| Wolf, Tilo: Nichtinvasive Messung von regionalen cerebralen Oxygenierungsänderungen während Leão´s ”cortical spreading depression“ und spontanen Depolarisationen bei fokaler cerebraler Ischämie mit der Nah-Infrarot-Spektroskopie. |
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Diese Arbeit ist der ”cortical spreading depression“ (CSD) und der optischen Methode der Nah-Infrarot-Spektroskopie (NIRS) gewidmet, deren Potential für die nichtinvasive Detektion und Messung der CSD im Hinblick auf Migränepatienten und Patienten mit cerebraler Ischämie exploriert werden sollte. Das erste Ziel der Studien, die zu dieser Dissertation beigetragen haben, ist mithin die Beantwortung der Frage, ob sich die Nah-Infrarot-Spektroskopie eignet, die CSD und spontan in der Umgebung fokaler cerebraler Ischämien entstehende Periinfarktdepolarisationen (PID) nichtinvasiv im Tiermodell nachzuweisen, um auf diese Weise den Weg für Untersuchungen in Migräne- und Schlaganfallpatienten zu bahnen. Darüberhinaus zielten diese Studien darauf ab herausfinden, ob die Veränderungen der cerebralen Oxygenierung bei beiden verschiedenen Formen der CSD sich mit NIRS unterscheiden und für eine Identifikation des Phänomens nutzen lassen.
Die CSD wurde erstmals vor mehr als 50 Jahren von dem brasilianischen Epilepsieforscher Aristides Leão als ”spreading depression of cortical activity“ beschrieben, der elektrocorticografische Messungen an Kaninchen ausführte [Leao, 1944]. Sie ist eine massive und simultane Depolarisierung nicht nur der Neuronen, sondern auch glialer Parenchymzellen des betroffenen Cortexabschnitts (”cortical“) mit zeitweiligem Funktionsverlust (”depression“) und wandert über den ipsilateralen Cortex (”spreading“).
Daß die CSD seit fünfzig Jahren nicht aufgehört hat, immer neue Forschergenerationen zu faszinieren, liegt daran, daß dieses eindrucksvolle Phänomen der Hirnrinde in den pathophysiologischen Szenarien zweier der wichtigsten neurologischen Erkrankungen eine immer wichtigere Rolle spielt: Der Migräne und dem Schlaganfall.
Seit den vierziger Jahren gilt die CSD als Modell der Migräneaura [Lashley, 1941]: Mit ihrer typischen Geschwindigkeit, ihren neuronalen Exzitationsphänomenen und dem nachfolgenden zeitweiligen Zusammenbruch der spezifischen neuronalen Aktivität liefert sie für das wandernde Flimmerskotom der visuellen Migräneaura ein schlüssiges Korrelat [Hardebo, 1991; Lauritzen, 1994].
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Abbildung 1: Das Flimmerskotom der Migräneaura als elektrophysiologisches Phänomen des primären visuellen Cortex´: links die Ausbreitung des Flimmerskotoms nach [Lashley, 1941] , der rechte Teil der Abbildung bezieht sich auf Durchblutungsmessungen während einer Migräneattacke [Lauritzen, 1987a].
In experimentellen fokalen Ischämien finden sich ebenfalls langsame, der CSD ähnliche Depolarisationswellen [Nedergaard, Hansen, 1993]. Während jedoch die CSD im normal perfundierten Gehirn keinen anatomischen Schaden verursacht [Nedergaard, Hansen, 1988], vergrößern die spontanen Depolarisationen in der Umgebung frischer fokaler Ischämien im Tierversuch den Infarkt [Hossmann, 1996].
Die CSD läßt sich in den Tiermodellen der Migräneaura und der fokalen cerebralen Ischämie technisch einfach nachweisen. Ihr Nachweis im Menschen jedoch blieb bis heute überaus schwierig. Wir sind hier auf nichtinvasive Methoden angewiesen. Obwohl es elektrophysiologische Untersuchungsmethoden wie die Magnetoenzephalografie gibt, die die CSD auch im Menschen potentiell nachweisen können, geben einfacher zugängliche Methoden uns eher eine Chance, die CSD im Menschen anhand sekundärer Phänomene praktisch dingfest zu machen, etwa durch Messung von typischen Änderungen der regionalen cerebralen Durchblutung.
Seit der Erstbeschreibung der CSD wurde eine große Anzahl von Untersuchungen durchgeführt, die auf die Aufklärung ihrer Mechanismen hinzielten. Dennoch sind wir noch immer weit von einer umfassenden Theorie der Physiologie (und Pathophysiologie) der CSD entfernt: Die Befunde sind bunt und variieren zwischen den Tiermodellen (z.B. Ratte, Springmaus, Katze), den verschiedenen Hirnregionen
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(z.B. Cortex, Hippocampus, Retina), Anästhesieformen (z.B. Halothan, Barbiturat), Untersuchungsmethoden und Labors.Im Rest dieser Einleitung werde ich Befunde zu den wesentlichen Charakteristika der CSD referieren, soweit sie für unsere Fragen von Bedeutung sind, und ich werde die verwendeten - bis auf die polarografische Sauerstoffmessung ausnahmslos optischen - Methoden kurz vorstellen. Im zweiten Teil der Arbeit werden zunächst die Hypothesen aufgestellt, die Anlaß für diese Arbeit waren. Danach werden die Modelle erläutert, bevor die Ergebnisse der Studien dargestellt werden. Der dritte Teil des Textes befaßt sich mit der Diskussion der Daten und daraus zu ziehenden Schlußfolgerungen.
Die CSD wird experimentell am häufigsten durch corticale Applikation von Kaliumchlorid (die Schwelle liegt bei etwa 80 mM [Bures et al., 1974]) ausgelöst. Für die intracorticale Injektion genügen Konzentrationen um etwa eine Zehnerpotenz niedriger (10-12 mM [Nicholson, Kraig, 1981]), bei hohen Konzentrationen ist auch die epidurale Applikation ausreichend. Die Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration führt zur Depolarisation von präsynaptischen Nervenendigungen, die ausreicht, spannungsabhängige Kationenkanäle zu öffnen. Der folgende Natrium- und Kalzium-Einstrom führt zur Freisetzung exzitatorischer und inhibitorischer Neurotransmitter. Freigesetztes Glutamat öffnet subsynaptische rezeptorgebundene Kationen-Kanäle an Dendriten und führen so zu einer Depolarisierung der Zellmembran.
Manche Experimentatoren nutzen einen kleinen superfiziellen corticalen Nadelstich (”pin prick“), der aber den Nachteil hat, nicht beliebig oft wiederholbar zu sein. Die tetanische Stimulation mit implantierten corticalen Elektroden hat sich bei Versuchen mit wachen Tieren [Buresova, Bures, 1985; Koroleva, Bures, 1993] bewährt. Auch die lokale Applikation von Glutamat ist zum Anstoß einer CSD geeignet. Für den Präparator ist es wichtig zu wissen, daß eine CSD auch schon durch die einfache Berührung des Cortex mit einem stumpfen Gegenstand ausgelöst werden kann.
Es ist nach wie vor nicht geklärt, warum die CSD ohne weiteres bei lyssencephalen Tieren, aber mit zunehmendem Grad der cerebralen Furchung immer schwieriger auslösbar ist: Ratten und Kaninchen sind hierfür unproblematisch (auch wenn sich viele der nachfolgenden physiologischen Effekte in beiden Spezies unterscheiden), bei Katzen macht sich häufig eine Konditionierung des Cortex (z.B. durch
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Luft-Exposition vor dem Versuch) erforderlich, in Primaten ist eine experimentelle Auslösung bisher nur in Operationspräparaten, nicht aber in vivo geglückt. Beim Menschen wurde ein einziger Kasus einer klinisch nachgewiesenen CSD veröffentlicht [Mayevsky et al., 1996].In Leão´s Versuchen erreichte die spontane elektrische Aktivität unter den jeweiligen Elektroden innerhalb 30 Sekunden ein Minimum, bei dem sie für 2-3 Minuten verweilte, um sich dann langsamer, d.h. binnen 5-10 Minuten wieder völlig zu erholen [Leao, 1944]. Dabei ist während der CSD die EEG-Aktivität nie ganz erloschen. Eine Welle dieser ”Depression“ wandert mit 2-5 mm/min [Leao, Morrison, 1945; Csiba et al., 1985] über den Cortex des Versuchstieres. Die markantesten Messungen erzielte Leão mit bipolaren Ableitungen, bei denen der Elektrodenabstand die ”Wellenlänge“ (Dauer mal Geschwindigkeit) der CSD unterschritt; monopolare Ableitungen dagegen ergaben weniger deutliche Resultate, da sie die Messung über größere Cortexareale integrieren.
Aufgrund der massiven simultanen Depolarisation der Zellen des Hirnparenchyms kommt es während der CSD zu einer deutlichen Negativierung des corticalen Gleichspannungspotentials um 5 bis 30 mV [Bures et al., 1974] (synonym: langsames Summenpotential, ”slow potential“, Gleichspannung : ”direct current“: DC, es soll im folgenden in Anlehnung an die moderne Literatur DC-Potential genannt werden). Daraus ergibt sich die Möglichkeit, die CSD elektrophysiologisch mit Messungen des Gleichspannungspotentials zu beobachten. In der Tat stellt dies die einfachste, robusteste und mittlerweile auch am häufigsten praktizierte Methode des elektrophysiologischen Nachweises der CSD im Tierexperiment dar. Als Ursache dieser Spannungsänderungen wurden Stromvektoren in zentripetalen Axonen diskutiert [Marshall, 1959], es dürfte hierfür jedoch vor allem der massive Anstieg der extrazellulären Kaliumkonzentration (s.u.) verantwortlich sein: Die Gliazellmembran wird schon durch geringen Anstieg der interstitiellen Kaliumkonzentration beträchtlich depolarisiert. Eine regionale Depolarisation verursacht eine Potentialdifferenz zu den entfernt liegenden Nachbarn im glialen Synzytium, und durch die niederohmigen Zellverbindungen kommt es zu Stromvektoren als Quelle
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der DC-Potentialveränderungen [Kuffler, 1967]. Auch andere Ionen wie Chlorid- oder Wasserstoffionen sind daran beteiligt [Marshall, 1959].Das DC-Potential beschreibt typischerweise einen biphasischen Verlauf mit einer raschen starken Negativierung (Depolarisierung), die sich nach etwa 12 Minuten umkehrt (Repolarisierung) und in eine - weniger starke - Positivierung (Hyperpolarisierung) übergeht, um sich nach wenigen weiteren Minuten wieder zu normalisieren (siehe Abb. 2: DC-Kurve B-A´). Es ist auch nicht ungewöhnlich, keine positive Auslenkung der DC-Kurve oder noch vor der Negativierung eine präkursorische Positivierung des DC-Potentials anzutreffen [Marshall, 1959; Bures et al., 1974] (siehe auch Abb.2: DC-Kurve B-A´´).
Abbildung 2: Corticale spreading depression in der Ratte. Bipolare EEG-Ableitungen zwischen den Elektroden 1 und 2, 2 und 3 etc. (Kurven sind unten fortgesetzt) und Messungen des langsamen Summenpotentials zwischen der kontralateralen Referenzelektrode B und den Elektroden A´ und A´´. Mit der von occipital nach rostral verzögert einsetzenden EEG-Abflachung korreliert die wandernde Negativierung des langsamen Summenpotentials (siehe unten). Aus [Bures et al., 1974].
Die umfassende Depolarisation des Parenchyms ist nicht die erste Manifestation der CSD: Im Beginn der Wellenfront steht vielmehr ein Anstieg der Aktivität
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neuronaler Einheiten (synonym: population spikes, neuronal burst of action potentials, intense synaptic noise) auf 200-300 % der Ruheaktivität, kurz vor oder auch noch mit dem steilen Abfall des DC-Potentials [Leao, 1944; Herreras et al., 1994]. Diese neuronalen bursts haben Amplituden von mehreren Millivolt und halten ca. 20 Sekunden an, wonach sie von etwa 180 Sekunden ”Funkstille“ gefolgt werden [Herreras et al., 1994]. Die völlige Erholung zur Ruheaktivität braucht etwa weitere 230 Sekunden [Amemori, Bures, 1988].Abbildung 3: DC-gekoppelte Aufzeichnung prodromaler ”neuronal bursts“ bei der ”cortical spreading depression“ (CSD) in ihrer zeitlichen Beziehung zur Negativierung des DC-Potentials. Die drei Kurven stellen Messungen derselben Episode einer CSD dar, nacheinander an verschiedenen Orten in verschiedenen Cortextiefen gemessen. Nach [Herreras et al., 1994]
Um so hohe Amplituden zu erklären, muß man von der synchronen Entladung vieler Neurone ausgehen. Wie eine solche Synchronisierun erfolgt, ist noch unklar. Sie ist jedenfalls nicht von synaptischer Übertragung abhängig [Sugaya et al., 1975] und unterscheidet sie sich dadurch wesentlich von epileptischen Mustern [Bures et al., 1974; Somjen et al., 1992; Herreras et al., 1994]. Möglicherweise spielen auch hier Ströme in gap junctions eine entscheidende Rolle [Herreras et al., 1994].
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Während der CSD kommt es - nicht durch die initialen neuronal spikes, sondern durch die anschließende Pan-Depolarisation des Parenchyms - zu drastischen Veränderungen der Ionenbalance [Bures et al., 1974; Kraig, Nicholson, 1978; Hansen, Zeuthen, 1981; Kraig et al., 1983; Bonthius et al., 1994]: Kalium verläßt durch subsynaptische Kanäle die Zelle und diffundiert in die Umgebung; seine Konzentration steigt extrazellulär von normal 3 mM auf etwa 60 mM an. Die extrazellulären Konzentration von Natrium fällt von normal 130 mM auf 70 mM und für Kalzium von normal 1,5 auf 0,15 mM ab. Die freigesetzten inhibitorischen Neurotransmitter öffnen Anionenkanäle, die zum Einstrom von Chlorid in die Zelle führen. Das in die Zelle einströmende NaCl nimmt osmotisch gebundenes Wasser mit in die Zelle, wodurch der Extrazellulärraum zugunsten des Intrazellulärraumes schrumpft. Auch auf das gliale Kompartiment hat die hohe interstitielle Kaliumkonzentration Auswirkungen: Im astrozytären Synzytium [Peters et al., 1991] wird es aufgenommen und diffundiert sehr schnell ab. Diese Kaliumströme tragen wesentlich zum negativen extrazellulären Potential bei [Hossmann, 1996].
Durch die massive Depolarisation der corticalen Zellen kommt es zur Freisetzung verschiedener Neurotransmitter. Die extrazelluläre Glutamatkonzentration verzwanzigfacht sich [Scheller et al., 1991] und trägt über NMDA-Rezeptoren zur Propagation der CSD bei, so daß die CSD mit NMDA-Antagonisten wie MK801 geblockt werden kann [Lauritzen, Hansen, 1992]. Auch etwa zehnfache Konzentrationsanstiege von Aspartat [Scheller et al., 1991] und Catecholaminen [Pavlasek et al., 1993] [Moghaddam et al., 1987] sind während CSD meßbar.
Die meiste Energie benötigt das Gehirn für die Aufrechterhaltung der transmembranösen Ionengradienten. Hierfür extrahiert es etwa 10% der Blutglucose und etwa 50% des Blutsauerstoffs [Ueki et al., 1988]. Um die in der CSD zusammengebrochene Homöostase der Ionenverteilung wiederzuerlangen, müssen die Zellen mit ihren Ionentransportern eine hohe zusätzliche Energie aufwenden [Gjedde et al., 1981], die sich in erhöhtem Sauerstoff-und Glucoseverbrauch widerspiegelt. Es verringert sich die Konzentration energiereicher intrazellulärer und extrazellulärer Substrate deutlich: ATP sinkt auf 62%, Phosphocreatin auf 24%, die interstitielle Glucosekonzentration auf etwa 50% [Csiba et al., 1985]. Dem parallel geht ein gleichzeitig auf 200-300% gestiegener Glucoseverbrauch [Gjedde et al., 1981; Nedergaard, Astrup, 1986]. Einige Autoren haben auch einen Anstieg des Sauerstoffverbrauchs um etwa 50 % gezeigt [Mayevsky, Weiss, 1991]. Gleichzeitig steigt jedoch die Lactatkonzentration auf etwa 200% an [Gault et al., 1994] und der pH fällt auf etwa 6,9 ab [Kraig et al., 1983], was auf eine Zunahme der anaeroben Glycolyse deutet.
Für die Aktivierung des Energiestoffwechsels wurde als Stimulus der mitochondriale Kalziumeinstrom eher als die Aktivierung der K-Na-ATPase verantwortlich gemacht [Erecinska et al., 1997].
Die akuten Blutflußveränderungen bei der CSD werden meist im Zusammenhang mit dem Energiestoffwechsel betrachtet, denn das Parenchym des Gehirns verfügt, anders als andere Organe, kaum über Energiereserven. Ohne Blutfluß kann die Ionenhomöostase allenfalls 2 min aufrechterhalten werden [Hansen, 1978]. Eine akute, kurz anhaltende Hyperperfusion auf das Doppelte bis Dreifache des Ruheflusses folgt den Ionenverschiebungen unmittelbar [Lauritzen, 1987b; Duckrow, 1993]. Obwohl nach wie vor nicht geklärt ist, ob eher Sauerstoff oder Glucose der limitierende Faktor sei, besteht Konsens, daß dieser Blutflußanstieg zur gesteigerten Substratbereitstellung während der akuten metabolischen Belastung zweckmäßig ist. Als potentielle Vermittler der cerebraler Blutflußveränderungen werden Protonen [Niwa et al., 1993; Wolf et al., 1997b], Adenosin [Rubio et al., 1975; Dirnagl et al., 1994], Kalium [Paulson, Newman, 1987; Dreier et al., 1995], die Substrate Sauerstoff und Glucose [Duckrow et al., 1985; Lopez-Barneo, 1994; Wolf et al., 1997b], Stickstoffmonoxid (NO) [Zhang et al., 1994; Wolf et al., 1996], und auch neurogene Mechanismen [Lou et al., 1987] diskutiert.
Simultan zu der Hyperperfusion bei CSD wurde ein Anstieg der Gewebsoxygenierung gemessen [Back et al., 1994b], während manche Studien eine Abnahme zeigen [Mayevsky et al., 1980].
Nach Ablauf der CSD wird in vielen Modellen eine langanhaltende Hypoperfusion (14C-Iodoantipyrin) auf ca. 70% für Stunden gesehen [Lauritzen, 1984].
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Über Veränderungen der regionalen cerebralen Blutoxygenierung des Gehirns während CSD gibt es in der Literatur keine Daten.Abgesehen von den Veränderungen im Energiestoffwechsel führt die CSD zu ausgedehnter Induktion von immediate early genes, etwa aus der Klasse der Leucin-Zipper (c-FOS, c-JUN, JUN-B), der Zink-Finger (ZIF 268, KROX 24), der Glucocorticoidrezeptoren (NGFI-B), oder der Interferone (PC4, TIS-7). Bei längeren Depolarisationen kommt es auch zur Expression von Streßproteinen wie HSP-70 [Hossmann, 1996]. Schließlich wurde eine akute Reduktion der globalen Proteinsynthese um 10 bis 40 % beschrieben [Mies, 1993a].
Bei Durchblutungsstörungen kommt es ab Unterschreitung eines bestimmten Schwellenwertes zu einem Versagen der ATP-abhängigen Kalium-Natrium-Pumpen und damit zum Anstieg der extrazellulären Kaliumkonzentration. Diese blockiert die synaptische Erregungsübertragung und depolarisiert jenseits einer Schwelle von 10-15 mM präsynaptische Nervenendigungen. Die dadurch freiwerdenden Neurotransmitter bewirken über NMDA-Rezeptor-abhängige Ionenkanäle einen massiven Kalziumeinstrom, der wiederum andere Ionenkanäle öffnet, so daß Kalzium, Kalium, Natrium, Wasserstoff, Chlorid und Hydrogenkarbonat ihren Konzentrationsgradienten nahezu ungehindert folgen können. Entsprechende Wassermengen treten in die Zelle ein, die durch den energetischen Kollaps irreversibel geschädigt wird [Siesjö, Bengtsson, 1989].
Während im Kern einer Ischämie diese kritische Perfusionsschwelle sicher unterschritten ist, verbessert sich die Blutversorgung mit zunehmendem Abstand von diesem Kern durch Kollateralversorgung. In dem Gebiet, das den Kern der Ischämie umgibt, entfernt sich die Perfusion zur Peripherie hin von dieser ischämischen Schwelle, ohne völlig normal zu sein. Dieses perfusionsgeminderte, aber noch mehr oder weniger intakte Gebiet um die manifeste Ischämie herum wird mittlerweile generell ”Penumbra“ (Halbschatten) genannt [Olsen et al., 1983]. Ob es nach der akuten Ischämie zum Infarkt oder zum intakten Gewebe gehören wird, hängt
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davon ab, wie es mit seinen eingeschränkten Ressourcen auf weitere energetische Belastungen reagieren kann, wie zum Beispiel die CSD.Durch Absenken der corticalen Perfusion unter die ischämische Schwelle von etwa 20% des normalen Wertes [Iijima et al., 1992; Hossmann, 1994] werden solche spontanen CSD ausgelöst. Sie entstehen vermutlich durch das frei werdende extrazelluläre Kalium und Glutamat im Kern der Ischämie oder in fluktuierend ischämischen Regionen der Penumbra [Nedergaard, Hansen, 1993]. Depolarisationen dieser Art sind in wenig regelmäßigen Abständen in der Umgebung frischer experimenteller fokaler Ischämien zu finden und wurden erstmals systematisch von Nedergaard und Hansen untersucht [Nedergaard, Astrup, 1986; Nedergaard, Hansen, 1993]. Die spontan in der fokalen cerebralen Ischämie auftretenden CSDs sollen im Folgenden wegen ihrer räumlichen und kausalen Beziehung zur Ischämie wie in der neueren Literatur Periinfarkt-Depolarisationen (PID) genannt werden. Dieser Begriff ist nicht ganz exakt und würde besser durch ”periischämische Depolarisationen“ ersetzt, da der ”Infarkt“ ein histo-pathologisches Konzept ist, und die Entwicklung von der fokalen Ischämie zum Infarkt zum Zeitpunkt des Auftretens der PID noch nicht abgeschlossen ist. Gerade auf dieser Dynamik bauen die therapeutischen Hoffnungen auf, die mit der Beeinflussung der PID verbunden sind.
Die Frequenz der PID´s ist sehr variabel und hängt vom der Spezies des Modells und von der verwendeten Anästhesie ab. Während Ratten in Halothan- oder Chloralose-Anästhesie bei experimentellem Verschluß der A. cerebri media etwa 1-3 PID in der ersten Stunde zeigen, finden sich unter Barbituratnarkose höhere Frequenzen [Hossmann, 1996]. Die PID tragen zur sukzessiven Vergrößerung des Infarktes auf Kosten der Penumbra bei [Iijima et al., 1992; Mies et al., 1993b; Back et al., 1994a], genau wie es auch in der Nähe einer experimentellen fokalen Ischämie zusätzlich applizierte ”klassische“ CSDs tun [Back et al., 1996]. Um so erstaunlicher ist es, daß diesen Befunden gegenüber normale CSD außer glialer Aktivierung [Kraig et al., 1991; Gehrmann et al., 1993] keine Spuren im Gewebe hinterlassen. Es liegt nahe, daß die Erklärung für diesen wesentlichen Unterschied darin liegen kann, daß bei der PID die Perfusion des metabolisch mehrbelasteten Gewebes erheblich kompromittiert ist. In der Tat wurde gezeigt, daß die bekannte Blutflußantwort auf langsame Depolarisationen wie die CSD um so geringer ausfällt, je näher die Messung am Ischämiekern stattfindet [Back et al., 1994b]. Entsprechend der kompromittierten Energieversorgung des betroffenen Gewebes ist die Repolarisationszeit in PID´s verlängert: Unter Halothan 2-5 min [Back et al., 1994b] und unter Barbituraten sogar 8 min [Nedergaard, Astrup, 1986]. Die Depolarisationen werden träger und können schließlich in einer terminalen Depolarisation enden.
Die Attraktivität optischer Methoden im Allgemeinen und der Nah-Infrarot-Spektroskopie im Besonderen beruht auf der Möglichkeit des nichtinvasiven Einsatzes, die auch eine Anwendung am Krankenbett oder gar im Ambulanzwagen denkbar macht.
Die optische Methode zur Messung metabolischer Vorgänge geht auf Tyndalls Doppelstrahl-Infrarot-Spektrometer [Tyndall, 1873] zurück. Otto Warburg hat sie mit seinem ”optischen Test“ für die Biochemie erschlossen [Warburg, Negelein, 1929]. Die technische Revolution, die im Krieg auf anglo-amerikanischer Seite mit der Entwicklung des RADAR verbunden war, lieferte präzise und rauscharme Verstärker im Mikrovolt-Bereich und neben anderen elektronischen Neuerungen vor allem spezialisierte elektronische Rechner. Mit dieser neuen Technik bauten Chance und Kollegen ”dual wavelength“ Spektrophotometer für Messungen schneller Redoxreaktionen. Die Untersuchungen der Redoxzustände in lebendem Gewebe führten hin zu bildgebenden Verfahren, die sich des sauerstoffabhängigen Absorptionsverhaltens des Hämoglobins bedienten [Grinvald et al., 1986; Frostig et al., 1990]. In diesem Zusammenhang wurde der Begriff ”intrinsic signal“ geprägt, der Absorptionsänderungen im sichtbaren Wellenlängenbereich in aktivierten Cortexarealen meint.
Von Anbeginn war das Interesse an der optischen Methode im nahinfraroten Bereich auf das Warburg´sche Atmungsferment und auf das Sauerstoff transportierende Blutpigment Hämoglobin gerichtet. Für Untersuchungen im Muskel, besonders im Herzmuskel, spielte daneben das Myoglobin eine Rolle. Optische Untersuchungen der Reaktionskinetik mitochondrialer Enzyme, u.a. in Tiefsttemperaturversuchen, ermöglichten eine weitgehende Differenzierung des Warburg´schen Atmungsfermentes in die verschiedenen Cytochrome der Atmungskette.
Matthes und Gross bauten ein ”Hämoglobinometer“, dessen Wirkprinzip darauf beruhte, daß Deoxyhämoglobin im roten Licht stärker, im infraroten Licht jedoch weniger stark absorbiert als Oxyhämoglobin [Matthes, Gross, 1939]. Hierin war das Prinzip der Messung von Veränderungen der Blutoxygenierung mit der Nah-Infrarot-Spektroskopie begründet.
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Das infrarote Licht, 1880 von dem Musiker und physikalischen Dilletanten Friedrich Wilhelm Herschel mit einem Glasprisma und einem Thermometer erstmalig nachgewiesen, ist bekannt für seine gute Penetration von Geweben (es sei an das therapeutische Rotlicht erinnert).Nah-Infrarot bezeichnet Licht in dem Wellenlängenbereich des Infraroten, der dem sichtbaren Spektrum am nächsten steht (nutzbares ”Fenster“ etwa von 700 bis 1000 nm). Die Technik der Nah-Infrarot-Spektroskopie in vivo wurde 1977 erstmals publiziert [Jobsis, 1977].
Die Methode beruht auf der guten Transparenz biologischer Gewebe für Licht in diesem Wellenlängenbereich bei gleichzeitiger Anwesenheit zweier biologisch relevanter Chromophoren: Hämoglobin und das Cytochrom aa3 (Cytochromoxydase) haben verschiedene Absorptionsspektra in Abhängigkeit von ihrem Oxygenierungs- bzw. Oxydationsgrad (s. Abb.4). Insofern können wir eigentlich von drei Chromophoren sprechen: dem Oxyhämoglobin, dem Deoxyhämoglobin und dem oxydierten Cytochrom aa3, wohingegen die reduzierte Cytochromoxydase in diesen Wellenlängenbereichen keine relevante Absorption aufweist [Cope, Delpy, 1988a]. Pigmente in Organen oder Haut beeinflussen das Absorptionsverhalten; auch Wassser weist am rechten Rand des Nah-Infrarot-Bereiches zunehmende Absorption auf.
Abbildung 4: Absorptionsspektra von Deoxyhämoglobin (Hb), Oxyhämoglobin (HbO2) und oxydierter Cytochromoxidase (aa3). Nach [Jöbsis, 1992].
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Hämoglobin kommt nur in den roten Blutzellen vor, daher kann sein Oxygenierungszustand als Indikator der Blutoxygenierung dienen.Das Cytochrom aa3 ist der endständige Elektronenakzeptor der Atmungskette. Es hat vier optisch aktive und redoxabhängige Zentren: zwei Häm-Ringe, die im sichtbaren Wellenlängenbereich absorbieren und zwei Kupferatome, die die Absorptionseigenschaften im Nahinfraroten bestimmen. Hier akkumulieren in Abwesenheit von Sauerstoff die vom Substrat bereitgestellten Elektronen. Die Kupferatome nehmen am Elektronentransport teil, ihre Absorption ist deshalb abhängig vom Redoxstatus: In oxydiertem Zustand erzeugen sie ein breites Absorptionsband um 840 nm, mit einer Halbbreite von etwa 100 nm. In reduziertem Zustand dagegen zeigen sie kaum Absorption. Deshalb liegt es nahe, das Enzym, und mithin sein Absorptionsspektrum, als optischen Indikator für die intrazelluläre Oxygenierung zu nutzen.
Die Absorptionsspektra im Nah-Infraroten sind also zusammengesetzt aus den unabhängigen Spektra der drei Chromophoren und müssen zur Berechnung von sauerstoffabhängigen Konzentrationsänderungen einer Dekonvolution unterzogen werden.
Der Anteil der Chromophoren Hämoglobin und Cytochromoxydase an der Absorption ist aufgrund ihrer physiologischen Konzentrationen im Hirngewebe unterschiedlich. Während die Hämoglobine in ihrer physiologischen Konzentration eine mittlere Extinktion von 0,10 OD/cm (bei 800 nm) haben, ist die der Cytochromoxydase nur 0,07 OD/cm (bei 825 nm) [Cope, Delpy, 1988a].
Kompliziert wird die Nah-Infrarot-Spektrophotometrie lebenden Gewebes weiterhin durch die streuenden Eigenschaften des Mediums. Durch sie läßt sich die Lambert-Beer´sche Gleichung nicht mehr ohne weiteres nach der Konzentration als Funktion der Extinktion umstellen, da die Weglänge der Photonen unbekannt ist:
Gleichung 1: Lambert-Beer´sches Gesetz (A: Absorption, e: Absorptionskoeffizient, c: Konzentration, r: optische Weglänge
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Licht, das durch Gewebe passiert, erfährt einen Intensitätsverlust sowohl durch Streuung als auch durch Absorption. Für Hirngewebe ist dieser Verlust etwa eine Größenordnung pro Zentimeter (d.h. eine optische Dichteeinheit, optical density, OD/cm). Für diese Abschwächung stellt der Nah-Infrarot-Bereich gewissermaßen ein ”Fenster“ dar. In NIRS-Anwendungen werden meist Lichtleiterkabel (Optoden) zur Illumination und als Kollektor verwendet. Während die ersten großen Intensitätsverluste durch die Streuung des vordem gebündelten Strahles beim Übertritt in das streuende Medium erfolgen, wird nach einigen Millimetern Lichtweges im Gewebe der Anteil der Absorption durch Chromophoren an den Lichtverlusten immer bedeutsamer.NIRS kann als spektrophotometrische Methode nur genutzt werden, wenn in der Lambert-Beer´schen Gleichung die Weglänge modifiziert wird.
Gleichung 2: modifiziertes Lambert-Beer´sches Gesetz (A: Absorption, e: Absorptionskoeffizient, c: Konzentration, r: optische Weglänge (Optodenabstand), DPF: Weglängenfaktor, G: Geometriefaktor)
Um eine Quantifizierung der Hämoglobin- und Cytochrom-Daten vornehmen zu können, ist es notwendig, die optische Weglänge des Lichtes im Gewebe zu kennen. Wegen der starken Streuung sind diese Weglängen sehr viel größer, als der einfache Optodenabstand (s. Abb.5). Durch einen differentiellen Weglängenfaktor (”differential pathlength factor“, DPF) kann die mittlere Weglänge aus dem Optodenabstand berechnet werden.
Für Gewebsscheiben [Delpy et al., 1988] und auch für den Kopf des Frühgeborenen [Wyatt et al., 1990] wurden solche DPF ermittelt (bei Frühgeborenen als etwa 4). Mit physiologischen Veränderungen der Absorption allerdings - das heißt für alle Fälle, wenn eine Messung interessant ist - ändern sich die DPF: Delpy und Kollegen ermittelten eine Abnahme des DPF um 30% pro OD/cm Zunahme der Absorption. Die maximalen physiologischen Absorptionsänderungen im Menschen betrugen dabei etwa 0,2 OD/cm, was einer DPF-Änderung von weniger als 10 % entspricht [Delpy et al., 1989].
Mit der NIRS kann im Transilluminations- wie auch im Reflektionsmodus gearbeitet werden, wobei ersterer nur bei entsprechend kleinen und transparenten
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Objekten praktikabel ist. Für Messungen in Neugeborenen wird der Transilluminationsmodus häufig verwandt, da der Kopf des Kindes mit einem Durchmesser von 10 cm eine optische Dichte von etwa 10 OD hat. Wenn man an einem kugelförmigen oder zylindrischen Objekt die Position der Optoden in einem kleineren Winkel als 180 Grad wählt, verringert sich nicht nur die mittlere Weglänge des Lichtes, sondern auch die Form des Meßvolumens verändert sich. Das heißt, daß der Volumenbereich, aus dem detektierte Photonen am wahrscheinlichsten stammen, sich von einer geraden in eine mehr und mehr gekrümmte Spindel wandelt, deren Mittellinie immer näher an die Oberfläche des Objektes gelangt (s. Abb.5).Abbildung 5: Computersimulation für Wahrscheinlichkeitsräume detektierter Photonen in einem runden Modell, das optisch homogen (links) oder geschichtet (rechts) ist; der Optodenabstand beträgt 5 cm. (nach Delpy, University College London, persönliche Mitteilung)
Dank dieser Krümmung - manche Kollegen sprechen in diesem Zusammenhang von einer ”Banane“ - kann man durch Verringerung des Optodenwinkels die Meßwahrscheinlichkeit im Cortex erhöhen. Zusätzlich gilt die weiße Hirnsubstanz als hochgradig reflektierend, so daß auch dies eine corticale Messung begünstigt. Van
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der Zee und Kollegen haben anhand eines Modells für den Licht-Transport den Einfluß des Optodenwinkels auf Änderungen des DPF ermittelt und gefunden, daß bei einem Optodenwinkel von unter 60 Grad die DPF-Abnahme so groß ist, daß große Fehler in der Konzentrationsberechnung unvermeidlich sind [van der Zee et al., 1990].Für den Kopf der Ratte ist bisher kein DPF bestimmt worden. Aus den Änderungen der optischen Dichten in unseren Versuchen ist eine absolute Bestimmung von Konzentrationen oder Konzentrationsänderungen daher nicht möglich. Dennoch können unter gleichbleibender optischer Geometrie relative Konzentrationsänderungen in arbiträren Einheiten (arbitrary units, AU) angegeben werden.
In Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von Delpy hat die Fa. Hamamatsu in der ersten Hälfte der neunziger Jahre das NIRO 500 auf den Markt gebracht, das uns durch die Förderung der DFG zur Verfügung steht.
Es arbeitet mit vier gepulsten Laserdioden bei den Wellenlängen 778, 813, 867 und 904 nm, mit einer Leistung von jeweils 10 W für eine Pulsdauer von 100 ns. Die Laser werden sequentiell mit einer Frequenz von jeweils 4 kHz gepulst.
Als Lichtleiter werden Glasfaserkabel verwendet, die für verschiedene Zwecke speziell angefertigt werden können. Wir benutzten die sogenannten ”Tumor“-Optoden, die in einem starren Kunststoffzylinder mit einem optischen Durchmesser von 3,4 mm enden.
Die von der detektierenden Optode aufgenommenen Photonen werden einer Photonen-Vervielfacher-Röhre (”photomultiplier tube“, PMT) zugeleitet, die das Signal jeder der verwendeten Wellenlängen in einem eigenen Kanal sammelt. Ein zusätzlicher Kanal sammelt das Licht, das einfällt, wenn kein Laser aktiv ist, so daß Korrekturen für unvermeidliches Umgebungslicht berechnet werden können [Cope, Delpy, 1988a].
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Abbildung 6: Blockschaltplan des Prototyps des NIRO 500; als Meßobjekt soll der Kopf eines Neugeborenen vorgestellt werden. Aus [Cope, Delpy, 1988a].
Ein in das Gerät integrierter Computer berechnet aus den für die einzelnen Wellenlängen gemessenen optischen Dichten Konzentrationsänderungen, die das Gerät in µM anzeigt, die aber wegen der fehlenden Validierung als arbiträre Einheiten (AU) behandelt werden müssen. Die Berechnung erfolgt über ein curve-fitting nach Algorithmen von Cope und Delpy [Brown, Marshall, 1985; Wray et al., 1988; Cope et al., 1988b].
Blutflußmessungen in der Mikrozirkuation waren lange Zeit auf ungenaue oder langsame oder umständliche Methoden wie Plethysmografie, thermische oder radioaktive Techniken angewiesen. Messungen waren on-line kaum möglich. Einen wesentlichen Fortschritt stellt auf diesem Gebiet die Laser Doppler Flußmessung (LDF) dar, deren Prinzip erstmals 1975 publiziert wurde [Stern, 1975]. Der Doppler-Effekt, auf dem die Methode, ähnlich wie der Ultraschall-Doppler, beruht, unterscheidet sich für kohärentes Licht in einem Punkte wesentlich von dem akustischen Phänomen: Eine Frequenzverschiebung kommt in der Akustik nur zustande, wenn der Generator (oder Reflektor) sich mehr oder weniger direkt auf den
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Empfänger zu oder von ihm weg bewegt. Wenn dagegen kohärentes Licht in einem turbulenten Medium gestreut wird, verlieren die Photonen durch die Streuung ihre gemeinsame Richtung wie Polarisation, und bei jedem der Streuungsereignisse werden ihre jeweiligen Frequenzen (d.h. Wellenlängen) von den bewegten streuenden Partikeln - in Abhängigkeit von deren jeweiliger Geschwindigkeit - nach dem Doppler-Effekt gedehnt oder gestaucht. Nicht bewegte streuende Partikel - in unserer Anwendung etwa Knochen und Hirngewebe - führen zu keiner Wellenlängenverschiebung bei den an ihnen gestreuten Photonen. Ein Teil der vielfach gestreuten und in ihren Wellenlängen vielfach modifizierten Photonen kann im reflektierten Licht detektiert werden. Anders als in der Spektrophotometrie ist die Menge des detektierten Lichtes (bzw. die Extinktion) für Laser-Doppler Messungen nicht maßgeblich. Die Spektrallinie des detektierten Lichtes (d.h. die Wellenlängenverteilung seiner Photonen) ist im Vergleich zum monochromatischen kohärenten Strahl, der eingestreut wurde, in einer Weise verbreitert, die die Geschwindigkeitsverteilung unter den streuenden Partikeln charakterisiert. Diese Information kann durch Spektralanalyse gewonnen werden. Ein Photon zum Beispiel, das im Kapillarbett auf einen bewegten Erythrozyten stößt, wird von ihm reflektiert (gestreut), und seine Wellenlänge wird in linearer Abhängigkeit von der Geschwindigkeit des Partikels verschoben. Dieser Vorgang wiederholt sich viele Male. Ein Photon, das mit Erythrozyten normaler durchschnittlicher Geschwindigkeit kollidierte, erfährt eine Doppler-Verschiebung von etwa 20 kHz. Zur Berechnung der mittleren Erythrozytengeschwindigkeit in der Mikrozirkulation muß man also Informationen über die Häufigkeit dieser Streuungsereignisse voraussetzen. Die ist aber von vielen Faktoren abhängig, wie Hämatokrit und Dichte des Kapillarbettes. Sinnvolle Messungen sind auch nur bei sicher zufällig bewegten Partikeln, d.h. nur im ungerichteten Fluß der Mikrozirkulation möglich, gerichtete Ströme in größeren Gefäßen verfälschen die Messung. Zudem wird das eingestrahlte Licht in sehr variabler Weise von stationärem Gewebe gestreut werden, das keine Doppler-Verschiebung verursacht. Diese sehr variablen Faktoren machen für jede Messung eine Kalibration erforderlich. Im Experiment werden LDF-Messungen bei Stimulationen meist gegen den Ausgangswert bei Ruhe normalisiert und dann als Prozent dieses Ausgangswertes angegeben.Die Methode wurde für die cerebrale Mikrozirkulation 1989 von Dirnagl und Kollegen validiert [Dirnagl et al., 1989] und kommt seitdem zu extensivem Einsatz.
Wir verwendeten das Gerät BPM2 der Firma Vasamedics St.Paul, MN, USA, das mit Laserlicht bei 780 nm arbeitet. Vor der Messung muß die Lokalisation der Sonde optimiert werden, so daß ein gleichmäßiger Ausgangswert gemessen werden kann.
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Bei dem von uns verwendeten Gerät erschienen Werte um 25 ”ml/100g/min“ als optimal (die Einheiten sind nicht validiert und daher arbiträr, wir arbeiten mit prozentualen Veränderungen vom Ausgangswert, s.o.). Sehr hohe oder sehr unregelmäßige Flüsse deuten auf die Nähe eines größeren Gefäßes hin und waren Anlaß für eine geringfügige Verschiebung der Sonde.Die polarografische Sauerstoffbestimmung geht auf das Jahr 1897 zurück [Danneel, 1897]. Die erste Anwendung der Methode am Menschen wurde 1950 veröffentlicht [Montgomery, Horwitz, 1950]. Heute wird die Methode klinisch in der Onkologie, in der Chirurgie zur Messung in Transplantaten oder Tumoren, in der Intensivmedizin zur Abschätzung der Sauerstoffverfügbarkeit, in der Neurochirurgie zu Untersuchungen der cerebralen Sauerstoffversorgung, in der Orthopädie und Rheumatologie, und darüberhinaus vielfach tierexperimentell angewandt. Es stehen dabei verschiedene Elektrodenformen zur Verfügung; flexible Schlauchelektroden, starre Elektroden in Nadelform, Mikroelektroden oder auch Oberflächenelektroden, bei deren Auswahl man zwischen räumlicher und zeitlicher Meßauflösung, aber auch Vorbereitungsaufwand und nicht zuletzt Kosten optimieren muß. Zwei wesentliche Formen der polarografischen Sauerstoffelektrode sind die sogenannte solid state und die Clark-Elektrode.
Bei der solid state Elektrode liegt die Diffusionsmembran direkt an der sauerstoffempfindlichen Kathode an, während die Anode außerhalb der Membran Schluß zum Gewebe hat (bei Nadelelektroden z.B. in Form des Kanülenrohrs). Die Membran muß neben Sauerstoff auch für Wasser und Hydroxylionen permeabel sein, die Elektrode muß vor dem Einsatz gewässert werden. Sie hat eine sehr schnelle Meßzeit (90% des Signals in 500ms) und kann für sehr kleine Meßvolumen gebaut werden (bis etwa 10-12 l).
Unter Anlegen einer Spannung kommt es an der Edelmetallkathode zur Reduzierung des Gewebssauerstoffes und an der Kathode wieder zur Oxydierung:
Gleichung 3: Die chemische Reaktion bei der polarografischen Sauerstoffmessung.
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Dabei kommt es - abhängig von der Konzentration des reduzierbaren Sauerstoffs - zum meßbaren Stromfluß (s. Abb.7).Eine Clark-Elektrode dagegen vereinigt Kathode und Anode im selben elektrolytischen Kompartment innerhalb einer nur für Sauerstoff durchlässigen Membran. Dadurch ist sie schneller einsetzbar, aber nicht so genau in der zeitlichen und räumlichen Auflösung.
In unseren Experimenten verwendeten wir den Licox-pO2 Monitor der Firma GMS (Gesellschaft für medizinische Sondentechnik mbH, 24247 Mielkendorf , Dorfstraße 2) mit einer 300µm solid state Nadelelektrode. Sie hat die Form einer größeren Kanüle, mit einer gaspermeablen Membran von etwa Durchmesser, während das Kanülenrohr als Anode diente.
Abbildung 7: Schaltprinzip der solid state Elektrode zur polarografischen Sauerstoffmessung. 1 gas- und wasserpermeable Membran, 2 Kathode aus Edelmetall, 3 Isolierung, 4 Anode mit 5 elektrolytischer Ankopplung. In der von uns verwendeten Nadelelektrode stellt eine Metallkanüle, die die Isolierung der Anode umschließt, die Anode dar. Aus Benutzerhandbuch der Fa. Licox.
Da der polarografische Sondenstrom vom Sauerstoffpartialdruck (pO2) linear abhängt, kann das Gerät durch Zwei-Punkt-Kalibrierung geeicht werden. Dazu wird der Sondenstrom 1) in einem mit Luft und 2) in einem mit 100% Stickstoff äquilibrierten wassergefülltem Eichgefäß bestimmt. Bei gleichzeitiger Messung der
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Temperatur und Angabe des barometrischen Druckes berechnet das Gerät daraus unter Anwendung der Formeln 4 a) und b) eine Eichkurve.Zur Messung werden die Sondenkonstante TS, der barometrische Druck PB, der Luftsauerstoffanteil O% und die Gewebstemperatur TT vor der aktuellen Messung bestimmt und in den Geräterechner eingegeben.
Gleichung 4: Berechnung des Sauerstoffpartialdruckes aus dem Sondenstrom bei der polarografischen Sauerstoffmessung. Legende:
| pO2 | Sauerstoffpartialdruck |
| I | Sondenstrom |
| IcN2 | Kalibrationsstrom in 100% N2 |
| IcO2 | Kalibrationsstrom in Luft |
| TC | Kalibrationstemperatur |
| TT | Gewebstemperatur |
| TS | Temperaturkoeffizient des sauerstoffabhängigen Sondenstromanteils |
| PcO2 | errechneter pO2 im Kalibrator |
| PB | barometrischer Druck |
| PW | Wasserdampfdruck im Kalibrator, errechnet mit TC unter Annahme von 100% Luftfeuchte |
| O% | Prozentualer Sauerstoffanteil der Luft |
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Obwohl diese Methode an den vorliegenden Studien einen geringen Anteil hat, erscheint sie interessant genug, um hier nicht weniger ausführlich vorgestellt zu werden.
Mit der Technik des ”phosphorescence life-time quenching“ zur Sauerstoffmessung wurde vor knapp zehn Jahren ein theoretischer Vorschlag aus den vierziger Jahren verwirklicht [Vanderkooi et al., 1987]. Sie basiert auf der zeitabhängigen Dämpfung (”quenching“) der Lumineszenz langlebiger, spin-verbotener (”spin-forbidden“) angeregter Lumiphoren, d.h. ”Sonden“-Moleküle, durch Sauerstoff, dessen Moleküle deren Anregungsenergie aufnehmen. Die meistbenutzten Sonden sind Metalloporphyrin-Albumin-Komplexe. Sie werden als ”triplet state probes“ bezeichnet und qualifizieren sich für in-vivo-Messungen durch folgende Eigenschaften: 1) Ihre Phosphoreszenz ist sauerstoffabhängig, 2) sie sind chemisch stabil, 3) ihr Phosphoreszenzspektrum liegt im Roten und Nah-Infraroten, wo biologische Gewebe relativ wenig absorbieren, 4) sie sind in den benötigten Konzentrationen nicht akut toxisch. Zur Messung werden diese Sonden intravenös appliziert und gelangen mit dem Blut in das zu messende Gewebe, wo sie durch Licht eines weiten Wellenlängenbereiches angeregt und in einen sogenannten ”triplet state“ versetzt werden können. Die folgende Lichtemission hängt in Intensität und Dauer (”life-time“, in Größenordnungen von 10-10 s) von der Konzentration des Sondenmoleküls und von der des Phosphoreszenz dämpfenden Sauerstoffes ab. Es ist dabei der wesentliche Vorteil dieser Methode, daß sie nicht die Intensität der Lichtemission, sondern deren Dauer als Funktion der Sauerstoffkonzentration mißt, wodurch die Messung unabhängig von der Sondenkonzentration im Gewebe ist. Gewöhnlich werden 10 bis 100 Luminiszenzverfall-Kurven gemittelt und durch nichtlineare Analyse an eine einfache, doppelte oder dreifache Exponentialfunktion angepaßt. Die Güte der Anpassung wird durch einen Korrelationskoeffizienten ausgedrückt. Die Phosphoreszenzdämpfung (”phosphorescence life-time quenching“) durch Sauerstoff ist diffusionslimitiert, was in der modifizierten Formel nach Stern und Volmer zur Berechnung der Sauerstoffkonzentrationen Ausdruck findet (s. Gleichungen 5 a) und b) [Vanderkooi et al., 1987].
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Gleichung 5: Abhängigkeit der Phosphoreszenz-Lebensdauer von der anwesenden Sauerstoffkonzentration. Legende:
 0 |
Lebensdauer der Phophoreszenz unter Abwesenheit von Sauerstoff |
|
Lebensdauer der Phophoreszenz bei der gegebenen Sauerstoffkonzentration [O2] |
| kq | Dämpfungskonstante (”quenching rate constant“) |
| DD | Diffusionskoeffizient des Sondenmoleküls (”donor“) |
| DA | Diffusionskoeffizient des Sauerstoffmoleküls (”acceptor“) |
| p | Wahrscheinlichkeit der Kollision von Sauerstoff mit einem angeregten Sondenmolekül im ”triplet state“ (etwa 0,11) |
Mit nur einem Sondenstoff kann man Sauerstoffkonzentrationen von Luftäquilibrierung bis hinab zum nanomolaren Bereich messen. Die Kopplung der Metalloporphyrine an Albumine dient zum einen dem Schutz der Sondenmoleküle vor Eigendämpfung (”self-quenching“), zum anderen der Vervielfachung der Dämpfungskonstante (”quenching rate constant“) kq.
Wir verwendeten das Gerät ”Oxyspot” der Firma GMS (Gesellschaft für medizinische Sondentechnik mbH, 24247 Mielkendorf , Dorfstraße 2).
Das Licht zur Anregung der Sondenmoleküle wird mit einer Hochfrequenz-Blitzlampe erzeugt, über einen flexiblen Lichtleiter zum Meßort geführt, wo ein zweites integriertes Glasfaserkabel das emittierte Licht empfängt und zu einer Hochspannungs-Photonenvervielfältiger-Röhre (”photon-multiplier-tube“, PMT) leitet. Das Signal wird verstärkt und digitalisiert. Ein angeschlossener Rechner koppelt den Blitzlampen-Zeitgeber mit an den A/D-Wandler, kontrolliert Zahl und Frequenz der Lichtblitze und den Dateneinzug mit der für die Messung benötigten Latenz. Das Gerät zeigt auf einem angeschlossenen Computer eine aktuelle Kurve von Lebensdauermessungen und den abgeleiteten pO2 Werten an, die als ASCII-Datei gespeichert werden. Der Geräteaufbau ist in Abb. 8 schematisch illustriert.
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Abbildung 8: Blockschaltplan eines Gerätes zur Sauerstoffmessung mit der ”phosphorecence life-time quenching“ Methode (Oxyspot, Fa. GMS)
Zur Messung werden folgende Parameter am Gerät eingestellt:
Die Faseroptik am Meßort integriert einen optischen Durchmesser von 3mm. Da in diesem Areal verschiedene Sauerstoffspannungen existieren können, stellt die Phosphoreszenzverfall-Kurve eine Summe von Exponentialen - jedes mit seiner eigenen Lebensdauer - dar. Die Gerätesoftware paßt die Kurve an ein einzelnes Exponential an (”curve fitting“). Die maximale Meßrate ist durch die Rechnergeschwindigkeit limitiert und beträgt bei einem 80386 (16 MHz) Rechner etwa 10 Hertz.
Als phosphoreszierende Sonde verwendeten wir an Rinderalbumin gekoppeltes Meso-tetra-[4-sulfonatophenyl]-porphine (TSPP).
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