Gruppe HSI (B).

Um das Ausmaß der Lipidperoxidation nach Reoxygenierung in diesem Modell zu bestimmen, wurden in den Papillarmuskeln von Gruppe HH im Vergleich zur aeroben Kontrolle die TBARS-Konzentrationen bestimmt. Dabei zeigten sich signifikant höhere TBARS-Konzentrationen nach Reoxygenierung im Vergleich zur Kontrolle (0,57 ± 0,05 nmol/mg prot, n = 11 vs. 0,39 ± 0,05 nmol/mg prot, n = 14, p < 0,05).

Effekte von Hypoxie, simulierter Ischämie und Reoxygenierung die kontraktile Funktion von Rattenpapillarmuskeln

Die Rattenpapillarmuskeln kontrahierten im Anschluß an die aeroben Kontrollbedingungen während 30 min Hypoxie (N2-Perfusion, Gruppe RH) in einer Badlösung mit 5 mM K+ bzw. während 30 min simulierter Ischämie (Perfusion mit 95 % N2 + 5 % CO2, 30 mM K+, Gruppe RSI). Anschließend erfolgte die Reoxygenierung während 30 min mit schnellem pO2-Anstieg und langsamer Korrektur der Azidose und weiterhin erhöhter extrazellulärer K+-Konzentration. Die normoxischen Kontrollwerte sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Effekte von Hypoxie, simulierter Ischämie und Reoxygenierung auf die kontraktile Funktion sind auf die aerobe Kontrolle normiert worden (Kontrolle = 1).

Der schnelle pO2-Abfall führte in beiden Gruppen zu einer schnellen Abnahme von PF, die in den ersten 10 min der Hypoxie in RSI langsamer als in RH verlief (Abb. 7A-F). In der späteren Hypoxiephase war die Abnahme von PF in RH gegenüber RSI verringert.


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Abb. 7: Charakteristik rhythmischer isometrischer Kontraktionen von Rattenpapillarmuskeln während Hypoxie (RH, n = 15), simulierter Ischämie (RSI, n = 12) und Reoxygenierung. Die Parameter wurden auf die aeroben Kontrollwerte normiert. * symbolisiert p<0,05 zwischen den Gruppen, + symbolisiert p<0,05 gegenüber dem aeroben Kontrollwert der gleichen Gruppe.


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Generell zeigte sich in beiden Gruppen eine stärkere Hypoxieempfindlichkeit von PF im Vergleich zu den humanen Vorhoftrabekeln. Nach 30 min Hypoxie war PF in RH auf 8 % und in RSI auf 1 % der aeroben Kontrollwerte abgesunken. Der Anstieg von (dF/dtmax)/PF weist wiederum darauf hin, daß PF stärker beeinflußt war als dF/dt. In der

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ersten Phase der Hypoxie traten in RH bei geringerer PF höhere Werte für (dF/dtmax)/PF gegenüber RSI auf. Im zweiten Teil der Hypoxie zeigte sich ein höheres (dF/dtmax)/PF bei kleinerer PF in RSI gegenüber RH. Beide Befunde stützen die Annahme, daß es sich in Hypoxie und simulierter Ischämie nicht um eine Zunahme der Kontraktionsgeschwindigkeit handelt, sondern daß die unterschiedliche Beeinflussung von (dF/dtmax)/PF hauptsächlich Ausdruck des unterschiedlichen Abfalles von PF ist. Der starke Rückgang von PF ergibt sich teilweise durch eine verringerte Zeit von TPF, die für die Kraftentwicklung zur Verfügung stand. Die Bedeutung von TPF für die entwickelte PF ist besonders in der ersten Phase der Hypoxie gut sichtbar, wo eine signifikant niedrigere TPF an eine verminderte PF in RH im Vergleich zu RSI gekoppelt ist. In der Anfangsphase der Hypoxie war die frühe Relaxation in beiden Gruppen nicht wesentlich beeinflußt. In beiden Gruppen zeigte sich in diesem Zeitabschnitt eine deutliche Verlängerung der späten Relaxation (Zunahme von RT97-RT50 gegenüber den aeroben Kontrollwerten), die nur in Gruppe RSI in der zweiten Phase der simulierten Ischämie zurückging. Die maximale Relaxationsgeschwindigkeit war am Ende der Hypoxie in RSI weniger reduziert als die zugehörige PF, so daß (dF/dtmin)/PF wuchs.

Der Einfluß der Hypoxie auf die Aktionspotentialcharakteristik ist in Abb. 8 dargestellt.

Abb. 8: Simultanregistrierung von isometrischen Kontraktionen (F) und Aktionspotentialen (AP) während Hypoxie (1. - 20. Minute).


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In der frühen Hypoxiephase war das Ruhemembranpotential vorübergehend relativ depolarisiert. Im weiteren Verlauf der Hypoxie kam es zu einer zunehmenden Aktionspotentialverkürzung bei weitgehend unbeeinflußtem Ruhemembranpotential. In der späten Hypoxiephase depolarisierten die Zellen verstärkt, dabei nahm die AP-Amplitude ab und die AP-Dauer war verkürzt. Bei einzelnen Myozyten führte die Membrandepolarisation zur vollständigen Unerregbarkeit.

Nach Beginn der schnellen Reoxygenierung stieg PF in beiden Gruppen sehr verzögert an (Abb. 7). Die Erholung von PF erfolgte in RH in den ersten 15 min der Reoxygenierung signifikant schneller als in RSI. In beiden Gruppen trat ein reversibler Anstieg der Grundspannung auf (Abb. 9). Am Ende der Reoxygenierung wurde in beiden Gruppen ein stabiles Niveau von ca. 30% von PF der aeroben Kontrolle erreicht. Als Zeichen einer verlängerten Kontraktion war eine Zunahme von TPF und eine Abnahme von (dF/dtmax)/PF sichtbar, die allerdings in RSI am Ende der Reoxygenierung signifikant deutlicher als in RH auftrat.

In RH verlangsamte die Reoxygenierung die gesamte Relaxation (Abnahme von (dF/dtmin)/PF, Zunahme von RT50 und RT97-RT50). Die initial höhere (dF/dtmin)/PF in RSI bei hoher RT50 weist auf eine verlangsamte Relaxation bei noch deutlich verminderter PF gegenüber RH hin. Die späte Relaxation war in RSI zu Beginn der Reoxygenierung gegenüber der aeroben Kontrolle wenig beeinflußt. Am Ende der Reoxygenierung zeigte sich in beiden Gruppen eine verringerte (dF/dtmin)/PF, eine verlängerte RT50 und RT97-RT50 im Vergleich zur aeroben Kontrolle als Ausdruck der geschädigten Relaxation.

Die verkürzte Aktionspotentialdauer nach Hypoxie war während Reoxygenierung zumindest teilweise reversibel, wobei eine deutliche AP-Verlängerung gegenüber Hypoxie erst in der späten Reoxygenierung auftrat.


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Abb. 9: Simultanregistrierung von isometrischen Kontraktionen (F) und Aktionspotentialen (AP) während Reoxygenierung.

Kraft-Intervall-Beziehungen

PEPmax entstand nach einem Extra- Reizintervall zwischen vorhergehender rhythmischer Kontraktion und Extrakontraktion von 250 ms in der aeroben Kontrolle mit 5 mM extrazellulärem K+ (RK5) und 30 mM K+ (RK30), von 180 ms in Hypoxie (RH), 400 ms in simulierter Ischämie (RSI), 300 ms in Reoxygenierung nach Hypoxie (ReoxRH) und 250 ms in Reoxygenierung nach simulierter Ischämie (ReoxRSI) (Abb. 10).

Abb. 10. PEPmax. Die optimalen Intervalle zur Erzielung der PEPmax sind unterhalb der Säulen dargestellt. Die Potenzierung wird als das Verhältnis der Amplitude der potenzierten Kontraktion zur Amplitude der vorhergehenden rhythmischen Kontraktion ausgedrückt. + symbolisiert p<0.05 vs. der aeroben Kontrolle und * p<0.05 vs. RH.


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Die Potenzierungen der postextrastimulatorischen Kontraktionen waren unter aeroben Kontrollbedingungen mit 5 mM bzw. 30 mM extrazellulärer K+-Konzentration nicht signifikant verschieden. In der Reoxygenierung nach simulierter Ischämie trat eine Zunahme der PEPmax gegenüber der Reoxygenierung nach Hypoxie und der aeroben Kontrolle auf (Abb. 10).

Das Aktionspotential in Gruppe RH war nach Extrareizung gegenüber den AP's bei rhythmischer Stimulation verlängert. Die Verlängerung betraf hauptsächlich die APD50 ohne daß die APD90 verändert wurde (Abb. 11).

Abb. 11: Simultanregistrierung vonisometrischen Kontraktionen (F) und Aktionspotentialen (AP) im Rattenpapillarmuskel bei 5 mmol/l extrazellulärer K+-Konzentration unter aeroben Bedingungen bei rhythmischer (a) und Extra-Stimulation (b).

Abb. 12: Nachpausenpotenzierungen in Abhängigkeit von der Pausendauer bei aerober Kontrolle mit einer extrazellulären K+-Konzentration von 5 mM (RK5) und 30 mM (RK30), nach 30 min Hypoxie (RH) und 30 min Reoxygenierung nach Hypoxie (REOXRH) bzw. simulierter Ischämie (REOXRSI). Die Potenzierung wird als Verhältnis der Amplitude von Nachpausenkontraktion zur Kontraktion vor der Pause ausgedrückt. *symbolisiert p<0,05 zwischen RK5 und RK30 und + p<0,05 versus der aeroben Kontrolle der gleichen Gruppe.


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Die NPP erreichten pausenabhängig unter aeroben Kontrollbedingungen bei 5 mM K+ in der Badlösung einen Wert von 1,93 (Abb. 12). Bei 30 mM K+ trat die NPPmax bereits nach 30 s Pausendauer mit einem Wert von 1,33 auf. In der Hypoxie entstand bei 5 mM K+ eine NPPmax von 3,37. Die in Reoxygenierung nach Hypoxie und simulierter Ischämie auftretenden NPP normiert auf die vorhergehende rhythmische Kontraktion unterschieden sich nicht von den unter aeroben Kontrollbedingungen gemessenen NPP.

Abb. 13: Simultanregistrierung von isometrischen Kontraktionen (F) und Aktionspotentialen (AP) im Rattenpapillarmuskel bei 5 mM extrazellulärer K+-Konzentration unter aeroben Bedingungen bei rhythmischer Stimulation (a) und nach 120 s Reizpause (b).

Die Aktionspotentialdauer nach Reizpausen war im Vergleich zu der vorhergehender Aktionspotentiale bei rhythmischer Stimulation pausenabhängig verlängert. Im Gegensatz zur AP-Verlängerung bei Extrastimulation ist die Verlängerung nach Reizpausen durch eine verzögerte späte Repolarisation bedingt (Abb. 13)

3.2. Kontraktile Funktion und biochemische Parameter von hypertrophiertem Myokard der Ratte mit chronischem Infarkt im Vergleich zu Myokard nach Scheinoperation

Tabelle 4 zeigt die Charakteristik der Tiere, der linksventrikulären Papillarmuskeln, die Parameter der rhythmischen isometrischen Kontraktionen und die Aktionspotentialcharakteristik unter aeroben Kontrollbedingungen von Ratten mit chronischem Myokardinfarkt und von scheinoperierten Tieren. Das Ventrikelgewicht und das Verhältnis von Ventrikelgewicht zu Körpergewicht waren 6 Wochen nach Myokardinfarkt im Vergleich zu den scheinoperierten Tieren als Ausdruck der Hypertrophieentwicklung signifikant erhöht. Der Durchmesser der linksventrikulären Papillarmuskeln in CI war ebenfalls signifikant höher als der Durchmesser der


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Papillarmuskeln in SO. Somit repräsentieren auch die Papillarmuskeln hypertrophiertes Myokard als Folge eines chronischen Myokardinfarktes.

Tabelle 4: Scheinoperation (SO) versus chronischer Myokardinfarkt (CI). Charakteristik der Tiere (A), linksventrikulärer Papillarmuskeln (B), der Parameter isometrischer rhythmischer Kontraktionen (C) und der Aktionspotentiale (D) unter aeroben Kontrollbedingungen.

A

 

 

 

 

Gruppe

 

SO (n=9)

CI (n=10)

p<

Körpergewicht (KG)

g

344,0 ± 14,63

351,0 ± 9,80

 

Ventrikelgewicht (VG)

g

1,060 ± 0,036

1,476 ± 0,103

0,05

VG/KG

mg/g

3,12 ± 0,08

4,27 ± 0,40

0,05

B

 

 

 

 

Länge

mm

4,61 ± 0,43

4,32 ± 0,33

 

Durchmesser

mm

0,75 ± 0,05

1,01 ± 0,08

0,05

50% der Vorlast für Fmax

mN

3,87 ± 0,17

4,32 ± 0,47

 

C

 

 

 

 

PF

mN

5,77 ± 0,92

5,75 ± 1,24

 

(dF/dtmax)/PF

1/s

12,67 ± 0,35

10,68 ± 0,25

0,001

“Vmax - Äquivalent“

1/s

171,94 ± 7,91

138,64 ± 10,16

0,05

T(dF/dtmax)

ms

69,78 ± 1,90

87,60 ± 3,59

0,01

TPF

ms

146,44 ± 4,71

173,20 ± 4,33

0,01

(dF/dtmin)/PF

1/s

7,80 ± 0,46

7,07 ± 0,27

 

(dF/dtmin)/F

1/s

12,82 ± 0,99

12,49 ± 0,71

 

RT50

ms

90,22 ± 4,73

100,80 ± 3,09

0.1

RT97-RT50

ms

102,44 ± 7,72

109,20 ± 8,10

 

D

 

 

 

 

AP Amplitude

mV

118 ± 6

92 ± 6

0,02

APD25

ms

14 ± 2

44 ± 6

0,01

APD50

ms

24 ± 4

72 ± 7

0,01

APD90

ms

177 ± 10

254 ± 12

0,01


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Kontraktile Funktion unter aeroben Bedingungen

Die isometrische Kraftentwicklung war unter aeroben Kontrollbedingungen in CI und SO vergleichbar (Tabelle 4). Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit erwiesen sich nach chronischem Myokardinfarkt im Vergleich zu den scheinoperierten Tieren als vermindert. Das Vmax-äquivalent als Ausdruck für die maximale lastfreie Verkürzungsgeschwindigkeit, das mit der Geschwindigkeit des Kreuzbrückenzyklus korreliert [129], war in den hypertrophierten Papillarmuskeln in CI ebenfalls signifikant verringert. Aktionspotentiale von 12 Zellen in den 9 Papillarmuskeln in SO und von 18 Zellen in den 10 Papillarmuskeln in CI wurden gemessen. Die Aktionspotentialdauer war in allen Abschnitten der Repolarisation in Gruppe CI gegenüber SO signifikant länger.

Kraft-Intervall-Beziehungen

Zur Charakterisierung des Exzitations-Kontraktionszyklus im hypertrophierten Myokard wurden Kraft-Intervall-Beziehungen als “experimentelle Werkzeug“ verwendet.

Abb. 14: PEPmax (A) und NPP nach 120 s Pausendauer (B) in der scheinoperierten Gruppe (SO, n = 9) und in der Gruppe mit chronischem Infarkt (CI, n = 10). Die optimalen Intervalle zur Erzielung der PEPmax sind unterhalb der Säulen dargestellt. Die Potenzierungen der postextrastimulatorischen Kontraktionen und Nachpausenkontraktionen wird als das Verhältnis der Amplituden der potenzierten Kontraktionen zu Amplituden der vorhergehenden rhythmischen Kontraktionen ausgedrückt. + symbolisiert p<0,05 gegenüber der aeroben Kontrolle.


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Die maximale postextrastimulatorische Potenzierung trat in SO nach einem Intervall von 200 ms zwischen rhythmischer Kontraktion und Extrakontraktion und in CI nach einem Intervall von 300 ms auf (Abb. 14A). Das Ausmaß der PEPmax war nicht signifikant verschieden zwischen CI und SO. Die Amplituden der Nachpausenpotenzierungen nach 120 s Pausendauer, normiert auf die Amplitude der vorhergehenden rhythmischen Kontraktion, war in CI 2,5 gegenüber 3,0 in SO, allerdings ohne statistische Signifikanz (Abb. 14B). Das Abklingen der Potenzierung der Nachpausenkontraktionen von Kontraktion zu Kontraktion verlief in CI signifikant schneller im Vergleich zu SO (Abb. 15).

Abb. 15: Abklingen der Potenzierung der Nachpausenkontraktionen nach einer Pause von 120 s. A: Die Potenzierung wurde auf die vorhergehende rhythmische Kontraktion normiert. B: Das Abklingen der Potenzierung wurde nach der von Urthaler [99] angegebenen Formel berechnet. * symbolisiert p<0,05 zwischen den Gruppen, + p<0,05 in einer Gruppe zwischen aerober Kontrolle und Reoxygenierung.

Eine Erhöhung der Stimulationsfrequenz von 0,5 Hz auf 1,0 Hz bewirkte nach der 20. Kontraktion in CI einen signifikant positiv inotropen Effekt (PF1Hz/PFo,5Hz: 1,11±0,05), der in SO (PF1Hz/PF0,5Hz: 0,99±0,03) nicht auftrat.


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Oxalat-stimulierte Ca2+-Aufnahme

Die Kalziumtransportaktivitäten des SR von hypertrophiertem linksventrikulärem Myokard nach chronischem Infarkt und von linksventrikulärem Myokard nach Scheinoperation sind in Abb. 16. dargestellt. Die maximale proteinkinase-A-aktivierte Ca2+-Aufnahme war in CI im Vergleich zu SO um 26% reduziert. Bei Proteinkinase-A-Inhibition zeigte sich eine Reduktion der Ca2+-Aufnahme um 23% in CI versus SO. Das Verhältnis zwischen proteinkinase-A-aktivierter und proteinkinase-A-inhibierter Ca2+-Aufnahme in die SR-Vesikel war vergleichbar in CI und SO, was auf vergleichbare in vivo Phosphorylierung der SR Ca2+-ATPase im hypertrophierten Myokard nach Infarkt und im Myokard der scheinoperierten Tiere hinweist.

Abb. 16: Oxalat-stimulierte Ca2+-Aufnahme. A: Maximale proteinkinase-A-aktivierte Ca2+-Aufnahme im linksventrikulären Myokard der scheinoperierten Gruppe (SO, n = 9) und hypertrophiertem Myokard mit chronischem Infarkt (CI, n = 10). B: oxalat-stimulierte Ca2+-Aufnahme unter Inhibition der Proteinkinase A. * symbolisiert p<0,05 SO versus CI.

Das Kreatinkinasesystem

Die Gesamtaktivität der Kreatinkinase (CK) betrug in linksventrikulärem Myokard der Kontrollgruppe 10,2 ± 0,1 U/mg prot. Davon waren 21,3 ± 1,3 % mitochondrialer Anteil, 62,6 ± 1,7 % CK-MM, 15,4 ± 0,8 % CK-MB und 0,6 ± 0,1 % CK-BB. Das nach chronischem Infarkt hypertrophierte Myokard zeigte deutliche Veränderungen in der CK-Gesamtaktivität und in der Verteilung des Isoenzymmusters. Die Gesamtaktivität nahm im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant ab (Abb. 17). Der Anteil der mitochondrialen Isoform und der MM-Isoform war signifikant reduziert während die MB- und BB-Isoformen signifikante Zunahmen zeigten. Insgesamt entspricht die


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veränderte Isoenzymverteilung einer Erhöhung des B-Monomers bei Verminderung des M-Monomers der Kreatinkinase im hypertrophierten Myokard nach chronischem Infarkt.

Abb. 17: Das Kreatinkinasesystem im linksventrikulären Myokard der Kontrollgruppe (n = 6, weiße Balken) und der Gruppe mit chronischem Infarkt (n = 7, schwarze Balken). Darstellung der Kreatinkinasegesamtaktivität (CK) und der Kreatinkinaseisoenzyme. * symbolisiert p<0,05 Kontrolle versus CI.

Abb. 18: Aktivitäten der Superoxiddismutase (SOD) und Gluthationperoxidase (GSH-Px) im linksventrikulären Myokard der Kontrollgruppe (n = 5) und der Gruppe mit chronischem Infarkt (n = 12). * symbolisiert p<0,05 zwischen den Gruppen.


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Endogene antioxidative Kapazität und Malondialdehydkonzentration

Die für die antioxidative Kapazität der Zelle wesentlichen Enzymaktivitäten der Gluthationperoxidase (GSH-PX) und Superoxiddismutase (SOD) sind im linksventrikulären Myokard der Kontrollgruppe und der Gruppe mit chronischem Myokardinfarkt bestimmt worden.

Die SOD- und GSH-PX- Aktivitäten waren um 40 % bzw. 50 % in der Gruppe mit chronischem Infarkt gegenüber der Kontrollgruppe erhöht (Abb. 18). Der Malondialdehydgehalt als Zeichen für Lipidperoxidation war in der Kontrollgruppe (0,86 ± 0,12 nmol/mgE) und der Gruppe mit chronischem Myokardinfarkt (1.29 ± 0.20 nmol/mgE) statistisch nicht verschieden.

3.3. Effekte von Hypoxie und Reoxygenierung auf die kontraktile Funktion von Rattenpapillarmuskeln nach chronischem Infarkt und Scheinoperation

Der schnelle Abfall des pO2 nach Einsetzen der Hypoxie (Abb. 2) bewirkte in der scheinoperierten Gruppe (SO) einen raschen Abfall von PF (Abb. 19A-E). In CI trat nach 5 min Hypoxie ein signifikanter Kraftanstieg gegenüber dem normoxischen Kontrollwert auf. Im weiteren Verlauf der Hypoxie kam es wie in SO zu einer Abnahme von PF, die allerdings gegenüber SO in der ersten Phase der Hypoxie signifikant langsamer verlief. Im Zeitraum zwischen 15 und 30 min Hypoxie glich sich der Kraftabfall in CI dem in SO an. Nach 30 min Hypoxie war PF in SO auf 3 % und in CI auf 6% des normoxischen Kontrollwertes abgesunken. Die Zunahme von (dF/dtmax)/PF in beiden Gruppen während der Hypoxie ist ein Zeichen für eine geringere Abnahme der maximalen Kontraktionsgeschwindigkeit im Verhältnis zur starken Abnahme von PF. Der schnelle Abfall der isometrischen Kraftentwicklung während der Hypoxie ist teilweise auf eine kürzere Dauer der Kraftentwicklung zurückzuführen, was sich in der Abnahme von TPF widerspiegelt.

Die Relaxation war am Ende der Hypoxie nicht signifikant beeinflußt. Zwischen SO und CI bestanden keine nachweisbaren Unterschiede nach 30 min Hypoxie. In CI wurde in den ersten 10 min der Hypoxie eine zeitweilige Zunahme von (dF/dtmin)/PF im Vergleich zu den normoxischen Kontrollwerten gemessen, was ein Hinweis auf einen schnelleren Abfall von PF gegenüber dF/dtmin ist. Zusammen mit dem signifikant höheren PF in CI versus SO im ersten Abschnitt der Hypoxie ergibt sich für CI das Bild einer nahezu unbeeinflußten maximalen Relaxationsgeschwindigkeit in diesem Zeitabschnitt. In beiden Gruppen war die RT50 zeitweilig vermindert.


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Abb. 19: Charakteristik von isometrischen Kontraktionen linksventrikulärer Papillarmuskeln von scheinoperierten Ratten (SO, n = 9) und Tieren 6 Wochen nach experimentellem Myokardinfarkt (CI, n = 10) während Hypoxie und Reoxygenierung.
* symbolisiert p<0,05 CI versus SO, + p<0,05 gegenüber der aeroben Kontrolle


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Die Reoxygenierung führte innerhalb von 30 min in beiden Gruppen zu einem nahezu konstanten Wiederanstieg von PF auf 30 % des normoxischen Kontrollniveaus. Ein Anstieg der Ruhespannung, der vollständig reversibel war, trat in beiden Gruppen während der ersten Minuten der Reoxygenierung auf (CI: 1,70 ± 0,62 mN/mm2; SO: 1,89 ± 0.80 mN/mm2). Die Frühphase der Reoxygenierung induzierte einen raschen Abfall der Kontraktionsgeschwindigkeit, sichtbar am verminderten (dF/dtmax)/PF und der verlängerten TPF. Daraus ist ein mehr tonisches Ansteigen der Kraft zu erkennen. Am Ende der Reoxygenierung blieb die Kontraktionsgeschwindigkeit in SO signifikant stärker geschädigt als in CI.


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Die Relaxation zeigte ebenfalls kurze Zeit nach Beginn der Reoxygenierung deutliche Schädigungen in beiden Gruppen (vermindertes (dF/dtmax)/PF und verlängerte RT50). Während der weiteren Reoxygenierung kam es zur partiellen Normalisierung der Relaxation, wobei die Relaxationsgeschwindigkeit am Ende der Reoxygenierung in CI signifikant höher als in SO und auch nicht mehr verschieden vom normoxischen Ausgangswert war.

3.4. Einflüsse von Histidin und Butylhydroxytoluen auf die kontraktile Funktion von Rattenpapillarmuskeln während Hypoxie und Reoxygenierung

Die Einflüsse der Radikalfänger Butylhydroxytoluen (BHT) und Histidin (His) auf die kontraktile Funktion von Rattenpapillarmuskeln nach Hypoxie und Reoxygenierung sind untersucht worden, indem eine Kontrollgruppe (KR), eine mit BHT (BHTR), eine mit His (HisR) und eine mit BHT und His (BHR) behandelte Gruppe einer Hypoxie von 30 min und anschließender Reoxygenierung von ebenfalls 30 min ausgesetzt war. Die Pharmakazugabe in die Badlösung erfolgte 15 min vor Beginn der Hypoxie, um eine ausreichende Diffusion in die Papillarmuskeln zu gewährleisten und einen eventuellen Einfluß der Pharmaka auf die kontraktile Funktion unter aeroben Kontrollbedingungen sichtbar zu machen. Da unter Kontrollbedingungen keine signifikanten Unterschiede in den Parametern des isometrischen Mechanogramms auftraten, wurden die während Hypoxie und Reoxygenierung auftretenden funktionellen Veränderungen auf die normoxischen Kontrollwerte normiert (Abb. 20, Kontrolle=1).

In allen Gruppen war bis zum Ende der Reoxygenierung, sichtbar an der TPF, eine weitgehende Erholung der Kontraktionsgeschwindigkeit eingetreten. Zwischen der Kontrollgruppe und den mit BHT- bzw. His- oder deren Kombination behandelten Gruppen bestand kein signifikanter Unterschied. Die isometrische Kraftentwicklung erreichte in KR nach Reoxygenierung ca. 45 % des aeroben Kontrollwertes. Alle Pharmaka bewirkten eine Zunahme von PF gegenüber KR, wobei in Gegenwart der Kombination aus BHT und Histidin die deutlichste Normalisierung auftrat.

Die Beschreibung der Relaxation erfolgte durch die Parameter RT50 und RT90, die auf aerobe Kontrollwerte normiert sind (Abb. 21).

Die frühe Relaxation war am Ende der Reoxygenierung in der BHT-behandelten Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe verlängert. Die späte Relaxation wurde durch die Pharmakazusätze nicht beeinflußt, so daß sich insgesamt eine normalisierende Wirkung der Radikalfänger auf PF ergab, ohne daß die Kontraktionsgeschwindigkeit oder die Relaxation signifikant beeinflußt wurden.


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Abb. 20: Normierte Maximalkraft (PF) und ihre Anstiegsdauer (TPF) von Papillarmuskelkontraktionen nach 30 min Hypoxie und 30 min Reoxygenierung der Kontrollgruppe (KR), mit BHT- (BHTR), mit His- (HisR) und mit BHT+His- (BHR) behandelter Gruppen. Die Parameter wurden auf die aeroben Ausgangswerte normiert. * symbolisiert p<0,05 gegenüber der Kontrollgruppe.

Abb. 21: Relaxationszeiten (RT50 und RT90) nach 30 min Hypoxie und 30 min Reoxygenierung von Papillarmuskelkontraktionen der Kontrollgruppe (KR), mit BHT- (BHTR), mit His- (HisR) und mit BHT+His- (BHR) behandelter Gruppen. Die Parameter wurden auf die aeroben Ausgangswerte normiert. * symbolisiert p<0,05 gegenüber der Kontrollgruppe.


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