Weber, Holm: ”Optimierung der Glaswollefiltration von menschlichen Ejakulaten zum Zwecke der assistierten Reproduktion und für labordiagnostische Untersuchungen“

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Kapitel 6. Darstellung der Ergebnisse

6.1. Vorversuch

Nach schonender Durchmischung des Filtrats durch mehrmaliges Wenden des Gefäßes und Entnahme der für die Messung benötigten Materialmenge etwa aus der Gefäßmitte zeigt sich bei der computerassistierten Motilitätsanalyse, daß die Zelldichte im Filtrat, unter Berücksichtigung des Verdünnungsfaktors, der des Ausgangsejakulates entspricht. Bei einer Zunahme der Zahl motiler Spermien um 15 % und des Anteils nicht linear motiler Spermien um 20 %, nimmt die VCL der Gesamtheit der motilen Spermien leicht, die der nicht linear motilen Spermien jedoch drastisch ab. Mit einem gegenüber dem Ausgangsejakulat um 2/3 reduziertem Anteil linear motiler Spermatozoen auf 5,3 %, ergibt sich bei hoher Standard- abweichung nahezu eine Halbierung der VCL linear motiler Spermatozoen im Filtrat. Bei der Partikelmessung fällt eine Linksverschiebung des mittleren Durchmessers und des Maximums auf (siehe Tabelle 1).

Die Unterschiede sind für den Anteil immotiler und lokal motiler Spermien negativ signifikant, für den Anteil motiler Spermatozoen hingegen positiv signifikant. Betrachtet man die Populationen letztgenannter, findet sich für den Prozentsatz der nicht linear motilen Spermien eine deutlich positive, für den der linear motilen Spermien eine negative Signifikanz. Ebenfalls statistisch negativ signifikant vom nativen Ejakulat im Vergleich mit dem Filtrat sind die VCL linear motiler Spermatozoen und die CASY®- Meßergebnisse, ausschließlich des Maximums partikulärer Teilchenregistrierung.

Das Ergebnis entspricht sowohl im Hinblick auf die erwünschte Anreicherung von Spermien insgesamt, als auch bezüglich des Anteils motiler Spermatozoen und deren absolute Geschwindigkeit nicht der Zielstellung. Deshalb wurde der Versuch nach erfolgter Zwischenauswertung in dieser Form nicht fortgesetzt.


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Tabelle 1: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der CASA- und CASY®-Meßergebnisse vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); statistische Aussage rechts mit Signifikanzen entsprechend Hauptaussage (H1); n = 10


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6.2. Hauptversuch

6.2.1. Entnahme Gefäßboden

6.2.1.1. Computer-Assistierte Spermienmotilitäts-Analyse (CASA)

30 min nach Filtration und Lagerung im Thermoschrank wurden im 1. Teil des Hauptversuches die Meßproben vom Gefäßboden entnommen. Bei dem 1. Merkmal, der Spermienkonzentration in Mio/ml, handelt es sich um einen Absolutwert, der zu 100 % gesetzt, sich in die Spermienkategorien: Immotile (Immo), lokal Motile (LoMo) und Motile (Mo) prozentual unterteilt. Die Letzteren wiederum lassen sich noch weiter spezifisieren in: Kreisläufer (Krs), nicht linear motile Spermien (NLMo) und die besondere Priorität besitzenden linaer motilen Spermatozoen (LMo). Da ein deutlicher Konzentrationssprung zu verzeichnen ist, erscheint es sinnvoll, reale Zahlenverhältnisse der Analyse zugrunde zu legen. In diesem Zusammenhang muß die Angleichung der gemessenen CASA-Spermienkonzentrationswerte an die ”Klassische Zählung“ erfolgen. Entsprechend dem WHO-Standard erfolgte die Bestimmung der nativen Spermienzahl pro ml unter dem Mikroskop bei 200-facher Vergrößerung. Die klassische Methode der Auszählung in der Neubauer-Kammer liefert anerkanntermaßen nach wie vor die genauesten Werte. Die Darstellung des Nativ-Ergebnispaares beider Verfahren erfolgte in einem Plot im Format der statistischen Regression (6.2.1.6. Statistische Verfahren).

Anhand der Verteilung konnte der Anstieg (Slope) der resultierenden Geraden mit 1,72825 ermittelt werden. Damit ergibt sich die Gleichung: y = 1,72825 x. x entspricht dabei den Werten der ”Klassischen Zählung“, y den CASA- Konzentrations- meßwerten. Nach Anpassung liegen folgende Verteilungs- verhältnisse vor (siehe Tabelle 2):


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Tabelle 2: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der CASA-Meßergebnisse in Korrelation mit der ”Klassischen Zählung“ vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); wiederspiegelt reale Zahlenverhältnisse; n=30

Ohne separaten Konzentrierungsschritt führt der entsprechend der Beobachtungen des Vorversuches modifizierte Ablauf der Glaswolle- Filtration zu einer Verdopplung der Spermatozoenzahl pro ml. An dieser Stelle muß noch einmal auf die vorgenommene Dilution von 400 µl verflüssigten nativen Ejakulats mit 800 µl temperatur- gleichen CASYton®’s hingewiesen werden. Hinter der aufgezeigten Verdopplung steckt also die potentiell stattgefundene Versechs- fachung! Das Ziel des Verdünnungsschrittes bestand in der für den Filtrationsprozeß essentiellen Herabsetzung der Viskosität des Seminalplasmas. Bei praktisch regelmäßig erzeugtem Spermiendichte- Anstieg um 100 %, bestand selbst bei oligozoospermen Ejakulaten keine Notwendigkeit, dem schonenden Filtrations- und Konzentrierungsverfahren einen weiteren Konzentrierungsvorgang anzuschließen, um die initiale Dilution aufzuheben.

Anhand der Graphik (siehe Abbildung 3) soll die Verteilung der Gesamtkonzentration von nativ 27,4 bzw. 69,5 Mio/ml nach Filtration auf die Spermatozoen-Fraktionen untersucht werden. Im Filtrat reduziert sich der Anteil immotiler Spermien von 54,5 % auf 11,7 %, was nur noch 1/5 des Ausgangswertes entspricht. Bei den lokal Motilen läßt sich mit einem Wert um die 6% ein Status quo verzeichnen.


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Herausragend ist das Ergebnis im Bereich der gewünschten motilen Zellpopulation mit einer prozentualen Verdopplung. Wärend die Kreisläufer und nicht linear motilen Spermien als motile Untergruppen anteilig Ausgangsniveau beibehalten, erhöht sich die Zahl linear motiler Spermatozoen von 0,8 auf 7,1 Mio/ml um nahezu das 9-fache.

Abbildung 3: Graphische Darstellung der prozentualen Spermatozoen- Fraktionen; natives Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (Fb)


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Daß sich am Boden des Eppendorf-Gefäßes, 30 min nach Filtration keine Fraktion niederer Qualität ”ausruht“, soll die Auswertung der VCL (curvilinear-velocity) beweisen. Bei der CASA-Registrierung der Spurgeschwindigkeit in [µm/s] handelt es sich um Absolutwerte. Daher ist eine direkte Vergleichbarkeit zwischen nativem Ejakulat und Filtrat möglich.

Über alle motilen Spermatozoen wird eine mittlere VCL-Erhöhung von 10 µm/s verzeichnet. Diese Tendenz zeichnet sich auch spezifisch für die Kreisläufer und nicht linear motilen Spermien ab. Überraschend wiederum die linear motile Fraktion. Nicht genug, daß ihre Filtratkonzentration eine 9-fache Steigerung erfahren hat, weist diese Subpopulation mit 62 µm/s einen sehr hohen mittleren Spurgeschwindigkeitswert auf.

Tabelle 3: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der CASA-VCL-Werte vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); n = 30


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6.2.1.2. Cell Counter+Analyser System (CASY®)

Welche Aussage liefern die CASY®-Messungen des nativen Ejakulats in Relation zum Glaswolle-Filtrat? Bedingt durch das genutzte Verfahren der Partikelmeßtechnick, dem ”Widerstands- meßprinzip“, werden neben Spermatozoen auch andere korpuskuläre Bestandteile im Seminalplasma (zelluläre und nichtzelluläre) quantitativ erfaßt. Die Filterleistung besteht nun gerade darin, sowohl diese korpuskulären Bestandteile als auch immotile Spermien im nativen Ejakulat zurückzuhalten. Mit Counts x 100000 pro ml werden demnach nativ neben der Spermienkonzentration oben genannte Bestandteile erfaßt. Post filtrationem sind diese als Ausdruck des Filtrationseffektes nicht mehr aufzufinden (siehe Abbildung 4).

Um von den mittels Cell Counter + Analyser System gewonnenen ”Counts“ (siehe Tabelle 4) eine reale Zahlenvorstellung zu bekommen, muß diesmal eine meßbedingte Dilution beachtet werden. Mit der Pipette wurde eine Meßprobe von 20 µl entnommen und in einen 10 ml (= 10000 µl) CASYton® enthaltenden Meßbecher pipettiert. Bei einem Verdünnungsverhältnis von 1:500 ergeben somit 2,08 Counts x 100000 pro ml (C/ml5) im nativen Ejakulat eine ”Teilchenzahl“ von 104 Mio/ml und nach Fitration 1,28 C/ml5 eine Spermatozoenzahl von 64 Mio/ml. Dem zufälligen und systemischen Fehler Rechnung tragend, kann man bei einem CASA-Filtrationswert von 69,5 Mio/ml von einem übereinstimmenden Ergebnis beider Meßverfahren sprechen (siehe Abbildung 4).


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Abbildung 4: Spermatozoenkonzentrationswerte in Mio/ml beider apparativer Meßverfahren vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (Fb); n = 30

Die CASY®-Parameter -”Durchmesserhäufigkeit“ (Max) und mittlerer Partikeldurchmesser (MDia)- zeigen die filtrationsbedingte Spermatozoen- Anreicherung. Innerhalb der Cursorgrenzen projiziert sich regelmäßig ein CASY-Graph in Form der Gaußschen Normalverteilungskurve, wobei Max dem Mittelwert µ der Gaußverteilung entspricht. Durch Elimination klein- und großpartikulärer Bestandteile nativen Ejakulates, erfaßt das der Zell- und Mikrobiologie entlehnte Analyse-System im Filtrat ein Maximum ”partikulärer Teilchenregistrierung“ von 3,47 µm. Bei gleichbleibendem mittleren Partikeldurchmesser von 4,3 µm selektiert sich somit eine Zellpopulation, deren Vertreter einen medianen Membrandurchmesser von 3,47 µm aufweisen (siehe Tabelle 4). Aus den CASA-Beobachtungen und -Meßwerten ergibt sich, daß es zulässig ist, ”Partikel“ dem Spermatozoon gleichzusetzen, womit die Ergebnisse der Zielstellung gerecht werden.


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Tabelle 4: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der CASY®-Meßergebnisse vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); n = 30

6.2.1.3. Morphologische Differenzierung

Als weiteres Kriterium zur Einschätzung des Filtrationseffektes erfolgte die Beurteilung der Spermatozoen-Morphologie. Entsprechend Punkt 3.5. wurde ein detailliertes Spermiozytogramm nach Shorr-Färbung sowohl nativ, als auch nach Filtration erstellt und von Merkmal 1 (Mpd/1) bis 10 (Mpd/10) differenziert.

Unterschiede beider Meßreihen hinsichtlich geringer- und höher- gradiger Überstreckungsformen, Akrosomen-, Flagellum-, Mittelstück- und Schwanzdefekte sind dabei zufälligen Charakters, wie die statistische Aufarbeitung der Ergebnisse zeigt (siehe Punkt 6.2.1.6.). Besonderes Augenmerk soll daher auf die im Filtrat signifikante Zunahme der Normalform (Mpd/1), sowie signifikante Abnahme von Kopfveränderungen (Makro- und Mikroköpfe; Mpd/9) und Vorstufen (Mpd/10) gelegt werden (siehe Tabelle 5).


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Tabelle 5: Ergebnisse der detaillierten morphologischen Differenzierung vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); rechts statistische Signifikanz entsprechend Hauptaussage (H1); n = 30

Mit der Erhöhung des Anteils normomorpher Spermatozoen von nativ 13,3 % auf 19,1 % im Filtrat unter gleichzeitiger Abnahme kopfveränderter Spermien von 6,5 auf 3,0 % und Verringerung der Spermien-Vorstufen, entspricht das Ergebnis der Zielstellung (siehe Abbildung 5).

Abbildung 5: Graphische Darstellung der detaillierten morphologischen Differenzierung vom nativen Ejakulat (gelb) im Vergleich mit dem Filtrat (braun) in %; n = 30


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6.2.1.4. Raster-Elektronen-Mikroskopische Filteranalyse

Einführend muß festgehalten werden, daß die Interpretation der elektronen-mikroskopischen Aufnahmen nur hypothetischen, keines- falls beweisenden Charakter haben kann. Betrachtet man den gesamten Filteraufbau als stabiles und weitgehend geschlossenes System, so führen die bisherigen Ergebnisse zu einer einfachen Gleichung. Dem ”System“, bestehend aus: Glaswolle-Filterelement, Eppendorf-Gefäß und Ejakulat-CASYton®-Gemisch, wird weder etwas hinzugefügt, noch etwas entzogen. Also gilt: Ejakulat- CASYton®-Gemisch = Filtrat + Filterablagerung. Die letztgenannte Variable der Gleichung entspricht dabei, in optischer Form der Wiedergabe, dem Inhalt der elektronen-mikroskopischen Aufnahmen. Durch Bildung der Differenz aus Nativ- und Filtrat-Messungen, einschließlich morphologischer Differenzierung, ergibt sich der Hinweis auf folgenden Filterinhalt post filtrationem:

Neben den aufgeführten Fraktionen, deren Wahrscheinlichkeit, der ”Rückhaltefunktion“ des Filters zu erliegen, erhöht ist, lagern sich weitere Ejakulat- und Seminalplasmabestandteile ab:


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6.2.1.5. Statistische Verfahren

Bezüglich der Abstimmung der mittels CASA registrierten Samenzellkonzentration auf die klassische Methode der Auszählung erschien es sinnvoll, sich eines Plots im Format der statistischen Regression zu bedienen. Dabei wurden die Nativ-Ergebnispaare beider Verfahren gegenübergestellt. Konsekutiv konnte anhand der Verteilung der Anstieg (Slope) der resultierenden Geraden mit 1,72825 ermittelt werden (siehe Abbildung 6). Der systematische Meßfehler des CASA-Systems fand somit Berücksichtigung. Mittels Anpassungsfaktor ergaben sich für weiterführende Betrachtungen reale Spermatozoen- dichteverhältnisse (siehe Punkt 6.2.1.1.).

Abbildung 6: Plot im Format der statistischen Regression für die Nativ- Konzentrationswerte CASA/Klassische Zählung, einschließlich Vorversuch; n = 40


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Ob die aufgetretenen Abweichungen zufälliger oder wesentlicher Natur sind, wird nachfolgend deren statistische Wertigkeit entscheiden (siehe Tabelle 6).

Im Kolmogorov-Smirnov-Test konnte für alle Merkmale sowohl nativ als auch nach Filtration Normalverteilung nachgewiesen werden. Damit war die Voraussetzung für die Anwendung des T-Test’s nach Student erfüllt. Der Tafelwert der t-Verteilung für eine Irrtumswahrscheinlichkeit von a = 5 % und f = n - 1 = 29 ist t = 2,05. Der Wert der Testgröße ist außer bei den lokal Motilen (LoMo), den nicht linear Motilen (LMo) und dem mittleren Spermiendurchmesser (MDia) größer als der Tafelwert. In diesem Falle muß die Nullhypothese, daß sich der Mittelwert einer normal verteilten Stichprobe (F) nur zufällig vom Mittelwert µ der normal verteilten Grundgesamtheit (N) unterscheidet, verworfen werden. Entsprechend wird für die Merkmale -Konzentration (Konz); Immotile (Immo); Motile (Mo); Kreisläufer (Krs); linear Motile (LMo); Spurgeschwindigkeit der Motilen (VMo), derKreisläufer (VKrs), der nicht linear Motilen (VNLMo) und der linear Motilen (VLMo); CASY®-Counts absolut (C); Counts pro ml (C/ml5) und Durchmesserhäufigkeit (Max)- die andere Möglichkeit des Entscheids, die Alternativhypothese, angenommen.

In Korrelation zur Richtung des signifikanten Unterschieds zwischen Nativ und nach Filtration, kann für den Hauptversuch die Hauptaussage H1 akzeptiert werden (letzte Spalte der Übersicht): Die Glaswolle-Filtration (Entnahme 30 min nach Filtration; Gefäßboden) führt zu einer Abnahme des Anteils immotiler Spermien bei adaequater Zunahme der motilen Fraktion, deren Spurgeschwindigkeit gesteigert ist.


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Tabelle 6: Statistische Aufarbeitung der Ergebnisse des Hauptversuches; zunächst Prüfung auf Normalverteilung mittels Kolmogorov-Smirnov-Test; Student-t-Test zur Ermittlung des p-Wertes; abgeleitete Signifikanz entsprechend Hauptaussage (H1); n = 30

Die statistische Wertigkeit des Spermiozytogramms wurde unter Punkt 6.2.1.3. bereits angesprochen. An dieser Stelle sollen die zugrunde liegenden Berechnungen dargestellt werden (siehe Tabelle 7).

Tabelle 7: Statistische Aufarbeitung der Ergebnisse des Hauptversuches; zunächst Prüfung auf Normalverteilung mittels Kolmogorov-Smirnov-Test; Student-t-Test zur Ermittlung des p-Wertes; abgeleitete Signifikanz entsprechend Hauptaussage (H1); n = 30


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6.2.2. Entnahme unterhalb Filtratspiegel

Die Wahl dieses zweiten Entnahmeortes im Rahmen des Hauptversuches sollte zu Vergleichszwecken Aufschluß über die Filtratverhältnisse am ”Gegenpol“ des Eppendorf-Gefäßes geben. Es wird ersichtlich, daß 35 min nach Filtration (die Bodenmessungen waren zeitlich vorangestellt) unterhalb des Filtratspiegels im Mittel lediglich eine oligozoosperme Konzentration registrierbar ist. Wärend die übrigen Fraktionen weitestgehend anteilig Nativniveau erreichen, ist der Anteil linear motiler Spermatozoen an der Gesamtkonzentration von 3,7 Mio/ml von ursprünglich 7,4 % auf 2,5 % gravierend abgefallen. Nach Angleichung an die ”Klassische Zählung“ ist auch hier nur der rechnerische Verdünnungsausgleich für den Absolutwert -Konzentration- zulässig.

Daneben ragt noch ein zweites Ergebnis dieses 2. Teils des Hauptversuches heraus. Voraussetzung für erfolgreiche assistierte Reproduktion ist eine hohe Spurgeschwindigkeit (VCL) linear motiler Spermien. Von 41,3 auf 9,4 µm/s kommt es zu einer nicht tolerierbaren Abnahme auf ¼ der Ausgangsgeschwindigkeit (siehe Tabelle 8). Sowohl im Hinblick auf die erwünschte Anreicherung von Spermien insgesamt, als auch bezüglich des Anteils der linear motilen Spermatozoen und deren absolute Geschwindigkeit, entspricht das Ergebnis nicht der Zielstellung.


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Tabelle 8: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der CASA- und CASY®-Meßergebnisse vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); n = 30

Die Eindeutigkeit der Ergebnisse wird durch deren statistische Aufarbeitung dokumentiert (siehe Tabelle 9).

Um auf Normalverteilung zu prüfen, wurde der Kolmogorov- Smirnov-Test angewandt. Nur wenn das Merkmalspaar (N/F) diese Voraussetzung erfüllte, konnte der Student-T-Test, anderenfalls mußte der Wilcoxon-Test angeschlossen werden (siehe Spalte 3 und 4). Im Resultat beurteilt der t-Test das Verhältnis der Mittelwerte nach Filtration (F) zu Nativ (N), bezogen auf das jeweilige Merkmal. Hingegen wird durch den Wilcoxon-Test ersichtlich, in wieviel Fällen das Filtratergebnis kleiner (Lt: lower than), größer (Gt: greater than) oder gleich (Eq: equal) dem Nativwert ist. Für die beiden besonders stark differierenden Parameter, linear Motile (LMo) und deren Spurgeschwindigkeit (VLMo), zeichnet sich eine deutliche statistische Signifikanz ab. Die postulierte Hauptaussage (H1: Die Glaswolle-Filtration führt zu einer Abnahme des Anteils immotiler Spermien bei adequater Zunahme der motilen Fraktion, deren Spurgeschwindigkeit gesteigert ist.), muß für den 2. Teil des Hauptversuches abgelehnt werden.


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Tabelle 9: Statistische Aufarbeitung der Ergebnisse des Hauptversuches (2. Teil); zunächst Prüfung auf Normalverteilung mittels Kolmogorov- Smirnov-Test; Student-t-Test zur Ermittlung des p-Wertes bzw. Wilcoxon-Test; abgeleitete Signifikanz entsprechend Hauptaussage (H1); n = 30


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