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Kapitel 3. Diskussion

3.1. Nichtinvasive Detektion der ”cortical spreading depression“ mit NIRS (Hypothese 1)

CSD (und PID) können mit der NIRS nichtinvasiv, d.h. bei intaktem Schädel, parallel zur elektrophysiologischen Messung detektiert werden.

In verschiedenen Tiermodellen wurden NIRS-Messungen durchgeführt, dabei handelte es sich aber fast ausschließlich um Fragen der globalen Oxygenierung und nicht der Kopplung von Metabolismus und Blutfluß mit hirnspezifischer Aktivität [Ferrari et al., 1983; Ferrari et al., 1990; Lubarsky et al., 1992; Hasegawa et al., 1992; Ogata et al., 1994]. Auch in der klinischen Forschung wurde NIRS bisher vor allem zur Überwachung der globalen cerebralen Sauerstoffversorgung verwendet [Edwards et al., 1991].

Das in dieser Arbeit verwendete Modell ist in seiner optischen Geometrie weit entfernt vom menschlichen Kopf. Aber da es möglich ist, Oxygenierungsänderungen am Menschen bei anderen Paradigmata mit weniger starken hämodynamischen Begleiterscheinungen zu messen [Obrig et al., 1995; Kleinschmidt et al., 1996; Obrig et al., 1996b], eröffnen die Daten der vorliegenden Arbeit die Aussicht, Phänomene wie die CSD oder PID anhand ihres Einflusses auf die regionale cerebrale Oxygenierung mit der NIRS zu detektieren. Es ist allerdings zu vermuten, daß der starken Gyrierung des menschlichen Gehirns wegen die CSD SICH nicht in so klassisch gleichmäßiger Form wie im Nager präsentiert. Man wird im Menschen den Ort der Messung - sei es während der Migräneaura oder im akuten Schlaganfall - genau planen müssen, denn es kann nicht davon ausgegangen werden, daß CSD oder PID sich über die ganze Hemisphäre ausbreitet, wie sie das im lyssencephalen Tier tut.

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3.2. Sauerstoffbedarf und -bereitstellung während der ”cortical spreading depression“ (Hypothese 2)

Die vorliegenden NIRS-Messungen zeigen eine relative regionale cerebrale Luxusoxygenierung im Verlauf der CSD, während das terminale Atmungskettenenzym Cytochrom aa3 stärker reduziert wird.

Von allen verwandten Meßparametern waren die mit NIRS gemessenen die ersten, die die Ankunft einer CSD registrierten und die letzten, die sich wieder dem Ausgangswert näherten. Während die LDF-Messung des Blutflusses (Meßvolumen etwa 1 mm³ des ca. 2 mm dicken Cortex [Dirnagl et al., 1989]) in ihrer Dynamik dem DC-Signal sehr ähnelte (Dauer der Auslenkung etwa 1-2 min), zeigten sich ersten NIRS-Veränderungen bereits etwa 1 Minute früher und waren erst nach etwa 5 min normalisiert. Da die Konzentrationsänderungen der Hämoglobine zwar nicht dem rCBF entsprechen, aber doch weitgehend von ihm abhängig sind, dürfen wir annehmen, daß das Meßvolumen der NIRS-Optoden wesentlich größer als das der anderen verwendeten Sonden ist. Aufgrund dieser Annahme müssen wir davon ausgehen, daß die räumliche Auflösung der Methode uns nicht erlauben wird, nur das aktuell von der CSD betroffene Gewebe zu messen. Wir können also nur große Veränderungen erkennen, in denen kurze, etwa präkursorische, und kleine Phänomene der regionalen cerebralen Durchblutungsänderungen untergehen müssen. Da sich der Cortex vor der sich ausbreitenden Wellenfront jedoch im Fließgleichgewicht befindet, gegen den ja alle Blutfluß- und Oxygenierungsveränderungen gemessen werden, trägt er nicht zum Signal bei.

3.2.1. Die Blutoxygenierung

Der Anstieg der Oxyhämoglobinkonzentration in der Hyperperfusionsphase der CSD bei gleichzeitigem Auswaschen des Deoxyhämoglobins während der CSD deutet darauf hin, daß mehr Sauerstoff in die Mikrozirkulation gelangt, als durch den Energiestoffwechsel während der CSD ausgeschöpft wird. Dieser Befund erscheint plausibel, da die Hyperperfusion bei CSD durch arterielle [Wahl et al., 1994] und arterioläre [Shibata et al., 1992; Colonna et al., 1994] Dilatation zustande kommt.

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3.2.2. Die Gewebsoxygenierung

Wir haben während der CSD polarografisch an der Gewebsoberfläche und mit dem ”phosphorescence life-time quenching“ in der Mikrozirkulation einen deutlichen Anstieg des Sauerstoffpartialdruckes gezeigt. Andere Untersucher, die Sauerstoffelektroden ins Gewebe versenkten, registrierten auch biphasische Veränderungen der Sauerstoffspannung mit einer initialen Abnahme und anschließendem Anstieg [Tsacopoulus, Lehmenkühler, 1977; Dietrich et al., 1994], während andere auch nur abnehmende Sauerstoffpartialdrücke während der CSD berichteten [Mayevsky et al., 1980; LaManna et al., 1989]. Angesichts der zeitlichen Auflösung unserer Messungen (2,5 s), kann ein kurzer Sauerstoffabfall übersehen worden sein. Die Arterialisierung der regionalen Mikrozirkulation während der bekannten Hyperperfusion spiegelt sich deutlich in diesem gleichzeitigen Ansteigen des corticalen Sauerstoffpartialdruckes wider. Daß unsere corticalen Messungen höher liegen als die anderer [Back et al., 1994b] mag daran liegen, daß wir mit beiden Methoden die unmittelbare corticale Oberfläche und nicht das tiefer liegende Parenchym gemessen haben. Sicher können wir sagen, daß die überwiegende Änderung, und damit die im Rahmen der zeitlichen und räumlichen Auflösung des NIRO 500 liegende ein Anstieg des Sauerstoffpartialdruckes war.

3.2.3. Die mitochondriale Oxygenierung

Um den aeroben Energiestoffwechsel des Hirnparenchyms zu beurteilen, hat man verschiedene Enzyme oder Substrate der Atmungskette als Indikator betrachtet: Zum einen das Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD) [Mayevsky et al., 1980; Dora et al., 1984; Mayevsky, 1984; Mayevsky et al., 1990], zum anderen auf das Cytochrom aa3 [Jöbsis et al., 1977; Sylvia, Rosenthal, 1978]. Für NAD wurden mit Fluorometrie während der CSD Oxydation (Ratten [Mayevsky et al., 1990], wache Springmäuse [Mayevsky et al., 1980]), aber auch Reduktion (anästhesierte Springmäuse [Mayevsky et al., 1980]) und biphasische Oxydations/Reduktions-Sequenzen (Katzen [Dora et al., 1984]) als Effekt der CSD berichtet. Letztere sind von den Autoren so interpretiert worden, daß die initiale oxydative, d.h. durch höhere Konzentrationen des oxydierten Enzyms gekennzeichnete Phase von einer zweiten Phase abgelöst werde, in der die Mobilisierung von Glucose aus dem Blut [Gjedde et al., 1981] wieder zu vermehrter Reduktion des Enzyms führt [Dora et al., 1984]. Im Zusammenhang mit seiner großen ”chemischen Entfernung“ vom Sauerstoff und seiner Nähe zu den reduzierenden Substraten sehen auch andere

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Gleichung 6: Grob schematische Darstellung der Reaktionen der Atmungskette, d.h. des Elektronenflusses von den Substraten hin zum Sauerstoff. Dabei wird ein Redoxpotential von -0,32 bis+0,82 Volt ausgeglichen (siehe die Zahlenangaben unter den Reaktionspartnern). Die Querbalken deuten die jeweiligen Reaktionskomplexe und Phosphorylierungsorte an. Der dritte Phosphorylierungskomplex stellt das terminale membranständige Enzym der Atmungskette dar, das Cytochrom aa3 (Cytochromoxydase). Die a und a3 Komponente enthalten je einen Häm-Ring und sind je mit einem Kupferatom gekoppelt [Jöbsis, 1992].

Das Cytochrom aa3 steht dem Sauerstoff am nächsten. In mitochondrialen in-vitro-Präparationen ist es im Fließgleichgewicht unter Luft zu fast 100% oxydiert [Chance, Williams, 1955]: Der Sauerstoffpartialdruck, bei dem eine 50 prozentige Reduktion erreicht wird (P₅₀) liegt nicht höher als 0,01 mm Hg [Chance, 1977]. Wird zu den Mitochondrien der ATP-Metabolit Adenosindiphosphat (ADP) zugegeben, so kommt es allerdings zu einer deutlichen, wenn auch geringen Reduzierung des Enzyms [Chance, Williams, 1955], das immerhin noch zu 99 % oxydiert bleibt. Unter diesen Umständen ist es verwunderlich, daß wir auf eine Reduktion trotz reichlichen interstitiellen Sauerstoffangebots stoßen. Verschiedene Untersucher haben auf den gleichermaßen überraschenden Befund hingewiesen, daß die Cytochromoxydase - in vivo anders als in vitro - bei Raumluft zu etwa 20% reduziert ist [Jöbsis et al., 1977], bzw. abhängig von der inspiratorischen Sauerstoffkonzentration zu 29% reduziert werden kann [Sylvia, Rosenthal, 1978]. In der Reflektions-Spektrophotometrie im Bereich des sichtbaren Lichtes fanden einige Untersucher eine klare Zunahme des Oxydationsgrades des Enzyms während der CSD [Jöbsis et al., 1977]. Unser Befund einer zeitweiligen Reduktion des Cytochroms aa3 erinnert aber eher an Daten von Haselgrove und Kollegen [Haselgrove et al., 1990]: Sie fanden in Folge der CSD nach einer sehr kurzen Oxydationsphase (mit räumlich hochauflösendem mitochondrialen NADH-Fluoreszenz-Imaging) eine 30-40 s lange Phase, in der das Cytochom aa3 wesentlich reduziert ist (

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Als Erklärung der Transition in den reduzierten Zustand der Cytochromoxydase wäre ein so starker Anstieg des Sauerstoffbedarfs der Atmungskette denkbar, daß er , trotz exzessiven Sauerstoffangebots im Gewebe, wegen einer limitierten Transportkapazität der Diffusion nicht gedeckt werden kann [Hotez et al., 1977; Kreisman et al., 1981; Gjedde et al., 1991]. Angesichts des Ausbleibens histologisch nachweisbarer Schäden nach vielfachen CSD [Nedergaard, Hansen, 1988] fällt es allerdings schwer zu glauben, daß der Energiestoffwechsel der Neuronen inadäquat sei. Vielmehr stellt sich die Frage, ob der akute Energiebedarf der Neuronen bei Aktivierung nicht so sehr aus der oxydativen Phosphorylierung, sondern zunächst aus der anaeroben Glycolyse heraus gedeckt wird.

Fox und Raichle haben nach dem Hinweis auf eine Entkopplung von Glucoseaufnahme und Sauerstoffverbrauch bei physiologischer Stimulation die Hypothese vorgeschlagen, daß der zusätzliche Energiebedarf bei Aktivierung eher durch Glycolyse als durch die oxydative Phosphorylierung gedeckt wird [Fox et al., 1988].

Ausgehend von den mikroanatomischen Befunden, die die Umhüllung der synaptischen Kontaktstellen und der cerebralen Kapillaren mit astrozytären Fortsätzen, und von der anerkannt großen Bedeutung der Astrozyten für die Bereinigung des Extrazellulärraumes von Kalium und Neurotransmittern, für die sie durch ihr Synzytium besonders gerüstet sind [Peters et al., 1991; Barres, 1991], ist ein Modell der Kompartimentierung des cerebralen Glucoseverbrauchs vorgeschlagen worden [Andersen, Marmarou, 1992; Magistretti et al., 1995; Magistretti, Pellerin, 1996].

Vor allem Magistretti und Mitarbeiter verweisen unter anderem auf Evidenz dafür, daß die Glucoseaufnahme des Hirngewebes bei Stimulation mehr im faserreichen Neuropil als in Perikarya-reichen Kerngebieten und eher in Astrozyten als in Neuronen stattfindet. Sie demonstrieren, daß Glucosetransporter auf v.a. Astrozyten, die Pyruvatdehydrogenase (die den Eintritt glycolytisch entstandenen Lactats in die oxydative Phosphorylierung ermöglicht) dagegen v.a. in neuronalen Perikarya zu finden sind. Der Schwerpunkt der energetischen Belastung liegt durch deren Transportfunktionen demzufolge eher auf den - zahlreicheren - Astrozyten als den Neuronen. Während die Astrozyten dafür durch Glycolyse zwar nicht

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Abbildung 16: Modell der Kompartimentierung des cerebralen Energiestoffwechsels: Das astrozytäre Synzytium nimmt Glucose aus den Kapillaren auf, die zum Großteil glycolytisch Energie für die Ionen- und Transmitterbereinigung aus dem synaptischenSpalt liefert und Lactat für die Atmungskette der Neuronen bereitstellt. Aus: [Magistretti et al., 1995]

Unter diesen Annahmen kann der hier berichtete Befund einer abnehmenden Oxydierung des Cytochroms aa3 im Zuge der CSD als Hinweis darauf interpretiert werden, daß der akute Energiebedarf für die Ionenpumpen - am ehesten in der Astroglia - vor allem glycolytisch bereitgestellt wird. Mit dem anfallenden Lactat wird gleichzeitig eine große Menge reduzierender Substrate bereitgestellt, die in der - im Fließgleichgewicht weitgehend oxydierten - Atmungskette zu einer vorübergehenden Verschiebung des Redoxgleichgewichts zur stärkeren Reduktion hin führt.

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3.2.4. Meßfehler des NIRO 500

An dieser Stelle muß ein wichtiges Problem bei der Interpretation der mit dem NIRO 500 erhobenen Daten besprochen werden: Bei dynamischen Prozessen des Cortex, und besonders bei der CSD werden die optischen Eigenschaften des Gewebes durch die zwangsläufige Zellschwellung auf Kosten des Extrazellulärraumes [Lipton, 1973; Hansen, Olsen, 1980; Jing et al., 1994] verändert. Die Algorithmen, die der Software des NIRO 500 zugrundeliegen, können physiologische Änderungen des Weglängenfaktors (DPF) nicht in Rechnung stellen. Der aus diesem Grunde bestehende Fehler betrifft alle Chromophoren in gleichem Maße und in gleicher Weise. Deshalb sind qualitative Aussagen über diametral entgegengesetzte Konzentrationsänderungen, wie sie in den Hämoglobinsignalen gesehen wurden, weniger problematisch.

Überdies ist die Berechnung der chromophorenspezifischen Absorption durch Anpassung der bei vier Wellenlängen gemessenen Extinktionen an die bekannten Absorptionsspektra eine gegenseitige Kontamination der Signale unvermeidbar. Da das Cytochrom aa3 in seiner Konzentration um eine Größenordnung niedriger als die Hämoglobine liegt [Cope, Delpy, 1988a], ist es besonders anfällig für Signalverunreinigungen durch die anderen Chromophoren.

Das NIRO 500 gibt die aus den Extinktionsänderungen berechneten Konzentrationsänderungen in µM an. In der einleitenden Beschreibung der Technik wurde darauf hingewiesen, daß in Ermangelung vorbestimmter Weglängenfaktoren für den Kopf der Ratte diese Einheiten arbiträr sind. Überdies müssen wir jedoch auch davon ausgehen, daß die optischen Geometrien der Messungen von Tier zu Tier und insbesondere bei unterschiedlichen Optodenpositionen in den beiden hier vorgestellten Studien nicht konstant waren. Insofern ist auch der Vergleich der quantifizierten Meßergebnisse zwischen den Studien nur für qualitative Aussagen möglich. Innerhalb der Studien dürfte die Variabilität der optischen Geometrie zu den hohen Standardabweichungen beigetragen haben.

Beide oben benannten methodischen Probleme (gegenseitige Signalkontamination und optische Weglängenänderungen) sind im Rahmen der NIRS prinzipiell lösbar:

Eine Verbesserung der Dekonvolution der verschiedenen Extinktionssignale ließe sich durch Verwendung von mehr als vier Wellenlängen für die NIRS erreichen [Obrig et al., 1996a]. Auf diese Weise könnte vor allem das Cytochromsignal besser getrennt und für weitere pathophysiologische Studien valide gemacht werden. Die Anzahl der gemessenen Wellenlängenpunkte auf dem Spektrum muß bei der

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Sowohl die dynamischen Änderungen der optischen Eigenschaften des Gewebes, als auch Unterschiede in der optischen Geometrie bei verschiedenen Versuchen werden einer Korrektur zugänglich, wenn (statt der Verwendung eines invariablen Weglängenfaktors im Algorithmus) mit den Extinktionsänderung bei verschiedenen Wellenlängen auch direkt die mittlere Weglänge der Photonen gemessen wird. Das ist mit simultaner Messung der Flugzeit der Photonen (”time of flight“ [Delpy et al., 1988]) oder mit Messung der Phasenverschiebungen (”phase resolved“ [Duncan et al., 1995]) des kohärent eingestrahlten Laserlichts möglich. Da aber auch das Absorptionsspektrum von Wasser im Nah-Infrarot-Bereich einen Gipfel aufweist (s. Abb. 17), und sich die Menge des Hirnwassers trotz der Verschiebungen zwischen den Kompartimenten nicht akut ändert, kann das Ausmaß der Extinktion bei dieser Wellenlänge als Maß für Weglängenänderungen der Photonen gelten [Matcher, Cooper, 1994].

Abbildung 17: schematisierte Absorptionsspektra von Oxyhämoglobin [HbO2], Deoxyhämoglobin [Hb], oxydiertem Cytochrom aa3 [CytO] und Wasser (OD mit 10 multipliziert) im Nahinfrarotbereich. Der Wasserabsorptionsgipfel (zur besseren Anschauung mit Faktor 10 überhöht dargestellt) kann zur Messung mittlerer Weglängen der Photonen genutzt werden und damit die Quantifizierung der Daten ermöglichen.

Eine Verbesserung der Methode durch simultane Bestimmung der mittleren optischen Weglänge würde nicht nur die Beurteilung relativer, d.h. von vorbestimmten Grundwerten abweichender Konzentrationsänderungen verbessern, sie könnt überdies die absolute Konzentrationsmessung für die Chromophoren ermöglichen [Matcher, Cooper, 1994].

In unserem Labor wird an einer Verbesserung der Technik in diesem Sinne gearbeitet [Obrig et al., 1996a; Kohl et al., 1997].

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3.3. Unterscheidung von Periinfarkt-Depolarisation und ”cortical spreading depression“ (Hypothese 3)

PID unterschieden sich in der vorliegenden Studie deutlich von normalen CSD durch biphasische Signalveränderungen in der NIRS, die in ihrem ersten Teil auf eine relative cerebrale Hypoxygenierung hindeuten, in ihrem zweiten Teil aber dem Muster der normalen CSD mit relativer Hyperoxygenierung ähnelten.

Da die Signalveränderungen für die Hämoglobine gegenläufig waren, dürfen wir die Messungen trotz der oben besprochenen optischen Probleme als physiologisch signifikant betrachten. Während die CSD im normal perfundierten Gehirn mit einer exzessiven Oxygenierung der Mikrozirkulation verbunden war, zeigen die initiale Konzentrationsabnahme des Oxyhämoglobins und Konzentrationszunahme des Deoxyhämoglobins bei den PID an, daß die Sauerstoffextraktion des Gewebes seine Zufuhr deutlich übersteigt. Besonders interessant ist in diesem Zusammenhang die Konzentrationsänderung des Deoxyhämoglobins, da es auch als Signal die Grundlage des kernspintomografischen BOLD-Signals ist [Ogawa et al., 1990]. Der Hinweis der NIRS-Daten auf einen Anstieg der Sauerstoffextraktion kann als Zeichen einer Steigerung des oxydativen Energiestoffwechsels interpretiert werden. Inwiefern diese Abnahme der Oxygenierung zur Pathologie der PID beiträgt kann anhand unserer Daten nicht beantwortet werden. Das gilt umso mehr, weil wir im Redoxstatus des Cytochroms aa3 kein anderes Verhalten sehen, als während CSD. Die durch wiederholte PID prolongierte Lactazidose des Gewebes wäre als alternativer Schadensmechanismus denkbar.

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Kleinere Optoden im Tierexperiment, etwa in der Größe der bisher verwendete LDF-Sonden (<1 mm) könnten die räumliche Auflösung der Methode erhöhen und so auch eine genauere Sequenzierung der Veränderungen der Oxygenierung ermöglichen, die in dieser Studie nur für relativ globale Oxygenierungsänderungen möglich war.

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Abbildung 18: Schematische Darstellung der optischen Geometrie der NIRS bei PID: Das Meßvolumen der Optoden umfaßt neben der Penumbra auch Teile des Ischämiekerns und es intakten Cortex. Aus [Wolf, Lindauer et al. 1997]

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