2 Material und Methoden

2.1 Zelllinien

2.1.1 Monozytäre Zelllinien HL-60 und THP-1

▼ 14 (fortgesetzt)

Für die in vitro Transfektionsexperimente wurden die Zelllinien HL-60 („American type culture collection“ (ATCC) CCL 240) und THP-1 (ATCC TIB 202) verwendet. HL-60 Zellen ähneln frühen undifferenzierten monozytären Vorläuferzellen, die in Abhängigkeit von den jeweiligen Stimuli entweder zu Granulozyten oder zu Monozyten/Makrophagen ausdifferenzieren können. THP-1 Zellen ähneln reifen Monozyten. Die Kultivierung der Zellen erfolgte in RPMI 1640-Medium bei 37°C, in wassergesättigter, 5%-iger CO2-Atmosphäre unter Zusatz von 10 % endotoxin-und mykoplasmenfreiem fetalem Kälberserum (FKS), 5 IE/ml Penicillin, 150 μl/ml Streptomycin und 10 μl/ml N-Aceytl-L-Alanyl-Glutamin (200 mM; Biochrom). Zur Haltung wurde die Zellkulturen in 2-3 tägigem Abstand im Verhältnis 1:3 in frisches Medium umgesetzt.

2.1.2 Humane embryonale Lungenfibroblasten (HELF)

▼ 15 

In den Versuchen zur Virusreplikation und Expression viraler Proteine wurden diploide humane embryonale Lungenfibroblasten (HELF, FI 301) verwendet.

Für die Westernblot Analysen wurden die Zellen in Müllerflachen bei 37°C in Minimal Essential Medium (MEM) mit Earle’s Salzen und 25 mM Hepes (Bio Whittaker) mit Zusätzen der Firma Biochrom (2 % endotoxinfreies FKS, 1 % N-Aceytl-L-Alanyl-Glutamin [200 mM], 1 % nicht-essentielle Aminosäuren [100x], 1 % Natriumpyruvat [100 x], 5 g/ml Gentamycinsulfat) kultiviert.

Für Plaque-Tests wurden HELF in 24-Well-Platten kultiviert und nach Infektion mit HCMV mit 2 ml MEME/Methozel-Medium (90 ml Methozel, 5 ml MEM [10 x Eagle], 5 ml MEM [10 x Hanks], 2,9 ml NaHCO3 [7,5%], 2 ml endotoxinfreies FKS, 1 ml N-Aceytl-L-Alanyl-Glutamin [200 mM], 0,275 ml Penicillin/Streptomycin) überschichtet.

2.2 Virus

▼ 16 

In allen Infektionsexperimenten wurde das HCMV-Isolat AD169 verwendet. Virusstocks wurden nach Zentrifugation (10’, 2000 rpm) aus dem Überstand vollständig infizierter HELF-Kulturen gewonnen und in flüssigem Stickstoff gelagert.

2.3 Plasmide

Das Plasmid pRR55hat eine Größe von 4086 bp und enthält den HCMV Haupt-IE1/2-Enhancer/Promotor des laboradaptierten Stammes AD169 (zwischen den Positionen –671 und +52 bp bezogen auf den IE1 Transkriptionsstart) gekoppelt an das Chloramphenicol-Acetyltransferase–Reportergen (CAT-Gen), sowie das Polyadenylierungssignal des „simian virus 40“ (SV 40) kloniert im Vektor pUC18 (Fickenscher et al., 1989).

In den Mutanten p17mut3, p18mut4 und p19mut5dieses Plasmids sind im Enhancer repetitive cis-agierende Elemente mutiert. Hierdurch wird die Bindung und die damit einhergehende transaktivierende Wirkung der Transkriptionsfaktoren CREB1/ATF1 (p19mut5), NFκB (p18mut4) und des Glukokortikoid-Rezeptorkomplexes (p17mut3) verhindert. Die Mutagenese von p18mut4 und p17mut3 wurde beschrieben (Prösch et al., 2000 b; Prösch et al., eingereicht; Prösch et al., 2002). Die Mutante p19mut5 wurde durch Nukleotidaustausch von AC zu TG in den 5 „cAMP-responsive elements“ innerhalb der 19 bp repetitiven Sequenzen erzeugt (Ozar Jasmin, 2002).

▼ 17 

Abb. 4: Schematische Darstellung der HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor Region und Lokalisation der Bindungsstellen für verschiedene Transkriptionsfaktoren (dargetellt als Pfeile). Die Lokalisation der Mutationen in den repetitiven Sequenzmotiven der verwendeten pRR55-Mutanten p17mut3, p18mut4 und p19mut5 sind durch X symbolisiert.

Im Plasmid pβc-344/-1 CAT ist die DNA-Sequenz des Ratten ß-Kasein Promotors zwischen den Positionen –344 und –1 in den CAT-Expressionsvektor pBLCAT2 einkloniert (Doppler et al., 1990). Es wurde freundlicherweise von W. Doppler zur Verfügung gestellt.

Das 2686 bp große Plasmid pUC18enthält Teile des pBR322 Vektors und des Bakteriophagen M13mp19, jedoch keine Anteile des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors oder eines anderen eukaryotischen Promotors und wurde daher als neutraler Vektor zum Ausgleich von DNA-Mengen in Kotransfektionsexperimenten verwendet.

2.4 Hormone, Zytokine, Hemmstoffe

▼ 18 

  • Dexamethason-21-dihydrogenphosphat

  • Merck

  • Tumor Nekrose Faktor-α (TNFα)

  • PeproTeck

  • Dibuturyladenosine cyclic monophosphat (db cAMP)

  • Sigma

  • Humanes Prolaktin (hPRL)

  • Sigma

  • Human Epidermal Growth Factor (hEGF)

  • PeproTech

  • Glukokortikoid-Inhibitor RU-486 (Mifepristone)

  • Roussel-Uclaf

2.5 Patienten und Patientenmaterial

2.5.1 Patienten

Das untersuchte Patientenmaterial stammt von Müttern (Citratblut, Muttermilch) und ihren frühgeborenen Kindern (Urine, Trachealsekrete/Pharyngealaspirate), die zwischen Mai 1999 und Oktober 2002 (1. Studienteil) bzw. Oktober 2002 und Juni 2003 (2. Studienteil) auf der Intensivstation der Klinik für Neonatologie Charité Universitätsmedizin Berlin, Campus Mitte hospitalisiert wurden. Die Frühgeborenen waren vor der 32. Schwangerschaftswoche oder mit einem Geburtsgewicht <1500 g geboren. Die Sammlung der Proben erfolgte nach Genehmigung durch die Ethikkommission der Charité und nach Einverständniserklärung der Mütter. Kinder wurden nur mit nativer Milch der eigenen Mutter über eine Nasensonde gefüttert. Bei nicht ausreichender Milchmenge wurde Frühgeborenen Formula-Nahrung hinzugefügt. Es wurden ausschließlich HCMV-seronegative Blutprodukte wurden transfundiert.

Die Reifebezeichung der Kinder in der Arbeit erfolgt nach der von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) vorgeschlagenen Definition:

▼ 19 

Frühgeborenes= Kind, welches vor der 37. Schwangerschaftswoche

Sehr kleines Frühgeborenes = “very low birth weight infants“, Neugeborenes mit einem Geburtsgewicht <1500 Gramm

Extrem kleines Frühgeborenes = “exremely low birth weight infants“, Neugeborenes mit einem Geburtsgewicht <1000 Gramm

2.5.2 Gewinnung von Muttermilch und zellfreier Molke

▼ 20 

Frische Milch von Müttern frühgeborener Kinder wurde nach Abpumpen auf der Station umgehend bei –20°C eingefroren und bei –80°C bis zur Probenaufbereitung und weiteren Verwendung gelagert. Zur Gewinnung von zellfreier und fettreduzierter Molke wurde ein modifiziertes Protokoll nach Hamprecht et al. (1998 b) verwandt: In vier Zentrifugationsschritten von je 10 min. bei 800 rpm, 1500 rpm, 3000 rpm und 5000 rpm (Heareus Megafuge 1,0 R) wurden der Fettüberstand und das Zellpellet entfernt. Zum Einsatz in Zellkultur wurde die Molke durch einen 0,22 μm Mikroporenfilter (Schleicher & Schuell) steril filtriert.

2.5.3 Gewinnung von Urin, Trachealaspiraten und Pharyngealsekreten

In wöchentlichen Abständen wurden kindliche Trachealaspirate (TS = Absaugprodukte aus dem Intubationstubus) oder Pharyngealsekrete (PS = Absaugprodukte aus dem hinteren Rachenraum nach Extubation) sowie Urinproben gesammelt und bis zur Aufarbeitung bei -20°C gelagert.

2.5.4 Serum und Periphere Blutmonozyten (PBMC)

Mütterliches Blut wurde innerhalb der ersten 14 Tage nach Entbindung entnommen. Serum durch Zentrifugation gewonnen aus Vollblut diente der Bestimmung des HCMV-Antikörper Status mittels ELISA (CMV-IgM ELA Assay [Medac], ETI-CYTOK-G, ETI-CYTOK-G Plus [Sorin Biomedica]). Die Isolation von Peripheren Blutmonozyten (PBMC) erfolgte aus 5 ml frischem EDTA-Blut mittels Ficollgradienten-Zentrifugation auf 3 ml Ficoll-Plaque (Pharmacia, 10’, 4000 rpm). Die gewonnenen Zellpellets wurden in PBS gewaschen und bei -20°C bis zur DNA-Präparation eingefroren.

2.6 Statistik

▼ 21 

Die statistische Auswertung der biometrischen Daten und klinischen Charakteristika der Frühgeborenen erfolgte mittels Mann-Whitney Test. Für die Analyse der durch Molkeproben hervorgerufenen Promotorstimulation im CAT-Essay wurde der nichtparametrische Wilcoxon Test für gepaarte Proben mit Hilfe der Software Statgraphics 7.0 (Manogistics) und SPSS 11.5.1 (SPSS) verwendet. Die Signifikanzgrenze wurde mit p < 0,05 definiert.

2.7 DNA-Isolierung und Polymerase Kettenraktion

2.7.1 DNA-Isolierung

DNA aus je 200 μl Urin-, TS, PS, PBMC- und Molkeproben wurde mit Hilfe des High Pure Viral Nucleo Acid–Kits (Roche) isoliert. Die Aufbereitung der Proben erfolgte nach den Angaben des Herstellers über Bindung der DNA an Spinnsäulen, von denen die DNA in ein Endvolumen von 50 μl Elutionspuffer eluiert wurde.

2.7.2 Polymerase Kettenreaktion (PCR)

2.7.2.1 HCMV-PCR

Die verwendeten Primer P1 und P2 amplifizieren ein 123 bp Fragment komplementär zur Immediate Early Region I des HCMV. Die Sequenz der Primer ist wie folgt (Olive et al., 1989):

▼ 22 

P1: 5’-gCA gAg CTC gTT TAg TgA ACC -3’

P2: 5’- CCg TTC CCg gCC gCg gAg gC -3’

Die Durchführung der PCR erfolgte in einem Gesamtvolumen von 25 µl. Pro Amplifikation wurden 5 µl der DNA-Suspension (siehe Kap. 2.7.1) und 20 µl Prämix eingesetzt. Der Prämix setzte sich wiefolgt zusammen:

▼ 23 

2,5 μl dNTP

(je 0,2 mM; Amersham Pharmacia)

0,5 μl Primer P1

(50 μM, TIB Molbiol)

0,5 μl Primer P2

(50 μM, TIB Molbiol)

0,1 μl Ampli-Taq Gold

(5 U/μl; Roche)

1,5 μl MgCl2

(100 mM Roche)

2,5 μl PCR-Puffer II

(10x; Roche)

12,5 μl Aqua dest

 

Das Reaktionsgemisch wurde mit einem Tropfen Mineralöl überschichtet. Die Amplifikation erfolgte im Thermo-Cycler (Hybaid Omn-E) über 40 Zyklen. Auf einen initialen 5 minütigen Denaturierungsschritt bei 94°C folgten 40 Zyklen mit 30’’ 94°C-Denaturierung, 1’ 55°C-Primeranlagerung und 2’ 72°C DNA-Synthese.

▼ 24 

Nach elektrophoretischer Auftrennung von 10 μl des PCR-Produktgemisches in einem 2%-igem Agarosegel mit Ethidiumbromid (0,1 µg/ml) konnten die amplifizierten Fragmente unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Die Sensitivität der PCR beträgt 10-50 HCMV-DNA-Kopien pro Ansatz (Prösch et al., 2002). Um falsch positive Ergebnisse durch Kontaminationen zu vermeiden, wurden verschiedene Proben eines Patienten getrennt an mindestens vier (meist sechs) verschiedenen Tagen präpariert. Bei jeder DNA-Isolation wurde eine Negativkontrolle mit PBS anstatt Patientenmaterial mitgeführt und zusätzlich zur Standard PCR-Negativkontrolle (Wasserkontrolle) in der PCR-Reaktion getestet. Als Positiv-Kontrolle fungierte 0,1 pg DNA aus mit AD169 infizierten Fibroblasten. Mit diesem Protokoll wird eine Sensitivität von ≥ 50 DNA-Kopien pro Reaktion erreicht.

2.7.2.2 ß-globin PCR

Zum Ausschluss falsch negativer Ergebnisse wurde jede Patientenprobe, die in der HCMV-PCR negativ war, auf das Vorhandensein von ß-globin DNA überprüft. Die ß-globin PCR wurde nach einem erstmalig von Bauer et al.(Bauer et al., 1991) beschriebenen Protokoll durchgeführt.

Die verwendeten Primer BG1 und BG3 hatten folgende Sequenzen:

▼ 25 

Als Positivkontrolle diente 1 μg DNA aus Plazentagewebe. Die Analyse der Amplifikate erfolgte elektrophoretisch auf Basis der Länge des amplifzierten Fragments (268 bp). Als Vergleich wurde ein 100 bp DNA-Längenstandard (BioLabs, USA) aufgetragen.

2.8 Transfektion monozytärer Zellen

2.8.1 DEAE-Dextranmethode

Die HL-60 und THP-1 Zellen wurden nach der von Stein et al. (Stein et al., 1993) optimierten Methode transient transfiziert. Hierzu wurden pro Ansatz 106 Zellen in serumfreiem RPMI 1640 Medium gewaschen und mit 5 μg Plasmid-DNA in 500 μl TBS/DEAE-Dextran-Puffer (137 mM NaCl; 0,7 mM CaCl2; 5 mM KCl; 25 mM Tris-HCl pH 7,4; 0,5 mM MgCl2; 0,6 mM Na2HPO4 und 10 mg/ml Dextran) für 45-60 min bei 37°C unter gelegentlichem Schwenken inkubiert. Nach erneutem Waschen in serumfreien RPMI-Medium wurden das Zellpellet in Medium/10 % FKS resuspendiert und je 106 Zellen in 24-Well Platten inkubiert. Mit dieser Methode wurde eine Transfektionseffizienz von ~10 % erreicht. Zur Testung der Molke wurden 400 μl Medium/10 % FKS und, wenn nicht anders angegeben, 200 μl Molke hinzugefügt. Alle Zellen wurden bis zur Ernte bei 37°C in einer wassergesättigten, 5%-igen CO2-Atmosphäre kultiviert.

2.8.2 Elektroporation

▼ 26 

Zur Analyse von Reportergen-Aktivitäten des Plasmids pβc-344/-1CAT reichte die durch die DEAE/Dextran Methode erzielte Transfektionseffizienz nicht aus. Dieses Plasmid wurde daher mittels Elektroporation transfiziert, wobei 107 HL-60 Zellen zunächst in serumfreien RPMI 1640 gewaschen, in 0,5 ml Medium (RPMI 1640) wiederaufgenommen und mit 30 µg Plasmid DNA elektroporiert wurden. Bei Kotransfektion mit zwei Plasmiden wurde die Gesamtmenge DNA durch Zugabe des Plasmids pUC 18 angeglichen. Die Elektroporation erfolgte in 4 mm Küvetten (Equi Bio) im Elektroporator Easy Jet Plus (Equi Bio) bei 270 V und 1050 μF. Die Impulsdauer wurde automatisch errechnet und betrug zwischen 20-25 msek. Durch diese Methode wurden ~50 % der Zellen transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellen umgehend in 4,5 ml RPMI/10 % FKS aufgenommen und bis zur Ernte unter An- oder Abwesenheit der zu testenden Substanzen bei 37°C in einer wassergesättigten, 5 %-igen CO2-Atmosphäre inkubiert.

2.9 Gewinnung von Zelllysaten und CAT-Assay

Mit Hilfe des CAT- Assays kann die Chloramphenicol-Acetyl-Tranferase (CAT) Aktivität in Zellextrakten transfizierter Zellen gemessen werden. Die auf den eingeschleusten Plasmiden kodierte Chloramphenicol-Acetyl-Transferase wird in dem Maße gebildet wie der stromaufwärts vom Reportergen klonierte HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor aktiviert wird. Die CAT-Aktivität ist daher ein Maß für die Promotoraktivität.

2.9.1 Ernte der Zellen und Gewinnung der Zelllysate

Die Ernte der Zellen erfolgte 30-40 Stunden nach Transfektion. In Vorversuchen wurde überprüft, dass sich die Zellzahl durch die Zugabe von Molke im Vergleich zur Kontrolle nicht veränderte.

▼ 27 

Zur Ernte wurden die Zellen zentrifugiert (10’, 2000 rpm,), mit PBS gewaschen und das Zellpellet in 40-60 μl CAT-I Puffer (0,25 mM Tris pH 7,5; 5 mM EDTA) resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgte durch fünfmaliges, fünfminütiges Frieren (Trockeneis/Ethanol Gemisch) und Tauen (37°C). Störende CAT-Isoenzyme wurden durch 10-minütige Inkubation bei 65°C inaktiviert. Durch Zentrifugation (10’, 12 rpm) wurden die Zellbestandteile abgetrennt und das Zelllysat für den CAT-Assay gewonnen.

2.9.2 Proteinbestimmung der Zelllysate

Der Proteingehalt der Zellextrakte wurde nach der Methode von Bradford (Bradford et al., 1976) bestimmt. Hierfür wurden je 5 µl des Zellextraktes und 95 µl PBS bzw. 100 µl PBS für den Leerwert in Eppendorfgefäße vorgelegt. Für die Kalibrierkurve wurden 100 µl einer Rinderserumalbumin-Standardlösung (RSA, Serva) mit den Konzentrationen 30, 70, 100, 150, 200 und 250 µg/ml vorbereitet. Die Zugabe von 1 ml Bradford-Lösung (Sigma) erfolgte möglichst in alle Proben. Nach kurzem Mischen und einer Inkubationszeit von mindestens 20 min wurden die Reaktionslösungen in Küvetten überführt und die Adsorption bei 595 nm im Photometer (Ultrospec Plus; Pharmacia) gemessen. Der Nullwert-Abgleich erfolgte gegen den Leerwert (PBS statt RSA). Die Proteinkonzentrationen der einzelnen Proben wurden mittels der Kalibrierkurve bestimmt und für den CAT-Assay auf einen gleichen Proteingehalt eingestellt.

2.9.3 CAT-Assay

Zur Messung der CAT-Aktivität wurden 20-30 μl Zellextrakt (gleiche Menge je Versuchreihe siehe Kap. 2.9.1.) mit 15 μl eines Prämix:

▼ 28 

gemischt.

Durch getrenntes Pipettieren der Zellextrakte und des Prämix an die Wand der Reaktionsgefäße und kurze Zentrifugation (5’’, 4000 rpm) wurde ein gleichzeitiger Start der chemischen Reaktion in allen Ansätzen gewährleistet. Die Proben wurden für 60 min bei 37°C inkubiert und die Reaktionen durch Zugabe von 500 μl Ethylacetat abgestoppt. Nach kräftigem Schütteln (Vortex) und Zentrifugation (3’, 12000 rpm) wurden die radioaktiven Reaktionsprodukte aus der wässrigen Phase extrahiert und mittels Vakuumzentrifugation (Univapo 150 N, Uniequip) vollständig eingeengt. Zum Auftragen auf die Dünnschichtchromatographieplatte (20 x 20 cm Kieselgelplatten, Merck) wurden die Reaktionsprodukte in 30 µl Ethylacetat gelöst. Die Auftrennung der nicht-, einfach- und mehrfach-aceythlierten Chloramphenicol-Derivate erfolgte in einer Chloroform:Methanol-Atmosphäre (19:1) unter dem Abzug, wobei Chloramphenicol-Derivate desto schneller laufen, je mehr sie acetyliert sind. Mittels des Automatic TLC-linear Analyzer (Tracemaster 20, Bertholdt) wurde die Verteilung der Radioaktivität in den einzelnen Spots gemessen und der prozentuale Anteil von acetyliertem C14-Chloramphenicol errechnet.

2.10 Plaque Test und immunzytochemische Färbung HCMV–infizierter Zellen

▼ 29 

Zur Untersuchung des Einflusses von Substanzen auf die HCMV-Replikation wurden Humane Embryonale Lungenfibroblasten (HELF) infiziert und mit einem halbfesten Methozel-Medium überschichtet. Dieses verhindert die freie Virusausbreitung weitestgehend. Das sich durch Zell-zu-Zell Kontakt ausbreitende Virus verändert die Morphologie der infizierten Zellen; typische Foci abgerundeter, vergrösserter Zellen werden als cytopathische Effekte (CPE) lichtmikroskopisch sichtbar. Die Ansammlungen infizierter Zellen werden nach immunzytochemischer Anfärbung mittels eines HCMV-spezifischen Antikörpers besonders deutlich sichtbar. Anzahl der CPE und die Zahl infizierter Zellen pro CPE ermöglichten Rückschlüsse auf das Ausmaß der viralen Infektion und Replikation.

2.10.1 Standard– Plaque Test

Konfluente HELF-Kulturen wurden in 24-Well Platten mit einer m.o.i (multiplicity of infection -Virus pro Zelle) von 0,02 des HCMV-AD169 infiziert. Hierzu wurden die Zellen mit 200 μl einer entsprechende Virusverdünnung in serumfreien MEME Medium zur Absorption eine Stunde bei 37°C inkubiert. Nach Entfernen des nichtadsorbierten Virus wurden die Zellen mit 2 ml MEME/Methozel (Zusammensetzung Kap. 2.1.2.) überschichtet. Zur Testung der Molke wurden 200 µl des MEME/Methozels durch 200 µl Molke ersetzt. Die infizierten Zellen wurden bei 37°C in 5 %-iger CO2-Atmosphäre kultiviert bis charakteristische CPEs lichtmikroskopisch erkennbar wurden.

2.10.2 Immunzytochemische Färbung HCMV-infizierter Zellen

Zu besseren Sichtbarmachung HCMV-infizierter Zellen wurden die Zellen mit dem HCMV-spezifischen Antikörper „anti-HCMV early antigen clone E13“ angefärbt, der die kernlokalisierten IE Proteine IE1 und IE2 detektiert. Hierzu wurden die Kulturen 6-10 Tage nach Infektion für 30 Minuten bei –20°C mit eiskaltem Ethanol/Aceton-Gemisch (95:5) fixiert. Zur Vermeidung unspezifischer Bindung wurden die Zellen mit einer Blockierungslösung aus 10 % FKS/0,2 % Tween (Serva) in PBS benetzt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Entfernen der Blocking-Reagenz wurden die Zellen mit 100 µl einer 1:1000 Verdünnung des HCMV-spezifischen monoklonalen Antikörpers E13 (Mouse Anti CMV Early Antigen, Oxford Biotech) in Blockierungslösung überschichtet und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen der Zellen mit PBS wurde der Sekundärantikörper (Goat Anti-Mouse IgG Peroxidase; Boehringer Mannheim) in einer 1:5000 Verdünnung auf die Zellen gegeben. Die Inkubation mit dem Sekundärantikörper erfolgte für 2 Stunden bei 37°C. Nach erneutem fünfmaligem Waschen mit PBS konnten die Antigen-Antikörperkomplexe durch Anfärbung mit Chromogen (AEC-Chromogen Staining Kit, Sigma) sichtbar gemacht und lichtmikroskopisch ausgewertet werden.

2.11 Western Blot Analysen

▼ 30 

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Western Blot Analysen zur Quantifizierung der Menge von gebildetem HCMV IE1 und IE2 Protein in infizierten Fibroblasten unter dem Einfluss von Molke durchgeführt. Hierzu werden HELF Kulturen mit dem HCMV-Isolat AD169 infiziert und in An- und Abwesenheit von Molke kultiviert. Gleiche Proteinmengen der aus den Zellen hergestellten Extrakte wurden elektrophoretisch aufgetrennt und die Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran transferiert. Durch Anfärbung mit einem Antikörper, der die IE1 und IE2 Proteine spezifisch erkennt, wurden die Proteinbanden sichtbar und konnten semiquantitativ ausgewertet werden.

2.11.1 Infektion der HELF-Kulturen

Ein konfluenter HELF-Monolayer in Müllerflaschen (106 HELF) wurden mit AD169 (m.o.i.=1) infiziert. Zur Adsorption wurden die Zellen mit dem Virus bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Anschließend erfolgte die Zugabe von 4 ml MEME/2% FKS. Um den Einfluss von Molke auf die IE1 und IE2 Proteinsynthese zu bestimmen wurden 1,2 ml Medium durch eine entsprechende Menge Molke ersetzt. Die infizierten Zellen wurden bei 37°C kultiviert und nach 3 Tagen geerntet. Hierzu wurde der Zellrasen dreimal mit PBS gewaschen und anschließend mittels eines Zellschabers (Greiner) abgeschabt. Die gewonnenen Zellen wurden in PBS resuspendiert und weitere zweimal mit PBS gewaschen und zentrifugiert (5’, 2000 rpm). Nach Kurzzentrifugation (20’’, 7000 rpm) wurde das Zellpellet zum Aufschluss der Zellen in 120µl Lysepuffer mit Proteinase-Inhibitoren resuspendiert.

Lysepuffer-Stock:

▼ 31 

  • 5 ml 1 M Tris pH 7,5

  • Endkonzentration:

  • 20 mM

  • 7,5 ml 5 M NaCl

  • 150 mM

  • 2,5ml NP40

  • 1,0 %

  • 0,5 ml NaN3(10 %)

  • 0,02 %

  • acqua dest ad 250 ml

  • 2,5 mM

Proteinase-Inhibitor Mix:

(auf 1 ml Lysepuffer)

▼ 32 

  • 5 μl EDTA (0,1 M)

  • 2,5 mM

  • 5 μl Phenylmethyl-sulfonyl-fluorid PMSF (0,4 M in Ethanol)

  • 2 mM

  • 2 μl Leupeptin (0,5 mg/ml in Ethanol)

  • 2 µg/ml

  • 1 μl Aprotinin (1 mg/ml in Ethanol)

  • 1 µg/ml

  • 1 μl Antipain (1 mg/ml in Ethanol)

  • 1 µg/ml

Die Zelllyse wurde durch leichtes Schütteln bei 4°C für eine Stunde unterstützt. Anschließende Zentrifugation (50’, 16500 rpm, 4°C) ermöglichte die Abtrennung partikulärer Bestandteile aus dem Zellextrakt. Der Proteingehalt der Proben wurde mittels Bradford-Methode bestimmt (siehe Kap. 2.9.2).

2.11.2 Western Blot Analysen

Zur Quantifizierung der IE-Proteine in den gewonnenen Zellextrakten wurden je 40 μg Gesamtprotein mit 1/3 Volumen Probenpuffer (25 ml Tris pH 6,8; 10 ml Glycerin; 5 ml 2-Mercaptoethanol; 1 ml Bromphenolblau (1%), 2 g SDS, aqua dest ad 100 ml) für 5 Minuten bei 100°C denaturiert und in einem 10%-igen Polyacrylamid- SDS Gel in 1x Laemmli-Puffer (10-fach Stammlösung: 144 g Glycin, 30 g Tris Base, 10 g SDS, acqua dest ad 1000 ml) elektrophoretisch aufgetrennt.

▼ 33 

Das Gel bestand aus einem Sammelgel (1,5 % PAA/SDS) und einem Trenngel (10 % PAA/SDS), die folgende Zusammensetzung hatten:

Sammelgel (1,5%)

Trenngel: (10%)

  • 625 µl Tris-HCL, pH 6,8

  • 3,75 ml Tris-HCL, pH 6,8

  • 500 µl Acrylamid/Bis 29:1 (30 %)

  • 3,33 ml Acrylamid/Bis 29:1 (30 %)

  • 25 µl SDS (20 %)

  • 50 µl SDS (20 %)

  • 50 µl Ammoniumpersulfat (10 %)

  • 100 µl Ammoniumpersulfat (10 %)

  • 10 µl TEMED

  • 20 µl TEMED

  • 3,79 ml dd H2O

  • 2,75 ml dd H2O

Die Trennung erfolgte entsprechend dem Molekulargewicht der Proteine. Als molekularer Längenstandard wurden 2 µl des BOA002-Protein Marker (MoBiTec) aufgetragen.

▼ 34 

Der Transfer der Proteine auf eine 9 x 6 cm Nitrocellulose Membran (Schleicher & Schuell) erfolgte im Tank-Blot Verfahren mit Hilfe des Mini Tank Elektroblotter (OwlScientific) bei 250 mV für 2 Stunden in einem Puffergemisch aus 10-fach Laemmli-Puffer, Methanol und Aqua dest (1:2:7).

Die Membran wurde über Nacht in 50 ml 1xtTBS (10-fach Stammlösung: 100 ml Tris pH 7.4 [10 mM], 90g NaCl [0,9 %], 5 ml Tween 20 [0,05 %], aqua dd at 1000 ml) mit 1,5 g Albumin bovine Fraction V (BSA, 3%, Serva) geblockt und bei 4°C leicht geschüttelt. Nach Spülen mit 1xtTBS erfolgte die Inkubation mit dem HCMV spezifischen monoklonalen Primärantikörpers “anti-HCMV early antigen clone E13“ (Oxford Biotech) in einer 1:400 Verdünnung in 1xtTBS für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Nach fünfmaligem Waschen wurde die Membran mit dem Sekundärantikörper “Goat Anti-Mouse IgG Peroxidase“ (Boehringer Mannheim) in einer 1:4000 Verdünnung in 1xtTBS für eine weitere Stunde bei leichtem Schwenken und Raumtemperatur inkubiert. Auf fünfmaliges Waschen mit 1xtTBS folgte die Anfärbung der Antigen-Antikörperkomplexe mit der Super Signal West Dura- Luminol/Enhancer Solution (Pierce). Die gefärbten Protein- Banden konnten unter einer CCD-Kamera mit Hilfe der Software Chemimager V.5.5 (Alpha Innotech Corp., Alpha Ease) detektiert und durch Farbdichtemessung der spezifischen Banden semiquantitativ ausgewertet werden.

Zur Darstellung der Aktin-Banden als Ladekontrolle wurde die zuvor mit dem IE 1/2-spezifischem Antikörper (siehe oben) inkubierten Membranen für 20 Minuten bei 65°C mit Strippinglösung (5 ml Tris pH 6,8, 5 ml 20%-iges SDS, 350 μl p-Mercaptoethanol, 45 ml dd H20) inkubiert, um die gebundenen Antigen-Antikörperkomplexe zu entfernen. Einem initialen Waschschritt mit 1xtTBS folgte die Inkubation mit dem Aktin-spezifischen Antikörper „Anti-Actin (C-11) goat polyclonal IgG (SantaCruz) in einer 1:1000 Verdünnung in 1xTBS sowie dem Sekundärantikörper „Anti-Goat IgG-HRP conj“ (Santa Cruz) in einer 1:4000 Verdünnung in 1xTBS nach dem oben beschriebenen Protokoll.


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31.07.2006