3 Ergebnisse

3.1 Untersuchungen zur Inzidenz von HCMV-Reaktivierungen während der Lakation in der laktierenden Brust und zur Virustransmission auf das gestillte Frühgeborene

▼ 35 

Obwohl Muttermilch eine Vielzahl antimikrobieller Substanzen enthält, die das gestillte Kind vor Infektionen schützen sollte, gilt infizierte Milch als der wichtigste Übertragungsweg für HCMV in der Säuglingsphase (Dworsky et al., 1983). In verschiedenen internationalen Studien wurden zum Teil sehr unterschiedliche Inzidenzen für die HCMV-Reaktivierung während der Laktation und die Übertragung von HCMV auf Frühgeborene ermittelt. Eine in Tübingen durchgeführte Studie zeigte überraschend hohe Übertragungsraten (Hamprecht et al., 2001). Als Beitrag zur Aufklärung der Epidemiologie der HCMV-Übertragung auf Frühgeborene in der Peri/postnatAlphase wurde eine prospektive klinische Studie durchgeführt. In der Neonatologie der Charité Berlin-Mitte wurde von 73 Müttern (58 im I. Studienteil; 15 im II. Studienteil) über den Zeitraum von einem (I. Teil) bis zwei Monaten (II. Teil) nach Geburt einmal wöchentlich Milchproben gesammelt und mittels PCR auf das Vorhandensein von HCMV-DNA getestet. Gleichzeitig wurden Urinproben und Trachealsekrete (Absaugprodukte aus dem Intubationstubus) bzw. Pharyngealsekrete (Absaugprodukte aus dem hinteren Rachenraum nach Extubation) ihrer 89 frühgeborenen Kinder (74 im I. Teil; 18 im II. Teil) auf HCMV-DNA untersucht. Das Untersuchungskollektiv beinhaltet 14 Zwillings- und eine Drillingsgeburt.

Mutter-Kind Paare wurden nach schriftlicher Einverständniserklärung in die Studie aufgenommen, wenn das kindliche Gestationsalter ≤ 32 Wochen betrug. Nicht berücksichtigt wurden Mutter-Kind Paare, bei denen das Frühgeborene eine pränatale HCMV-Infektion, schwere Missbildungen sowie unklare metabolische Funktionsstörungen aufwies. Ausgeschlossen wurden auch Frühgeborene, die innerhalb des Untersuchungszeitraumes verstarben oder deren Mütter vor Erreichen der 3. Woche post partum keine Milch mehr gaben. Alle Kinder wurden ausschließlich mit unbehandelter Milch der eigenen Mutter über eine Magensonde gefüttert. Reichte diese Muttermilchmenge nicht aus, wurde den Frühgeborenen Formulanahrung gegeben. Für notwendige Transfusionen wurden nur HCMV-seronegative Blutprodukte der Charité-Blutbank verwendet.

Während des Untersuchungszeitraumes wurden bei zwei Müttern (eine davon brachte Zwillinge zur Welt) eine pränatale Übertragung von HCMV bei ihren 3 Frühgeborenen nachgewiesen. Die Diagnose der pränatalen Infektion erfolgte durch Nachweis von HCMV-DNA in Nabelschnurblut, mütterlichen PBMCs, sowie kindlichem Urin, Trachealsekret und Blut direkt nach der Geburt. Bei der Mutter und ihren Zwillingen war zum selben Zeitpunkt eine HCMV-Antigenämie nachweisbar -wodurch eine Abgrenzung zur perinatalen Infektion möglich war. Diese Mutter-Kind Paare wurden aus der Studie ausgeschlossen.

3.1.1 Inzidenz von DNAlaktia und DNAemia in stillenden Müttern in den ersten beiden Monaten nach Entbindung

▼ 36 

Zum Nachweis von HCMV-DNA in den Muttermilchproben (DNAlaktia), wurden aus diesen wie in Kap. 2.7. detailliert beschrieben, zunächst zellfreie Molke präpariert. Aus je 200 µl Molke wurde die Nukleinsäure isoliert und mittels PCR auf die Anwesenheit von HCMV-spezifischer DNA überprüft. Alle Proben, die in der HCMV-PCR negativ waren, wurden zusätzlich mit ß-Globin spezifischen Primern amplifiziert. Hierdurch konnte nachgewiesen werden, dass die DNA-Präparation aus allen Proben erfolgreich war und sich in den Proben keine Substanzen befanden, welche die PCR hemmten. Abbildung 5 zeigt exemplarisch die Ergebnisse der HCMV- und ß-Globin PCR für 5 Molkeproben von 5 verschiedenen Müttern.

Abb. 5: HCMV- und β-Globin PCR aus Molkeproben von 6 Müttern.
Links: Die HCMV-PCR amplifizierte ein 123 bp DNA Fragment bei Anwesenheit von HCMV-DNA in der Molke (hier nur Mutter 5 links). Als Positivkontrolle wurde DNA aus AD169-infizierten Fibroblasten verwendet.
Rechts: Nachweis von β-Globin DNA in HCMV-negativen Molkeproben der Mütter 1-4. Das Amplifikat ist 268 bp lang. Als Positivkontrolle diente DNA aus Plazentagewebe. M= 100 bp Längenmarker; Roche.

Im Ergebnis aller Untersuchungen ergab sich, dass bei 48 der 73 (66 %) Mütter in mindestens 3 aufeinanderfolgenden Molkeproben HCMV-DNA nachgewiesen werden konnte (Tab.1). Die Inzidenz der HCMV-DNAlaktia war in beiden Studienteilen identisch (I. Teil: 38/58 = 66 %; II. Teil: 10/15 = 67 %; Tab.1). Beide Studienteile werden im folgenden daher zusammen besprochen.

▼ 37 

Tab. 1: Inzidenzen von HCMV-DNAlaktia bei Müttern frühgeborener Kinder (gesamt und getrennt nach den beiden Studienteilen.)

Studien-

Teil

Anzahl der

Mütter

HCMV-DNAlaktia

positive Mütter

I

58

38 / 58 (66 %)

II

15

10 / 15 (67 %)

I+II

73

48 / 73 (66 %)

HCMV-DNA war im Durchschnitt das erste Mal 7,1 (± 2,6) Tage nach der Entbindung in der Molke nachweisbar. Bei allen Müttern, bei denen HCMV-DNA in einer Molkeprobe gefunden wurde, konnte auch in sämtlichen nachfolgend gesammelten Molkeproben über den gesamten Untersuchungszeitraum DNAlaktia detektiert werden.

Für 28 der 73 Mütter konnte der Serostatus ermittelt werden. Es zeigte sich, dass 20 dieser 28 Mütter HCMV-IgG positiv, 8 seronegativ waren (Tab. 2). Dies entspricht einer Seroprävalenz von 71 %. In einer Mutter konnten zusätzlich IgM-Antikörper gegen HCMV nachgewiesen werden, was auf eine aktive HCMV-Infektion dieser Mutter hinweist. Die hierbei gemessene IgG-Avidität spricht gegen eine erst kurze Zeit zurückliegende Primärinfektion und lässt eine HCMV-Reaktivierung vermuten. In 19 von 20 (95 %) der HCMV-seropositiven Müttern war eine DNAlaktia nachweisbar. HCMV scheint daher in nahezu allen HCMV-seropositiven Müttern in einer sehr frühen Phase der Laktation reaktiviert und in der Brustmilch ausgeschieden zu werden. Interessanterweise konnte auch bei einer der 8 seronegativen Mütter (12,5 %) HCMV-DNA in der Brustmilch nachgewiesen werden.

▼ 38 

Tab. 2: Korrelation von mütterlichen HCMV-Serostatus und HCMV-DNAlaktia

Serostatus

HCMV-DNAlaktia

IgG - / IgM –

(n= 8)

1 / 8 (12,5%)

IgG +/ IgM –

(n= 19)

18 / 19 (95 % )

IgG +/ IgM +

(n=1)

1 / 1 (100 %)

Um zu prüfen, ob in Müttern mit HCMV-DNAlaktia eine systemische HCMV-Infektion vorliegt, wurden von 19 Müttern mit bekanntem Serostatus zusätzlich zur Brustmilch periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs) auf die Anwesenheit von HCMV-DNA geprüft. Die Blutproben wurden in den ersten beiden Wochen nach Entbindung gesammelt. Wie in Tab. 3 aufgeführt, konnte nur in 2 von 13 (15 %) Müttern mit nachgewiesener DNAlaktia auch HCMV-DNA im Blut (DNAemia) nachgewiesen werden. Eine der beiden Mütter war HCMV IgM seropositiv. Bei den anderen untersuchten Müttern war es zu keiner IgM-Serokonversion bei Nachweis von Virus in der Milch gekommen. Auch wurde keine virale DNA im Blut von Müttern gefunden, deren Molke DNAlaktia negativ getestet wurde. Diese Befunde unterstreichen die Annahme, dass es sich bei der HCMV-Reaktivierung in der Brust seropositiver Mütter während der Laktation um einen lokal begrenzten Prozess handelt.

Tab. 3: Korrelation zwischen mütterlichem HCMV-Serostatus, -DNAlaktia und -DNAemia.
Dargestellt sind Daten von 19 Müttern, deren Blut und Brustmilch mittels PCR auf HCMV-DNA getestet wurde

HCMV-Serostatus

HCMV DNAlaktia

HCMV DNAemia in PBMC

IgM - / IgG -

(n= 6)

0 / 6 (0 %)

0 / 6 (0 %)

IgM - / IgG +

(n=12)

12 / 12 (100 %)

1/12 (8 %)

IgM + / IgG +

(n=1)

1 / 1 (100 %)

1 / 1 (100 %)

3.1.2 Untersuchungen zur Inzidenz der HCMV Übertragung auf das Frühgeborene

▼ 39 

Um die Mutter-zu-Kind Übertragung von HCMV zu untersuchen, wurden kindlicher Urin und Tracheal- oder Pharyngealsekrete (TS/PS) auf das Vorhandensein von HCMV-DNA bzw. ß-Globin-DNA getestet. Der Nachweis von HCMV-DNA in drei unabhängigen, aufeinanderfolgenden Urin- und/oder TS/PS Proben wurde als Anzeichen einer HCMV-Übertragung und aktiven HCMV-Infektion im Neugeborenen gewertet. Eine perinatale Infektion liegt definitionsgemäß vor, wenn die Infektion in dem Zeitraum vom Beginn der Wehen bis eine Woche post partum stattgefunden hat. Spätere Infektionen sind postnatale Infektionen (Ho et al., 1991). Da HCMV erst frühestens eine Woche nach Infektion in internen Körperflüssigkeiten (z.B. Urin, Blut) nachweisbar ist, werden als postnatal infizierte Neugeborene nur die Kinder gewertet, bei denen virale DNA erstmals in der 2. Woche post partum im Urin nachweisbar ist (vgl. Kap. 1.5.3).

Unabhängig vom mütterlichen Serostatus übertrugen 20 von 73 Müttern (27 %) HCMV peri- oder postnatal auf ihre Frühgeborene. Bezogen auf die Mütter mit nachgewiesener DNAlaktia betrug die Transmissionsrate 42 % (20/48). Die Übertragungsraten von DNAlaktia positiven Müttern waren mit 40 % (15/38) im I. Studienteil und 50 % (5/10) im II. Studienteil vergleichbar. Der unterschiedliche Untersuchungszeitraum von einem Monat (I. Studienteil) bzw. zwei Monaten (II. Studienteil) hatte also kaum Einfluss auf das Ergebnis. Dies unterstreicht, dass die Virustransmission vorwiegend innerhalb des ersten Monats nach der Geburt erfolgte. Betrachtet man die 28 Mütter isoliert, für die der Serostatus ermittelt werden konnte, wird deutlich, dass es in der Gruppe der Mütter mit positivem HCMV-Serostatus mit 37 % (7/19) am häufigsten zu einer Übertragung des Virus auf das Neugeborene kam (Abb. 6). Die einzige Mutter mit aktiver HCMV-Infektion (IgG+/IgM+) übertrug das Virus interessanterweise nicht. In der Gruppe der seronegativen Mütter kam es nur in einem Fall zur HCMV-Übertragung. Diese Mutter hatte eine nachgewiesene HCMV-DNAlaktia bei seronegativen HCMV-Serostatus und übertrug das Virus auf ihr Kind.

Abb. 6: Korrelation von mütterlichen HCMV-Serostatus, HCMV-DNAlaktia und HCMV- Übertragung auf das Frühgeborene.

3.1.3 HCMV-Infektionen der Frühgeborenen

▼ 40 

Von den 89 untersuchten Frühgeborenen wurden 22 (24 %) im Laufe der Studie mit HCMV infiziert. HCMV-DNA konnte in allen infizierten Kindern –mit einer Ausnahme- sowohl in Proben des oberen Respirations- (Tracheal/Pharyngealsekrete) als auch des Urogenitaltraktes (Urin) nachgewiesen werden. Dies weist auf eine systemische Infektion der Kinder hin. Für 13 der 22 infizierten Frühgeborenen konnte eine postnatale Infektion durch Virusnachweis im Urin ab der 2. Woche post partum gesichert werden. Für die restlichen 9 Kinder blieb der genaue Zeitpunkt der Übertragung ungeklärt. Bei diesen Kindern waren Urin und TS/PS-Proben nach der Geburt zunächst negativ, der Urin wurden aber erstmalig bereits innerhalb der ersten oder zweiten Lebenswoche HCMV-DNA positiv. Definitionsgemäß handelt es sich hier um perinatale HCMV-Infektionen für die neben Muttermilch andere Virusübertragungswege zu diskutieren sind. 12 der 13 postnatal infizierten Kinder wurden mit HCMV-haltiger Muttermilch gefüttert. Ein Kind erhielt von der Mutter nachweislich HCMV-DNAlaktia negative Brustmilch. Das zweite Kind (Zwillinge) dieser Mutter blieb uninfiziert, sodass hier nosokomiale Infektionen z.B. durch HCMV-positives aber seronegativ gescreentes Blut nicht ausgeschlossen werden können.

Wie zu erwarten, waren Kinder von Müttern mit positivem HCMV-Serostatus und/oder HCMV-DNAlaktia besonders gefährdet, sich mit HCMV zu infizieren. Die kumulative peri/postnatale Transmissionsrate der Frühgeborenen HCMV-DNAlaktia positiver und/oder HCMV-seropositiver Mütter betrug 38 % (21/55). Zwei der 22 (10 %) mit HCMV infizierten Frühgeborenen entwickelten klinische Symptome, die auf eine HCMV-Infektion zurückgeführt werden konnten. Beide Kinder wurden postnatal mit HCMV infiziert, wahrscheinlich über die DNAlaktia positive Brustmilch ihrer Mütter. Das eine Frühgeborene mit besonders geringem Geburtsgewicht (380 Gramm) entwickelte eine Thrombozytopenie mit schwerem abakteriellem „sepsis-like-syndrome“, das im Verlauf eine Reintubation erforderte (Kind 1 in Tab. 4) . Bei dem zweiten Frühgeborenen konnte am Ende der 3. Lebenswoche -zwei Wochen nach dem ersten Nachweis von HCMV-DNA in der Brustmilch seiner Mutter– erstmals virale DNA in Urin und TS-Proben nachgewiesen werden. In der 4. Lebenswoche entwickelte dieses Kind eine schwere Hepatitis mit Cholestase-Ikterus, für den sonographisch und labordiagnostisch keine andere Ursache als HCMV gefunden werden konnte (Kind 9 in Tab. 4). Unter Therapie mit Ganciclovir besserte sich der Zustand beider Kinder, obgleich in ihren Urin- und TS-Proben über den gesamten weiteren Untersuchungszeitraum hohe Mengen an HCMV-DNA nachweisbar waren.

Bei den weiteren 20 infizierten Kindern wurden keine eindeutig der HCMV-Infektion zuzuordnenden klinischen Symptome beobachtet.

▼ 41 

Tab. 4: Diagnose und klinische Daten der 22 HCMV-infizierten Kinder.
Abk.: w=weiblich; m=männlich, 0= negativ; += positiv; ROP= retinopathia praematuorum; RDS= „respiratory distress syndrome“; BPD1=Bronchopulmonale
Dysplasie mit Beatmungspflichtigkeit >25% am 28. Lebenstag; BPD2 = Bronchopulmonale Dysplasie mit Beatmungspflichtigkeit > 36. Gestationswoche. AI=Ammnioninfektionssyndrom

Infizierte

Kinder

n = 22

Geschlecht

Geburts-gewicht (g)

erster Nachweis

von HCMV-DNA

(Tage pp.) in

Transmission

BPD1

BPD2

RDS

ROP

AI

HCMV-assoziierte

Symptome

Art der Entbindung

  
   

Urin

TS/PS

   

1

M

1670

14

14

Postnatal

0

0

0

0

+

 

vaginal

 

2

W

380

28

28

Postnatal

+

+

+

+

+

Sepsis-like disease

Sektio

 

3

M

970

28

28

Postnatal

+

+

+

+

0

 

Sektio

 

4

M

815

14

28

Postnatal

+

+

+

+

+

 

Sektio

 

5

W

726

14

14

Postnatal

0

0

0

0

0

 

Sektio

 

6

M

1080

20

20

Postnatal

+

0

+

0

+

 

Sektio

 

7

M

1186

14

28

Postnatal

0

0

0

+

+

 

vaginal

 

8

W

930

20

20

Postnatal

0

0

0

0

+

 

Sektio

 

9

W

1305

24

24

Postnatal

0

0

0

0

+

Hepatitis- Cholestase/Ikterus

Sektio

 

10

M

1670

28

7

Postnatal

0

0

0

0

+

 

vaginal

 

11

W

680

14

28

Postnatal

+

0

+

0

0

 

Sektio

 

12

W

1480

12

12

Postnatal

0

0

+

0

0

 

Sektio

 

13

W

1290

12

5

Postnatal

+

+

+

0

0

 

Sektio

 

14

M

960

5

12

unbekannt

+

0

+

+

0

 

Sektio

 

15

W

730

3

5

unbekannt

0

0

0

+

0

 

Sektio

 

16

W

670

7

5

unbekannt

+

+

+

0

0

 

Sektio

 

17

M

2010

5

3

unbekannt

0

0

+

0

+

 

vaginal

 

18

M

1070

5

3

unbekannt

+

0

+

+

+

 

Sektio

 

19

M

1020

3

3

unbekannt

0

0

+

0

0

 

vaginal

 

20

W

960

5

1

unbekannt

+

0

+

0

+

 

vaginal

 

21

M

1320

3

1

unbekannt

+

0

0

0

0

 

Sektio

 

22

M

780

3

1

unbekannt

0

0

0

0

0

 

Sektio

 

Vergleicht man die Gruppe der HCMV-infizierten Kinder (n = 22) mit der Gruppe der nicht infizierten Kinder (n = 67) so wird deutlich, dass sie sich im Bezug auf Gestationsalter, Geburtsmodus, Geburtsgewicht und Inzidenz von Amnioninfektionssyndromen nicht unterscheiden (Tab. 5). Es fällt jedoch auf, dass die Hälfte (11/22; 50 %) der HCMV-infizierten Kinder aber nur 39 % der uninfizierten Kinder laborparametrische Zeichen einer Neonatalinfektion (Def: GP > 1.0 mg/dl in den ersten drei Lebenstagen oder IL-6 >100 pg/ml) zeigte. HCMV-positive Kinder entwickelten darüber hinaus deutlich häufiger Funktionsstörungen der Atemwege mit Bronchopulmonaler Dysplasie BPD1 (41 % vs. 33 %), BPD2 (23 % vs. 10 %) oder „respiratory dystress syndrome (RDS)“ (64 % vs. 45 %). Die Beatmungsdauer infizierter Kinder war im Mittel mit 14 Tagen deutlich länger als die für nicht infizierte Kinder mit 9 Tagen. Auch wenn sich statistisch für diese Unterschiede keine Signifikanz ergab (p>0,05; Mann-Whitney Test), weisen sie doch darauf hin, dass eine in der peri- und postnatalen Periode erworbene HCMV-Infektion ein ernstzunehmendes Gesundheitsrisiko insbesondere für Frühgeborene darstellen kann.

Tab. 5: Klinische Charakteristika der peri/postnatal mit HCMV infizierten und nicht infizierten
Frühgeborenen.

 

Anzahl der

Kinder

n=89

Nicht infizierte

Kinder

n=67 (75%)

HCMV-infizierte

Kinder

n=22 (25%)

Gestationsalter [Woche]

28 (24-33)

29 (24-33)

28 (24-32)

Geburtsgewicht [g]

1119 (380-2010)

1133 (390-1825)

1048 (380-2010)

Geschlecht [m/w]

54 / 35

42 / 25

12 / 10

Geburtsmodus [vaginal / Sektio]

26 / 63

20 / 47

6 / 16

Beatmungsdauer [Tage]*

10 (0-83)

9 (0-46)

14 (0-83)

Neonatale Infektion

37 (41 %)

26 (39 %)

11 (50 %)

Amnioninfektion

23 (48 %)

33 (49 %)

10 (45 %)

ROP

19 (22 %)

12 (18 %)

7 (32 %)

RDS

44 (49 %)

30 (45 %)

14 (64 %)

BPD1

31 (35 %)

22 (33 %)

9 (41 %)

BPD2

12 (13.5 %)

7 (10 %)

5 (23 %)

3.2 Einfluss von Molke auf die Virusreplikation und IE 1/2-Proteinsynthese in HCMV-infizierten HELF

3.2.1 Effekt von Molke auf die HCMV-Replikation in HELF

▼ 42 

Die hohe Inzidenz von 95 % HCMV-Reaktivierung in der laktierenden Brust bei seropositiven Müttern und die Beobachtung, dass es sich im Wesentlichen um einen lokalen Reaktivierungsprozess handelt, wirft die Frage auf, ob in der laktierenden Brust bioaktive Substanzen gebildet werden, die einen Einfluss auf die Reaktivierung und/oder Replikation von HCMV ausüben können. Um dies zu untersuchen, wurde aus Milchproben durch mehrere Zentrifugationsschritte fett- und zellfreie Molke präpariert. Im Standard-Plaque Test wurde der Einfluss der Molke auf die HCMV-Replikation untersucht. Hierzu wurden konfluent gewachsene HELF-Kulturen in 12-Well-Platten mit dem HCMV-Isolat AD169 infiziert (m.o.i = 0,02) und in An- oder Abwesenheit von 110 µl/ml Molke kultiviert. Eine detaillierte Versuchsdurchführung ist in Kap. 2.10.1 beschrieben. Die Anfärbung der infizierten Zellen 6-10 Tage nach Infektion ermöglichte die lichtmikroskopische Auswertung der typischen cytopathischen Effekte (CPE). Um den Effekt von Molke auf die Virusvermehrung quantitativ zu erfassen, wurde die Anzahl der CPE pro Well in der unbehandelten Viruskontrolle im Vergleich zu der Anzahl der CPE in den mit Molke behandelten Kulturen bestimmt. Um auszuschließen, dass eine erhöhte HCMV-Vermehrung in molkebehandelten HELF durch in der Molke vorhandenes Virus verursacht sein könnte, wurden alle Molkeproben zusätzlich auf uninfizierte HELF gegeben. Hierbei zeigte sich, dass die Molke von 2 von 10 Müttern soviel HCMV enthielt, dass es in HELF-Kulturen zur Bildung typischer CPE kam. Die Molke dieser beiden Mütter wurde von weiteren Infektionsversuchen ausgeschlossen.

Die Kultivierung der AD169-infizierten HELF mit Molke von 8 Müttern führte in allen Fällen zu einer 1,7- bis 2,6 –fachen Steigerung der Virusreplikation (Anzahl an Foci [CPE] pro Well im Vergleich zur Kontrolle) (Abb. 7). In einzelnen Experimenten mit Molke der Mütter J und W war die Anzahl der CPE im Vergleich zur Kontrolle mehr als dreifach erhöht. Zum Vergleich: Dexamethason (5x10-5M) erhöhte die Plaqueanzahl im Mittel um den Faktor 1,5 im Vergleich zur Kontrolle (Abb.7).

Abb. 7: Einfluss von Molke und Dexamethason auf die HCMV-Replikation in HELF.
Konfluente HELF-Kulturen wurden mit AD169 (m.o.i=0,02) infiziert und in An- und Abwesenheit von Molke (110 µl/ml) von 8 verschiedenen Müttern oder Dexamethason (Dexa 5x10-5M) kultiviert. Nach Anfärbung infizierter Zellen mit dem HCMV-spezifischen Antikörperklone E13 wurde die Anzahl der Foci pro Well bestimmt. Die Anzahl der CPE in der unbehandelten Viruskontrolle wurde „1“ gesetzt. Die aufgeführten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus je 3 unabhängigen Experimenten.

▼ 43 

Jeder Focus entsteht aus einer initial infizierten Zelle, von der ausgehend die Virusnachkommen weitere Zellen durch direkten Kontakt infizieren. Ein freie Virusausbreitung über das Medium wird im Versuchsaufbau durch Verwendung von halbfestem Medium (Methozel) weitestgehend verhindert. Während die Anzahl an Foci pro Well allein lediglich Rückschlüsse auf eine effizientere Viruspenetration und/oder Initiation des Replikationszyklus ermöglicht, gibt die Größe der einzelnen Foci Aufschluss über die tatsächliche Replikationsaktivität des Virus. Wie die lichtmikroskopischen Aufnahmen in Abbildung 8 exemplarisch für Mutter „I“ zeigen, führt der Zusatz von Molke nicht nur zu einer erhöhten Anzahl (Abb. 8 A+B), sondern auch zu einer deutlichen Vergrößerung der cytopathischen Effekte (Abb. 8 C+D). Die durchschnittliche Größe der CPEs wurde durch Auszählung der infizierten Zellen in 5 repräsentativen CPEs quantifiziert. Dabei zeigte sich, dass sich pro CPE in den mit Molke behandelten Proben durchschnittlich 1,1 - 2,6 mal so viele infizierte Zellen befanden wie in der unbehandelten Viruskontrolle (Abb.9).

Abb. 8: Lichtmikroskopische Aufnahme der CPEs in unbehandelten (A und C) und molkebehandelten (B und D) AD169 - infizierten HELF.
Die infizierten Zellen wurden mit dem HCMV-spezifischen Antikörper E13 (Kap. 2.10.) angefärbt. A und C: 2.5-fache Vergrößerung, B und D: 10-fache Vergrößerung. Für das hier dargestellte Experiment wurde Molke der Mutter „I“ verwendet.

Unter Zugabe von Dexamethason stieg die durchschnittliche Anzahl infizierter Zellen pro CPE um das 1,8-fache im Vergleich zur Viruskontrolle. Bis auf eine Ausnahme (Muttermilch K) korrelierte die Steigerung der Anzahl CPEs (Abb. 7) mit einer erhöhten Anzahl HCMV-positiver Zellen pro CPE (Abb. 9), was auf eine erhöhte Replikationsrate bzw. -geschwindigkeit des Virus in Gegenwart von Molke schließen lässt. Molkeproben von seronegativen Müttern (F, K, P) und seropositiven Müttern (E, I, J, T, W) zeigten in diesen Experimenten keine Unterschiede.

▼ 44 

Abb. 9: Einfluss von Molke und Dexamethason auf die Virusausbreitung in HELF.
HELF wurden mit AD169 (m.o.i=0,02) infiziert und unter An- und Abwesenheit von Molke (110 µl/ml) von 8 verschiedenen Müttern oder Dexamethason (Dexa 5x10-5M) kultiviert. Nach Anfärbung infizierter Zellen mit dem anti-HCMV-AK E13 wurde die Anzahl infizierter Zellen in 5 repräsentativen CPEs ausgezählt, gemittelt und relativ zur Viruskontrolle errechnet. Hierzu wurde die Anzahl infizierter Zellen pro CPE in der unbehandelten Viruskontrolle „1“ gesetzt. Die aufgeführten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus je 3 unabhängigen Versuchen

3.2.2 Effekt von Molke auf die HCMV-Immediate Early Proteinsynthese

Mittels Westernblot Analysen wurde untersucht, welchen Einfluss Molke auf die Synthese der Immediate-Early Proteine IE1 und IE2 von HCMV AD169 in HELF hat. Hierzu wurden konfluente HELF-Kulturen mit AD169 infiziert (m.o.i.=1) und unter Zugabe von Molke (300 µl/ml) für 72 Stunden kultiviert (Kapitel 2.11.) Zum Vergleich wurden eine nichtinfizierte Zellkontrolle, eine unbehandelte Viruskontrolle, sowie eine mit Dexamethason (5x10-5M) behandelte Viruskontrolle mitgeführt. Für den Westernblot wurden je 40 μg Gesamtprotein elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Die Darstellung der IE-Proteine erfolgte mittels des spezifischen monoklonalen HCMV Antikörpers E13 (anti-HCMV early antigen clone E13), der die IE1- und IE2 - Proteine erkennt.

Wie der repräsentative Immunoblot in Abb. 10 A zeigt, konnte in allen infizierten Proben (Spuren 1-8) IE1- und IE2- Protein nachgewiesen werden. Die Menge von IE1-Protein (72 kDa) war in allen Proben höher als die von IE2 (86 kDa). In der unbehandelten Viruskontrolle (Spur 1) war deutlich weniger IE1- und IE2-Protein nachweisbar als in den mit verschiedenen Molkeproben (Spur 2-7) oder Dexamethason (Spur 8) behandelten Proben. Die Menge an Aktin war in allen Proben vergleichbar, sodass Unterschiede in der aufgetragenen Gesamtproteinmenge ausgeschlossen werden konnten. In der uninfizierten Zellkontrolle (Spur 9) konnte keine HCMV-spezifischen IE-Proteine nachgewiesen werden, was Kontaminationen während des Versuches ausschließt und die Spezifität des verwendeten Antikörpers belegt.

▼ 45 

Die Auswertung der Immunoblots mit dem Programm Chemimager V.5.5 (Alpha Ease) ermöglichte die Farbdichtemessung der angefärbten Banden im linearen ungesättigtem Skanbereich. Hierdurch war eine semiquantitative Auswertung der Bandenstärke möglich. Die Bandendichten wurden gemessen und im Vergleich zur unbehandelten Viruskontrolle errechnet. Im Mittel der 3 durchgeführten Immunoblots ergab sich eine 1,6 - 2,6-fach erhöhte IE 1/2-Proteinsynthese in mit Molke kultivierten Proben im Vergleich zur unbehandelten Viruskontrolle (Abb. 10 B). Dexamethason steigerte die IE 1/2- Proteinsynthese im Mittel um den Faktor 2,7 (± 0,2).

Zusammengefasst belegen diese Versuche, dass Molke die IE-Genexpression von HCMV in HELF steigert.

Abb. 10: Einfluss von Molke oder Dexamethason auf die Synthese der HCMV IE Proteine IE1 und IE2.
A. Immunoblots für HCMV IE1 und IE2 Protein und Aktin
HELF wurden mit AD169 (m.o.i. = 1) infiziert und 3 Tage in An- und Abwesenheit von Molke (300 µl/ml) verschiedener Mütter oder Dexamethason (Dexa 5x10-6M) kultiviert. Je 40 µg Protein wurden elektrophoretisch aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrozellulosemembran mit dem anti-HCMV Antikörper E13 im Immunoblot angefärbt. Die Abbildung zeigt einen von 3 repräsentativen Blots. Nach „Strippen“ der Membran wurde der Blot mit anti-Aktin Antikörpern inkubiert.
B. Semiquantitative Auswertung der Immunoblots
Die quantitative Auswertung der Immunoblots erfolgte mittels Farbdichtemessung der Banden im linearen Skanbereich. Es wurde jeweils die Dichte der mit anti-HCMV AK E13 angefärbten Banden relativ zur unbehandelten Kontrolle errechnet. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichung der relativen Bandendichten aus drei unabhängigen Versuchen.

3.3 Einfluss von Molke auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors in HL-60 und THP-1 Zellen

3.3.1 Einfluss von Molke auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor in HL-60 und THP-1 Zellen

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In den folgenden Experimenten sollte untersucht werden, ob der stimulierende Effekt von Molke auf die HCMV-Replikation und IE 1/2- Proteinsynthese auf eine erhöhte Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors zurückgeführt werden kann. Der HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor reguliert die Synthese der IE1- und IE2- Proteine (siehe Kap. 1.4.2.). Hierzu wurden HL-60 oder THP-1 Zellen als Modell für monozytäre Vorläuferzellen (HL-60) bzw. reife Monozyten (THP-1) nach der in Kap. 2.8.1. beschriebenen DEAE-Dextran Methode transient mit dem Plasmid pRR55 transfiziert. pRR55 enthält den gesamten HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor gekoppelt an ein Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT)-Reportergen. Die transfizierten Zellen wurden 30 Stunden in An- und Abwesenheit von Molke (200 μl pro 600 μl Medium) kultiviert. Im anschließenden CAT Assay wurde die Menge der in den Zellen gebildeten Chloramphenicol-Acetyl-Transferase als Maß für die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors gemessen. Stichprobenartige Zellzählungen zeigten, dass es in mit Molke behandelten Proben im Vergleich zur Kontrolle zu keinem veränderten Zellwachstum kam.

Die in Abb. 11 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass Molke die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotor in HL-60 Zellen deutlich erhöht. Dieser Effekt ist konzentrationsabhängig. Die Erhöhung der zugesetzten Molkemenge von 50 µl auf 200 µl in einem Gesamtvolumen von 600 µl führte zu einer linearen Steigerung der Promotoraktivität. Die durch Molkeproben verschiedener Mütter hervorgerufenen Stimulationsraten unterschieden sich hierbei in ihrer absoluten Höhe. Bei allen Proben war eine signifikant höhere (alle Proben p<0,005; Wilcoxon Test) IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität in mit Molke behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrolle zu sehen. Diese Beobachtung bestätigte sich in den weiter unten beschrieben Untersuchungen zur Kinetik der molkeabhängigen Stimulation des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors für verschiedene Mütter.

Abb. 11: Einfluss steigender Konzentrationen von Molke auf die CAT-Expression in pRR55 transfizierten HL-60 Zellen.
HL-60 Zellen wurden mit pRR55 transient transfiziert und unter An- und Abwesenheit steigender Menge Molke von drei verschiedenen Müttern kultiviert. Nach 30 Stunden wurde die CAT-Expression gemessen. Die CAT-Expression in der unbehandelten Kontrolle wurde „1“ gesetzt. Dargestellt sind die relativen CAT-Expressionswerte aus 3 unabhängigen Experimenten.

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Der stimulierende Einfluss von Molke auf die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors war nicht auf HL-60 Zellen beschränkt, sondern wurde auch in THP-1 Zellen beobachtet. In parallel durchgeführten Versuchen wurden gleiche Mengen von HL-60 und THP-1 Zellen mit pRR55 transfiziert und unter Zugabe der gleichen Menge Molkeprobe von unterschiedlichen Müttern kultiviert. In diesen Experimenten zeigte sich, dass die Stimulierung des IE1/2-Enhancer/Promotors durch gleiche Molkeproben in HL-60 und THP-1 Zellen nahezu identisch und damit unabhängig vom Differenzierungsgrad der Zellen ist (Abb. 12).

Abb. 12: Einfluss von Molke auf die CAT-Expression in pRR55-transfizierten HL-60 und THP-1 Zellen.
HL-60 und THP-1 Zellen wurden parallel mit pRR55 transfiziert und unter An- und Abwesenheit identischer Molkeproben (200 µl/600 µl) kultiviert. Die CAT-Expression der jeweiligen unbehandelten Kontrolle wurde „1“ gesetzt. Die relativen CAT-Expressionen unter Zugabe von Molkeproben 3 verschiedener Mütter von je 3 verschiedenen Abnahmezeitpunkten sind dargestellt. Abgebildet sind die Ergebnisse von drei Einzelexperimenten.

3.3.2 Kinetik der Stimulation des IE1/2-Enhancer/Promotors durch Molke stillender Mütter in den ersten Monaten der Laktation

Die Virusausscheidung mit der Muttermilch beginnt in den ersten Wochen nach Entbindung, erreicht in den ersten 3-6 Wochen der Laktation ein Maximum und fällt dann langsam ab (Vochem et al., 1998; Yasuda et al., 2003). Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die Promotor-stimulierende Aktivität der Molke ebenfalls einer bestimmten Kinetik folgt. Dazu wurde von 10 Müttern einmal wöchentlich über 5-7 Wochen nach Entbindung Brustmilch gesammelt und der Effekt der daraus präparierten Molke auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors in transient transfizierten HL-60 Zellen untersucht. Die Ergebnisse sind in Abb. 13 A und B zusammengefasst.

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Es zeigte sich, dass auch über einen längeren Zeitraum alle untersuchten Molkeproben die CAT-Expression in pRR55-transfizierten HL-60 Zellen steigern. Die Promotoraktivität war in Abhängigkeit von der Mutter im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle um die Faktoren 1,7 (±0,8) bis 7,2 (±2,4) erhöht. Molkeproben von 7 der 10 Mütter erhöhten die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors um mehr als das Dreifache im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle (Mütter I, D, G, N, K, P, E). Die Steigerung der IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität durch Molke war für alle Molkeproben statistisch signifikant (p>0,005; Wilcoxon-Test ).

Die Höhe der Stimulierung folgte dabei im Mittel einer zeitlichen Kinetik: Für alle Mütter wurden die höchsten Stimulationswerte mit Molkeproben aus den ersten beiden Wochen nach Entbindung gemessen. Danach sank der stimulierende Effekt auf ein niedrigeres, aber weiter deutlich über der Kontrolle liegendes Niveau ab, auf dem er bis zur 7. Woche verblieb.

Im Mittel erhöhte Molke, die in der ersten Woche nach Entbindung gesammelt wurde, die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors um den Faktor 4,9 (±1,5). In der 2. Wochen sank dieser Faktor auf 4,5 (±1,5) und betrug in der 5. Woche nach Entbindung noch 3,5 (±0,9).

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Zur statistischen Auswertung dieser Daten wurde der nichtparametrische Wilcoxon-Test für gepaarte Proben verwandt, in dem Wertunterschiede zwischen gemittelten Stimulationsraten der einzelnen Wochen gegeneinander analysiert wurden. Dabei zeigte sich, dass die gemessenen Stimulationswerte für Molkeproben der 1. Woche signifikant höher waren als für die der 2. Woche (p=0,024), der 3. Woche (p=0,007), der 4. Woche (p<0,001) und der 5. Woche (p=0,009), wobei die Stimulationsrate in der 5. Woche nochmals geringfügig anstieg. Die mit Molkeproben aus der 6. und 7. Woche nach Entbindung erzielten Ergebnisse zeigten zwar weiterhin eine stimulierende Wirkung, wurden aber in die statistische Auswertung nicht einbezogen, da für diese Wochen nicht von allen 10 Müttern Proben zur Verfügung standen.

Die beobachtete Kinetik war unabhängig vom Serostatus der Mütter. Statistisch ergab sich bei separater Berechnung der molkevermittelten Stimulationskinetiken seronegativer und seropositiver Mütter kein signifikanter Unterschied. Allerdings zeigten die Molkeproben von HCMV-seropositiven Müttern (Abb. 13 A) ein im Mittel etwas stärkeren Effekt auf die IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität als die Molken seronegativer Mütter (Abb. 13 B). Die Ursache hierfür konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht geklärt werden. Da die Experimente an verschiedenen Tagen durchgeführt werden mussten, die Zellen also nicht immer in identischem Zustand waren, ist nicht auszuschließen, dass der Zellzustand auf die absoluten Stimulationsraten einen Einfluss hatte. Wie im Kapitel Material und Methoden ausgeführt, wurden im Rahmen dieser kinetischen Untersuchungen die Molkeproben einer Mutter jeweils unter identischen Bedingungen getestet, da das primäre Ziel die Darstellung der Stimulationskinetik der Molkeproben einer Mutter im Laufe der Laktation war. Die Unterschiede in den absoluten Stimulationswerten seropositiver und seronegativer Molke könnten jedoch auch dadurch verursacht sein, dass die stimulierende Substanz in HCMV-seronegativen Müttern vermindert gebildet wird. Um Unterschiede zwischen der Molke seropositiver und seronegativer Mütter zu belegen, bedarf es weiterer Versuche, in denen die Molkeproben unterschiedlichen Mütter unter identischen Bedingungen getestet werden.

Von den 5 seropositiven Müttern, deren Molke über einen längeren Zeitraum gesammelt und im Transfektionssystem untersucht wurde, übertrugen 3 das Virus auf das Frühgeborene. Vergleiche der Stimulationskinetiken (Abb. 13 A) der Molke dieser Transmitter (Mütter G, F, N) im Vergleich zu den seropositiven Non-Transmittern (Mütter D, I) zeigten keine signifikanten Unterschiede. Die gemittelten Stimulationswerte von Molkeproben aus der 1. Woche waren in der Transmittergruppe mit 4,9 ±2,5 (Mutter F), 5,3 ± 2,8 (Mutter N) und 5,7 ±1,7 (Mutter G) leicht niedriger als in der Non-Transmittergruppe mit 6,0 ±3,2 (Mutter D) und 6,4 ±1,2 (Mutter I). Für eine sichere Aussage bedarf es allerdings der Untersuchung eines größeren Kollektivs an Mutter-Kind Paaren und, wie oben erwähnt, müssten die Molkeproben verschiedener Mütter unter absolut identischen Bedingungen getestet werden.

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Abb. 13: Einfluss von Molke verschiedener Mütter auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors im Verlauf der Laktation
HL-60 Zellen wurden mit pRR55 transfiziert, in An- und Abwesenheit von 200 μl Molke/600 μl Medium kultiviert und die CAT-Expression nach 30 Stunden gemessen. Dargestellt sind die CAT-Expressionswerte relativ zur unbehandelten Kontrolle, die „1“ gesetzt wurde. Die Molkeproben wurden von 5 HCMV-seroSpositiven (A) und 5 HCMV-seronegativen Müttern (B) während der ersten 5 bis 7 Wochen nach Entbindung gesammelt. Die dargestellten Ergebnisse sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei unabhängigen Versuchen.

Im Rahmen der Arbeit konnten Muttermilchproben von einer Mutter eines reif geborenen Kindes über einen Zeitraum von 6 Monaten nach Entbindung gesammelt und getestet werden. Es zeigte sich, dass die den HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor stimulierende Aktivität auch 6 Monaten nach Entbindung noch in der Brustmilch vorhanden ist (Abb. 14). Die Kinetik ist erwartungsgemäß vergleichbar derjenigen, die für Mütter frühgeborener Kinder in den ersten beiden Monaten der Laktation beobachtet wurde (vgl. Abb. 13). Der stimulierende Effekt war am höchsten in der Molke, die während der 1. Woche nach Entbindung gesammelt wurde (3,3 ±0,5), und fiel dann auf ein gleichbleibendes, etwas niedrigeres Niveau ab (2,5 ± 0,4).

Abb. 14: Einfluss von Molkeproben einer Mutter auf die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors im Verlauf von 6 Monaten nach Entbindung
HL-60 Zellen wurden transient mit pRR55 transfiziert, 30 Stunden unter An- und Abwesenheit von 200 μl Molke/ 600 μl Kulturmedium kultiviert und die CAT-Expression gemessen. Molkeproben einer Mutter (Mutter W) von unterschiedlichen Abnahmezeitpunkten (1.-6. Monat der Laktation) wurden getestet. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der relativen CAT- Expressionswerte aus drei unabhängigen Versuchen.

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Zusammenfassend machen die Versuche deutlich, dass der stimulierende Effekt von Molke auf die Virusreplikation und IE-Proteinexpression mit einer Erhöhung der Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors einhergeht. Molke muss daher eine oder mehrere Substanzen enthalten, die über eine Aktivierung des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors die IE-Genexpression erhöhen können. Diese Substanz(en) tritt (treten) physiologisch sowohl in seropositiven als auch seronegativen Müttern mit einer bestimmten Kinetik in der Molke auf. Ihre Konzentration ist am Anfang der Laktation am höchsten und sinkt dann auf einen etwas niedrigeren Wert, der dann über lange Zeit (wahrscheinlich die gesamte Laktation) relativ konstant bleibt.

3.4 Untersuchungen zum Mechanismus der Molke-vermittelten Stimulierung des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors

3.4.1 Untersuchungen zur Rolle von Glukokortikoiden im Prozess der molkevermittelten HCMV IE1/2-Enhancer/Promotorstimulation in HL-60 Zellen

Die Stimulierung der Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors wird durch Bindung von aktivierenden Transkriptionsfaktoren an unikale oder repetitive Sequenzen im Enhancer hervorgerufen (Mocarski et al., 2002). Um den Mechanismus der IE-Promotorstimulation durch Molke genauer zu untersuchen und Hinweise auf die Natur und den Wirkmechanismus der verursachenden Substanz(en) zu gewinnen, wurden Zellen mit drei verschiedenen Promotormutanten transfiziert und unter Zugabe von Molke kultiviert.

In dem Plasmid p17mut3 sind die 17 bp Sequenzmotive durch Nukleotidaustausch so verändert, dass sie den Glukokortikoidrezeptor nicht mehr binden können (Prösch et al., eingereicht). Um zu prüfen, ob Glukokortikoide eine Rolle für die Molke-vermittelte Stimulation des IE1/2-Enhancer/Promotors spielen, wurden HL-60 Zellen parallel mit dem Wildtyp Promotor pRR55 oder p17mut3 transfiziert und unter Zugabe gleicher Molkeproben kultiviert. Zur Kontrolle wurde eine parallel transfizierte Kultur mit Dexamethason (5x10-6M) behandelt. Wie Abbildung 15 zeigt, führte die Zugabe von Dexamethason zu einer durchschnittlichen Steigerung der Wildtyp Promotoraktivität um den Faktor 2,2 (±0,6). Im Unterschied dazu reagierte der mutierte Promotor in p17mut3 nicht mehr oder nur noch marginal auf gleiche Mengen Dexamethason. Dies entspricht einer Verminderung der Dexamethason-induzierten Promotorstimulation um 83 % im Vergleich zum Wildtyppromotor. Nach Behandlung p17mut3-transfizierter HL-60 Zellen mit Molkeproben von 6 verschiedenen Müttern zeigte sich, dass die Promotormutante auf 4 der 6 Molken deutlich geringer reagierte als der Wildtyppromotor (Abb. 15). Im Vergleich zum Wildtyppromotor waren die Stimulierungsraten in mit der Promotormutante p17mut3 transfizierten Zellen um 10-90 % reduziert (Mütter W, J, I, F). Ein vollständiger Verlust der stimulierenden Wirkung von Molke auf den IE1/2-Enhancer/Promotor nach Eliminierung der GR-bindenden Sequenzen wurde jedoch nicht beobachtet. Diese Versuchsergebnisse zeigen, dass das 17 bp Motiv des IE1/2-Enhancers und Glukokortikoide eine wichtige Rolle in der Vermittlung der molkeinduzierten IE1/2-Enhancer/Promotorstimulation spielen.

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Abb. 15: CAT-Expression in pRR55 und p17mut3 transfizierten HL-60 Zellen nach Behandlung mit Molke.
HL-60 Zellen wurden parallel mit pRR55 und p17mut3 transfiziert und mit 200 μl Molke/600 µl Medium bzw. 5x10-6M Dexamethason (Dexa) kultiviert. Nach 30 Stunden wurde die Promotoraktivität im CAT-Assay gemessen und relativ zur unbehandelten Kontrolle errechnet. Zur vergleichenden Darstellung der Aktivität beider Promotorkonstrukte nach Behandlung mit Molke wurde die in pRR55-transfizierten HL-60 Zellen gemessene CAT-Expression 100% gesetzt (schwarze Säulen). Die Abbildung zeigt je 2 unabhängige Versuche pro Molkeprobe bzw. Mittelwerte und Standardabweichung aus 7 unabhängigen Versuchen (Dexa).

In einem weiteren Ansatz wurde auf andere Weise überprüft, ob Glukokortikoide tatsächlich an der Stimulation der IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität durch Molke direkt beteiligt sind. Hierzu wurden in einem pRR55-transfizierte HL-60 Zellen mit Molke unter Zugabe von RU-486, einem Inhibitor des Glukokortikoidrezeptors, inkubiert. Für diese Experimente wurden diejenigen Molkeproben verwendet, für die in p17mut3- versus pRR55-transfizierten HL-60 Zellen eine deutlich verringerte promotorstimulierende Aktivität nachgewiesen worden war (Abb. 15, Molke Mütter W + J). Zur Kontrolle wurden pRR55-transfizierte HL-60 Zellen mit Dexamethason (5x10-6M) oder mit RU-486 (5 ng/ml) behandelt. Hierdurch sollte zunächst abgesichert werden, dass RU-486 die transkriptionsaktivierende Eigenschaft von Dexamethason hemmt. Da DMSO, als Lösungsmittel für RU-486 selbst die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor minimal beeinflusst, wurde allen Kontrollen die adäquate Menge DMSO zugesetzt.

Wie in Abb. 16 dargestellt, antagonisierte RU-486 die durch Dexamethason hervorgerufene Stimulation des Promotors vollständig. In Gegenwart von RU-486 sank die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors sogar unter die in Abwesenheit von Dexamethason gemessene Basisaktivität. Die durch die beiden Molkeproben „W“ und „J“ hervorgerufene Promotorstimulation in pRR55-transfizierten HL-60 Zellen wurde durch Zugabe von RU-486 in 3 unabhängigen Versuchen im Mittel um 32 % (Molke W) bzw. 61 % (Molke J) gesenkt. RU-486 hatte damit einen ähnlichen, wenn auch etwas schwächeren Hemmeffekt auf die molke-induzierte Stimulation des IE1/2-Enhancer/Promotors als die Eliminierung der Bindungsstellen des Glukokortikoidrezeptors im IE-Enhancer (vgl. Abb. 15). Einschränkend muss aber angemerkt werde, dass wegen der Gefahr von toxischen Einflüssen keine höheren Mengen RU-486 eingesetzt wurden. Es könnte daher sein, dass höhere Mengen an RU-486 zu ähnlichen Ergebnissen geführt hätten wie bei Verwendung der Promotormutante p17mut3.

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Abb. 16: Antagonisierender Effekt von RU-486 auf die CAT-Expression in Dexamethason- und Molke -behandelten pRR55-transfizierten HL-60 Zellen.
Mit pRR55 transfizierte HL-60 Zellen wurden unter Zugabe von 200 μl /600 µl Molke oder 5x10-6M Dexamethason (Dexa) mit 3 μl DMSO oder 3 µl RU-486 (5 mg/ml DMSO) kultiviert. Nach 30 Stunden wurde die CAT-Expression gemessen und die relative CAT-Expression errechnet. Dargestellt ist ein repräsentativer Versuch von 3 unabhängigen Experimenten mit Molkeproben der Mütter W und J.

3.4.2 Untersuchung zur Rolle von TNFα und cAMP im Prozess der molkevermittelten HCMV IE1/2-Enhancer/Promotorstimulation in HL-60 Zellen

Wie im Kapitel 3.4.1. beschrieben, führte das funktionelle Ausschalten der GRE-Sequenzmotive im IE-Enhancer zu einer deutlich reduzierten Ansprechbarkeit des IE1/2-Promotors auf den stimulierenden Einfluss durch Molke. Eine vollständige Aufhebung der Molke-vermittelten IE1/2-Enhancer/Promotorstimulation wurde dabei allerdings nicht beobachtet. Es ist daher anzunehmen, dass weitere Substanzen und Transkriptionsfaktoren an diesem Prozess beteiligt sind. In den folgenden Versuchen sollte geprüft werden, ob Tumor Nekrose Faktor Alpha (TNFα) und zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) an der Molke-vermittelten IE1/2-Enhancer/Promotor-Stimulation beteiligt sind. Sowohl für TNFα als auch für cAMP wurde gezeigt, dass sie die IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität stimulieren (Prösch et al., 2000 b; Stein et al., 1993). TNFα wird bei Entzündungsreaktionen gebildet und wurde in unterschiedlichen Mengen in der Molke gemessen (Buescher et al., 2001; Laiho et al., 2003). cAMP wird durch die Stresshormone Adrenalin und Noradrenalin induziert, ebenso wie durch das in der Molke nachgewiesene Prostaglandin E2 (Rodriguez-Palmero et al., 1999).

In der Promotormutante p18mut4 sind die vier 18 bp Sequenzmotive im IE1/2-Enhancer mutiert. Dies führt dazu, dass sie den Transkriptionsfaktor „Nuklear Faktor Kappa B“ (NFκB) nicht mehr binden können. Der mutierte Promotor ist nicht mehr durch TNFα stimulierbar (Abb. 17 A). In der Enhancermutante p19mut5 wurden in den fünf 19 bp Sequenzmotiven Nukelotidaustausche vorgenommen, die eine Bindung des „cAMP responsive element binding protein / activating transcription factor-1 (CREB/ATF-1) an die “cAMP-responsive elements“ (CRE) verhindern (Ozar Jasmin, 2002). Diese Promotormutante zeigt in HL-60 Zellen eine stark verminderte Ansprechbarkeit auf cAMP (Abb. 17 B).

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Wurden HL-60 Zellen parallel mit pRR55, p18mut4 oder p19mut5 transfiziert und mit der selben Molkeprobe behandelt, beobachteten wir eine nahezu identische CAT-Expression in allen Zellkulturen (Abb. 17 A+B). Die CAT-Expression in mit p18mut4 transfizierten HL-60 Zellen wurde durch die Molke von einer Mutter sogar stärker stimuliert (120-151 %) als in den mit pRR55 transfizierten Zellen (Abb. 17 A).

Diese Versuche zeigen, dass der stimulierende Effekt der Molke auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors nicht über TNFα/NFκB oder Substanzen vermittelt wird, die den endogenen cAMP-Spiegel erhöhen (z.B. Adrenalin, Noradrenalin, Prostaglandin E2).

Abb. 17: CAT-Expression in pRR55 und p18mut4 (A) oder p19mut5 (B) transfizierten HL-60 Zellen nach Behandlung mit Molke.

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HL-60 Zellen wurden parallel mit pRR55 und den HCMV IE-Promotormutanten p18mut4 (A) oder p19mut5 (B) transfiziert und in Ab- oder Anwesenheit von 200μl Molke/600 µl Medium, 5 ng/ml TNFα oder 0,5 mg/ml dbcAMP kultiviert. Nach 30 Stunden wurde die CAT-Expression gemessen und die Stimulationsraten als Verhältnis der CAT-Expression in unbehandelten und behandelten Proben errechnet. Die Stimulierung des Wildtyp Promotors (pRR55) durch cAMP, TNFα oder Molke wurde 100 % gesetzt (schwarze Säulen). Die in den mit p18mut4 und p19mut5 transfizierten und mit gleichen Molkeproben behandelten Zellen gemessene CAT-Expression ist in Prozent relativ zur CAT-Expression in den mit pRR55 transfizierten Zellen angegeben. Die Abbildung zeigt Mittelwerte und Standardabweichung aus 7 unabhängigen Versuchen (cAMP, TNFα) bzw. die Werte aus zwei unhabhängigen Versuchen pro Molkeprobe.

3.4.3 Einfluss von humanem Prolaktin und Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors in HL-60 Zellen

Auf der Suche nach weiteren möglichen Mediatoren, welche die beobachtete Erhöhung der HCMV-Replikation und der IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität durch Molke vermitteln könnten, wurde der Einfluss von Epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und humanem Prolaktin auf den IE1/2-Enhancer/Promotor untersucht. Muttermilch enthält 0,8-1,8 µg/ml EGF und 11-43 ng/ml Prolaktin (Cox et al., 1996; Dvorak et al., 2003; Ho et al., 1991). Verschiedene Arbeitsgruppen hatten Prolaktinrezeptoren auf HL-60 Zellen beschrieben (Dardenne et al., 1994; Nishiguchi et al., 1993). HL-60 Zellen wurden mit pRR55 transfiziert und unter An- und Abwesenheit steigender Konzentrationen von humanem Prolaktin kultiviert. In diesen Experimenten hatte Prolaktin in Konzentrationen von 0,1 - 1000 ng/ml keinen messbaren Einfluss auf die Promotoraktivität (Abb. 18).

Abb. 18: Einfluss von Prolaktin auf die IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität in pRR55-transfizierten HL-60 Zellen.
HL-60 Zellen wurden mit pRR55 transient transfiziert und in Anwesenheit steigender Konzentrationen Prolaktin für 30 Stunden inkubiert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der CAT-Expression relativ zur unbehandelten Kontrolle (“1“) aus drei unabhängigen Versuchen.

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Um zu prüfen, ob die von uns verwendeten HL-60 Zellen tatsächlich auf Prolaktin reagieren können, wurden HL-60 Zellen mit dem als prolaktinsensitiv beschriebenen Plasmid pβc-344/-1CAT transfiziert (Doppler et al., 1995). Dieses Plasmid enthält den Ratten β-Kasein Promotor stromabwärts vom CAT-Reportergen. Die basale CAT-Expression in mit pβc-344/-1CAT transfizierten HL-60 Zellen war nach Verwendung der DEAE-Dextranmethode jedoch zu gering, um auswertbare Ergebnisse zu erhalten. Deshalb wurden die Zellen in weiteren Versuchen mittels Elektroporation transfiziert, wodurch eine höhere Transfektionseffizienz (≈50 %) erreicht werden konnte. Die basale CAT-Expression nach Elektroporation war höher, wurde durch Zugabe von Prolaktin jedoch nicht weiter erhöht (nicht dargestellt). Es muss daher hinterfragt werden, ob auf den verwendeten HL-60 Zellen tatsächlich Prolaktinrezeptoren exprimiert werden. Auch die Kultivierung pRR55 transfizierter HL-60 Zellen mit EGF zeigte im untersuchten Konzentrationsbereich von 0,1-50 µg/ml keinen Einfluss auf die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors (Abb. 19). EGF-Rezeptoren wurden auf monozytären Zellen (HL-60 und U 937) beschrieben (Eales-Reynolds et al., 2001; Taetle et al., 1991). Diese Angabe wurde im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht verifiziert.

Eine aktive Rolle von Prolaktin oder EGF an der durch Molke in unserem HL-60 Transfektionssystem beobachteten Stimulation des IE1/2-Enhancer/Promotors erscheint unwahrscheinlich, auch wenn ein genereller Einfluss von Prolaktin oder EGF auf den IE1/2-Enhancer/Promotor in anderen Zellsystemen damit nicht ausgeschlossen werden kann.

Abb. 19: Einfluss des Epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) auf die IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität in pRR55-transfizierten HL-60 Zellen.
HL-60 Zellen wurden transient mit pRR55 transfiziert und in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen EGF für 30 Stunden inkubiert. Dargestellt sind die Mittelwerte und Standardabweichungen der CAT-Expression relativ zur unbehandelten Kontrolle (“1“) aus drei unabhängigen Versuchen.


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31.07.2006