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Kapitel 2. Die Studien dieser Arbeit

2.1. Hypothesen

1. Die NIRS ist in der Lage, die CSD und PID anhand der Veränderungen der regionalen cerebralen Blutoxygenierung nichtinvasiv zu detektieren.
2. Die NIRS liefert Daten, die es erlauben, Aussagen über die regionale cerebrale Oxygenierung während der CSD zu machen. Dabei wird vermutet, daß die kurzdauernde Hyperämie über einen Anstieg des Gewebs-Sauerstoffpartialdruckes auch zu einer stärkeren intrazellulären Oxygenierung führt, die man anhand einer Konzentrationszunahme des oxydierten Cytochroms aa3 abschätzen kann.
3. Die regionale cerebrale Oxygenierung bei der PID unterscheidet sich in typischer Weise von der CSD. Dabei liegt wegen des infarktvergrößernden Effekts der PID bei der cerebralen Durchblutungsstörung der Verdacht nahe, daß die ungenügende Blutflußsteigerung während der PID im Randgebiet einer fokalen Ischämie zu einer Verschlechterung der regionalen cerebralen Oxygenierung führt.

2.2. Die Modelle

Es wurden 280-320g schwere männliche Wistar-Ratten verwendet, die nach kurzer Halothannarkose mit intraperitonealer Gabe von Thiopental (Trapanal^® 100mg/kg Körpergewicht) anästhesiert wurden, die Anästhesie wurde durch intermittierende Gaben von 5mg Thiopental so aufrechterhalten, daß die Tiere keine Reaktion auf einen Schmerzreiz im Schwanz zeigten. Nach dem Versuch wurden die Tiere durch eine hohe Dosis Thiopental getötet.

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2.2.1. Präparation und Messungen

2.2.1.1. Grundpräparation

Die Tiere wurden tracheotomiert und anschließend mechanisch beatmet (Effenberger Kleintierrespirator, Pfaffing), der endexspiratorische CO₂-Partialdruck wurde kontinuierlich überwacht (Heyer Artema MM204, Schweden). Die Körpertemperatur wurde mit einem geregelten Heizkissen bei 37,5 ± 0,5 C gehalten. Es wurden eine Femoralarterie und -vene mit PE-Schlauch kannüliert, so daß der mittlere arterielle Blutdruck kontinuierlich gemessen (RFT Biomonitor, Zwönitz) und intermittierend arterielle Blutgasanalysen (AVL Compact I, Graz, Österreich) vorgenommen werden konnten. Über den venösen Zugang wurde kontinuierlich physiologische Kochsalzlösung appliziert (1ml/h).

2.2.1.2. Tierpräparation und Messungen bei ”cortical spreading depression“

Die Tiere (n=9) wurden in einem stereotaktischen Rahmen fixiert. Der Skalp wurde zur Lokalanästhesie mit 1%iger Xylocainlösung unterspritzt und teilweise reseziert. Über dem frontalen Cortex wurden beidseits mit einem Fräser (mit Kochsalzlösung gekühlt) jeweils eine offene Trepanation angelegt, die mit einem Wall aus Knochenwachs umgeben wurde. Die Dura wurde in diesen Fenstern vorsichtig entfernt. Die craniellen Fenster wurden mit künstlichem Liquor [Levasseur et al., 1975] gefüllt, welcher für die Auslösung der CSD kurzzeitig mit Kaliumchloridlösung ausgetauscht werden konnte.

Auf der rechten Seite wurde jeweils 5 und 10 mm occipital der frontalen Trepanation mit gekühltem Bohrer für die Anlage einer Kalomelelektrode zur Aufzeichnung des DC-Potentials trepaniert. Die Messung des DC-Potentials erfolgte differentiell über beide Kalomelelektroden (FD223, WPI, Sarasota, FL, USA), so daß die Geschwindigkeit der CSD aus dem Abstand der Spitzen der resultierenden biphasischen Kurve berechnet werden konnte (s. Abb.13, unterste Kurve).

Am Bohrloch 10 mm occipital der CSD-Auslösung wurde außerdem mit einem Mikromanipulator eine ”solid-state“ Sauerstoff-Nadelelektrode (Licox, GMS, Mielkendorf) durch die Dura hindurch auf den Cortex aufgesetzt. In derselben Region - allerdings über dem intakten Schädel - wurden die beiden Optoden (optischer Durchmesser 3,4 mm) des Nah-Infrarot-Spektrometers (NIRO 500, Hamamatsu, Japan) positioniert. Ihre Anordnung erfolgte in etwa 70 Grad rechtwinklig zur

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Die Glasfasersonde zur Laser-Doppler-Flußmessung (LDF) wurde in symmetrischer Position, d.h. 10 mm occipital vom Ort der Aulösung der CSD angebracht, nachdem der Knochen dort zur Erhöhung der Lichtdurchlässigkeit mit einem gekühlten Fräser ausgedünnt worden war [Dirnagl et al., 1989; Lindauer et al., 1993]. LDF und NIRS mußten in verschiedenen Hemisphären gemessen werden, weil die Laserilluminationen beider Techniken miteinander interferieren, wenn sie in derselben Hemisphäre zur Anwendung kommen. Die gemessenen rCBF-Werte beziehen sich also nie auf dieselben CSD wie die NIRS-Daten, sondern auf die analoge, zur selben Zeit, im selben Tier, kontralateral ausgelöste CSD.

Abbildung 9: Schematische Versuchsanordnung für die Messungen in normaler CSD: Die CSD wurde gleichzeitig analog in beiden Hemisphären mit Kaliumchloridlösung ausgelöst. In der rechten Hemisphäre wurde das DC-Potential differentiell über zwei Kalomelelektroden im Abstand von 5 und 10 mm von der Auslösestelle gemessen. An der letzteren Stelle wurde gleichzeitig der corticale Sauerstoffpartialdruck (pO₂) und die cerebrale Oxygenierung mit NIRS gemessen, während in der analogen CSD der anderen Hemisphäre der regionale Blutfluß mit Laser-Doppler-Flußmessung bestimmt wurde (beide Techniken interferieren, wenn sie in derselben Hemisphäre eingesetzt werden). Anders als im Schema war der Schädelknochen bis auf zwei kleine Trepanationen für die Elektroden intakt.

Durch Superfusion von 150 mM KCL-Lösung für 30 s in den frontalen Trepanationen wurden im Abstand von 45 min CSD ausgelöst. Dabei wurden DC, NIRS, LDF

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2.2.1.3. Präparation der fokalen Ischämie

Die fokale Ischämie wurde im Bereich der A. cerebri media durch das sogenannte Fadenmodell erreicht [Nagasawa, Kogure, 1989; Longa et al., 1990]. Zur Vorbereitung des Mediaverschlusses wurde das Tier nach der Grundpräparation rücklings gelagert. Die rechte A. carotis communis wurde langstreckig präpariert, nachdem das Trigonum caroticum mit Xylocain infiltriert worden war. Die A. carotis communis wurde ligiert, und ihre beiden distalen Äste mit kleinen gefäßchirurgischen Klammern zeitweilig abgeklemmt. Etwa einen Zentimeter unterhalb der Carotisgabel wurde das Gefäß eröffnet und ein Kunststoffschlauch von 1,3 mm Stärke eingeführt, bis kurz vor die Carotisgabel gebracht und fixiert. Durch diesen Führungsschlauch wurde ein Vicryl^®-Faden mit thermisch abgerundeter und beschichteter (Uhu^®) Spitze (etwa 0,3 mm) in die carotis interna eingeführt, der oberhalb des Schlauchendes mit zwei chirurgischen Fäden im Gefäß verschieblich umbunden wurde. Danach wurden die gefäßchirurgischen Klammern entfernt und der Faden an der A. pterygopalatina vorbei an die Schädelbasis vorgeschoben, die sich als Zunahme des Widerstandes bemerkbar machte. Dort verblieb der Faden für den Rest der Präparation.

2.2.1.4. Präparation und Messungen bei fokaler Ischämie

Die Tiere (n=10) wurden vorsichtig auf den Bauch umgelagert und in einem stereotaktischen Rahmen fixiert. Der Skalp und der rechte M. temporalis wurden zur Lokalanästhesie mit 1%iger Xylocainlösung unterspritzt und teilweise reseziert. Mit einem gekühlten Bohrer wurde parietal nahe der Linea terminalis eine Trepanation angelegt (s. Abb.11, Punkt A). Sie diente der Positionierung einer Kalomel-Elektrode zur epiduralen Registrierung des DC-Potentials der PID. Oberhalb und seitlich der Elektrode wurden die NIRS-Optoden mit verkleinertem optischen Durchmesser (1,7 mm) plaziert (s. Abb.11, Punkte B und C). Temporal und rostral davon - näher zum Kern der zu erwartenden Ischämie im Gebiet der A. cerebri media hin - wurde die LDF-Sonde angebracht. Auch in diesem Experiment war

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Nach stabiler Messung der normalen Mikrozirkulation im Gebiet der zu erwartenden Ischämie mit LDF wurde unter weiterer Kontrolle des regionalen cerebralen Blutflusses (rCBF) der Faden in der A. carotis interna weiter vorangeschoben, bis der LDF mit einem plötzlichen deutlichen Rückgang den Verschluß der A. cerebri media anzeigte.

Unmittelbar nach Nachweis der Ischämie wurde der LDF ausgeschaltet und die Messung mit NIRS begonnen. In der darauffolgenden Stunde wurden die auftretenden PID mit DC und NIRS gemessen und die Daten alle 2,5 s mit einem PC aufgezeichnet. Die maximalen Auslenkungen vom Ausgangswert der Parameterkurven wurden für die Auswertung herangezogen, und Konzentrationsabnahmen sind durch ein negatives Vorzeichen gekennzeichnet. Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) angegeben [Wolf et al., 1997a].

Abbildung 10: Schematische Darstellung des Verschlusses der A. cerebri media mittels eines in die A.carotis communis eingeführten Vicryl-Fadens mit präparierter Spitze. Der Faden wurde zur Erzeugung der Ischämie unter Kontrolle des regionalen Blutflusses mit Laser-Doppler-Flußmessung vorgeschoben, bis der Abfall des Blutflusses die Verlegung des Abgangs der A.c.m. anzeigte.

S	Führungsschlauch
F	Faden
ACC	A. carotis communis
ACE	A. carotis externa
APP	A. pterygopalatina
ACP	A. cerebri posterior
ACM	A. cerebri media
ACA	A. cerebri anterior

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Abbildung 11: Sondenpositionierung während der Versuche mit fokaler cerebraler Ischämie: A Kalomelelektrode für Registrierung des DC-Potentials, B und C NIRS-Optoden, D Laser-Doppler-Sonde zur Messung des regionalen Blutflusses (rCBF).

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2.3. Ergebnisse

2.3.1. ”cortical spreading depression“ bei normaler Perfusion

Die physiologischen Daten der Tiere wurden während des Versuches im Normbereich gehalten (s. Tab. 1).

Tabelle 1: Physiologische Daten der Versuchstiere Parameter unmittelbar vor der gemessenen CSD.

CSD ließen sich mit Superfusion von Kaliumchloridlösung einfach auslösen. Die Ausbreitung der DC-Potentialauslenkung erfolgte mit der erwarteten typischen Geschwindigkeit 3,2 ± 0,4 mm/min.

Wir beobachteten den typischen kurzzeitigen Anstieg des regionalen cerebralen Blutflusses (rCBF), er betrug 279 ± 102 % des Ausgangswertes.

NIRS registrierte deutliche Konzentrationsänderungen der Chromophoren, eine typische Aufzeichnung ist unten abgebildet (s. Abb.13). Dabei stieg Oxyhämoglobin in der Konzentration deutlich an, während die Konzentration des Deoxyhämoglobins in etwas geringerem Maße abfiel.

Die vorherrschende Änderung des auf der Cortexoberfläche gemessenen Sauerstoffpartialdrucks war ein Anstieg von 43 ± 11 mm Hg um 14 ± 10 mm Hg. Einige Messungen zeigten jedoch Undulationen oder steile Abbrüche, die den Verdacht auf einen mechanischen Artefakt nahelegten, wie er etwa durch Druck des Hirngewebes auf die aufgesetzte Nadelsonde während der vorübergehenden Gewebsschwellung zustande kommen konnte. Diese Artefakte waren für uns Anlaß, in drei Tieren außerhalb der NIRS-Studien die optische Methode des

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Tabelle 2: mittlere maximale Deflektionen der NIRS während der gemessenen CSD.

Abbildung 12: Typische Messung des Sauerstoffpartialdruckes mit ”phosphorescence life-time quenching“.

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Abbildung 13: regionaler cerebraler Blutfluß (rCBF) mit Laser-Doppler-Flußmessung (LDF), polarografisch gemessener corticaler Sauerstoffpartialdruck (pO₂), die mit NIRS gemessenen Konzentrationsänderungen von Oxyhämoglobin [HbO2], Deoxyhämoglobin [Hb] und Cytochrom aa3 [CytO] sowie das corticale DC-Potential. Das DC-Potential zeig eine zweiphasige Auslenkung, weil es differentiell zwischen den beiden Kalomelelektroden in Ausbreitungsrichtung der CSD gemessen wurde, der erste, negative peak zeigt die CSD bei 5 mm, der zweite, positive bei 10 mm vom Ort der Auslösung. Der Pfeil indiziert die CSD-Auslösung.

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2.3.2. Periinfarkt-Depolarisationen

Die physiologischen Daten der Tiere wurden während des Versuches stabil gehalten und sind in der Tabelle aufgeführt.

Tabelle 3: Physiologische Daten der Versuchstiere mit fokaler Ischämie bei Beginn und 45 min nach Beginn der fokalen Ischämie.

Durch das Vorschieben des Vicrylfadens wurde der rCBF auf 31 ± 8 % des Ausgangswertes abgesenkt (s. Abb.14). Ungefähr vier bis 8 Minuten nach Einsetzen der fokalen Ischämie konnte die erste PID beobachtet werden.

Wie CSD, zeigten auch PID im NIRS deutliche Signalveränderungen. Während die CSD jedoch nur einfache Zu- oder Abnahmen der regionalen Konzentrationen des Oxy- und Deoxyhämoglobins verursachte, zeigte die Dynamik der Blutoxygenierung während der PID einen zweiphasigen Verlauf: In der ersten Phase kam es zu einem Abfall des Oxyhämoglobins und zu einer Zunahme des Deoxyhämoglobins. Dieses Muster machte nach 1 bis 2 Minuten einen Übergang in eine zweite Phase durch, in der das Konzentrationsverhältnis sich umkehrte und Oxyhämoglobin anstieg, während Deoxyhämoglobin abfiel. Der Konzentrationsverlauf des oxydierten Cytochroms aa3 dagegen zeigte nur eine einphasige Abnahme und ähnelte hierin sehr dem Verlauf während der normalen CSD. (Tab.). Eine typische Registrierung einer Reihe von PID ist unten abgebildet (s. Abb.15). Die negativen DC-Potentiale waren deutlich verbreitert.

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Abbildung 14: Regionaler cerebraler Blutfluß (rCBF) mit Laser-Doppler-Flowmessung (LDF) (obere Kurve) und DC-Potential (untere Kurve) während und kurz nach Induktion der fokalen Ischämie. Bei diesem Versuch wurde nicht unmittelbar von LDF auf NIRS- Messung umgeschaltet, so daß für die erste Periinfarktdepolarisation (PID, siehe Pfeil) noch das Ausbleiben der für CSD sonst typischen Hyperperfusion gezeigt wird.

Abbildung 15: Typische Reihe von PID mit NIRS und DC. Die Depolarisationen sind mit über 5 min deutlich breiter als bei normaler CSD. Die NIRS-Antwort besteht in einer ersten Phase mit [HbO2]-Abfall und [Hb]-Anstieg, in der zweiten Phase kehrt sich das Muster um und ähnelt dem der normalen CSD. [CytO] zeigt eine einphasige Reduktion.

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Tabelle 4: Maximale Konzentrationsänderungen während der 2 Phasen der PID

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