Weber, Holm: ”Optimierung der Glaswollefiltration von menschlichen Ejakulaten zum Zwecke der assistierten Reproduktion und für labordiagnostische Untersuchungen“

Aus der Hautklinik, Abteilung Andrologie
des Universitätsklinikums Charite’


Medizinische Fakultät der Humboldt-Universität zu Berlin
(Direktor: Prof. Dr. med. S. Engel)

Dissertation
”Optimierung der Glaswollefiltration von menschlichen Ejakulaten zum Zwecke der assistierten Reproduktion und für labordiagnostische Untersuchungen“

zur Erlangung des akademischen Grades
doctor medicinae
(Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät der
Humboldt-Universität zu Berlin

von
Herrn Holm Weber
geb. am 06. September 1968 in Freiberg

Dekan: Prof. Dr. med. W. Sterry

Gutachter:
1. Prof. Weitze
Institut für Reproduktionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
2. Prof. Kentenich
Frauen- und Kinderklinik DRK Berlin
3. Prof. Engel
Andrologische Abteilung der Dermatologischen Klinik Charité Berlin

eingereicht: September 1998
Datum der Promotion: April 1999

Abstract

An efficient procedure for sperm preparation is presented using glass wool (microfibre code 112) in a special filter arrangement. Centrifugation as a means of spermatozoa concentration, a process which is extremely harmful to the sperm cells, can be dispensed with by making use of a concentration effect induced by the form of the vessel. The results that follow are mean values from 30 measurements. Computer-Assisted Sperm-motility Analysis (CASA) shows a significant rise of the sperm cell contents in the filtrate (27,45 vs. 69,56 million/ml) as compared with the native ejaculate. The distribution ratio of sperm populations observed after glass wool filtration provides favourable conditions for assisted reproduction. Reduction of the immotile portion to one fifth (54,53 vs. 11,66 %) yields a consecutive rise of the portion of motile sperms (39,53 vs. 82,06 %). Further specification of motile spermatozoa shows a shift in favour of sperms moving in a straight line. The decrease of the portion moving in circles is significant (34,96 vs. 31,1 %) after filtration, whereas the reduction in the subpopulation of sperms not moving in a straight line is of a rather incidental nature. Of particular interest, however, is the increase in sperm cells moving in straight lines (7,36 vs. 12,43 %). Basing considerations on absolute figures , a nine-fold increase in spermatozoa moving in straight lines, from the native value of 0,8 to 7,1 million/ml, can be demonstrated (even for oligozoospermial ejaculates) after filtration. Their curvilinear velocity (VCL) rises, in this connection, to a disproportionately high degree (41,26 vs. 62,66 µm/sec), whereas a filtration-induced rise of the VCL by only 10 µm/sec is observed for all motile spermatozoa on the average. Furthermore, a Cell Counter + Analyser System (CASY®) was employed making use of a particle test procedure. In this way, it could be proved that glass wool filtration produces a marked enrichment in a population of sperm cells with a mean membrane diameter of 3,47 µm with simultaneous reduction of the small- and large-corpuscular (cellular and non-cellular) fractions. In keeping with this are the results of the morphological differentiation (strict criteria). A significant increase in the standard form (13,33 vs. 19,16 %) with an adequate reduction in macro and micro heads (6,5 vs. 3,03 %) as well as in prestages (8,33 vs. 5,96 %) could be observed after filtration. Pictures taken with the electron-scan microscope clearly show that spermatozoa presenting membrane defects as well as mucous proteins, in particular, attach to the glass wool fibre surface.

Keywords:
Glass wool filtration, Sperm preparation, Vessel form, Human

Zusammenfassung

Mittels Glaswolle (Microfibre code 112) in einer speziellen Filtrations-Anordnung steht ein effektives Spermienpräparations- verfahren zur Verfügung. Durch Ausnutzung eines gefäßform- induzierten Konzentrierungseffektes kann auf samenzellschädigende Zentrifugation zur Spermatozoen-Anreicherung verzichtet werden. Folgend aufgeführte Ergebnisse sind Mittelwerte aus 30 Messungen. Die Computer-Assistierte Spermienmotilitäts-Analyse (CASA) zeigt eine gegenüber dem nativen Ejakulat signifikante Erhöhung der Spermienkonzentration im Filtrat (27,45 vs. 69,56 Mio/ml). Das Verteilungsverhältnis der Samenzell-Populationen nach Glaswolle- Filtration bietet gute Voraussetzungen für assistierte Reproduktion. Unter Abnahme des immotilen Anteils auf 1/5 (54,53 vs. 11,66 %), erhöht sich konsekutiv der motile Spermien-Anteil (39,53 vs. 82,06 %). In der weiteren Spezifisierung motiler Spermatozoen, kann eine Verschiebung zugunsten linear motiler Spermien registriert werden. Während die Verringerung der nicht linear motilen Subpopulation nur zufälligen Charakters ist, weist der Kreisläuferanteil post filtrationem einen signifikanten Rückgang auf (34,96 vs. 31,1 %). Der Zuwachs linear motiler Samenzellen ist jedoch von besonderem Interesse (7,36 vs. 12,43 %). Bei Zugrundelegung von Absolut- zahlenwerten, läßt sich (auch für oligozoosperme Ejakulate) ein nahezu 9-facher Anstieg linear motiler Spermatozoen von nativ 0,8 auf 7,1 Mio/ml nach Filtration demonstrieren. Ihre Spurgeschwindigkeit (curvilinear velocity-VCL) nimmt dabei überproportional zu (41,26 vs. 62,66 µm/s), während sich über alle motilen Spermien im Mittel nur eine filtrationsbedingte VCL-Erhöhung von 10 µm/s abzeichnet. Weiterhin kam ein Cell Counter + Analyser System (CASY®) zum Einsatz, das ein Verfahren der Partikelmeßtechnik nutzt. So gelang der Nachweis, daß die Glaswolle-Filtration unter Reduktion klein- und großkorpuskulärer Bestandteile (zelluläre und nichtzelluläre) eine deutliche Anreicherung einer Samenzell-Population mit medianen Membrandurchmesser von 3,47 µm bewirkt. Die Ergebnisse der morphologischen Differenzierung (strict criteria) stehen damit im Einklang. Nach Filtration konnte eine signifikante Zunahme der Normalform (13,33 vs. 19,16 %) bei adäquater Verminderung von Makro- und Mikroköpfen (6,5 vs. 3,03 %) sowie Vorstufen (8,33 vs. 5,96 %) registriert werden.

Auf den raster-elektronen-mikroskopischen Aufnahmen wird deutlich, wie besonders membrandefekte Spermatozoen und muköses Eiweiß der Glaswolle-Faseroberfläche verhaften.

Schlagwörter:
Glaswoll-Filtration, Spermienpräparation, Gefäßform, Mensch


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Inhaltsverzeichnis

Titelseite”Optimierung der Glaswollefiltration von menschlichen Ejakulaten zum Zwecke der assistierten Reproduktion und für labordiagnostische Untersuchungen“
Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
1 Einführung
2 Problemstellung
3 Patienten und Untersuchungsmethoden
3.1.Patientenauswahl
3.2.Spermatologische Basisdiagnostik
3.3.Computer-Assistierte Spermienmotilitäts-Analyse (CASA)
3.4.Cell Counter + Analyser System (CASY®1)
3.5.Morphologische Differenzierung
3.6.Raster-Elektronen-Mikroskopische Filteranalyse
3.7.Statistische Verfahren
4 Versuchsaufbau
4.1.Materialien
4.2.Filterpräparation
4.3.Anordnung der Filterelemente
5 Durchführung
5.1.Vorversuch
5.2.Hauptversuch
5.2.1.Entnahme Gefäßboden
5.2.2.Entnahme unterhalb Filtratspiegel
6 Darstellung der Ergebnisse
6.1.Vorversuch
6.2.Hauptversuch
6.2.1.Entnahme Gefäßboden
6.2.1.1. Computer-Assistierte Spermienmotilitäts-Analyse (CASA)
6.2.1.2.Cell Counter+Analyser System (CASY®)
6.2.1.3.Morphologische Differenzierung
6.2.1.4.Raster-Elektronen-Mikroskopische Filteranalyse
6.2.1.5.Statistische Verfahren
6.2.2.Entnahme unterhalb Filtratspiegel
7 Diskussion der Ergebnisse
7.1.Geeigneter Filteraufbau
7.2.Vorversuch
7.3.Hauptversuch
7.3.1.Entnahme Gefäßboden
7.3.1.1.Computer-Assistierte Spermienmotilitäts-Analyse (CASA)
7.3.1.2.Cell Counter+Analyser System (CASY®)
7.3.1.3.Morphologische Differenzierung
7.3.1.4.Raster-Elektronen-Mikroskopische Filteranalyse
7.3.1.5.Gefäßformeffekt
7.3.2.Entnahme unterhalb Filtratspiegel
8 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis
Anhang A Bildanhang
Selbständigkeitserklärung
Danksagung
Lebenslauf

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der CASA- und CASY®-Meßergebnisse vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); statistische Aussage rechts mit Signifikanzen entsprechend Hauptaussage (H1); n = 10
Tabelle 2: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der CASA-Meßergebnisse in Korrelation mit der ”Klassischen Zählung“ vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); wiederspiegelt reale Zahlenverhältnisse; n=30
Tabelle 3: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der CASA-VCL-Werte vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); n = 30
Tabelle 4: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der CASY®-Meßergebnisse vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); n = 30
Tabelle 5: Ergebnisse der detaillierten morphologischen Differenzierung vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); rechts statistische Signifikanz entsprechend Hauptaussage (H1); n = 30
Tabelle 6: Statistische Aufarbeitung der Ergebnisse des Hauptversuches; zunächst Prüfung auf Normalverteilung mittels Kolmogorov-Smirnov-Test; Student-t-Test zur Ermittlung des p-Wertes; abgeleitete Signifikanz entsprechend Hauptaussage (H1); n = 30
Tabelle 7: Statistische Aufarbeitung der Ergebnisse des Hauptversuches; zunächst Prüfung auf Normalverteilung mittels Kolmogorov-Smirnov-Test; Student-t-Test zur Ermittlung des p-Wertes; abgeleitete Signifikanz entsprechend Hauptaussage (H1); n = 30
Tabelle 8: Mittelwert (MW) und Standardabweichung (SD) der CASA- und CASY®-Meßergebnisse vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (F); n = 30
Tabelle 9: Statistische Aufarbeitung der Ergebnisse des Hauptversuches (2. Teil); zunächst Prüfung auf Normalverteilung mittels Kolmogorov- Smirnov-Test; Student-t-Test zur Ermittlung des p-Wertes bzw. Wilcoxon-Test; abgeleitete Signifikanz entsprechend Hauptaussage (H1); n = 30
Tabelle 10: Mittelwerte der CASA-Konzentrationswerte bei schichtweiser Entnahme von je 100 µl nach Filtration vom Gefäßboden; n = 3

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1:Modell der Filter-Gefäß-Einheit standardisiert für alle 3 Versuchsreihen
Abbildung 2: Gegenüberstellung der Entnahmeorte und -bedingungen
Abbildung 3: Graphische Darstellung der prozentualen Spermatozoen- Fraktionen; natives Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (Fb)
Abbildung 4: Spermatozoenkonzentrationswerte in Mio/ml beider apparativer Meßverfahren vom nativen Ejakulat (N) im Vergleich mit dem Filtrat (Fb); n = 30
Abbildung 5: Graphische Darstellung der detaillierten morphologischen Differenzierung vom nativen Ejakulat (gelb) im Vergleich mit dem Filtrat (braun) in %; n = 30
Abbildung 6: Plot im Format der statistischen Regression für die Nativ- Konzentrationswerte CASA/Klassische Zählung, einschließlich Vorversuch; n = 40
Abbildung 7: Konisches Reaktionsgefäß; Hauptstrom der Spermienbewegung (gelb)

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