4 Diskussion

4.1 HCMV-Reaktivierung in stillenden Müttern und Übertragung auf Frühgeborene

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Infektionen mit HCMV sind die häufigste Ursache kongenitaler Virusinfektionen (Pass et al., 2001). Während sie in der Mehrzahl der Fälle asymptomatisch verlaufen, entwickeln 10 % der kongenital infizierten Neugeborenen eine symptomatische HCMV-Infektion mit zum Teil schweren Akutsymptomen (Petechien, Ikterus, Hepatosplenomegalie, Hypotonie, Krämpfe) und chronischen Komplikationen wie Hörverlust und mentalen Entwicklungsstörungen (Boppana et al., 1992; Pass et al., 1980; Peckham et al., 1991; Ramsey et al., 1991; Vochem et al., 2003). Das Risiko einer intrauterinen Virusübertragung auf das Kind ist bei Primärinfektion der Mutter während der Schwangerschaft dreifach höher (3 % der Fälle) als bei Reinfektion/Reaktivierung (1 %). Für Kinder HCMV-seronegativer Mütter besteht daher das größte Risiko für eine intrauterine Virusübertragung während der Schwangerschaft.

Mütter mit HCMV-seropositivem Antikörperstatus übertragen das Virus hingegen in hohem Maße postnatal auf das Neugeborene – hauptsächlich über infizierte Muttermilch (Asanuma et al., 1996; Bryant et al., 2002; Hamprecht et al., 2001; Mosca et al., 2001; Vochem et al., 2003). Eine effiziente HCMV-Reaktivierung des latenten Virus zu Beginn der Laktation in der Brust scheint dabei eine wichtige Rolle zu spielen(Bryant et al., 2002; Hamprecht et al., 2001; Numazaki et al., 1997). Der Mechanismus dieses Prozesses ist noch gänzlich ungeklärt. Reife Neugeborene erkranken nur sehr selten symptomatisch an einer postnatal akquirierten HCMV-Infektion, während das Risiko einer symptomatischen postnatalen HCMV-Infektion für sehr kleine Frühgeborene (Def. siehe Kap. 2.5.1.) deutlich erhöht ist (Hamprecht et al., 2001; Hamprecht et al., 2000; Maschmann et al., 2001). Ausgeprägte Neutropenien, Thrombozytopenien sowie im Vergleich zu nicht HCMV-infizierten Frühgeborenen ein deutlich längerer Sauerstoffbedarf wurden beschrieben (Kumar et al., 1984; Maschmann et al., 2001; Paryani et al., 1985; Yeager et al., 1983). Yeager beobachtete einen Zusammenhang zwischen HCMV-Infektionen und Entstehung einer Brochopulmonalen Dysplasie (BPD) bei Frühgeborenen. Obwohl in einer in unserem Institut durchgeführten Studie dieser Zusammenhang statistisch nicht belegt werden konnte, zeigte die Studie, dass HCMV-Infektionen ein deutlicher Risikofaktor für die Entstehung der BPD sind (Prösch et al., 2002 b).

Die erhöhte Rate an HCMV-Infektionen in Frühgeborenen dürfte damit im Zusammenhang stehen, dass das Immunsystem von sehr kleinen Frühgeborenen noch unzureichend entwickelt ist. Zudem gibt es Hinweise, wonach die mütterliche Leihimmunität bei Frühgeborenen weniger ausgebildet ist. Zwar werden insbesondere in den ersten Tagen nach Entbindung hohe Mengen sekretorisches Anti-HCMV IgA in die Milch ausgeschieden, doch dieses gelangt, anders als bei den meisten Tierspezies, nicht in den kindlichen Blutkreislauf (Dworsky et al., 1983; Hanson et al., 1998; Numazaki et al., 1997; Van de Perre et al., 2003). Systemisch neutralisierende IgG Antikörper der Mutter schützen das Neugeborene erst nach der 28. Schwangerschaftswoche (Bryant et al., 2002; Dworsky et al., 1983), und die im kindlichen Organismus gemessenen HCMV IgG-Titer fallen bei unreifen erkrankten Frühgeborenen deutlich schneller ab als in erkrankten reifgeborenen Kindern (Yeager et al., 1983).

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In unserer zweiteiligen prospektiven Studie mit 73 Müttern und ihren 89 frühgeborenen Kindern konnten wir zeigen, dass unabhängig vom Serostatus 66 % (48/73) der Mütter frühgeborener Kinder HCMV mit der Muttermilch ausschieden. Diese Prozentzahl entspricht in etwa der in Deutschland ermittelten HCMV-Seroprävalenz von 60-70 % der deutschen Bevölkerung (Döcke et al., 1994). Berücksichtigt man den HCMV-Serostatus der untersuchten Mütter, so bestätigte sich, dass eine Reaktivierung des Virus in nahezu allen seropositiven Müttern (95 %) stattfindet. Damit stimmen unsere Daten mit der bisher größten Studie von Hamprecht und Mitarbeiter in Tübingen (2001) überein. Hier wurde HCMV-DNAlaktia bei 50 % aller und 96 % der HCMV-seropositiven Mütter nachgewiesen. Studien aus Japan beschreiben eine teils niedrigere Inzidenz von DNAlaktia in 40-70 % aller und in 67-92 % der seropositiven Mütter (Asanuma et al., 1996; Hotsubo et al., 1994; Mosca et al., 2001; Yasuda et al., 2003). Im Unterschied zu unserer und der Tübinger Studie wurde in den japanischen Studien unfraktionierte Brustmilch in der PCR eingesetzt. Der Nachweis von HCMV-DNA aus unfraktionierter Brustmilch im Vergleich zu zellfreier Molke hat sich als weniger sensitiv herausgestellt (die untere Detektionsgrenze ist doppelt so hoch wie in zellfreier fettreduzierter Molke), da Lipid-Komponenten in der nativen Brustmilch die Taq-Polymerase hemmen können (Hamprecht et al., 1998 b). Bei gleichen Untersuchungsmethoden wäre bei der japanischen Bevölkerung sogar eine noch höhere Inzidenz von HCMV-Reaktivierung denkbar, da hier die HCMV-Seroprävalenz bis zu 90 % beträgt (Asanuma et al., 1996). In einigen Studien gelang es, in 30 – 60 % der Muttermilchproben seropositiver Mütter HCMV anzuzüchten (Ahlfors et al., 1999; Hamprecht et al., 2001; Hotsubo et al., 1994). Das zeigt, dass replikationskompetentes, infektiöses Virus in der Molke in zellfreier Form vorliegt. Für die im Vergleich zur PCR-Analyse höhere Nachweisgrenze der Virusanzucht kann neben der geringeren Sensitivität der Methode auch die Anwesenheit von neutralisierendem sekretorischem HCMV IgA und unspezifischeren antimikrobiellen Substanzen (z.B. Laktoferrin, Lysozym, Vitamin A) in der Milch verantwortlich sein. Sekretorisches HCMV-IgA kann milcheigenes HCMV neutralisieren (Alford et al., 1991). Laktoferrin hingegen behindert die Adsorption von HCMV an der Zielzelle (Harmsen et al., 1995). In der hier diskutierten Studie waren Versuche zur Virusanzucht aufgrund zu geringer Mengen an Muttermilch leider nicht möglich.

In den bisher veröffentlichten Studien wurde ausschließlich bei HCMV-seropositiven Müttern eine HCMV DNAlaktia und/oder Virolaktia beobachtet (Ahlfors et al., 1999; Asanuma et al., 1996; Hamprecht et al., 2001; Hotsubo et al., 1994; Mosca et al., 2001; Yasuda et al., 2003). In dem von uns untersuchten Kollektiv von Müttern beobachteten wir erstmals bei einer von 8 HCMV seronegativen Müttern eine HCMV-DNAlaktia. Interessanterweise übertrug diese Mutter das Virus postnatal auf ihr Neugeborenes, wodurch eine Kontamination der gewonnenen Milchproben zusätzlich ausgeschlossen werden kann. Der Nachweis von HCMV-DNA in HCMV-seronegativen Blutspendern betrug in einer vorangegangenen Studie unserer Arbeitsgruppe bei Verwendung der gleichen hochsensitiven PCR 5-10 % (Döcke et al., 1994). Larrson und Mitarbeiter (1998) wiesen bei 14 % der HCMV-seronegativen Blutspender HCMV-DNA in PBMCs nach. Wurden aus den PBMC die Blutmonozyten durch Adhärenz an Plastikoberflächen isoliert, erhöhte sich die Detektionsrate sogar von 14 % auf 55 %. In der Transplantationsmedizin werden seit längerem Virustransmissionen durch HCMV-seronegative Blutprodukte auf seronegative Empfänger berichtet (Miller et al., 1991) und in in vitroVersuchen wurde HCMV in PBMCs HCMV-seronegativer Spender reaktiviert (Soderberg-Naucler et al., 1997). Die allgemein zur HCMV-Diagnostik verwendeten ELISA wurden auf der Basis des Laborstammes AD169 entwickelt. Spezielle ELISA, die gegen Antigene klinischer Virusstämme gerichtet sind, zeigten in der Arbeit von Rabar (Rahbar et al., 2004)in 36 % HCMV-spezifische Antikörper im Blut zuvor seronegativ getesteter Blutspender. Diese Beobachtungen unterstreichen die Annahme, dass es einige HCMV-Träger gibt, die bei Infektion nicht serokonvertieren oder deren HCMV Antikörper mit den herkömmlichen ELISA (Medac, Sorin) nicht detektierbar sind.

HCMV Transmission auf das Frühgeborene wurde in unserer Studie bei 22 / 89 (24 %) der untersuchten Kinder durch wiederholten Nachweis viraler DNA in unterschiedlichen Proben nachgewiesen. Bei weiteren drei Frühgeborenen von zwei Müttern wurde eine pränatale HCMV-Infektion bestätigt. Unter Ausschluss dieser Kinder wurden 21 von 55 Frühgeborenen, die einem erhöhten Transmissionsrisiko durch die Mütter ausgesetzt waren (HCMV-Virolaktia und/oder --Seropositivität der Mutter), peri/postnatal infiziert. Daraus ergibt sich eine kumulative Transmissionrate von 38 %. Diese ist vergleichbar mit der Tübinger Studie (37 %), in der der Virusnachweis ebenfalls mittels PCR in zellfreier Molke erfolgte (Hamprecht et al., 2001). In zwei ähnlich aufgebauten japanischen Studien wurden kumulative Transmissionsraten von 10 % und 25 % bestimmt (Mosca et al., 2001; Yasuda et al., 2003). Diese geringeren Übertragungsraten sind darauf zurückzuführen, dass die Muttermilch in diesen Studien vor dem Füttern routinemäßig für mehrere Tage bei –20°C eingefroren wurde (Mosca et al., 2001; Yasuda et al., 2003), oder die Kinder prophylaktisch hochdosiert mit Hyperimmunglobulin behandelt wurden (Mosca et al., 2001; Yasuda et al., 2003). Sowohl in Tübingen als auch bei uns in der Neonatologie wurde die Milch vor Verabreichung lediglich für maximal 12 Stunden bei 4°-10°C gekühlt aufbewahrt.

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Eine immer wieder diskutierte Frage ist die Rolle von Muttermilch als Überträgermedium von HCMV auf das Frühgeborene. In unserer Studie wurden 21 der 22 infizierten Kinder (94 %) mit virushaltiger Milch gefüttert. Für 12 der 21 Kindern konnte eine postnatale Infektion nachgewiesen werden. Für sie ist eine Infektion über virushaltigen Muttermilch hoch wahrscheinlich. Bei einem weiteren postnatal infizierten Kind (eines Zwillingspaares) konnte über den gesamten Untersuchungszeitraum keine HCMV-DNAlaktia der Mutter festgestellt werden. Da der Serostatus der Mutter unbekannt war, konnte der genaue Übertragungsweg nicht geklärt werden. Interessanterweise blieb das mit der selben Milch gefütterte Geschwisterchen uninfiziert. Daher müssen in diesem Fall auch andere – von der Muttermilch und der Mutter unabhängige Übertragungswege- wie insbesondere nosokomiale Infektionen vermutet werden. Zwar wurden dem Frühgeborenen nur HCMV-seronegative Blutprodukte verabreicht, wie weiter oben bereits besprochen, können jedoch auch HCMV-seronegative Blutprodukte HCMV enthalten. Auch eine Infektion über engen körperlichen Kontakt und infizierten Speichel anderer Familienangehöriger oder des medizinischen Personals können nicht zweifelsfrei ausgeschlossen werden.

Bei 9 der HCMV-infizierten Kinder wurde HCMV-DNA bereits innerhalb der ersten beiden Lebenswochen im Urin nachgewiesen. Der Definition nach handelt es sich hierbei nicht mehr um postnatale Infektion, sondern perinatale oder asymptomatische pränatale Infektionen (Ho et al., 1991). Alle Mütter dieser 9 Kindern waren DNAlaktia positiv, also mit HCMV infiziert. Als weitere Infektionsquelle kommt neben Muttermilch der Kontakt mit kontaminierten Zervikalsekreten unter der Geburt in Frage. Allerdings wurden nur 3 dieser 9 Kinder vaginal entbunden, sodass eine Übertragung über infiziertes Zervikalsekret theoretisch möglich gewesen wäre. Bei allen 9 Kindern war die Urinprobe des ersten Lebenstages HCMV-negativ. Zusätzlich konnte von 5 dieser Kinder Plazentagewebe und Nabelschnurblut per PCR auf HCMV-DNA getestet werden. Alle Proben waren negativ. Eine asymptomatische intrauterine HCMV-Infektion kann damit zwar nicht mit absoluter Sicherheit ausgeschlossen werden, erscheint aber unwahrscheinlich. Der genaue Übertragungsweg für diese 9 Kinder bleibt ungeklärt.

Zusammengefasst scheint Muttermilch in unserer Studie nicht die einzige, wohl aber die häufigste und wichtigste Quelle von HCMV bei der Übertragung auf das Neugeborene zu sein. Stillen kommt damit eine zentrale Bedeutung in der HCMV-Übertragung auf das Neugeborene zu. In einer prospektiven Studie untersuchte Stagno und Mitarbeiter (1980) 28 reifgeborene Kinder von Müttern mit Virolaktia. Stillen führte bei 11 von 19 (58 %) der Kinder zu einer HCMV-Infektion innerhalb der ersten 6 Lebensmonate, während sich keines der 9 (0 %) mit der Flasche ernährten Kinder infizierte. Dworsky und Mitarbeiter (Dworsky et al., 1983) zeigten, dass eine längere Stilldauer mit einer erhöhten Transmissionsinzidenz der 58 reifgeborenen Kinder korreliert. Im Bezug auf sehr kleine Frühgeborene konnte die Tübinger Studie hingegen zeigen, dass nicht die Dauer des Stillens, sondern die Höhe der Viruslast und das frühe Auftreten von HCMV in der Milch die entscheidenden Risikofaktoren für eine Virustransmission sind (Hamprecht et al., 2001; van der Strate et al., 2001). Ein direkter Beweis für die Virusübertragung durch Muttermilch ergab die genomische Analyse der Viren aus der Muttermilch und aus dem Urin des Kindes. Sie zeigten gleiche Virusvarianten bei Mutter und Kind (Hamprecht et al., 2001; Peckham et al., 1987; Prix et al., 1998).

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Der genaue Infektionsweg, der zur Infektion durch infizierte Muttermilch führt, ist unklar. HCMV kann an eine Vielzahl von Zelltypen adsorbieren und diese infizieren. Als Rezeptor für die Virusadsorption wird der Epidermale Wachstumsfaktor (EGF)- Rezeptor diskutiert (Wang et al., 2003). Zusätzlich könnte die Bindung des HCMV-Hüllproteine gB an Heparansulfat Proteoglykane beim Adsorptionsprozess eine CO-Rezeptorfunktion haben (Compton et al., 1993). Aufgrund eines noch ungeklärten Post-Penetrationsblocks ist eine produktive HCMV-Replikation jedoch nur in wenigen Zelltypen möglich, wie Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, glatten Muskelzellen, Hepatozyten, Granulozyten und Monozyten/Makrophagen (Kahl et al., 2000; Plachter et al., 1996; Sinzger et al., 1996). Kürzlich wurde gezeigt, dass HCMV auch Langerhans’sche Zellen der Mukosa infizieren kann (Hertel et al., 2003). Epidemiologische Daten und Befunde aus histopathologischen Präparaten sprechen für einen Viruseintritt über muköse Epithelzellen der Atemwege, des Gastrointestinal (GI)- oder Genitaltraktes (Sinzger et al., 1996). Neben Epithelzellen müssen bei der HCMV-Übertragung aber noch weitere Zelltypen als Eintrittspforten existieren. Anders wäre eine hämatogene Infektion (intrauterin oder nach Blutransfusionen) nicht zu erklären. Für selbständig trinkende Kinder ist, wie beim Erwachsenen auch, eine Infektion über die Mund- und Rachenschleimhaut möglich. Die Frühgeborenen in unserer Studie wurden jedoch über eine Magensonde unter Umgehung der Mund-, Rachen- und ösophagealen Schleimhaut mit Muttermilch ernährt. HCMV ist als behülltes Virus äußerst empfindlich gegenüber niedrigen pH-Werten und wird in der Regel während der Magenpassage inaktiviert. Bei Frühgeborenen ist im Unterschied zu Reifgeborenen der pH-Wert des Magens allerdings erhöht, sodass eine Übertragung über den GI-Trakt möglich wäre. Bei diesen Kindern könnte zellfreies HCMV die Magen-Passage überleben und über die Schleimhäute des tieferen GI-Traktes direkt in den Körper gelangen (van der Hoof et al., 1994).

Alternativ ist eine Infektion über infizierte Milchzellen denkbar. Milch-Makrophagen sind stark mit Lipiden beladen und hierdurch vor Säurezersetzung geschützt (Eglinton et al., 1994). HCMV könnte in produktiv infizierten Langerhans’schen Zellen die Magenpassage überleben und über Invasion in die resorbierende Schleimhaut des kindlichen GI-Traktes in den Organismus gelangen (Ogra et al., 1977; Xanthou et al., 1997).

Postnatale HCMV-Infektionen führen bei reifgeborenen Kindern äußerst selten zu symptomatischen Krankheitsverläufen (Vochem et al., 2003). Sehr kleine Frühgeborene befinden sich durch die Unreife ihres eigenen Immunsystems und des fehlenden Antikörperschutzes von der Mutter vor Ende der 28. Schwangerschaftswoche hingegen in einer Art immunkompromitierten Zustand. Sie sollten deutlich anfälliger für HCMV-Infektionen mit symptomatischen Verläufen sein. Wir konnten in unserer Studie bei 2 der 9 (22 %) postnatal infizierten Kinder ein sepsisartiges Krankheitsbild bzw. eine Hepatitis mit Cholestase-Ikterus beobachten, die beide unter Ganciclovir Therapie ausheilten und für die keine andere Ursache als die HCMV-Infektion gefunden werden konnte. In der Tübinger Studie wiesen vergleichsweise 4 von 33 (12 %) infizierten sehr kleinen Frühgeborenen schwere sepsisartige Krankheitsbilder mit Apnoe, Bradykardie und petechialen Blutungen auf (Maschmann et al., 2001). Detaillierte klinische Untersuchungen fanden sogar bei 6/18 Frühgeborenen (Yeager et al., 1983) und 16/33 sehr kleinen Frühgeborenen (Maschmann et al., 2001) zumindest ein Symptom (wie z.B. Neutropenie, Thrombozytopenie), das unspezifisch auch einer HCMV-Infektion zugeschrieben werden könnte. Die Studien aus Japan berichten hingegen in keinem einzigen Fall von symptomatischen Krankheitsverläufen peri- oder postnatal HCMV infizierter Frühgeborener (Asanuma et al., 1996; Mosca et al., 2001; Sharland et al., 2002; Yasuda et al., 2003). Einschränkend muss auch hier die prophylaktische Gabe von Immunglobulinen in Japan beachtet werden.

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Bei genauerer Analyse der klinischen Parameter der von uns untersuchten Frühgeborenen wurde deutlich, dass HCMV-Infektionen den akuten Krankheitsverlauf von Frühgeborenen in der Neonatalperiode negativ beeinflussen. So zeigte sich bei HCMV-infizierten im Vergleich zu uninfizierten Frühgeborenen eine erhöhte Inzidenz von „Bronchopulmonaler Dysplasie2“ (Prösch et al., 2002 b), „Respiratory Dystress Syndrome“ (64 % vs. 45 %), Retinopathia praematuorum (32 % vs. 18 %) und Neonatalinfektion (50 % vs. 39 %). Dabei ist nicht klar, ob die erhöhten Inzidenzen von Bronchopulmonaler Dysplasie, Respiratory Dystress Syndrome und Neonatalinfektion kausal mit der HCMV-Infektion zusammenhängen. Es ist aber davon auszugehen, dass sie einen zusätzlichen Risikofaktor für diese Erkrankungen darstellen, da bei allen Kindern das Virus in Tracheal-oder Pharyngealsekreten nachgewiesen werden konnte. Denkbar ist ebenso, dass der bereits eingeschränkte Gesundheitszustand der Frühgeborenen die HCMV-Infektion erst ermöglicht und nachfolgend den Krankheitsverlauf verschlechtert hat. Experimentelle Untersuchungen unterstützen die Hypothese, dass eine HCMV-Infektion bei Frühgeborenen einen negativen Einfluss auf die frühkindliche Lungenreifung hat. So supprimiert HCMV in vitro die Expression des Epidermalen Wachstumsfaktor Beta (EGF-β) -Rezeptors auf embryonalen Lungenfibroblasten (Beutler et al., 2003; Fairley et al., 2002). Durch Bindung von EGF an den EGF-Rezeptor auf Lungenfibroblasten wird eine Signaltransduktionskaskade in Gang gesetzt, die im Zusammenspiel mit Typ-II Alveolarzellen zur Reifung der Lunge und Entwicklung des Surfactantsystems beiträgt (Klein et al., 1995). EGF und der EGF-Rezeptor sind besonders für die Synthese von Surfactant Protein A verantwortlich- einem wichtigen Faktor der innaten Immunabwehr-. EGF-Rezeptor defiziente Mäuse zeigten eine reduzierte Differenzierung des Alveolarepithels und eine inadäquate Ventilation der Alveolen (Miettinen et al., 1995; Miettinen et al., 1997).

EGF wird von Müttern Frühgeborener in besonders hohem Maße in die Milch ausgeschieden (Dvorak et al., 2003), womöglich als Kompensationsmechanismus, um die Lungenreifung ihrer unreifen Kinder zu beschleunigen. Über eine Blockierung des EGF-Signalweges und damit einhergehenden Hemmung der SP-A Produktion könnten HCMV-Infektionen eine verzögerte Lungenreifung in infizierten Frühgeborenen verursachen. Dies würde die Häufung respiratorischer Komplikationen (längere Beatmungszeit, Bronchopulmonale Dysplasie, Respiratory Dystress Syndrome) der infizierten Kinder in unserer Studie erklären.

Neben einer negativen Beeinflussung des akuten Krankheitsverlaufes Frühgeborener durch HCMV-Infektion, wären insbesondere bei sepsisartigen Krankheitsbildern mit BPD und Lungenschädigung der Frühgeborenen auch Langzeitschäden zu erwarten. Fokussierend auf Entwicklungsstörungen und Hörbeeinträchtigungen zeigte das Flow-up der sehr kleinen Frühgeborenen aus der Tübinger Studie über 2- 4,5 Jahren zunächst keine Auffälligkeiten in der Gruppe der früh postnatal mit HCMV infizierten Kinder im Vergleich zu den nicht infizierten Frühgeborenen (Vochem et al., 2003; Vollmer et al., 2004).

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Insgesamt ist davon auszugehen, dass es infolge peri/postnataler HCMV-Infektionen bei mindestens 10 % der infizierten sehr kleinen Frühgeborenen zu schweren symptomatischen Erkrankungen (in unserer Studie 2/22 = 9 %; Tübinger Studie 4/33 = 12 %) mit der Gefahr bleibender chronischer Schäden kommt. Vor diesem Hintergrund wurde in Deutschland die Diskussion entfacht, Muttermilch für frühgeborene Kinder zur Virusinaktivierung vorzubehandeln. Durch geeignete Inaktivierungsverfahren muss hierbei einerseits HCMV in der Milch effektiv und sicher inaktiviert werden, gleichzeitig aber sollen wichtige Inhaltsstoffe (immunologische Faktoren, Vitamine, Enzyme etc.) nicht zerstört werden. Während Einfrieren der Milch das Virus nicht effektiv genug inaktiviert (Bryant et al., 2002; Dworsky et al., 1982; Maschmann et al., 2001; Maschmann et al., 1999), führt Holder-Pasteurisierung (63°/30 min) neben effektiver Inaktivierung von HCMV auch zur Zerstörung von wichtigen Immunglobulinen und Lymphozyten (Dworsky et al., 1982; Goldblum et al., 1984). Lediglich Kurzzeitpasteurisierung (72°C, 10 Sek.) scheint beide geforderten Kriterien zu vereinen und ist gegenwärtig in der Überführungsphase in die klinische Praxis. Allerdings sind die hierbei nötigen Geräte zur Zeit noch nicht kommerziell verfügbar (Hamprecht et al., 2001).

In einem kürzlich publizierten Konsensuspapier der Ernährungskommission der Österreichischen Gesellschaft für Kinder und Jugendheilkunde wurde vorgeschlagen, von allen Müttern Frühgeborener < 1500 Gramm oder <32. SSW den HCMV-Serostatus zu erheben. Ist die Mutter HCMV IgG-negativ könne die Muttermilch ohne Bedenken gefüttert werden, ist sie hingegen HCMV IgG-positiv soll das Kollostrum verworfen und die Muttermilch bis zur vollendeten 34. SSW einer Holderpasteurisation unterzogen werden (Zwiauer et al., 2003). In unserer Studie konnten wir im Fall einer seronegativen Mutter virale DNA in der Muttermilch nachweisen. Unter Berücksichtigung früherer Untersuchungen von Blutspendern ist anzunehmen, dass die Dunkelziffer HCMV-infizierten Mütter, bei denen es zu keiner Serokonversion gekommen ist, und Müttern, deren Serostatus mit den herkömmlichen ELISA falsch negativ bestimmt wurde, 5-10 % beträgt (s.o.). Der mütterliche Serostatus allein erscheint daher nicht auszureichend, gefährdete Kinder sicher zu identifizieren. Wir plädieren in Übereinstimmung mit Neonatologen der Charité (Prof. R.R. Wauer) daher dafür, die Milchproben aller Mütter (unabhängig vom Serostatus) von Kindern mit einem Geburtsgewicht unter 1500 Gramm und/oder unter der 32. SSW bis zur 6. Lebenswoche zu pasteurisieren. Dieser Zeitraum erscheint ausreichend, da der Gipfel der DNAlaktia und damit das höchste Infektionsrisiko um den 40. Tag nach der Geburt erreicht ist und danach stetig sinkt (Hamprecht et al., 2001). Einzig ausgenommen sollten Frühgeborene sein, die nicht über eine Magensonde oder Flasche ernährt werden müssen, sondern direkt an der Brust gestillt werden können. In diesen Fällen ist individuell zwischen dem Risiko der HCMV-Infektion des Kindes und der besonderen emotionalen Bedeutung des Stillens für die Mutter-Kind-Beziehung abzuwägen. Um Risikofaktoren für das Auftreten symptomatischer postnataler HCMV-Infektionen genauer zu definieren und die ersten Leitlinien zur Muttermilchernährung gefährdeter Frühgeborener zu evaluieren und weiter zu entwickeln, sind weitere Studien unter Einbeziehung größerer Patientengruppen notwendig. Nur so können Frühgeborene vor schädigenden HCMV-Infektionen durch Muttermilch bewahrt werden, ohne ihnen jedoch in unnötigem Maße die Muttermilch mit ihren schützenden und stärkenden Einflüssen vorzuenthalten.

4.2 Einfluss von Muttermilch auf die Reaktivierung und Replikation von HCMV

Die Forschungsergebnisse der letzten Jahre bringen die HCMV-Reaktivierung in Zusammenhang mit 3 grundlegenden Mechanismen (vgl. Kap. 1.6.):

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Die Mechanismen, die zu einer HCMV-Reaktivierung zu Beginn der Laktation führen sind bisher nicht untersucht. Die oben beschriebenen allgemeinen Mechanismen treffen jedoch auch für das Ende der Schwangerschaft zu. Insbesondere die Änderungen des mütterlichen Immunsystems während der Schwangerschaft, der mit Stress verbundene Geburtsvorgang sowie die tiefgreifenden hormonellen Umstellungen nach der Geburt wären als Ursache der HCMV-Reaktivierung in latent infizierten Zellen zu Beginn der Laktation denkbar. Die Population an T-Helferzellen ist bei Müttern am Ende der Schwangerschaft im Verhältnis zur Zahl der T-Suppressorzellen reduziert (Numazaki et al., 1997). Dies könnte die Aktivität der für die virale Abwehr wichtigen Natürlichen Killerzellen derart beeinflussen werden, dass es zu einer lokalen Virusreaktivierung in einem Milieu kommt, das weitere Vorteile für die HCMV- Replikation und -Reaktivierung bietet.

Die HCMV-Reaktvierung während der Laktation scheint ein lokal auf die Brust begrenzter Prozess zu sein. Bei lediglich 2 von 13 Müttern mit nachgewiesener DNAlaktia konnte in unserer Studie auch eine systemische HCMV DNAemia nachgewiesen werden (vgl. Kap. 3.1.2.). Eine dieser beiden war die einzige von 13 untersuchten Müttern, bei der neben einer DNAlaktia auch eine HCMV IgM-Serokonversion als Zeichen einer akuten systemischen Infektion infolge Reaktivierung beobachtet wurde. Auch in anderen Studien wurde bei nachgewiesener DNAlaktia und/oder Virolaktia keine IgM-Serokonversion der Mütter beobachtet (Asanuma et al., 1996; Hamprecht et al., 2001; Hotsubo et al., 1994). In älteren Untersuchungen hingegen wurde um den Geburtstermin herum infektiöses HCMV nicht nur aus Milch sondern auch aus 5,9 % (18/305) mütterlicher Urinproben und 13,4 % (35 / 261) Zervikalsekreten isoliert (Reynolds et al., 1973; Stagno et al., 1980). Unabhängig vom Vorhandensein von Virus in der Milch wurden in einer Studie aus Brasilien HCMV-positive Zervikalsekrete bei 10 % (4 / 40) der schwangeren Frauen gefunden (Spano et al., 2004). Hamprecht (Hamprecht et al., 2001) konnte in Deutschland allerdings bei keiner von 73 Müttern mit DNAlaktia virale DNA in mütterlichen Rachenabstrichen oder Urinproben nachweisen. Damit sind die Anzeichen einer systemischen HCMV-Reaktivierung während der Schwangerschaft oder Laktation gering.

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Bisher sind beim Menschen lediglich Vorläuferzellen der Monozyten/Makrophagen im Knochenmark als HCMV Trägerzellen und Ort der Latenz definitiv nachgewiesen (Hahn et al., 1998; Kondo et al., 1996; Mendelson et al., 1996). Daneben unterstützen auch reife Monozyten/Makrophagen, Fibroblasten, Endothel- und Epithelzellen eine HCMV-Replikation in vivo (Plachter et al., 1996). Folgt man der Hypothese einer lokalen Reaktivierung von HCMV in der Brust, so könnte das Virus einerseits über die aus dem mütterlichen Blutkreislauf ausgewanderten latent infizierten Monozyten/Makrophagen das Brustgewebe erreichen. Ein bestimmtes Milieu (virusstimulierende Substanzen, Schutz vor Immunabwehr o.ä.) könnte eine lokale HCMV-Reaktivierung und -Vermehrung in den eingewanderten Monozyten/Makrophagen begünstigen. Das Virus wird in der Milch häufiger zellfrei als zellassoziiert gefunden (Asanuma et al., 1996; Hamprecht et al., 1998 a; Hamprecht et al., 1998 b). Die Fraktion der Milchzellen zu Beginn der Laktation besteht aus 30-62 % Makrophagen, 35-60 % Granulozyten und 5-27 % Lymphozyten (Eglinton et al., 1994; Goldman et al., 2002). Der genaue Leukozytentyp, in dem das zellassoziierte Virus in der Milch auftritt, ist bisher nicht eindeutig identifiziert (Hamprecht et al., 2000).

Ein weiteres Virus, das in hohem Maße in die Milch ausgeschieden wird und dabei das gestillte Kind infizieren kann, ist das Humane Immunodeficiency Virus (HIV). In Untersuchungen zum Mechanismus der HIV-Migration in die Brustdrüsen, ist man auf eine Vielzahl intestinaler „homing marker“ auf HIV-infizierten Lymphozyten gestoßen. Eine zielgerichtete Wanderung von Lymphozyten, die das Virus von mukösen Zellen des GI-Traktes aufnehmen und über eine enteromammilläre Achse in die Brust verschleppen, wird diskutiert (Goldman et al., 2002; Kourtis et al., 2003). Auf diesem Wege könnten insbesondere Epithelzell-adaptierte HIV-Stämme des GI-Traktes -und in Analogie vielleicht auch HCMV-Stämme- die Brust erreichen. Die GI-Adaptation von HIV erleichterte in vivo die produktive HIV-Infektion von Brustepithelzellen (Toniolo et al., 1995). Dies könnte auch bei der Infektion des Kindes über Zellen des GI-Traktes eine begünstigende Rolle spielen. Allerdings findet man HIV- im großen Gegensatz zu HCMV- fast ausschließlich zellassoziiert und nicht als freies Virus in der Brustmilch.

Neben der Einwanderung latent infizierter Monozyten/Makrophagen-Vorläuferzellen in die Brust, wäre auch denkbar, dass Zellen der Brustdrüse (z.B. epitheliale Drüsenzellen) ein weiterer bisher unbekannter Latenzort von HCMV beim Menschen darstellen. Die sich ändernden Bedingungen im lokalen Milieu der Brust während der Laktation könnten zur Reaktivierung von latentem HCMV in epithelialen Drüsenzellen führen, in denen es daraufhin zur massiven Virusproduktion kommt.

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Der Zeitpunkt des ersten HCMV-Nachweises in der Brustmilch weist darauf hin, dass die Virusreaktivierung in direktem Zusammenhang mit der Produktion von Milch steht. In Vormilch (Kollostrum), die in den ersten 3 Tage nach Entbindung gebildet wird, wurde keine HCMV-DNA nachgewiesen (Asanuma et al., 1996; Hotsubo et al., 1994; Mosca et al., 2001; Yasuda et al., 2003). In unserer Studie war virale DNA im Durchschnitt erstmalig in Milchproben des 7. Tages (± 2,6) der Laktation detektierbar. Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit den Beobachtungen von Yasuda (Yasuda et al., 2003) in der 2.Woche post partum und Hamprecht (Hamprecht et al., 2001) in der 3. Woche post partum. Die Viruslast in der Milch steigt zunächst drastisch an und erreicht im Mittel in der 3. bis 6. Woche der Laktation ihren Gipfel (ebenda). Quantitative PCR-Untersuchungen haben gezeigt, dass sich zu diesem Zeitpunkt 104 –106 HCMV-DNA Kopien pro ml in der Milch befinden (van der Strate et al., 2001; Vochem et al., 1998; Yasuda et al., 2003). Danach sinkt die Viruslast kontinuierlich über einen langen Zeitraum ab, Virus ist aber auch nach mehreren Monaten noch nachweisbar (ebenda, eigene Untersuchungen). Die hohe Effektivität der HCMV-Reaktivierung während der Laktation (95 % HCMV-seropositiven Mütter scheiden Virus in der Muttermilch aus) erhebt die Frage, ob es in der Brustdrüse zur vermehrten Produktion von Substanzen kommt, die die Reaktivierung und Replikation von HCMV in den potentiellen Targetzellen (Monozyten/Makrophagen, Milchzellen) begünstigen bzw. stimulieren.

Aus der Literatur gibt es Hinweise, dass sich in der Muttermilch eine Vielzahl von Substanzen befinden, für die antivirale oder antimikrobielle Wirkung in vitrobeschrieben wurde (Lönnerdal et al., 2003; Portelli et al., 1998). In Standard-Plaque-Tests führte die Vorinkubierung von HELF mit nativer Milch vor HCMV-Infektion in 2 von 3 Proben zu einer deutlichen Verringerung der HCMV-Infektion (Clarke et al., 2000). Analog bewirkten die in der Muttermilch nachgewiesenen Substanzen Laktoferrin, Monolaurin und Vitamin A eine Hemmung der Infektion von HELF mit HCMV-AD169 in vitro(Clarke et al., 2000; Harmsen et al., 1995; Isaacs et al., 2000; Portelli et al., 1998; Tanaka et al., 1984 a). Als Mechanismus für den antiviralen Effekt diskutieren die Autoren die Zerstörung der HCMV-Hülle durch antivirale Milchlipide (Clarke et al., 2000), die Virusneutralisierung durch spezifische IgA-Immunglobuline (Alford et al., 1991) und die Blockierung von Heparansulfat- einem zellulären Ko-Rezeptor für HCMV (Harmsen et al., 1995; Wang et al., 2003). Der antivirale Effekt in diesen Experimenten war umso geringer, je kürzer die HELF-Kulturen mit Laktoferrin oder nativer Milch vorinkubiert wurden. Bei Zugabe von Laktoferrin zum Zeitpunkt der Infektion war die hemmende Wirkung gänzlich aufgehoben (Harmsen et al., 1995). Die beobachtete Schutzwirkung scheint damit auf der Hemmung der Virusadsorption durch milcheigene Stoffe zu beruhen. Die hohe Inzidenz von DNAlaktia und Virolaktia, sowie die beschriebenen Transmissionsraten auf gestillte Kinder (siehe oben) zeigen, dass diese Substanzen in vivo allerdings nicht in der Lage sind, HCMV in der Milch effizient zu inaktivieren und die Übertragung von HCMV zu verhindern. Entgegen den Erwartungen korrelieren hohe Laktoferrinkonzentrationen in der Milch nicht mit geringeren HCMV-Transmissionsraten auf das Neugeborene (van der Strate et al., 2001).

Andere in vitro Untersuchungen belegen, dass verschiedene milcheigene Stoffe die HCMV-Replikation sogar begünstigen könnten. So führte die Zugabe der in hoher Konzentration in der Muttermilch vorhandenen Stoffe wie Sialyl-Laktose, Glukokortikoiden oder Prostaglandin E2 und F2α auf AD-169 infizierte HELF zu einer deutlich gesteigerten HCMV-Vermehrung (Clarke et al., 2000; Portelli et al., 1998; Tanaka et al., 1984 a; Tanaka et al., 1984 b). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der direkte Einfluss von zellfreier, fettreduzierter menschlicher Molke auf die HCMV-Replikation in vitro in HELF unabhängig vom Adsorptionsprozess untersucht. In diesen Infektionsexperimenten zeigte sich, dass Molke die HCMV-Replikation im Plaque-Test um das 1,7- bis 2,6-fache erhöht (vgl. 3.2.1.). Der replikationssteigernde Effekt von Molke korrelierte mit einer erhöhten Synthese der Immediate Early Proteine IE1 und IE2 (vgl. 3.2.2.). Gleiche Molkeproben ergaben vergleichbare Stimulierungsraten sowohl der Replikation des Virus als auch der IE1 und IE2 Protein-Synthese.

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Die HCMV Immediate Early Proteine IE1 und IE2 werden im Prozess der HCMV-Reaktivierung aus der Latenz sowie im produktiven Replikationszyklus als erste virale Proteine unabhängig von einer zellulären de-novo Proteinsynthese exprimiert (Ho M, 1991; Meier und Stinski, 1996). Sie regulieren die Transkription nachgeschalteter Early (β) und Late (γ) Gene, wobei erste vorwiegend viruspezifische Enzyme und letzte virale Strukturproteine kodieren (Mocarski et al., 2001). Zugleich besitzen IE1 und IE2 autoregulative Aktivität, indem sie die weitere Expression des gemeinsamen IE-Lokus positiv (IE1) oder negativ (IE2) beeinflussen (Cherrington et al., 1991; Fortunato et al., 1999; Malone et al., 1990). Durch Mutationsanalysen wurde gezeigt, dass die Expression der IE1 und IE2 Proteine essentiell für die Initiation und Aufrechterhaltung der Virusreplikation ist (Chang et al., 1989; Gawn et al., 2002; Greaves et al., 1998; Marchini et al., 2001; Mocarski et al., 1996; Wathen et al., 1982).

Die Expression der IE1 und IE2 Proteine wird durch einen sehr starken IE-Enhancer/Promotor kontrolliert (Boshart et al., 1985). Distal des Enhancers liegt eine Modulatorregion (Abb. 3). Während die Deletion der Modulatorregion keine Auswirkung auf die virale Replikation in verschiedenen Zelltypen zeigte (Meier et al., 1997), ist der distale Enhancer absolut essentiell für die IE-Genexpression und bedingt die Effizienz der Virusreplikation (Isomura et al., 2003; Meier et al., 2000). Die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotor wird bestimmt durch die an ihn bindenden Transkriptionsfaktoren (Meier et al., 1996). Dem IE1/2-Enhancer/Promotor kommt daher eine Schlüsselfunktion im produktiven Replikationszyklus und im Prozess der HCMV Reaktivierung zu.

In transienten Transfektionsexperimenten mit monozytären Zelllinien (einer der potentiellen Targetzellen für HCMV in der laktierenden Brust) konnten wir zeigen, dass Molkeproben von 10 verschiedenen Müttern frühgeborener Kinder die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors konzentrationsabhängig stimulieren. Dieser Effekt war in beiden getesteten monozytären Zelllinien, HL-60 und THP-1, identisch (siehe Kap. 3.3.1.) und damit unabhängig vom Differenzierungsgrad der Zellen. Die absolute Höhe der Stimulation variierte jedoch zwischen Molkeproben verschiedener Mütter und änderte sich im Verlauf der Laktation. Molkeproben aus den ersten beiden Wochen nach der Geburt zeigten signifikant höhere Effekte auf die Aktivität des IE1/2-Enhancer/Promotors als Molkeproben der 3.-5. Woche nach Geburt. Der Peak der stimulierenden Wirkung von Molke auf den HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor in der 1.-2. Woche geht somit dem Peak der Virusausscheidung in Muttermilch voran. Die höchste Viruslast in der Brustmilch wurde 3-6 Wochen nach Beginn der Laktation beobachtet (Van de Perre et al., 2003; Vochem et al., 1998; Yasuda et al., 2003). Da HCMV ein langsam replizierendes Virus ist, dessen Replikationszyklus bei optimalen Bedingungen 2-3 Tage braucht (Mocarski et al., 2001) , ist die Verzögerung von 1-2 Wochen zwischen Peak der stimulierenden Aktivität und höchster Viruslast gut erklärbar. Untersuchungen an Transplantierten, Sepsis- und Myokardinfarktpatienten mit hoher Inzidenz von HCMV-Reaktivierungen haben ähnlich gezeigt, dass zwischen dem Peak des TNFα- oder Katecholaminspiegels im Blut und dem ersten Nachweis der HCMV-Antigenämie/DNAämie etwa 10 Tage liegen (Döcke et al., 1994; Fietze; et al., 1994; Prösch et al., 2000 a). Die beobachtete Kinetik der molke-abhängigen Stimulierung der IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität könnte mit der Zusammensetzung der Milch zusammenhängen, die sich insbesondere innerhalb der ersten Wochen der Laktation verändert. Frühe Milch enthält höhere Anteile an Proteinen, Oligosacchariden und Milchzellen, im Vergleich zu später Milch, in der höhere Laktose- und Fettanteile gemessen werden (Kunz et al., 1999; Lönnerdal et al., 2003).

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Tab. 6: Inhaltsstoffe humaner Muttermilch
(Gupta et al., 1983; Kunz et al., 1999; Lönnerdal et al., 2003; Rodriguez-Palmero et al., 1999; Wallace et al., 1997)

Hormone

Immunmodulatoren

 

  • Prolaktin

 

  • Sekretorisches IgA

 

  • Glukokortikoide

 

  • Oligosaccharide

 

  • Progesteron

 

  • Fettsäuren

 

  • Östrogen

 

  • Interleukine: IL1-β; IL-6,
  • IL-8, IL-10, TNFα, TGF-α, β

Wachstumsfaktoren

 

  • Vitamine A, E, D, K

 

  • Epidermaler Growth Factor-β (EGF-β)

 

  • Prostaglandine E2, F2α

 

  • Gonadotropin – Releasing Hormon (Gn-RH)

 

  • Laktoferrin

 

  • Insulin-like growth factor (IGF-1)

 

  • RANTES

 

  • Erythropoietin (EPO)

 

  • Prostaglandine E2, F2α

 

  • Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF)

Enzyme

   

  • α1-Antitrypsin

Proteine

 

  • Lipasen

 

  • Caseine β, κ

 

  • Lysozyme

 

  • α-Lactalbumin

 

  • Bile salt-stimualted lipase

 

  • Serum- Albumin

 

  • Amylase

Dabei enthält Muttermilch neben den für die Ernährung des Kindes notwendigen Substanzen über 45 bioaktive Faktoren, darunter Enzyme, Hormone, Wachstumsfaktoren und Zytokine, die Einfluss auf die von uns beobachteten Effekte nehmen könnten. In Tabelle 6 sind nur einige dieser bereits bekannten Inhaltsstoffe aufgezeigt, während die Liste neu entdeckter Substanzen stetig wächst (Bianco et al., 2001; Michalsky et al., 2002; Michie et al., 1998; Takahata et al., 2001).

Aus klinischen und experimentellen Untersuchungen in unserer Arbeitsgemeinschaft ist bekannt, dass systemische Entzündungen (insbesondere TNFα) und Stress (vermittelt über Katecholamine und Glukokortikoide) eine Reaktivierung von HCMV auslösen können (Archimandritis et al., 1992; Fietze et al., 1994; Glaser et al., 1985; Prösch et al., 2002 b; Prösch et al., eingereicht). Hierbei binden bestimmte Transkriptionsfaktoren (NFκB für TNFα, CREB/ATF für Katecholamine) bzw. der intrazelluläre Glukokortikoidrezeptor (GR) direkt an repetitive Elemente im HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor und erhöhen seine Aktivität (siehe Kap. 1.4.2).

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Glukokortikoide sind besonders in der frühen Phase der Laktation in der Muttermilch erhöht (Kulski et al., 1981; Patacchioli et al., 1992). TNFα aber auch der lösliche TNFα-Rezeptor wurden in unterschiedlichem Maße in der Muttermilch nachgewiesen (Buescher et al., 2001). Durch den mit der Geburt einhergehenden Stress könnten auch Katecholamine vermehrt in die Muttermilch ausgeschieden werden.

Mithilfe von Promotormutanten, die entweder nicht mehr den GR (p17mut3), NFκB (p18mut4) oder CREB/ATF (p19mut5) binden können, prüften wir, ob diese Transkriptionsfaktoren in die stimulierenden Effekte von Molke auf den HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor involviert sind um dann Rückschlüsse auf die Mediatoren der HCMV (Re-)aktivierung während der Laktation ziehen zu können.

Bei 4 von 6 getesteten Molkeproben verschiedener Mütter konnte in unseren Versuchen gezeigt werden, dass die Deletion der GREs (p17mut3) den stimulierenden Einfluss der Molke auf die Aktivität des IE 1/2- Enhancer/Promotors deutlich verringert (vgl. 3.4.1.). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass Glukokortikoide in der Muttermilch eine der Substanzen sein könnten, welche die Stimulation des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor verursachen. Diese Hypothese wurde gestützt durch Experimente, in denen durch Zugabe des Antiglukokortikoids RU-486 zu pRR55-transfizierten HL-60 Zellen die stimulierende Wirkung von Molke ebenfalls gesenkt werden konnte (vgl. 3.4.2.). Allerdings war die Reduktion des stimulierenden Effektes von Molke auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor in beiden Versuchsansätzen inkomplett, sodass davon auszugehen ist, dass Glukokortikoide nur ein Faktor in einem multifaktoriellen Prozess der Promotorstimulation durch Molke sind.

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Die drei im IE1/2-Enhancer/Promotor enthaltenen 17 bp Sequenzmotive wurden als Bindungsort für den Transkriptionsfaktor „Nuklear Faktor-1“ (NF-1) beschrieben (Niller et al., 1991). Kürzlich identifizierten unsere Arbeitsgemeinschaft innerhalb dieser 17 bp Sequenz ein „glucocorticoid responsive element“ (GRE) (Prösch et al., 2001). Mittels EMSA wurde eine Bindung des Glukokortikoidrezeptors (GR) an diese GRE bestätigt und gezeigt, dass NF-1 und der GR gleichzeitig am 17 bp Motiv des IE1/2-Enhancer/Promotors binden können. Natürliche und synthetische Glukokortikoide (z.B. Kortisol, Dexamethason) binden an den durch die Hitzeschockproteine hsp90 und hsp56 inaktivierten intrazellulären Glukokortikoidrezeptor und bewirken dessen Aktivierung (Pratt et al., 1993; Smith et al., 1993). Dissoziation der Hitzeschockproteine und Hyperphosphorylierung führen zu Konformationsänderung und schneller Translokation des Rezeptorkomplexes in den Zellkern (Orti et al., 1989; Picard et al., 1987). Hier binden GR-Homodimere an spezifischen GREs in der Promotorregion, wodurch die Transkription Gene positiv (z.B. Surfactant Protein A, Haptoglobin, Leptin, Glukose 6-Phosphatase, Glutaminase) oder negativ (Interleukine 1-4, 6, 8, 10, 12, IFNγ, ICAM-1) beeinflusst wird (McKay et al., 1999). In HL-60 Zellen wurde eine Stimulierung der HCMV IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität durch Dexamethason gezeigt (Prösch et al., 1992). Dieser Effekt war spezifisch auf die Wirkung der Glukokortikoide zurückzuführen: wurden die GRE-Konsensussequenz so mutiert, dass im EMSA keine Bindung des GR mehr beobachtet werden konnte, war auch die Stimulierbarkeit dieser IE-Promotormutante durch Glukokortikoide aufgehoben (ebenda). Mit der transaktivierenden Wirkung von Glukokortikoidrezeptoren auf den IE1/2-Enhancer/Promotor wurde erstmals ein Mechanismus beschrieben, der die schon lange bekannte Steigerung der HCMV-Replikation durch Glukokortikoide in vitro in HELF, Vorhautfibroblasten und Makrophagen auf molekularer Ebene erklärt (Lathey et al., 1991; Leonardi et al., 1992; St George et al., 1994; Tanaka et al., 1984 a; Tanaka et al., 1984 b).

Glukokortikoide (Z.B. Kortison, Kortisol, Dexamethason) sind Steroidhormone, die in der Zona fasciculata der Nebenniere gebildet werden. Sie sind wichtige Gegenspieler des Insulins bei der Regulation des Plasmaglukosespiegels und greifen in Prozesse des Eiweiß- und Fettstoffwechsels ein (Löffler et al., 2003). Ihnen kommt eine starke antiphlogistische Wirkung zu, indem sie die Genexpression inflammatorischer Zytokine herunterregulieren und die Proliferation von Lymphozyten hemmen (McKay et al., 1999). In vivo Untersuchungen an Mäusen und Ratten zeigten, dass Glukokortikoide essentiell für die Reifung der Brustdrüsen sowie den Prozess der Laktogenese sind (Nguyen et al., 2001). Sie induzieren den Schluss von tight junctions zwischen den alveolären Brustepithelzellen und ermöglichen damit die gezielte Ansammlung von Milch im Lumen (ebenda). Synergistisch mit Prolaktin (Dogusan et al., 2001) stimulieren Glukokortikoide die Genexpression des wichtigsten Milchproteins ß-Kasein (Doppler et al., 1989; Stöcklin et al., 1997). Interessanterweise verläuft dieser Prozess allerdings unabhängig von einer direkten DNA-Bindung des GR über Protein-Protein Interaktion mit dem „signal transducer and activator of transcription 5“ (STAT 5) (Doppler et al., 1989; Stöcklin et al., 1997). Der Gehalt an Glukokortikoiden in der Muttermilch schwankt in Molkeproben verschiedener Mütter und liegt zwischen 17 bis136 ng/ml (Alexandrova et al., 1983; Patacchioli et al., 1992). Damit beträgt er in etwa 5 - 25 % des mütterlichen Plasmakortisolgehalts (Ost et al., 1985). Ein besonders hoher Kortisolgehalt wird in Kollostrum und früher Milch gemessen, während er bei fortschreitender Laktation deutlich sinkt (Kulski et al., 1981; Patacchioli et al., 1992). Da wir in unseren Untersuchungen beobachteten, dass die Molke in den ersten beiden Wochen der Laktation den IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität von HCMV besonders deutlich stimuliert (vgl. 3.3.2.), korreliert dies mit den in der Literatur beschriebenen höheren Kortisolkonzentrationen in früher Milch.

Die Deletion der NFκB-Bindungsorten hatte im Gegensatz zu den GREs keine Auswirkung auf die molke-abhängige Stimulation der HCMV IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität in monozytären Zellen. TNFα als potenter Entzündungsmediator scheint daher in diesem Prozess keine oder nur eine sehr untergeordnete Rolle zu spielen. Lediglich eine Molkeprobe zeigte in mit p18mut4 transfizierten Zellen im Vergleich zu mit pRR55 transfizierten Zellen einen deutlich reduzierten Effekt auf die CAT-Expression. In dieser Molkeprobe könnte TNFα zur Stimulation des IE1/2-Enhancer/Promotors und viralen Replikation beigetragen haben (Prösch S, pers. Mitteilung). Der in der Literatur beschriebene TNFα-Gehalt von Milchproben der ersten Monate zeigt mit 0-2933 pg/ml sowohl enorme individuelle Unterschiede als auch weite Diskrepanzen zwischen verschiedenen Studien (Buescher et al., 2001; Hawkes et al., 1999; Laiho et al., 2003; Rudloff et al., 1992). Etwa 3-20 % stillender Mütter entwickeln in den ersten 3 Monaten der Laktation eine akute Mastitis (Kaufmann et al., 1991). Milchproben, die während einer akuten Mastitis gewonnen wurden, wiesen signifikant erhöhte TNFα-Konzentrationen auf (Buescher et al., 2001), und in vitroisolierte Milchmonozyten reagierten mit einer 2-100-fach erhöhten Produktion von IL-6 und TNFα, wenn sie durch Infektion mit dem RS-Virus stimuliert wurden (Sone et al., 1997). Über HIV ist bekannt, dass Mastitis die Viruslast in der Brustmilch erhöht und zu signifikant erhöhten Transmissionsraten auf die gestillten Säuglinge führt (Semba et al., 1999; Willumsen et al., 2003). Entzündungen der Brust – auch getriggert durch eine HCMV-Infektion der Brust per se - wurden daher auch als wichtiger Stimulus der HCMV Virusreplikation in der Brust/Milch diskutiert. Neben TNFα enthält Kollostrum und Milch auch bedeutende Mengen (4507 ± 770 pg/ml) an löslichem TNFα-II Rezeptor (Büscher et al., 1996; Hawkes; Bryan et al., 1999; Laiho et al., 2003; Liu et al., 1992; Rudloff et al., 1992)b. Der Großteil des in Milch enthaltenen TNFα liegt daher wahrscheinlich in gebundener und somit inaktivierter Form vor (Baldanti et al., 1998; Büscher et al., 1996; Büscher et al., 1998; Rudloff et al., 1992). Neutralisierung der TNFα Aktivität in der Milch könnte ein Grund für die nach unseren Daten untergeordnete Rolle von TNFα in der Muttermilch sein. Ob es allerdings bei Frauen mit akuter Mastitis zu erhöhten HCMV- Re(aktivierungen) in der Brust kommt, ist unklar und müsste in einer Studie geklärt werden. Die von uns verwendete Muttermilch stammte ausschließlich von Müttern ohne Zeichen einer Mastitis.

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Die in Stresssituationen vermehrt gebildeten Katecholamine Adrenalin und Noradrenalin (Lodish et al., 1995; Löffler et al., 2003) sowie Prostaglandin E2 führten in in vitro Transfektionsexperimenten zu einer Aktivierung des IE1/2-Enhancer/Promotors in THP-1 und HL-60 Zellen (Kline et al., 1998; Prösch et al., 2000 b). Die Promotorstimulation durch Katecholamine und Prostaglandin E2 erfolgt dabei über Erhöhung des intrazellulären cAMP Gehalts, wodurch die Transkriptionfaktoren der CREB/ATF-Familie aktiviert werden. CREB-1/ATF-1 binden an die „cAMP responsive elements“ (CRE) in den 19 bp Motiven im IE1/2-Enhancer/Promotor (Fickenscher et al., 1989; Hunninghake et al., 1989; Meier et al., 1996; Stamminger et al., 1990) und führen zu einer Steigerung der IE1/2-Promotoraktivität (Keller et al., 2003; Prösch et al., 2000 b). Prostaglandin E2 wird in den ersten drei Monaten der Laktation mit steigender aber sehr heterogener Konzentration (<10-9966 pg/ml) in die Brustmilch ausgeschieden (Hawkes et al., 1999), die Konzentrationen von Adrenalin und Noradrenalin in der Milch sind nicht bekannt. Nach den Ergebnissen der Transfektionsexperimenten mit p19mut5 spielen Katecholaminen und Prostaglandinen keine signifikante Rolle im Prozess der Molke-induzierte IE1/2-Enhancer/Promotorstimulation. Einschränkend ist allerdings zu bedenken, dass natürliche Katecholamine nur eine kurze Halbwertszeit von 30-120 Sekunden haben (Löffler et al., 2003) und ihr Einfluss in unserem Transfektionssystem daher nur schwer zu erfassen ist.

Zwei weitere Substanzen, die an der Molke-abhängigen Stimulierung des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor beteiligt sein könnten, sind Prolaktin und der Epidermale Wachstumsfaktor (EGF). In Milchproben der ersten Woche werden deutlich höhere Prolaktinkonzentrationen (43,1 ± 4 ng/ml) als in Milchproben nach einem Monat (11 ± 1,4 ng/ml) gemessen (Cox et al., 1996; Yuen et al., 1988). Prolaktin übt Zytokine-ähnliche Wirkung auf PBMCs und Granulozyten aus, in denen es über Aktivierung von STAT5 die Expression immunmodulatorischer Gene wie dem „interferon regulatory factor-1“-Gen (IRF-1) und verschiedene “suppressor of cytokine signaling“ Genen (SOCS) moduliert (Dogusan et al., 2001). Auch EGF wird besonders am Beginn der Laktation in hohen Mengen (0,8-1,8 μl/ml) in die Milch sekretiert (Lönnerdal et al., 2003; Read et al., 1984; Saito et al., 1994). Dabei weisen Milchproben von Müttern sehr kleiner frühgeborener Kinder (23.-27. GW) signifikant höhere EGF-Konzentration auf als die reif geborener Kinder (32.-36. bzw. 38.-42. GW) (Dvorak et al., 2003). Da diese Charakteristika durchaus mit der von uns beobachteten Kinetik der IE1/2-Enhancer/Promotorstimulation durch Molke vereinbar waren, wurde der Einfluss von EGF und Prolaktin auf die IE1/2-Enhancer/Promotoraktivität in pRR55-transfizierten HL-60 Zellen geprüft. Hierbei zeigten jedoch weder Prolaktin noch EGF einen Einfluss auf die Aktivität des HCMV IE1/2-Enhancer/Promotors (vgl. 3.4.3.), obwohl Prolaktinrezeptoren (Dardenne et al., 1994; Nishiguchi et al., 1993) und EGF-Rezeptoren (Eales-Reynolds et al., 2001; Taetle et al., 1991) auf HL-60 Zellen beschrieben wurden. Einschränkend muss allerdings angeführt werden, dass im Rahmen dieser Arbeit nicht abgeklärt werden konnte, ob die von uns verwendeten HL-60 Zellen tatsächlich Rezeptoren für Prolaktin und EGF auf ihrer Oberfläche exprimieren. Da viele Substanzen ihre Aktivität erst in Kombination mit anderen Substanzen entfalten (z.B. Prolaktin/Kortisol), müssten in folgenden Experimenten auch Kombinationen von Substanzen getestet werden.

Zusammenfassend konnte im Rahmen der vorliegenden Dissertation gezeigt werden, dass zellfreie Molke die Replikation von HCMV über Erhöhung der Aktivierung des IE1/2-Enhancer/Promotors und der IE1- und IE2-Proteinsynthese erhöhen kann. Der Effekt ist multifaktoriell. Ein Faktor konnte identifiziert werden– Glukokortikoide. Die Natur der anderen Komponenten bleibt unbekannt. TNFα, Katecholamine und Prostaglandin E konnten weitgehend ausgeschlossen werden. Die Rolle von Prolaktin und EGF muss weiter untersucht werden, ebenso wie der Einfluss des strukturellen EGF Homologs „Transforming Growth Faktor-β“ (TGF-β) und Laktoferrin. Beide Substanzen wurden in Muttermilch nachgewiesen (Lönnerdal et al., 2003; Saito et al., 1994). Kürzlich wurde gezeigt, dass Laktoferrin und TGF-β die Replikation des Humanen T-Zell Leukämie Virus Typ 1 (HTLV-1) in infizierten PBMCs steigern (Moriuchi et al., 2001; Moriuchi et al., 2002). Basis der stimulierenden Aktivität von TGF-β auf die HTLV-1 Replikation ist die Erhöhung der Long-terminal repeat (LTR)-Promotoraktivität des Virus. In der gleichen Publikation wurde darauf hingewiesen, dass der HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor in PBMCs HTLV-1 infizierter Patienten durch TGF-β ’geringfügig erhöht’ wird. In einer Studie schien eine hohe Laktoferrinkonzentration mit hoher HCMV Viruslast in der Milch zu korrelieren (van der Strate et al., 2001). Auch für Laktoferrin wurde eine transaktivierende Aktivität nachgewiesen, die es über direkte DNA-Bindung an eine „Laktoferrin bindende Konsensus Sequenz“ (LBS) ausübt (He et al., 1995). Über diese LBS steigert Laktoferrin die IL-1β Expression in humanen myeloischen Leukämiezellen (K562) (Son et al., 2002). Eine transaktivierende Wirkung von TGFβ und Laktoferrin auf den HCMV IE1/2-Enhancer/Promotor wäre daher denkbar und sollte geprüft werden.


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31.07.2006