Weber, Holm: ”Optimierung der Glaswollefiltration von menschlichen Ejakulaten zum Zwecke der assistierten Reproduktion und für labordiagnostische Untersuchungen“

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Kapitel 5. Durchführung

Als Vorleistung der Versuchsdurchführung sind die unter 4.2. und 4.3. aufgeführten apparativen Voraussetzungen zu schaffen. Gereinigte CASY®-Meßbecher müssen vor Gebrauch mit Aqua dest. gespült werden, um der geforderten Partikelfreiheit zu entsprechen. Die Meßbecher füllt man anschließend mit 10 ml filtriertem CASYton®. Das Aufsetzen des Rotrand-Microfilters auf die Dispensette® hat sich dabei bewährt. Da die CASY-Messungen bei 24°C stattfinden, muß nur ein gefüllter Meßbecher für die spätere Filterspülung im Thermoschrank auf 37°C temperiert werden. CASY®1 wird ”saubergemessen“, wobei trotz großzügigerer Herstellerangaben der Background vor jeder Messung unter 20 counts/ml liegen sollte. Die Vorbereitungen am CASA-System beschränken sich auf die rechtzeitige Inbetriebnahme von Vormwärmplatte und beheizbarem Mikroskoptisch. Die Lagerung der Filterelemente, des nativen wie filtrierten Probenmaterials während des gesamten Versuchsablaufes, als auch die CASA-Messungen finden bei 37 °C statt. Nach der Verflüssigung des Ejakulats im Thermoschrank muß eine gleichmäßige Durchmischung erfolgen. Dazu wird das gesamte Proben-Volumen mit einer Einweg-Spritze vorsichtig 2 mal aufgezogen. Die mit 5 µl Nativejakulat beschickte Neubauer-Kammer bleibt dann für 3 Minuten auf der Vorwärmplatte. Indes kann die CASY®-Messung erfolgen. 20 µl der Probe gibt man dafür in einen der vorbereiteten Meßbecher. Damit eine Gleichverteilung des Ejakulats in den 10 ml CASYton® stattfindet, wird der verschlossene Becher 7 mal gewendet, nicht geschüttelt. Es erfolgt die Messung und anschließende Abspeicherung unter einem CASY®-file. Nun können am CASA-Gerät 6 Gesichtsfelder gemessen werden. Die Ausgangswerte liegen somit vor. Es kann filtriert werden.

Der im Thermoschrank vorbereitete CASY®-Meßbecher wird entnommen. 2 ml des Inhaltes dienen als Säulen-Spüllösung, 800µl als Medium. Zunächst wird der Filter in ein 15-ml-Reagenzglas gestellt. Nacheinander rinnt 2 mal 1 ml CASYton® durch den Filter und trägt Glasfaserpartikel hinaus. 800 µl temperaturgleichen Mediums füllt man


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in ein nicht perforiertes Reaktionsgefäß und gibt 400 µl gut gemischten Ejakulats hinzu, was einer Verdünnung von 3:1 entspricht. Auch hier muß Gleichverteilung erzielt werden. Der Inhalt wird deshalb 3 mal vorsichtig aufgezogen und wieder ausgespritzt. Nach Abschluß der Spülung und Einpassung des Filters im Deckel des Eppendorf-Gefäßes, kann er behutsam mit dem Gemisch überschichtet werden. Dies geschieht unter Gebrauch einer 1,10 x 50mm langen Kanüle, die eine direkte Annäherung an die Filteroberfläche gewährleistet. Der folgende Umgang mit dem Filtrat variiert in den beiden Versuchsreihen:

5.1. Vorversuch

Sofort nach Filtration werden CASA- und CASY-Bestimmungen standardisiert durchgeführt. Das Eppendorf-Gefäß wird 7 mal gewendet, ohne zu schütteln. Die für beide Meßsysteme erforderliche Filtratmenge von 5 µl bzw. 20 µl annähernd gleichmäßig durchmischter Spermiensuspension wird entnommen.

5.2. Hauptversuch

5.2.1. Entnahme Gefäßboden

Nach der Gewinnung des Filtrats wird der Eppendorf-Deckel entriegelt, um spätere Manipulationen zu vermeiden. Bei der anschließenden 30-minütigen Lagerung im Thermoschrank kommt es auf den erschütterungsfreien senkrechten Stand des Gefäßes an. Ohne Turbulenzen oder gar aufsteigende Bläschen zu erzeugen, entnimmt man die Filtratmenge von 5 µl für die CASA-Analyse, 20 µl für die Partikelmessung sowie 5 µl für das Ausstrichpräparat des detailierten Spermiozytogramms strikt vom Boden des Eppendorf-Gefäßes.

5.2.2. Entnahme unterhalb Filtratspiegel

Zu Vergleichszwecken wird die entsprechende Menge 35 Minuten nach Filtration unmittelbar unterhalb des Filtratspiegels entnommen. Auch hierbei wird standardisiert gearbeitet.


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Abb. 2: Gegenüberstellung der Entnahmeorte und -bedingungen


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