Einleitung

1.1 Die Familie der Herpesviridae

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Infektionen mit Viren der Familie der Herpesviridae sind sowohl bei Wirbeltieren als auch beim Menschen weit verbreitet. Von über 100 Herpesviren gelten allerdings nur neun als humanpathogen. Hierzu zählen die Herpes Simplex Viren Typ 1 und 2 (HSV-1/2), das Varicella Zoster Virus (VZV), das Epstein Barr Virus (EBV), die Humanen Herpesviren 6a, 6b, 7 und 8 (HHV-6/7/8), sowie das Humane Cytomegalievirus (HCMV). Infektionen mit diesen Viren führen zu einem breiten Spektrum von Erkrankungen. Es reicht vom lokal begrenzten bläschenförmigen Hautausschlag der Herpes Simplex Viren, über generalisierte Manifestationen bei Windpocken (VZV), lebensbedrohliche Pneumonien Immungeschwächter durch HCMV (siehe Kap. 1.5.4.) bis hin zur Beteilung von Herpesviren an der Entstehung von Tumorerkrankungen (EBV, HHV-8).

Eine charakteristische Eigenschaft aller Herpesviren ist ihre Fähigkeit, nach oftmals subklinisch verlaufender Primärinfektion in ein latentes Stadium überzugehen. In diesem vor der Immunabwehr geschützten Zustand kann das Virus lebenslang im Organismus persistieren. Unter bestimmten Einflüssen können Herpesviren aus der Latenz reaktiviert werden (siehe Kap. 1.6.2). Als Folge kommt es zu Erkrankungen mit oft gänzlich neuer Symptomatik. In ihrem morphologischen und genomischen Aufbau zeigen die einzelnen Vertreter der Herpesviren grundlegende Gemeinsamkeiten (siehe Kap. 1.3.). Aufgrund ihrer unterschiedlichen biologischen Eigenschaften –wie Pathogenität, Vermehrungszyklus sowie Wirts- und Zellspezifität - werden sie in die drei Unterfamilien der α-, β- und γ- Herpesvirinae unterteilt.

1.2 Das Humane Cytomegalievirus (HCMV)

Das Humane Cytomegalievirus ist der wichtigste Vertreter der β-Herpesviren. Es zeichnet sich durch eine strenge Wirtsspezifität und einen langsamen Replikationsszyklus von 48-72 Stunden aus. Vom Virus infizierte Zellen erscheinen vergrößert, runden sich ab und zeigen typische Einschlusskörperchen. Dieser auffällige cytopathische Effekt (CPE) war es, der Forscher auf das Virus aufmerksam machte und später zu seiner Namensgebung führte (griech.: kytos= Zelle; megas= groß). Anfang des 20. Jahrhunderts beobachtete der Pathologe Jesionek erstmals diese typisch aufgeblähten Zellen in Lungen-, Leber- und Milzmaterial von Todgeburten(Jesionek et al., 1904). Die zugrundeliegende Krankheit wurde als kongenitales Cytomegalie-Einschluss- Syndrom („Cytomegalic inclusion body disease“) bezeichnet. Jesonik hielt eine Besiedlung mit Protozoen für die Verursacher der typischen Zellveränderungen. Erstmals 1925 wurde eine virologische Ätiologie postuliert(von Glahn et al., 1925). Es dauerte aber weitere drei Jahrzehnte, bis das infektiöse Agens erstmalig im Elektronenmikroskop als Viruspartikel identifiziert (Minder et al., 1953) und schließlich 1956/57 nahezu zeitgleich in drei Laboren isoliert werden konnte (Rowe et al., 1956; Smith et al., 1956; Weller et al., 1957). Nun war es möglich, das Virus zu diagnostischen Zwecken zu kultivieren und seine Natur durch in vitro Experimente genauer zu erforschen. Stern und Friedman (Stern et al., 1960) zeigten bald darauf, dass es sich bei den beobachteten Einschlusskörperchen im Zytoplasma um Produkte der im Kern stattfindenden Virusreplikation handelt. Durch neue Methoden wurde klar, dass verschiedene HCMV Genotypen existieren und dass in immunsupprimierten Patienten unterschiedliche Genotypen gleichzeitig gefunden werden können (Baldanti et al., 1998; Chou et al., 1989; Gerna et al., 1992). Versuche, einzelne Genotypen (z.B. Subtypen des Glykoproteins B) bestimmten charakteristischen klinischen Infektionsverläufen zuzuordnen, zeigten allerdings keine eindeutigen Zusammenhänge. Eine Einteilung in HCMV-Subtypen existiert daher nicht (Fries et al., 1994; Vogelberg et al., 1996).

1.3 Morphologie und Genomstruktur von HCMV

1.3.1 Morphologie

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Die Struktur von HCMV-Virionen entspricht dem typischen Aufbau der Herpesviren (siehe Abb. 1).

Abb. 1: Strukturschema des HCMV
Das reife Viruspartikel hat einen Durchmesser von 150 – 200 nm. In seinem Inneren befinden sich das Virus-Core, eine fibrilläre Nukleoproteinmatrix, mit der das doppelsträngige, lineare DNA Genom assoziiert ist. Es wird von einem ikosaedrischen Kapsid umgeben.

Zwischen Kapsid und äußerer Virushülle („envelope“) liegt das elektronendichte, hauptsächlich aus Phosphoproteinen bestehende Tegument. Die beiden häufigsten Tegumentproteine (pp65, pp150) stellen ein wichtiges Antigentarget in der HCMV-Schnelldiagnostik dar, für andere Tegmentumproteine (z.B. pp71, pUL26) konnten transaktivierende Wirkungen auf die virale Genexpression nachgewiesen werden (Liu et al., 1992; Stamminger et al., 2002). In der alles umschließenden Virushülle, die aus einer Lipid-Doppelmembran besteht, sind virale Glykoproteine stecknadelförmig eingelassen, die im Elektronenmikroskop als „spikes“ sichtbar werden. Sie dienen u.a. der Rezeptorerkennung und Adsorption des Virus. Ihre starke Immunogenität macht sie zur favorisierten Zielstruktur in der Impfstoffentwicklung (Griffiths et al., 2002). Bedingt durch seine Struktur ist HCMV empfindlich gegenüber niedrigem pH, Lipidlösungsmittel und Hitze. Kälte von –20°C konserviert das Virus, zur sicheren Erhaltung der Infektiösität ist allerdings eine Lagerung bei –70°C erforderlich (Mocarski et al., 2001).

1.3.2 Genomstruktur

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Das HCMV Genom gehört mit ca. 230 kbp und etwa 200 ORFs zu den größten viralen Genomen. Es ist in zwei unikale Segmente – ein langes Segment (UL) und ein kurzes Segment (US) unterteilt (Abb. 2). Diese werden am Ende durch terminale repetitive Sequenzen flankiert (TRS ,TRL) und in der Mitte durch interne repetitive Sequenzen (IRL, IRS) verbunden. Da die unikalen Segmente invertieren können, kommt das humane CMV (im Gegensatz zu tierpathogenen CMV-Stämmen, denen interne Repeats fehlen) in 4 verschiedenen Isomeren vor (Ho et al., 1991).

Abb. 2: Genomstruktur von HCMV. Erläuterungen im Text (Ho et al., 1991)

1.4 Genomexpression und der Immediate Early 1/2-Enhancer/Promotor

1.4.1 Genomexpression

Nach Wanderung des Nukleokapsids in den Kern der infizierten Zelle erfolgt hier die Transkription viraler Gene mit Hilfe der zellulären RNA Polymerase II in einem zeitlich streng kontrollierten Ablauf: kaskadenartig werden „sehr frühe“ (Immediate Early [IE]), „frühe“ (Early [E]) und „späte“ (Late [L]) Proteine von entsprechenden α-Genen (IE), β-Genen (E) und γ-Genen (L) in zeitlicher Reihenfolge transkribiert. Der Grossteil der IE-Transkripte stammt aus einem stark exprimierten „major IE Locus“, der sich zwischen den Positionen 169 und 175 kbp des HCMV Genoms befindet. Die Synthese der wichtigen hier kodierten Proteine IE1 (72 kDa) und IE2 (86 kDa) beginnt bereits zwei Stunden nach Infektion, ist unabhängig von einer de novo Synthese zellulärer Proteine und absolut essentiell für die folgende Virusreplikation (Mocarski et al., 2001). Die IE1 und IE2 Proteine haben transaktivierende Wirkung auf die Expression „früher“ und „später“ Gene, und können ihre eigene Synthese positiv (IE1) oder negativ (IE2) regulieren (Malone et al., 1990). Die Haupt-IE-Proteine greifen zudem in Zellzyklus- und Wachstumskontrollmechanismen des Wirtes ein. Ihnen kommt daher eine besondere Bedeutung für den Beginn der viralen Replikation nach Infektion und den Prozess der Reaktivierung zu (siehe Kapitel 1.6.2.). Die zeitlich nachfolgend exprimierten β-Gene kodieren vorwiegend für virusspezifische Enzyme, die für den DNA- Metabolismus und Replikationsprozess benötigt werden und die Expression der γ-Gene steigern. Durch letztere werden ausschließlich virale Strukturproteine exprimiert, die für Zusammenbau und Ausschleusung infektiöser Viruspartikel von Bedeutung sind.

1.4.2 Der Immediate Early ½-Enhancer/Promotor

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Die Regulation der Haupt-IE-Gene erfolgt durch einen außergewöhnlich starken IE1/2-Enhancer/Promotor (Boshart et al., 1985). Dieser Promotor ist essentiell für eine effiziente Virusreplikation (Isomura et al., 2003). Er enthält eine für die Initiation der Transkription nötige TATA-Box, sowie eine CAAT-Box, über die spezifische Proteine die Transkription nachgeschalteter Gene erhöhen können. Darüber hinaus wird die Aktivität des Promotors im besonderen Maße von drei stromaufwärts liegenden Regionen reguliert: dem „Enhancer“, der „Nuclear factor 1-“ und der „Modulatorregion“.

Wie Abbildung 3 zeigt, liegen in allen drei Regionen repetitive Bindungsorte für zelluläre Transkriptionsfaktoren. Die Modulatorregion kann durch Bindung der Transkriptionsfaktoren „Ying-Yang 1“ (Liu et al., 1994)und Modulator binding Factor 1 eine hemmende Wirkung auf die Promotoraktivität ausüben. Den in der „nuclear factor-Region“ (Adam et al., 1987)angesiedelten „konsensus binding sites“ für Proteine der NF1/CBP- (CAAT-binding protein) Familie kommen sowohl negative als auch positive regulatorische Eigenschaften zu (Mocarski et al., 2001).

Abb. 3: Schematische Struktur der Haupt-IE 1/2-Promotorregion
Die repetitiven Sequenzen im HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor sind als (21-bp Repeat), (19-bp Repeat), (18-bp Repeat), (17-bp Repeat) und (13-bp Repeat) dargestellt, die an sie bindenden Transkriptionsfaktoren (links) wurden durch Pfeile zugeordnet. (Mocarski et al., 2001)

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Die Enhancerregion spielt die weitaus entscheidendste Rolle in der Regulation der Promotoraktivität. Sie enthält zahlreiche repetitive und unikale Bindungsstellen für verschiedene zelluläre Transkriptionsfaktoren. Diese Bindungsstellen werden jeweils nach ihrer Größe als „17-, 18-, 19-, und 21 bp repeats“ bezeichnet.

Bindung von YY1 und MBF1 an die 21 bp repeats führen zu einer Hemmung der Promotoraktivität. Die Synthese beider Transkriptionsfaktoren nimmt mit fortschreitender Zelldifferenzierung ab (Liu et al., 1994), was ein Hinweis darauf sein könnte, dass diese Transkriptionsfaktoren an der Etablierung und Aufrechterhaltung der Latenz beteiligt sind (siehe Kap.1.6.2.). Die fünf 19 bp Motive sind u.a. für die promotorstimulierende Wirkung von cyclischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und Katecholaminen verantwortlich (Keller et al., 2003; Prösch et al., 2000 a). Sie enthalten „cAMP responsive elements“, die den durch erhöhte cAMP-Spiegel aktivierten Transkriptionsfaktor CREB1/ATF1 binden (Hunninghake et al., 1989). Lange wurde dieser Sequenz eine wesentliche Rolle für die basale Grundaktivität des IE-Promotors zugeschrieben (Stamminger et al., 1990), neuere Untersuchungen an entsprechenden Virusmutanten stellen dies jedoch wieder in Frage (Keller et al. 2003).

Die 18 bp Repeats sind Bindungsstellen für den Nuclear Factor Kappa B (NFκB) (Prösch et al., 1995; Sambucetti et al., 1989). Dieser liegt inaktiv gebunden an den Inhibitor Kappa B (IκB) im Cytosol. Insbesondere bei entzündlichen Prozessen induzieren Zytokine wie Tumor Nekrose Faktor Alpha (TNFα) oder Interleukin-1 (IL-1) über die Aktivierung von Sauerstoffradikalen und Erhöhung der Proteinkinase C –Aktivität eine Phosphorylierung von IκB. Diese hat zur Folge, dass IκB durch Proteasomen abgebaut wird und der aktive NFκB-Komplex in den Zellkern transloziert (McKay et al., 1999). Über Bindung an das 18 bp Repeat im HCMV IE1/2-Enhancer führt NFκB zu einer potenten Stimulierung der Promotoraktivität in monozytären HL-60 und U-937 Zellen (Prösch et al., 1995; Stein et al., 1993). Sowohl das 18-, wie auch das 19 bp Repeat sind konservierte Sequenzen, die auch bei tierpathogenen CMV Stämmen zu finden sind (Hunninghake et al., 1989); nicht aber das 17 bp Repeat. Ihm wurde daher lange keine große Bedeutung beigemessen. An ihn binden die Transkriptionsfaktoren NF1 und das „stimulating Protein 1“ (SP1), ein ubiquitäres Kernprotein. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass auch die stimulierende Wirkung von Glukokortikoiden auf den HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor über ein in dieser 17 bp Sequenz gelegenen Glucocorticoid receptor responsive elements (GRE) vermittelt wird (Prösch et al., eingereicht).

1.5 Epidemiologie, Übertragung und Klinik der HCMV-Infektion

1.5.1 Allgemeines

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Infektionen mit HCMV sind weltweit verbreitet, die Seroprävalenzen in verschiedenen Ländern variieren in Abhängigkeit vom sozioökonomischen Standard des Landes (Pass et al., 2001). So liegt die Prävalenz spezifischer HCMV-Antikörper in Industrienationen wie Amerika, Europa und Australien bei 40-70% der Bevölkerung und damit deutlich niedriger als in Nationen in Afrika und Asien, für die Seroprävalenzen im Erwachsenenalter von 85-100% beschrieben werden (Hirota et al., 1992; Krech et al., 1973; Lamberson et al., 1992). Nach erfolgter Primärinfektion kann es zu sporadischen HCMV-Reaktivierungen kommen, bei denen infektiöses Virus in Speichel, Urin, Tränen, Blut, Samenflüssigkeit, Zervikalsekreten und Muttermilch für einen Zeitraum von Monaten bis Jahren ausgeschieden wird (Lang et al., 1975; Reynolds et al., 1973; Stagno et al., 1975). Die Seroprävalenzen steigen mit fortschreitendem Alter insbesondere innerhalb zweier Altersgruppen durch horizontale Ausbreitung: Bei Kinder bis zum 5. Lebensjahr und im frühen Erwachsenenalter. Enger körperlicher Kontakt durch Eltern und Personal in Kindergärten sowie untereinander (Kind - Kind) wird für den ersten Anstieg, der Beginn sexueller Kontakte für den zweiten verantwortlich gemacht (Carlström et al., 1970; Stagno et al., 1994). Auch eine vertikale Infektionsausbreitung von der Mutter zum Kind ist möglich, da das Virus insbesondere bei Primärinfektion während der Schwangerschaft die Plazentaschranke überwinden und das ungeborene Kind infizieren kann (siehe Kap. 1.5.2.).

1.5.2 Kongenitale HCMV-Infektion

Nach erfolgreicher Zurückdrängung von Röteln-Infektionen während der Schwangerschaft ist das Krankheitsbild der „cytomegalic inclusion disease“, hervorgerufen durch kongenitale HCMV-Infektionen, heute die häufigste pränatal übertragene Infektionskrankheit. Je nach Population werden 0,2 - 2,2 % aller Neugeborenen auf diesem Wege infiziert (Peckham et al., 1991; Stagno et al., 1983; Vochem et al., 2003). Zu einer Übertragung kann es in jedem Schwangerschaftstrimester, sowohl bei Primärinfektion, Reinfektion oder Virus-Reaktivierung der Mutter kommen (Ahlfors et al., 1999; Griffiths et al., 2002). Eine fetale Infektion nach Primärinfektion der Mutter ist am häufigsten (in 1/3 der Fälle) und resultiert deutlich öfter in Spontanaborten, Frühgeburten und schwereren Krankheitsverläufen als bei Reinfektionen oder Virusreaktivierungen (Stagno et al., 1986). Der Großteil der Infektionen verläuft klinisch inapparent. Jedes 10. infizierte Neugeborene zeigt jedoch bereits bei Geburt schwere Akutsymptome wie Hepatosplenomegalie, Thrombozytopenie, Petechien, Mikrozephalie, Wachstumsstörung, Chorioretinitis, andauernder Ikterus, in seltenen Fällen auch Pneumonie. Vorsichtige Schätzungen gehen von einer Letalitätsrate von 10-30 % der symptomatisch infizierten Kinder aus (Newell et al., 2000). Neben diesen Akutsymptomen verursacht die kongenitale HCMV-Infektion Spätschäden im Bereich des zentralen und peripheren Nervensystems. Bis zu 12 % der bilateralen Innenohrschwerhörigkeit werden pränatalen Infektionen mit HCMV zugeschrieben (Peckham et al., 1987) und die Inzidenz von mentalen Entwicklungs-störungen, cerebralen Verkalkungen und Atrophien der Nervi optici korreliert eindeutig mit dem Auftreten kongenitaler HCMV-Infektionen (Anderson et al., 1996; Pass et al., 1980; Ramsey et al., 1991). Die Kosten für Pflege und Betreuung der so erkrankten Kinder wird in den USA auf eine Billion Dollar pro Jahr geschätzt (Stratton et al., 2000) -ein Grund, warum seit langem an einem Impfstoff gearbeitet wird, der durch humorale Immunität der Mütter die Zahl schwerwiegender kongenitaler Infektionen reduzieren soll.

Der Mechanismus, durch den das Virus den Fetus infiziert, ist noch ungeklärt. Plazentäre Cytotrophoblasten bilden die Barriere zwischen maternalem und fetalem Blutkreislauf. Im Abortmaterial konnte in 7-30 % des untersuchten Materials HCMV-DNA nachgewiesen werden (Pereira et al., 2003; Spano et al., 2002). Immunohistochemische Untersuchungen an HCMV-infizierten Plazenten zeigten Viruspermissivität für plazentare Endothelzellen und Trophoblasten (Sinzger et al., 1993). Dabei muss es nicht zwingend auch zu einer Infektion des Fetus kommen, wenn plazentäres Gewebe infiziert ist (Hayes et al., 1971). Fallbeschreibungen berichten sogar von biplazentären Zwillingsschwangerschaften, bei denen beide Plazenten, jedoch nur einer der Feten infiziert wurde (Revello et al., 2003). In vitro Infektionen zeigten eine Virustransmission von uterinen Endothelzellen zu plazentären Cytotrophoblasten (Maidji et al., 2002). Es wird daher zur Zeit ein Transmissionsmodell diskutiert, in dem zunächst die Plazenta über uterine Endothelzellen produktiv infiziert wird, das Virus von hier über plazentäre Synzytio- und Cytotrophoblasten Anschluss an Endothelzellen des fetalen Blutkreislaufs erhält, um sich schließlich hämatogen im Fetus auszubreiten (Maidji et al., 2002).

1.5.3 Peri/postnatale HCMV-Infektionen

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Von „perinatalen HCMV-Infektionen“ spricht man beim initialen Nachweis von Virus innerhalb der ersten 2 Wochen nach Geburt im Urin, bei zunächst negativen Befund direkt nach der Geburt (Ho et al., 1991). Die Infektion des Kindes geschieht hierbei im Zeitraum vom Beginn der Wehen bis 1 Woche nach Geburt.

Postnatale Infektionen sind Infektionen die nach der 1. Lebenswoche das Neugeborene befallen. Sie können erst nach ausreichender Virusvermehrung etwa ab der 3. Lebenswoche durch Virusnachweis beim Kind diagnostiziert werden.

Insbesondere zwei Übertragungsmodi werden für peri/postnatale Infektionen mit HCMV diskutiert: Kontakt mit infiziertem mütterlichem Zervikalsekret oder Blut unter der Geburt und

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Aufnahme von infizierter Muttermilch.

Bei Virusausscheidung im Zervikalsekret der Mutter um den Geburtstermin resultierte nach einer Studie in den USA eine Mutter-Kind Übertragungsrate von 57 %. Virusausscheidung in Urin und Speichel alleine führte hingegen zu keiner Infektion des Kindes (Stagno et al., 1980). Neuere Untersuchungen konnten diese hohe Übertragungsrate über infizierte mütterliche Zervikalsekreten nicht bestätigen, ihre Ergebnisse stellten die Rolle der Muttermilch als Übertragungsmedium wieder in den Vordergrund. So fanden sich bei 63-76 % seropositiver Mütter infektiöses Virus (Virolaktia) (Ahlfors et al., 1985; Hamprecht et al., 2001; Mosca et al., 2001) und in sogar 92-96% virale DNA in der Milch (DNAlaktia) (Hamprecht et al., 2001; Hotsubo et al., 1994; Meier et al., 2005; Yasuda et al., 2003). In diesen Studien wurde über eine postnatale Transmissionsrate von 19-37 % der Kinder von seropositiven Müttern berichtet. Die Übertragungsraten waren vergleichbar in der Gruppe von Spontangeburten und Kaiserschnitt-Entbindungen, wo kein Kontakt zu potentiell infiziertem Zervikalsekreten bestand. Dieser Befund ist ein starker Hinweis auf postnatale Übertragung von HCMV über Muttermilch. In der neuesten Studie von Hamprecht et al. (2001) konnte darüber hinaus kein Virus in mütterlichen Rachenabstrichen und Urinproben nachgewiesen werden. Im Unterschied dazu zeigen die Daten, dass es in nahezu allen seropositiven Müttern zu einer Reaktivierung und Ausscheidung des Virus zu Beginn der Laktation mit der Brustmilch kommt. Da es hierbei keine Anzeichen einer systemischen Virusinfektion der Mutter gibt, scheint dieser Reaktivierungsprozess lokal auf die Brust begrenzt zu sein. Virus wird nur selten in Kolostrum (Vormilch) gefunden (Numazaki et al., 1997). Die gemessene Viruslast ist am höchsten zwischen der 3. und 6. Woche post partum (van der Strate et al., 2001; Vochem et al., 1998; Yasuda et al., 2003). Das Virus erscheint in der Milch häufiger zellfrei als zellassoziiert an Leukozyten (Hamprecht et al., 2000). Der genaue Übertragungsmechanismus und der mögliche Latenzort sind noch unbekannt.

Während peri/postnatale HCMV-Infektionen bei gesunden Neugeborenen in der Regel asymptomatisch verlaufen, werden bei „sehr kleinen Frühgeborenen“ (≤ 1500 gr, ≤32. Gestationswoche) häufiger auch klinische Infektionsverläufe beobachtet. Symptomatische HCMV-Erkrankungen wurden in bis zu 12 % der so infizierten Frühgeborenen mit den typischen Hepatopathien, Thrombozytopenien, Pneumonien und sepsisartigen Krankheitsbildern beschrieben (Hamprecht et al., 2001).

1.5.4 HCMV-Infektionen im Erwachsenenalter

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HCMV-Infektionen des Erwachsenen zeigen je nach Immunstatus des Betroffenen sehr unterschiedliche klinische Bilder:

Bei immunkompetenten Patienten verläuft die Primärinfektion in den meisten Fällen gänzlich asymptomatisch. Nach einer Inkubationszeit von 2-8 Wochen kann es in seltenen Fällen zu einer der EBV-assoziierte Mononukleose ähnlichen Erkrankung kommen. Sie ist durch grippale Symptome mit hohem Fieber, Abgeschlagenheit, Gliederschmerzen und rubelliformen Hautausschlag charakterisiert. Bei Verursachung durch HCMV findet man jedoch nur in 30 % der Fälle die für die EBV assoziierte Mononukleose typische Pharyngitis, Lymphadenopathie und Splenomegalie (Pass et al., 2001). Das Krankheitsbild der HCMV assoziierten Mononukleose ist selbstlimitierend und ebbt in der Regel nach 2-6 Wochen ab.

Viel schwerwiegendere Folgen haben HCMV- Infektionen für immunsupprimierte Patienten, insbesondere in der Transplantations-Medizin und bei HIV-Kranken. Hier kann es zu schweren symptomatischen Primärinfektionen, Reinfektionen und Reaktivierungen kommen. Nahezu alle HIV-infizierten Personen sind HCMV-seropositiv. Im Stadium AIDS breitet sich das Virus in fast alle Organe aus und verkompliziert den Krankheitsverlauf. Am häufigsten befällt es das Auge und führt zu einer HCMV-Retinitis, welche die vollständige Erblindung des Patienten zur Folge haben kann (Jabs et al., 1989). Die Entwicklung einer Ösophagitis und ulcerierender Kolitis wird bei jedem 10. HIV-Patienten beobachtet. Etwas seltener aber mit schwerwiegenden Konsequenzen kommt es zu HCMV-Pneumonien, Encephalitiden, Gastritiden und Hepatitiden. Eine gegenseitige Replikationssteigerung von HIV-1 und HCMV auf Promotorebene kann den Krankheitsverlauf beider Infektionen zudem verschlimmern (Pass et al., 2001).

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Bei Transplantat-Empfängern sind eine erhöhte Morbidität und Letalität durch HCMV bekannt (Rubin et al., 1990). Unbehandelt entwickelten etwa 2/3 der Transplantatempfänger eine mehr oder weniger schwer verlaufende HCMV-Infektion (Nachweis von Virus-DNA und -Antigen ohne Organmanifestation) Insbesondere seronegative Empfänger von Knochenmarks-, Nieren- oder Lebertransplantaten seropositiver Spender entwickeln aber in 15 % der Fälle auch schwere Pneumonien und Colitiden, sowie Funktionsstörungen des Transplantats. Aus ersten klinischen und tierexperimentellen Studien gibt es Hinweise, dass HCMV direkt an der Transplantatabstoßung beteiligt ist (Reinke et al., 1994; Soderberg-Naucler et al., 2001).

Die Assoziation weiterer Krankheiten mit HCMV-Infektionen wird diskutiert. Klinische Studien lassen eine ursächliche Beteilung von HCMV an der Entstehung von Atheriosklerose und Koronararterien-Restenosen vermuten (Adam et al., 1987; Grattan et al., 1989; Hendrix et al., 1990; Melnick et al., 1983; Rubin et al., 1990). Experimentelle Daten unterstützen hierbei ein Pathogenesemodell, in dem HCMV die Proliferation glatter Muskelzellen beschleunigt, einen lokalen Inflammationsprozess mit Invasion von Monozyten induziert, der schließlich die Bildung von artheriosklerotischen Plaques begünstigt (Lemstrom et al., 1993; Li et al., 1998). Auf der Suche nach onkogenen Wirkungen von HCMV wurde eine Interaktion von IE-Proteinen mit zellzyklus-regulierenden Proteinen z.B. Rb und p53 beschrieben (Castillo et al., 2004). Virale DNA und Antigen wurden in Zervikal-, Prostata- und Kolonkarzinomen gefunden (Doniger et al., 1999; Samanta et al., 2003), wobei jedoch die Interpretation dieser Befunde durch die Omnipräsenz von HCMV und seine opportunistische Aktivität in tumorgeschwächten Patienten problematisch ist. Eindeutige Anzeichen für eine klinisch relevante onkogene Wirkung von HCMV existieren derzeit nicht.

1.6 Latenz und Reaktivierung von HCMV

1.6.1 Mechanismus und Ort der Latenz

HCMV infiziert insbesondere muköse und duktale Epithelzellen, aber auch Endothelzellen, alveoläre Fibroblasten, Mikrogliazellen, dendritische Zellen und Pneumozyten. Nach Primärinfektion und Ausbreitung (lytischer Infektionszyklus) im Körper geht das HCMV in das Stadium der Latenz über, in dem es lebenslang im Organismus persistiert. Hierbei liegt das virale Genom in 3-13 Genkopien als extrachromosomales Episom in latent infizierten Zellen (Slobedman et al., 1999). In diesem Zustand ist es nur mit äußerst sensitiven PCR-Methoden und nach Anreicherung latent infizierter Zellen detektierbar (Larsson et al., 1998). Infektiöses Virus kann nicht nachgewiesen werden. Die virale Genexpression beschränkt sich auf einige wenige latenzassoziierte sense- und anti-sense Transkripte (LAT) der IE-Region. Ob diese eine Funktion in der Aufrechterhaltung der Latenz haben- so wie es für die LATs bei HSV diskutiert wird- ist bis heute unklar (Kondo et al., 1995; Lunetta et al., 2000).

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Hämatopoetische Vorläuferzelllinien und die aus ihnen hervorgehende Monozyten/Makrophagen wurden als Hauptlatenzorte diskutiert und bestätigt. Zugrunde lag die Beobachtung, dass Bluttransfusionen seropositiver Spender in HCMV-negativen Empfängern eine Infektion hervorrufen können (Adler et al., 1985), wobei die Virusübertragung durch Verwendung Leukozyten-depletierten Blutes verhindert werden konnte (de Graan-Hentzen et al., 1989). Mittels hochsensitiver PCR Techniken wurde in CD33+ und CD34+ Vorläuferzellen des Knochenmarks und in weiter ausdifferenzierten CD14+ peripheren Blutmonozyten (PBMC) virale DNA nachgewiesen (Hahn et al., 1998; Kondo et al., 1996; Mendelson et al., 1996; Taylor-Wiedeman et al., 1991). Versuche, in denen permissive Zellen (Fibroblasten) mit in vitroinfizierten Granuloyten-Makrophagen-Vorläuferzellen co-kultiviert wurden, zeigten, dass diese Zellen nicht nur DNA-Bruchstücke sondern intakte vermehrungsfähige Virusgenome enthalten. Ähnliche Experimente gelangen mit peripheren Blutmonozyten seropositiver Spender nach allogener Stimulierung (Hahn et al., 1998; Soderberg-Naucler et al., 1997; Soderberg-Naucler et al., 2001). In Anbetracht der Tatsache, dass Blutmonozyten in vitro keinen lytischen Replikationszyklus zulassen, jedoch DNA in PBMCs gesunder seropositiver - und sogar einiger weniger seronegativer- Patienten nachweisbar ist hat sich ein Latenzmodell durchgesetzt, in dem hämatopoetische Vorläuferzellen des Knochenmarks nach Primärinfektion ein Reservoir für latentes Virus darstellen.

1.6.2 Mechanismen der HCMV-Reaktivierung

Absolute Vorraussetzung für die HCMV-Reaktivierung ist der Wiederbeginn der IE-Genexpression (Greaves et al., 1998; Iskenderian et al., 1996). Hierfür werden verschiedenen Mechanismen diskutiert.

Zelldifferenzierungsprozesse:Bestimmte Zelllinien (z.B. monozytäre THP-1 und Ntera2-Karzinomazellen), die zunächst durch einen Block der IE-Genexpression keinen lytischen Replikationszyklus zulassen, können nach Weiterdifferenzierung infektiöses Virus bilden. Dieser Block wird wahrscheinlich durch zelluläre Transkriptionsfaktoren wie z.B. YY1, ERF und Oct-6 verursacht, welche die IE-Promotoraktivität und eine Verpackung der viralen DNA in deacetyliertes Histon (Nukleosomen) hemmen. Bei Zelldifferenzierung nimmt die Menge der hemmenden zellulären Transkriptionsfaktoren ab, während die Synthese aktivierender Transkriptionsfaktoren ansteigt. Eine ausreichende IE 1/2-Expression wird ermöglicht (Sissons et al., 2002). Nach dieser Theorie ist die Virusreaktivierung ein mehr oder weniger ständig erfolgender physiologischer Prozess, der bei ausreichender Immunabwehr lokal beschränkt bleibt, da die HCMV-tragenden Monozyten/Makrophagen zügig eliminiert werden.

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Klinisch und experimentelle Daten belegen, dass systemische Entzündungen und extremer Stress zur Virusreaktivierung beitragen.

Bei systemischer Entzündung wie Psoriasis, Sepsis oder als Reaktion auf allogene Transplantation (unter Behandlung mit anti-Lymphozyten Antikörpern z.B. OKT3, AT9) steigt die Inzidenz aktiver HCMV-Infektionen deutlich an. Diese korreliert mit einer Ausschüttung von Zytokinen wie IL-2, IL-6, IL-8, IFN-γ und besonders TNFα(Asadullah et al., 1999; Döcke et al., 1994; Fietze et al., 1994; Hummel et al., 2002). TNFα induziert die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFκB und steigert nachfolgend die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotor in HL-60- und U-937 Zellen, die undifferenzierten Vorläuferzellen der Monozyten/Makrophagen ähnlich sind (Prösch et al., 1995; Stein et al., 1993). Die Behandlung mit TNFα konnte latentes HCMV in in vitroinfizierten Granulozyten/Makrophagen Vorläuferzellen reaktivieren (Hahn et al., 1998) sowie latentes Maus-Virus (MCMV) im in vivoMausmodell (Hummel et al., 2002).

Für das Herpes Simplex Virus bereits lange bekannt, hat auch Stress und seine körperlichen Reaktioneneinen direktenEinfluss auf die Reaktivierung von HCMV. Klinische Studien mit Patienten unter besonderer Stresseinwirkung, z.B. nach Myokardinfarkt oder Probanden vor Prüfungen, zeigen eine erhöhte Inzidenz aktiver HCMV-Infektionen, erhöhte HCMV IgG Level oder vermehrte Virusausscheidung (Archimandritis et al., 1992; Glaser et al., 1985; Prösch et al., 2000 b; Prösch et al., 2000 a; Toro et al., 1996). Stress führt zur vermehrten Ausschüttung von Katecholaminen und Glukokortikoiden. Beide Stoffe induzieren in monozytären Zellen einen Signalweg, der zur gesteigerten Bindung von CREB1/ATF-1 und des Glukokortikoidrezeptors (GR) am IE1/2-Enhancer und nachfolgend zu einer erhöhten Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors führt (Lee et al., 1999; Prösch et al., 1999; Prösch et al., eingereicht). Über den cAMP-Signalweg können auch Medikamente wie Pentoxyfillin die Etablierung von HCMV-Infektionen zusätzlich begünstigen (Staak et al., 1997).

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Im Überblick wird deutlich, dass nicht einzelne Mechanismen für sich, sondern eher das Zusammenspiel mehrerer Prozesse (s.o.) die Virus-Reaktivierung ermöglicht.

1.7 Fragestellung der Arbeit

HCMV wird in der Brustmilch der überwiegenden Zahl seropositiver Mütter in den ersten Wochen nach der Geburt ausgeschieden (Asanuma et al., 1996; Hamprecht et al., 2001; Hotsubo et al., 1994; Mosca et al., 2001). Da bei den meisten Müttern keine systemische HCMV-Infektion nachweisbar ist, wird eine lokale Virusreaktivierung und -vermehrung von HCMV in der laktierenden Brust oder Milch diskutiert. Weder der Latenzort des Virus in der Brustdrüse, noch die Mechanismen, die die hypothetische Reaktivierung des Virus auslösen oder unterstützen, sind gegenwärtig bekannt. Auf der Basis des Modells der lokalen Reaktivierung von HCMV während der Laktation postulieren wir, dass in der laktierenden Brust Substanzen produziert und in die Milch ausgeschieden werden, welche die HCMV-Replikation steigern. Da gezeigt wurde, dass die Virolaktia einer charakteristischen Kinetik mit maximalen Virustitern zwischen der 3. und 6. Woche nach Geburt folgt (Hamprecht et al., 2001; Yasuda et al., 2003), soll auch das Auftreten von Substanzen, welche die Virusreplikation stimulieren oder die Reaktivierung des latenten Virus beeinflussen könnten, im zeitlichen Verlauf untersucht werden. Hierzu sollen im Rahmen einer klinischen Studie Muttermilchproben von 10 Müttern frühgeborener Kinder aus der Klinik für Neonatologie Charité Universitätsmedizin Berlin, Campus Mitte einmal wöchentlich während der ersten beiden Monate nach der Geburt gesammelt und untersucht werden.

Für das Ausmaß der HCMV-Replikation und im Prozess der Reaktivierung spielt die Expression der HCMV Immediate Early Proteine IE1 und IE2 eine Schlüsselrolle (Greaves et al., 1998; Iskenderian et al., 1996). Ihre Expression wird von dem HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor kontrolliert (Boshart et al., 1985). In dieser Arbeit soll durch in vitro Infektions – und Transfektionsversuche der Einfluss von zellfreier Molke aus der Brustmilch stillender Mütter auf die Virusreplikation und Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors in monozytären Vorläuferzellen (einem natürlichem Latenzortes von HCMV) untersucht werden.

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Als Beitrag zur Epidemiologie der peri- und postnatalen HCMV-Infektionen sollen im Rahmen der klinischen Studie die Inzidenz der mütterlichen HCMV-Reaktivierung und Transmission auf ihre frühgeborenen Kinder bestimmt werden. Hierzu wird über einen Zeitraum von zwei Monaten wöchentlich Muttermilch, kindlicher Urin und Tracheal/Pharyngealsekrete gesammelt und mittels PCR auf HCMV-DNA untersucht. Zusätzlich sollen der HCMV-Serostatus der Mütter ermittelt und mütterliches Blut auf eine systemische HCMV-Infektion (DNAemia) untersucht werden. Die Auswertung der epidemiologischen Daten erfolgt unter Einbeziehung von Daten, die im Rahmen einer Studie zur Rolle von HCMV für die Entstehung der Bronchopulmonalen Dysplasie (BPD) erhoben (Prösch et al., 2002 b) und bisher nicht ausgewertet wurden.

Die Studien im Rahmen der vorliegenden Arbeit stellen einen Beitrag zur Bewertung des Risikos peri- und postnataler HCMV-Infektionen bei Frühgeborenen unter besonderer Berücksichtigung der Übertragung durch Muttermilch dar. Erstmalig sollen durch in vitroVersuche potentielle Mechanismen der HCMV-Reaktivierung und -Replikationssteigerung in der laktierenden Brust aufgezeigt werden.


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31.07.2006