Weber, Holm: ”Optimierung der Glaswollefiltration von menschlichen Ejakulaten zum Zwecke der assistierten Reproduktion und für labordiagnostische Untersuchungen“

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Kapitel 3. Patienten und Untersuchungsmethoden

3.1. Patientenauswahl

Genutzt werden konnten Ejakulate konsekutiver Patienten der andrologischen Ambulanz. Für den Vorversuch ergab sich ein Umfang von 10, für den Hauptversuch von 30 Patienten. Der Aufgabenstellung entsprechend, erfolgte eine Einschränkung der verarbeitbaren Ejakulate nur in Hinsicht auf ihre Zelldichte, Motilität und Konsistenz. Grundvoraussetzung war dabei ein ausreichendes Restvolumen nach Routinediagnostik von 500µl. Zur Filtration geeignet waren Samenmuster mit einer Zelldichte >5 Millionen/ml und einer Gesamtmotilität >20 %. Ausschlußkriterium war neben der Unterschreitung beider Werte eine abnorme Viskosität der verflüssigten Probe. Von dieser wurde ausgegangen, wenn sich nach Aspiration in eine 5-µl-Pipette eine Fadenlänge von mehr als 2 cm ergab. Die Gewinnung der Patientenejakulate erfolgte unter standardisierten Bedingungen:

Nach einer 3-5 tägigen sexuellen Karenz wurde das Ejakulat in der Klinik durch Masturbation gewonnen. Auf 37°C vorgewärmte sterile Plastik-Petrischalen dienten zum Auffangen und dem Transport. Bei Raumtemperatur verflüssigte die Probe in der Regel nach 20-30 Minuten.

3.2. Spermatologische Basisdiagnostik

Das gut durchmischte verflüssigte Ejakulat wurde anschließend nach WHO-Standart untersucht. Neben der Bestimmung von Farbe, Volumen, Konsistenz, ph-Wert, Spermienzahl pro ml, Gesamtzahl an Spermatozoen und Gesamtmotilität (WHO-Kategorie ”a“, ”b“ und ”c“), wurde eine morphologische Differenzierung und der Spermien-Antikörper-Test durchgeführt. Zusätzlich erfolgte die Erfassung der progressiven Motilität gemäß Ishii et al (1977): Eine Neubauer-Kammer wurde dabei mit 20-fach verdünntem Ejakulat


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beschickt. Ungeachtet ihrer Bewegungsrichtung zählt man alle Spermatozoen aus, die in einer Minute die 0,1 mm Quadratlinie passieren. Die registrierte Anzahl wird durch die Spermienzahl pro ml geteilt und mit 100 multipliziert. Das Ergebnis in %/ml angegeben, stellt den Spermienmotilitätseffizienz(SME)- Index dar. Der Normalwert laut Ishii beträgt 70 %/min (im Bereich von 50-99 %/min). 3 Stunden nach Verflüssigung hingegen ergibt sich ein mittlerer Minimalwert von 35 %/min. Ermittelt wurde dieser Wert anhand von Untersuchungen an 1000 Patienten (Engel und Petzoldt; 1984). Folglich wurden SME-Werte 30 Minuten nach Verflüssigung (t1) und 3 Stunden nach Verflüssigung (t2) bestimmt.

3.3. Computer-Assistierte Spermienmotilitäts-Analyse (CASA)

Nach dem Erfassen der unter 3.1. genannten Parameter, erfolgte eine vollautomatische Analyse der Bewegungsparameter. Dazu stand ein CASA-Gerät der neuen Generation zur Verfügung. Das mika motion analyzer-Programm (1993) der mika medical GmbH für Windows ist eine Weiterentwicklung des DOS-Programms CMA V4.4. Die Version 1.1 stellt eine Programmversion auf einer neuen Plattform dar. Die Datengewinnung erfolgte nach den neuesten WHO-Richtlinien. CASA-Messungen erfolgten im nativen Ejakulat, sowie nach der Filtration.

Meßstandart:

Felder

6

Kammertiefe

10 µm

Temperatur

37 °C

Verdünnung

1

Geschwindigkeitsgrenze immotil

10 µm/sec

Geschwindigkeitsgrenze lokal motil

15 µm/sec

Linearitätsgrenze

90 %

Maximaler Radius für Kreisläufer

10 µm


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3.4. Cell Counter + Analyser System (CASY®1)

CASY®1 (Modell TTC) als deutsche Entwicklung, ist eingetragenes Warenzeichen der Schärfe System GmbH. Es handelt sich um ein Produkt langjähriger Erfahrungen mit analytischen Arbeitsmethoden in der Zellbiologie und Mikrobiologie. Die Technologie verbindet ein bewährtes Verfahren der Partikelmeßtechnik, das ”Widerstands- meßprinzip“, mit einer modernen Methode der Signalauswertung, der ”Pulsflächenanalyse“. Anwendung findet es ursprünglich bei der qualitativen und quantitativen Beurteilung von Zellkulturen. Sowohl Partikel, als auch intakte Zellen verdrängen eine ihrem Volumen entsprechende Menge einer Elektrolytlösung. Die resultierende Widerstandserhöhung ist ein Maß für deren Volumen. Damit steht ein Registrierverfahren zur Verfügung, das neben Spermatozoen andere korpuskuläre Bestandteile des Ejakulats (zelluläre und nichtzelluläre) quantitativ erfaßt.

CASY®-Messungen des nativen Ejakulats in Relation zum Glaswolle-Filtrat sollen eine Aussage über den Filtrationseffekt liefern. Des weiteren ist zu zeigen, ob eine Anreicherung von Spermien stattfindet. Dynamische Bewegungsparametergewinnung mittels CASA und detailierte Konzentrationsbestimmung des CASY®-Systems sollen sich gegenseitig ergänzen.

Meßstandart:

Ein Cursorpaar, begrenzt den Bereich der Größenverteilung, für den CASY®1 die Messergebnisse berechnet.

3.5. Morphologische Differenzierung

Neben der unter 3.1. beschriebenen routinemäßigen morphologischen Differenzierung nativer Ejakulate in:

- Normalform - Kopfveränderungen

- Mittelstückveränderungen - Schwanzveränderungen

- Frühformen,


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wurde im Hauptversuch ein detailiertes Spermiozytogramm nach Shorr-Färbung sowohl nativ, als auch nach Filtration erstellt:

  • Normalform

= 1

  • Überstreckungsformen 1. und 2. Grades

= 2

  • Überstreckungsformen 3. Grades

= 3

  • Akrosomaler Defekt

= 4

  • Überstreckung und akrosomaler Defekt

= 5

  • Flagellumdefekte; Mittelstückdefekt

= 6

  • Schwanzdefekt

= 7

  • Färbungsdefekte der Flagella ohne strukturelle Defekte

= 8

  • Makro- und Mikroköpfe

= 9

  • Vorstufen

= 10

3.6. Raster-Elektronen-Mikroskopische Filteranalyse

Die Fixierung des Glaswolle-Filters erfolgte nach der Filtration mit 2,5% Glutaraldehyd-Cacodylatpuffer-Lösung. Um eine völlige Durchtränkung der im Fasergitter zurückgehaltenen organischen Substanzen zu erzielen, wurde die Säule mit 1 ml der Lösung beschickt. Zirca 750µl liefen ab, bevor die Tuberkulin-Spritze an Konus und Oberseite verschlossen wurde. Der über dem Glaswolle-Paket stehende Glutaraldehydspiegel blieb so erhalten. Die Elektronen-Mikroskopischen Aufnahmen der Filterschichten erfolgten in der Brandenburgischen Technischen Universität Cottbus.

3.7. Statistische Verfahren

Die erhobenen Daten und Meßwerte wurden in Excel-4-Tabellen erfaßt und konnten als Grundlage der nachfolgend aufgeführten statistischen Aufarbeitung in einem SPSS-Programm eingelesen werden. Bei der Auswertung der Filtrationsergebnisse im Vergleich zum nativen Ejakulat wurde zunächst auf Normalverteilung geprüft. Dabei kam der Kolmogorov-Smirnov Goodness of Fit Test zur


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Anwendung. Zum Teil wurde ein zusätzlicher histographischer Verteilungsüberblick geschaffen. Im Falle des Vorliegens normal verteilter Werte, schloß sich der Student-t-Test an. Mußte die Normalverteilung abgelehnt werden oder war diese erfüllt, jedoch der Stichprobenumfang (Vorversuch) zu gering, fogte der Nicht- Parametrische-Wilcoxon-Test.

Für die Anpassung der CASA-Spermienkonzentrationswerte an die ”Klassische Zählung“ wurde ein Plot im Format der statistischen Regression erstellt.


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