Fragestellung der Arbeit

Die inhibitorische Wirkung von Myelin auf das Wachstum von Neuronen ist seit längerem bekannt. Obwohl sich viele Studien mit der axonalen Wegfindung und dem Sprouting im Hippocampus beschäftigt haben, sind nur wenige Daten über Myelinisierungvorgänge im sich entwickelnden Hippocampus bekannt. Auch über Änderungen der Myelinverteilung nach Läsion liegen keine ausreichenden Daten vor. Ein Grund dafür war die schwierige Detektionsmöglichkeit von Myelin. Vor allem dünn myelinisierte Fasern ließen sich kaum darstellen. Für das Verständnis von myelin-assozierten Wachstumshemmern und deren Verteilung in einer so plastischen Gehirnregion wie dem Hippocampus ist die Kenntnis des regionalen Verteilungsmusters myelinisierter Axone von großer Wichtigkeit. In der vorliegenden Arbeit soll für die Region des Hippocampus folgendes untersucht werden:

1. Etablierung einer geeigneten Myelinfärbemethode für licht- und bestenfalls auch für elektronen mikroskopische Analysen.
2. Wie sieht das Verteilungsmuster von Myelin

im sich entwickelnden,
im adulten und
im deafferenzierten Hippocampus aus?

Die neu identifizierte Genfamilie der Nogos gehört zu den membran-assozierten Proteinen, die sowohl in vitro, aber auch in vivo auswachshemmende Eigenschaften auf Axone zeigen. Es kamen folgende Fragen auf, die in dieser Arbeit geklärt werden sollen:

1. Expremieren neben Oligodendrozyten noch andere Zellen des ZNS´ die Nogo Transkripte?
2. Wie sieht das Verteilungsmuster der Nogo Transkripte

im sich entwickelnden,
im adulten und
im deafferenzierten Hippocampus aus?

3. Gibt es Unterschiede im Expressionsmuster der einzelnen Isoformen und dem Rezeptor?
4. Können darüber eventuell Rückschlüsse auf deren mögliche Funktionen bei De- und Reorganisationsvorgängen geschlossen werden?

experimentelle Versuchsanordnung

Sowohl bei der Myelinfärbung als auch bei den Nogo- Expressionsanalysen weichen die untersuchten Überlebensstadien nach ECL (1 dal, 2 dal, 3 dal, 5 dal, 10 dal, 15 dal, 21 dal, 28 dal, 60 dal) von den 1997 von Kelly und Steward eingeteilten Stadien ab. So wurde die Phase 1 und 2 nach Kelly und Steward zu einer zusammengefasst (1 dal). Phase 3 wurde nochmals auf Grund der großen Relevanz unterteilt (3 dal, 5 dal, bei der Myelinfärbung zusätzlich 2 dal). Phase 4 wurde in 15 dal, 21 dal und 28 dal unterteilt. Für die Phase 5 wurde bei der Myelinfärbung 60 dal gewählt. Bei der Nogo- Expressionsanalyse wurde auf das Langzeitstadium (> 30 Tage) verzichtet, da bei allen Isoformen bereits am Ende der 5. Phase (28 dal) in allen untersuchten Regionen die Ausgangswerte wieder erreicht waren.

Myelinfärbung

Für die Färbung der myelinisierten Fasern musste eine geeignete Färbetechnik gefunden werden, die folgenden Ansprüchen Rechnung tragen konnte:

Sensibilität; v.a. sehr dünn myelinisierte Fasern (z.B. die der Molekularschicht des Gyrus dentatus) müssen detektiert werden können
Erkennung von pathologischem Myelin
Möglichkeit zur quantitativen Auswertung
einfache Handhabung (z.B. lichtmikroskopisch auswertbar, Stabilität der Färbung, gute Reproduzierbarkeit, Möglichkeit zu Gegenfärbungen, idealerweise auch für ultrastrukturelle Analysen kompatibel))

Die bereits etablierten Färbemöglichkeiten erwiesen sich für die oben erwähnten Forschungsvorhaben als wenig brauchbar. So ist die Detektierbarkeit von dünn myelinisierten Fasern mit dem histologischen Farbstoff Luxol Fast Blue fast ausgeschlossen. Die Immunhistochemie mit dem kosten- intensiven Myelin Basic Protein Antikörper ist aufgrund der großen Variabilität und der schwierigen Reproduzierbarkeit ebenfalls nicht die geeigneteste Methode. Der zu seiner Zeit neu von unseren Kollaborationsparntern entwickelte Farbstoff Black Gold sollte in Pilotstudien einige der erforderlichen Ansprüche erfüllen (Schmued & Slikker, 1999).

Expressionsanalysen der Nogo Familie

Die in situ Hybridisierung erwies sich für die oben genannte Fragestellung als eine geeignete Methode. Mit Hilfe der in situ Hybridisierung ist man in der Lage, die räumliche Verteilung von mRNA lichtmikroskopisch sichtbar zu machen. Dabei hybridisiert das markierte komplementäre Oligonukleotid (cDNA) mit seinem Gegenstück (antisense) auf dem fixiertem Gewebestück. Bei einer radioaktiven Markierung erscheint die so detektierte mRNA als schwarzer Fleck auf dem exponierten Röntgenfilm (Autoradiographie). Bei der nicht- radioaktiven ISH wird der Ort über eine Farbstoffreaktion kenntlich gemacht. Mit der nicht-radioaktiven ISH kann die zelluläre Verteilung der mRNA detaillierter beurteilt werden, als mit der radioaktiven.