Weber, Holm: ”Optimierung der Glaswollefiltration von menschlichen Ejakulaten zum Zwecke der assistierten Reproduktion und für labordiagnostische Untersuchungen“

39

Kapitel 7. Diskussion der Ergebnisse

7.1. Geeigneter Filteraufbau

Mit der Tuberkulin-Spritze als Träger einer 15 mg Manville Glaswolle-Portion (Microfibre code 112), die auf eine Höhe von 6 mm verdichtet wird, steht ein brauchbarer, einfach herstellbarer Filter zur Verfügung. Für die Fließeigenschaften des mittels hydro- statischen Drucks passierenden Ejakulat-CASYton®-Gemisch’s, sind die Spritzen-Abmaße von grundlegender Bedeutung. Die entscheidende Rolle spielt das Verhältnis zwischen Spritzen- und Konusansatzdurchmesser. Beim Gebrauch von Filterträgern, die von der Dimension der Tuberkulin-Spritze abweichen (der Konusansatz beträgt hier 50 % des Spritzendurchmessers), ist mit Turbulenzen und partieller Stase in der unteren Filterrandzone zu rechnen. Betroffen davon sind Spritzen, deren Konusansatz nicht zentriert ist und/oder nur einen Bruchteil des Gesamtdurchmessers aufweist. Vergleichbare Strömungsverhältnisse wie Turbulenzen, prästenotische Strömungsverlangsamung mit fortschreitender Ablagerung (Plaquebildung) finden sich pathophysiologisch im Bereich einer Gefäßstenose. Im Folgenden mußte im Rahmen der experimentellen Vorbereitung entschieden werden, welches Volumen die konstante Glaswollemasse von 15 mg im Filterträger einnehmen soll. Von hypothetischer Bedeutung waren dabei die beiden Extreme der Filterpräparation. Zu lockeres Beschicken der Tuberkulin-Spritze mit Glaswolle führt zum Durchlauf des zu filtrierenden Gemisches innerhalb weniger Sekunden ohne jeglichen Filtereffekt. Damit geht die eigentliche ”Rückhaltefunktion“ verloren. Auf der anderen Seite gestattet ein zu stark verdichtetes Filterelement keine Durchdringung. Hierbei wird der Filter seiner ”Passagefunktion“ nicht gerecht. Anhand der Meßgröße -Durchflußzeit- der beiden Medien, Casyton® und Seminalplasma, konnte gezeigt werden, daß die Glaswolle-Säulenhöhe von 6 mm einen kontinuierlichen


40

Filtrationsablauf garantiert, wobei ein guter Kompromiß zwischen ”Rückhalte- und Passagefunktion“ des Filters gefunden wurde.

Hinsichtlich der Glaswollepartikelausschwemmung stand zunächst nur die Minimierung des systematischen Fehlers im Mittelpunkt. Freiwerdende Glaswollepartikel gehen in die Bilanz als kleinkorpuskuläre Bestandteile ein. Durch siebenmalige CASYton®- Spülung von je 1 ml, konnte ein Plateau erniedrigter Partikel- ausschwemmung nachgewiesen werden, daß sich bereits nach dem 2. Durchlauf einstellte. Zunächst nur der experimentellen ”Bereinigung“ dienend, hat die Partikelreduktion weitreichendere Bedeutung. Im Rahmen der assistierten Reproduktion, steht am Ende der Ejakulat-Aufbereitungskette zum Beispiel die homologe Insemination. Für deren Erfolg ist eine Verminderung kleinkorpuskulärer Bestandteile als mögliche Induktoren entzündlicher Reaktion wünschenswert.

7.2. Vorversuch

Als erste Aufbereitungsmöglichkeit unter Anwendung genannter technologischer Vorleistungen, steht die Glaswolle-Filtration mit Probeentnahme gleich nach Filtration aus der Gefäßmitte zur Disposition. Anhand der Meßergebnisse wird ersichtlich, daß ein derartiges Verfahren keinen praktischen Wert hat. Bei der Betrachtung des ersten Merkmals -der mittels CASA gemessenen Spermienkonzentration in Mio/ml-, hatten sich die Erwartungen bestätigt. Unter Berücksichtigung des Verdünnungsverhältnisses wurde annähernd die gleiche Zelldichte wie vor Filtration erreicht. Genaueren Aufschluß über die Qualität des Filtrates, sollten die prozentualen Anteile der einzelnen Spermatozoen-Populationen liefern. Ein 15 %-iger Anstieg konnte bei den motilen Spermien verzeichnet werden, der mit einem Rückgang von 10 Prozent der immotilen und 5 Prozent der lokal motilen Samenzellen einhergeht. Die CASA-Filtrationsergebnisse hatten somit eine Entwicklung in die gewünschte Richtung genommen. Das besondere Augenmerk muß


41

allerdings auf jene Population gerichtet sein, dessen Ausbeute und zielgerichtete Beweglichkeit für den Erfolg einer homologen Insemination unabdingbar ist. An der um 2/3 reduzierten Dichte und einer Abnahme der Spurgeschwindigkeit von nativ 65 µm/s auf 34 µm/s wurde offensichtlich, daß das Filtrat hinsichtlich linear motiler Spermatozoen nicht den geforderten qualitativen Sprung verzeichnete. Im Gegenteil, es mußte kritisch festgehalten werden, daß die Glaswolle-Filtration entsprechend dem Prozedere des Vorversuchs an entscheidendem Punkt zu einer Regression führt. Die CASY®-Konzentrationswerte unterstreichen die CASA-Messungen. Erfolgt auch hier der rechnerische Ausgleich des Verdünnungs- verhältnisses, ergibt sich die gleiche Konzentration wie im nativen Ejakulat. Durch Homogenisierung und fehlende zeitliche Voraussetzungen, kann sich der im Hauptversuch genutzte gefäßformbedingte Konzentrierungseffekt hier nicht ausbilden. Ohne separaten Konzentrierungsschritt nicht brauchbar, war der Vorversuch für die Weiterentwicklung der Versuchsplanung unabdingbar. So wurde der zum Ende des Vorversuchs beobachteten fraglichen bodennahen Samenzellverdichtung in einer variierten Versuchsdurchführung (Hauptversuch) nachgegangen.

7.3. Hauptversuch

7.3.1. Entnahme Gefäßboden

7.3.1.1. Computer-Assistierte Spermienmotilitäts-Analyse (CASA)

Nach Abschluß eines Vorversuches fiel vor dem Verwerfen des Filtrats eine wie Schneegestöber anmutende Verdichtung im Bereich der Konusspitze des mäßig durchscheinenden Eppendorf-Gefäßes auf. Es handelte sich um ein Ejakulat mit bereits nativ sehr hoher Spermatozoenzahl. Das Gefäß hatte nach Meßende ca. ½ Stunde gestanden. Probatorisch erfolgte die Probenentnahme vom Gefäßboden für eine CASA-Messung. Was sollte man vorfinden?


42

Überlegungen hinsichtlich zweier Gesetzmäßigkeiten prägten die Erwartungshaltung. 1) Motile Spermatozoen ändern ihre Bewegungsrichtung an Grenzflächen, sind also in physiologischer Flüssigkeit stochastisch gleichverteilt. 2) Avitale Spermien sinken zu Boden. Fazit: Am Boden müßte sich eine Fraktion niederer Qualität ”abgelagert“ haben.

Statt dessen fand sich in der mikroskopischen CASA-Übersichts- einstellung eine enorme Konzentrierung hochmotiler Spermatozoen. Das Filtrat wies einen Anteil von 15 % linear motiler Samenzellen mit einer Spurgeschwindigkeit von über 60 µm/s auf. Das Ergebnis überraschte, wurde jedoch mit Skepsis betrachtet. Die beiden noch ausstehenden Einzelversuche der Vorversuchsreihe waren daher nach Beendigung der Routine-Messungen von besonderem Interesse. Die Konzentrierung am Gefäßboden bestätigte sich.

Im daraus erwachsenen Hauptversuch wird ein Spermienselektions- verfahren aufgezeigt, daß quantitativ und qualitativ neue Maßstäbe setzt. 30 min nach Glaswolle-Filtration läßt sich am Gefäßboden des Filtrat-Auffanggefäßes eine Verdoppelung der Spermatozoen- ausgangskonzentration von 27,45 auf 69,56 Mio/ml bei gleichzeitiger Verringerung des immotilen auf 1/5 sowie Steigerung des motilen Samenzellanteils von nativ 39 % auf 82 % nach Filtration nachweisen. Gänzlich zerstreut werden die Vorstellung der stochastischen Gleichverteilung und die Annahme der Ablagerung einer minder qualitativen Fraktion. Ersterer widerspricht die ”Unausgewogenheit“ der Samenzellverteilung mit dem Negativ- ergebnis bei Entnahme unterhalb des Filtratspiegels einerseits und der bodennahen Spermienballung andererseits. Unter Spezifisierung obiger Merkmalswerte mit einer von nativ 0,8 auf 7,1 Mio/ml post filtrationem um nahezu das 9-fache gesteigerten Zahl linear motiler Spermien, die mit einer überproportionalen Zunahme der Curvilinear-Velocity um 20 µm/s aufwarten (VCL-Erhöhung um 10 µm/s über alle motilen Spermatozoen), ist auch die ”Ablagerungstheorie“ für konische Gefäße nicht länger haltbar.


43

7.3.1.2. Cell Counter+Analyser System (CASY®)

Nach den entsprechend des Hauptversuches veränderten Durchführungs- bedingungen konnte erstmals vom Cell Counter + Analyser System ein Punktum maximum einer deutlich angereicherten Zell-Population gefunden werden. Die Verteilungskurve nativen Ejakulats fällt kontinuierlich von einer hohen Zahl kleiner ”Partikel“ zu größeren Partikeldurchmessern hin ab. Die Tatsache, daß der mittlere Partikeldurchmesser (MDia) sich filtrationsbedingt nicht ändert, beweist die gleichermaßen für klein- als auch großpartikuläre Ejakulat- Bestandteile wirkende ”Rückhaltefunktion“ des Glaswolle-Filters. Ergänzend belegt dies auch das detaillierte Spermiozytogramm, bei dem eine signifikante Abnahme makro- und mikrokopfveränderter Samenzellen registriert wird. Nach Filtration zeichnet sich somit eine Gauß’sche Normalverteilungskurve ab. Deren Median (= Maximum partikulärer Teilchenregistrierung) spiegelt die zelluläre Anreicherung wieder. In Korrelation mit den CASA-Parametern wird deutlich, daß sich eine Spermien-Population selektiert, die durch ein hochmotiles Spermatozoon mit einem Membrandurchmesser von 3,47 µm als typischer Vertreter repräsentiert wird.

7.3.1.3. Morphologische Differenzierung

Die Konzentrierung hochmotiler Spermatozoen als funktionaler Aspekt, bildet eine Einheit mit der Samenzell-Morphe. Um die Objektivität zu erhöhen, erfolgte die morphologische Einschätzung unter Anwendung der von Kruger et al. (1986) aufgestellten ”strict criteria“. Die Spermien-Morphologie ist als ein guter Indikator für die zu erwartende in vitro Fertilisations-Rate zu betrachten (Kaskar et al., 1993). Von daher kann das unter 6.2.1.3. dargestellte Ergebnis der morphologischen Differenzierung, mit einer glaswolle-filtrations- bedingten Zunahme der Normalform von 13,3 auf 19,2 %, optimistisch stimmen.


44

7.3.1.4. Raster-Elektronen-Mikroskopische Filteranalyse

Die hohe Filterselektionsleistung findet auch auf den raster- elektronen-mikroskopischen Aufnahmen ihren optischen Nieder- schlag. Im konkret vorliegenden Falle neigen von der Normomorphie, einem medianen Kopfdurchmesser von 3,47 µm abweichende oder gar membrandefekte Spermatozoen früher zur Glaswollefaseradhärenz. Physikalische Grundlage der somit zum Ausdruck kommenden ”Filterleistung“ sind, die der hydrostatischen ”Passage“ des gesamten Ejakulat-CASYton®-Gemisch’s entgegenwirkende Adhäsionskräfte. Definiert als zwischenmolekulare Van-der-Waals- Kräfte, sorgen sie für Aneinanderhaften der Oberflächenschichten verschiedener Stoffe. Eigenbeweglichkeit motiler Samenzellen ist daher Grundvoraussetzung für deren Überwindung. Desweiteren ist dem Filter in Abhängigkeit von der Glaswolle-Fasergitter-Dichte eine rein mechanische Funktion eigen. Die gewonnenen raster-elektronen- mikroskopischen Schichtaufnahmen stellen die Wiederspiegelung der Gesetzmäßigkeiten dar.

7.3.1.5. Gefäßformeffekt

Welche Erklärung findet sich für die abgelaufene bodennahe Konzentrierung hochmotiler Spermatozoen? Bei dem erbrachten Nachweis einer 9-fachen Steigerung der Filtratkonzentration der linear motilen Fraktion und überproportionaler Zunahme ihrer Spurgeschwindigkeitswerte, drängte sich der Verdacht aktiver Leistung auf. Diesen Sachverhalt zu prüfen, war Aufgabe eines speziellen Versuchsaufbaues. Im Zentrum der Untersuchungen stand die Gefäßform.

1) Verfolgung der Spermienbewegungsbahnen

Das nur spärlich durchscheinende Eppendorf-Gefäß, für optische Analysen ungeeignet, wurde durch ein gläsernes Reaktionsgefäß mit nahezu identischer Konuskrümmung ersetzt (siehe Abbildung 7).


45

Abbildung 7: Konisches Reaktionsgefäß; Hauptstrom der Spermienbewegung (gelb)

Ein Lichtmikroskop wurde derart aufgebaut, daß sein Strahlengang horizontal verlief. Indem man dem Ejakulat-CASYton®-Gemisch vor Filtration 2 Tropfen Eosin zusetzte, kontrastierten die Samenzellen im gleichmäßig angefärbten Filtrat. Ohne den senkrechten erschütterungsfreien

Stand des Reagenz- glases zu beeinträchtigen, war es bei 200-facher Vergrößerung möglich, durch Regulierung der Tiefenschärfe in den Schichten kontinuierlich zu ”wandern“. Neben dem Vorherrschen stochastischer Bewegungsbahnen, waren solche registrierbar, die bei spitzwinkeligem Wandauftreffwinkel, eine spitzwinkelige Richtungsänderung erfuhren. Im nicht konischen Teil des Reaktionsgefäßes hingegen, wo rechtwinkeliges Auftreffen wahrscheinlicher ist, waren an der Grenzfläche alternative Richtungswechsel zum Flüssigkeitsspiegel hin häufiger (siehe Abbildung 7; rot markierte Bewegungs- bahn). Mit dem Fortschreiten der Zeit, noch vor dem Erreichen der ½ Stunde nach Filtration, war tendenziell Abwärtsbewegung häufiger zu registrieren, als Aufwärtsbewegung der Spermatozoen. Der sich konisch verjüngende untere Teil des Gefäßes gewann dabei zunehmend an Bedeutung. Jetzt hier spitzwinkelig auftreffende Spermien nahmen zunehmend regelmäßig einen spitzwinkeligen zum Boden gerichteten Richtungswechsel vor. Dabei imponierte die hohe Samenzelldichte am Gefäßboden wie ein ”Schneegestöber“.


46

2) ”Parallelversuch“

Im letzten Abschnitt wurde die Hauptversuchsreihe um ein Element erweitert. Unter Gewährleistung weiteren standardisierten Vorgehens erfolgte mit dem selben Ausgangsejakulat parallel Filtration in ein herkömmliches Reagenzglas ohne Konusansatz. Bodenentnahmen nach 30 min konnten keinen Konzentrierungseffekt nachweisen. Spermien- verteilung, Spurgeschwindigkeit und CASY®-Meßkanal der höchsten Samenzelldichte bei bestimmtem Membrandurchmesser (Max) ergaben Meßwerte, die dem Vorversuch (Entnahme Mitte, nach Filtration und Durchmischung) glichen. Lichtmikroskopisch konnten neben stochastischen, keine gerichteten Spermozoen-Bahnverläufe beobachtet werden.

3) ”Schichtenversuch“

Aus den angestellten Beobachtungen erwuchs eine Frage ganz praktischer Bedeutung: ”Wie hoch reicht der Spermatozoen- Konzentrationspool?“ -oder anders formuliert- ”Welche hochqualitative Filtratmenge ist verfügbar?“

Diese Überlegung war Ausgangspunkt für den ”Schichtenversuch“. Das standardisierte Vorgehen entsprach dem des Hauptversuches. Bei einer Filtratmenge von circa 1100 µl (800 µl CASYton® + 400 µl durchmischtes Ejakulat - Filterrückstand) wurde nach 30 min vom Gefäßboden 100 µl-weise abpipettiert. Mit abfallender Spermien- konzentration ergab sich ”Schicht“ 1 bis 10, die der CASA- Konzentrationsmessung zugeführt wurden (siehe Tabelle 10).

Das native Ejakulat wies in drei Meßreihen nach Anpassung an die ”Klassische Zählung“ eine mittlere Spermatozoenkonzentration von 35,6 Mio/ml auf. Bei kontinuierlichem Spermatozoenabfall vom Gefäßboden in Richtung Filtratspiegel, ähnlich einer Titrationsreihe, konnte gezeigt werden, daß noch in der 5. ”Schicht“ ein Mittelwert von 19,7 Mio/ml am Boden des Eppendorf-Gefäßes nachweisbar ist. Der Gefäßformeffekt der Spermienkonzentrierung wurde auch nach Pipettieren in jeder ”Schicht“ erneut wiksam. Somit stehen 500 µl hochqualitative Filtratmenge zur Verfügung.


47

In Abhängigkeit von der weiteren Nutzung (z. Bsp. homologe Insemination) und geforderter seminalplasmafreier Spermiensuspension, kann das gesamte Filtrat auch einem Zentrifugationsschritt unterzogen werden. Nach Dilution und Filtration beträgt der Seminalplasma-Anteil allerdings maximal 20 %. Eine Zentrifugation nach erfolgter Filtration ist als unproblematisch anzusehen, da das Filtrat kaum noch Leukozyten und defekte Spermatozoen enthält, die ja in erster Linie als Produzenten von freien Radikalen in Betracht kommen.

Tabelle 10: Mittelwerte der CASA-Konzentrationswerte bei schichtweiser Entnahme von je 100 µl nach Filtration vom Gefäßboden; n = 3


48

Was nutzt ein effizientes Spermienselektionsverfahren ohne ausreichende Konzentrierung. Die Chronik der Glaswolle-Filtration reicht von Jeyendran et al. (1986) über Van der Ven et al. (1988) bis Rhemrev et al. (1989). Kontinuierlich wurde das Verfahren hinsichtlich des Filteraufbaues modifiziert. Den Versuchsabläufen gemein war dabei stets eine der Filtration vorangestellte Zentrifugation diluierten nativen Ejakulates. Anschließend erfolgte die sanfte Beschickung der Glaswolle-Filteroberfläche. Im Laufe der Vervollkommnung der Glaswolle-Filtration zu einem hocheffizienten Spermienpräparationsverfahren blieb jedoch die Zentrifugation stets essentieller Konzentrierungsschritt.

Aitken und Clarkson (1988 und 1989) zeigten, wie Zentrifugation unselektierter Spermienpopulationen nativen Ejakulats ursächlich für die Produktion von Hyperoxid, Wasserstoffperoxid und Hydroxyl- Radikalen ist. Deren Übergang innerhalb der zellkompaktierten Pellets auf ”intakte“ Samenzellen, verursacht irreversible Schäden. Die besonders in oligozoospermen Ejakulaten von Spermatozoen selbst, als auch von Makrophagen und Neutrophilen freigesetzten reaktiven Sauerstoffradikale, führen durch ihr außerordentliches Schädigungspotential nachweislich zu einer Beeinträchtigung der Fertilisierungsfähigkeit. Aufgrund gleichen Schädigungsmechanismus’, forderte Mortimer (1991) die Einstellung multipler Wasch-Schritte vor der Separation der motilen Population. Trotz einhelliger Meinung, daß Zentrifugation zu iatrogener Spermienmembran- schädigung führt -im Extremfall kann das bei einem Mann mit von vornherein verminderter Samenqualität eine Fertilisierung verhindern-, konnte mangels anderer Möglichkeiten der Konzentrierung bislang nicht auf diese verzichtet werden.

Damit wird die Tragweite des hier gefundenen gefäßformbedingten Konzentrierungseffektes deutlich. Während es sich bei Zentrifugation um von außen einwirkende Fliehkraft handelt, ist die an konischer Grenzfläche induzierte ”Mechanotaxis“ eine aktive gerichtete Leistung des Lebens.


49

Bei bislang gefundenen nicht zufälligen Unterschieden in Spermatozoenkonzentration, Spurgeschwindigkeit, Membrandurch- messer und Morphe erscheint die Vorabäußerung, es könne sich nur um passives zu Boden sinken qualitativ minderwertiger Spermien handeln, nicht realistisch.

In Anbetracht der Spermatozoenaszension im weiblichen Genitaltrakt als komplexen Vorgang, sind Erklärungsmuster nicht immer schlüssig. Schumacher (1987) schreibt von ”Druckwirkung fördert den Eintritt der Spermatozoen in die Tuben“ und ”bemerkenswerter Fähigkeit der Tube“. Anatomisch-physiologisch passiert das Spermium die als ”Durchgangsstraße“ fungierende Cavitas uteri. Der weitere Weg führt des Spermatozoon in Richtung eines sich verjüngenden Lumens, dem Ostium uterinum tubae, weiter durch den Isthmus tubae, der mit einem Durchmesser von 2-3 mm engsten Stelle des Eileiters. Sich unmittelbar anschließend, folgt der Ort der Befruchtung, die Ampulle. Neben physikalisch-chemischer Eigenschaften des Zervikalsekrets und hormoneller Steuerung im Sinne einer Chemotaxis, findet sich auch hier ein Anhalt für eine mechanische Komponente, welche die gerichtete Spermienmotilität anregt.

7.3.2. Entnahme unterhalb Filtratspiegel

Durch die Wahl dieses zweiten Entnahmeortes sollten zu Vergleichszwecken die Verhältnisse am ”Gegenpol“ des Eppendorf- Gefäßes untersucht werden. Die unterhalb des Filtratspiegels registrierten Ergebnisse demonstrieren, daß sich dort im Gegensatz zum ”Konzentrationspol“ Gefäßboden keine hochmotilen Spermato- zoen befinden. Der Filtrat-”Überstand“ hingegen ist mit einer Spermatozoenkonzentration nach Angleichung an die ”Klassische Zählung“ von 3,7 Mio/ml und einer drastischen Spurgeschwindig- keitsabnahme linear motiler Samenzellen auf ¼ des Nativwertes für assistierte Reproduktion nicht verwertbar.


[Titelseite] [Abkürzungsverzeichnis] [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [Bibliographie] [Anhang] [Selbständigkeitserklärung] [Danksagung] [Lebenslauf]

© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiDi DTD Version 1.1
a subset from ETD-ML Version 1.1
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Tue Jun 22 15:48:46 1999