Meyer, Hellmuth-Alexander: Identifizierung und Charakterisierung evolutionär konservierter Komponenten des Protein-Translokationsapparates im Endoplasmatischen Retikulum
Identifizierung und Charakterisierung evolutionär konservierter Komponenten des Protein-Translokationsapparates im Endoplasmatischen Retikulum
Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)

An der

Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Diplom-Biologe Hellmuth-Alexander Meyer

Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Bernhard Ronacher

Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Jürgen Mlynek

Gutachter:
Prof. Dr. E. Hartmann
Prof. Dr. W. Lockau
Prof. Dr. R. Erdmann

Datum der Promotion: 18.05.2001

Abstract

Im Gegensatz zur den monomeren Leaderpeptidasen der bakteriellen Plasmamembran bestehen die eukaryotischen Signalpeptidasen der ER-Membran aus einem heteromeren Protein-Komplex. In der Hefe S. cerevisiae setzt sich die Signalpeptidase aus den vier Membranproteinen Sec11p, Spc1p, Spc2p und Spc3p zusammen. Neben der zur prokaryontischen Leaderpeptidase homologen Untereinheit Sec11p wird auch Spc3p benötigt um die Spaltungsfunktion in der Zelle auszuüben. Die Deletion von SPC3 führt zu einer lethalen Akkumulation von sekretorischen Vorstufenproteinen in vivo, sowie zum Verlust der Spaltungsaktivität in vitro. Spc1p und Spc2p sind nicht essentiell für die Hefe. Für Spc2p konnte jedoch gezeigt werden, daß die Signalpeptidase über die Spc2p Untereinheit mit den b-Untereinheiten des Sec61-Komplexes und des Ssh1-Komplexes interagiert. Vermutlich wird es so dem Komplex ermöglicht, während des Translokationsprozesses engen Kontakt zu der im Translokationskanal befindlichen Signalsequenz aufzunehmen.

Im zweiten Teil der Arbeit wurden neue Komponenten aus der ER Membran von Säugern aufgereinigt. Dabei wurde ein ribosomenfreier Sec61-Komplex entdeckt, der mit zwei weiteren Membranproteinen assoziiert ist. Die beiden neuen Membranproteine weisen Homologien zu essentiellen Untereinheiten des postranslational aktiven Sec-Komplexes der Hefe S. cerevisiae auf. Die Rolle des neu entdeckten Säugerkomplexes während der Protein-translokation ist noch unbekannt, in der Arbeit werden mögliche Funktionen des Komplexes diskutiert.

Schlagwörter:
Signalpeptidase, ER-Transport, Sec61, Sec63

Abstract

In contrast to the monomer leaderpeptidase of the prokaryotic plasmamembrane, the eukaryotic signalpeptidase of the ER-membrane is a heteromer protein complex. In yeast the signalpeptidase consist of the four subunits Sec11p, Spc1p, Spc2p and Spc3p. Additional to Sec11p also Spc3p is essential for cell growth and cell life. The depletion of Spc3p cause lethal accumulation of precursor proteins in vivo and lost of cleavage activity in vitro. Spc1p and Spc2p are not essential for the cell. We show here, that the Spc2p subunit interacts with the ß-subunits of the Sec61- and the Ssh1-complex. These data implicate that Spc2p facilitates the interactions between different components of the translocation site.

In yeast, efficient protein transport across the endoplasmic reticulum (ER) membrane may occurco-translationally or post-translationally. The latter process is mediated by a membrane protein complex that consists of the Sec61p complex and the Sec62p-Sec63p subcomplex. In contrast, in mammalian cells protein translocation is almost exclusively co-translational. This transport depends on the Sec61 complex, which is homologous to the yeast Sec61p complex and has been identified in mammals as a ribosome-bound pore-forming membrane protein complex. We report here the existence of ribosome-free mammalian Sec61 complexes that associate with two ubiquitous proteins of the ER membrane. According to primary sequence analysis both proteins display homology to the yeast proteins Sec62p and Sec63p and are therefore named Sec62 and Sec63, respectively. The probable function of the mammalian Sec61-Sec62-Sec63 complex is discussed with respect to its abundance in ER membranes, which, in contrast to yeast ER membranes, apparently lack efficient post-translational translocation activity.

Keywords:
signalpeptidase, Sec61, Translocation, Sec63


Seiten: [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteIdentifizierung und Charakterisierung evolutionär konservierter Komponenten des Protein-Translokationsapparates im Endoplasmatischen Retikulum
1 Zusammenfassung
2 Einleitung
2.1Transport von Proteinen in das Lumen des ER
2.1.1Transportsignale für den Transport ins ER
2.1.2Der cotranslationale Proteintransport in das ER
2.1.2.1Der Sec61-Komplex
2.1.2.2Das TRAM Protein
2.1.3Der posttranslationale Proteintransport in das ER
2.1.3.1Der Sec-Komplex
2.1.4Posttranslationale Modifikationen der Polypeptidkette
2.1.4.1Der Signalpeptidase-Komplex
2.2Zielsetzung
3 Material und Methoden
3.1Material
3.1.1Chemikalien, Enzyme und Medien
3.1.2Puffer und Lösungen
3.1.3Detergenzien
3.1.4Lipide
3.1.5Versuchsorganismen
3.1.5.1Escherichia coli Stämme
3.1.5.2Saccharomyces cerevisiae Stämme
3.1.5.3Säugetiere
3.1.6Antikörper
3.1.7Plasmide
3.2Methoden
3.2.1Molekularbiologische Methoden
3.2.2Hefegenetische Methoden
3.2.2.1Transformation von S. cerevisiae mit Plasmid-DNA.
3.2.2.2Herstellung von Hefe-Deletionsmutanten
3.2.3Proteinanalytische Methoden
3.2.3.1SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
3.2.3.2Coomassiefärbung
3.2.3.3Autoradiographie
3.2.3.4Westernblot
3.2.4Biochemische Methoden
3.2.4.1In vitro Transkription und Translation
3.2.4.2In vitro Signalpeptidase Spaltungsassay
3.2.4.3N-Glycosidase F Spaltungsassay und ConA-Blot
3.2.4.4Protein-Quervernetzung mittels Bismaleinimidhexan
3.2.5Proteinbiochemische Methoden
3.2.5.1Herstellung von rauhen Mikrosomen sowie Puromycin/Hochsalz behandelten rauhen Mikrosomen
3.2.5.2Zellfraktionierung
3.2.5.3Saccharose-Gradienten-Zentrifugation
3.2.5.4Aufreinigung von Proteinen mit einem 6xHis-Motiv
3.2.5.5Reinigung des ER-Signalpeptidase-Komplexes aus Hefe
3.2.5.6Coimmunopräzipitation von Sbh2p mit dem SP-Komplex
3.2.5.7Aufreinigung des Säuger Sec63/Sec61 Komplexes
3.2.5.8Coimmunopräzipitation von Sec62 und Sec63 mit dem Sec61-Komplex
4 Ergebnisse
4.1Der ER-Signalpeptidase Komplex der Hefe
4.1.1Die Signalpeptidase der Hefe ist ein heteromerer Protein-Komplex
4.1.1.1Aufreinigung der Signalpeptidase aus der Hefe S. cerevisiae
4.1.1.2Identifizierung von Proteinen aus der aufgereinigten SP-Komplex-Fraktion
4.1.1.3Molekulare Charakterisierung von Spc2p und Spc3p
4.1.1.4Spc3p ist ein Glycoprotein
4.1.1.5Spc2p und Spc3p sind integrale Bestandteile des SP-Komplexes der Hefe
4.1.2Analyse der Funktion von Spc3p
4.1.2.1Spc3p ist essentiell für das Zellwachstum
4.1.2.2Spc3p ist essentiell für die Prozessierung von Transportproteinen
4.1.2.3Der Verlust von Spc3p destabilisiert den SP-Komplex
4.1.2.4Sec11p kann die Funktion von Spc3p nicht ersetzen
4.1.3Analyse der Funktion von Spc2p
4.1.3.1Spc2p ist unter normalen Wachstumsbedingungen nicht essentiell
4.1.3.2Depletion von Spc2p destabilisiert den SP-Komplex und vermindert die Signalpeptidaseaktivität in vitro
4.1.3.3Die Depletion von Spc2p verringert die Menge an Sbh2p in der Zelle
4.1.3.4Der SP-Komplex interagiert physisch mit Sbh1p und Sbh2p
4.2Identifizierung einer Sec-Komplex ähnlichen Struktur im Säuger
4.2.1Identifizierung und Klonierung von Sec62p und Sec63p homologen Proteinen im Säuger
4.2.2Charakterisierung des Sec63/Sec61 Subkomplexes
4.2.3Sec62 und Sec63 sind nicht mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert
4.2.4Sec62 und Sec63 sind assoziiert mit dem Sec61-Komplex
4.2.5Zelluläre Expression und Lokalisation von Sec62 und Sec63
5 Diskussion
5.1Die Signalpeptidase
5.1.1Eukaryonten besitzen einen konservierten ER-Signalpeptidase-Komplex
5.1.2Sec11p und Spc3p werden für die katalytische Aktivität der ER-Signalpeptidase benötigt
5.1.3Spc1p und Spc2p unterstützen die Spaltungsaktivität des SP-Komplexes
5.1.4Der SP-Komplex interagiert mit der Translokationspore
5.2Identifizierung eines Sec-Komplex ähnlichen Translokationskomplexes im Säuger
5.2.1Säuger-Sec61alpha ist assoziiert mit Sec62 und Sec63
5.2.2Mögliche Funktion des pentameren Säuger- Sec61/62/63 Komplexes
5.3Evolutionär konservierte Komponenten des ER-Translokationsapparates
Bibliographie Literatur
Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis
Lebenslauf
Anhang A Publikationsliste
Selbständigkeitserklärung
Danksagung

Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Modell des cotranslationalen Proteintransportes durch die ER-Membran in Säugerzellen.
(1)
Die Signalsequenz der wachsenden Polypeptidkette wird vom SRP erkannt und gebunden. Gleichzeitig interagiert das SRP auch mit dem Ribosom, wodurch es zu einem Elongationsarrest kommt. (2) Der Komplex aus Ribosom, naszierender Polypeptidkette und SRP bindet an die ER-Membran, wobei das SRP mit seinem membranständigen Rezeptor und das Ribosom mit dem Sec61-Komplex interagiert. (3) Unter GTP-Hydrolyse wird die Signalsequenz vom SRP auf den Sec61-Komplex übertragen. Es erfolgt ein zweiter Signalsequenzerkennungsschritt durch den Sec61-Komplex. (4) Der Translokationskanal öffnet sich zum ER-Lumen. Der N-Terminus der naszierenden Kette liegt in einer Haarnadelkonformation vor, wobei der eine Teil der Schleife von der Signalsequenz und der andere Teil von den C-terminal nachfolgenden Abschnitten der Polypeptidkette gebildet wird. Die Signalsequenz interagiert dabei mit Sec61alpha, TRAMp und Membranlipiden. Durch die weitere Elongation der Polypeptidkette wird der C-terminale Bereich der Schleife durch die Membran geschoben. Die Signalsequenz wird dabei vom restlichen Protein durch den Signalpeptidase-Komplex (SP-Komplex) abgespalten. (5) Anschließend wird die restliche naszierende Polypeptidkette direkt durch den von Ribosom und Sec61-Komplex gebildeten Kanal ins Lumen des ER transportiert.
Abb. 2: Der Sec61-Komplex aus Säugerzellen.
A) Schematische Darstellung des Sec61-Komplexes. Der Komplex besteht aus den drei Membranproteinen Sec61 alpha, beta und gamma. Die Transmembransegmente der Proteine sind als graue Zylinder dargestellt. B) Errechnete elektronenmikroskopische Durchschnittsdarstellung der Sec61-Pore aus 125 Einzelobjekten. Die Masseschwerpunkte sind durch schwarze Punkte gekennzeichnet. Die Ringstruktur in der Membran setzt sich aus drei bis vier Sec61-Komplexen zusammen (Hanein et al., 1996).
Abb. 3: Modell des posttranslationalen Proteintransportes durch die ER-Membran der Hefe S. cerevisiae. (1) Das zu transportierende Protein wird vollständig im Cytoplasma synthetisiert und durch cytosolische Chaperone in einem translokationskompetenten Zustand gehalten. Die Signalsequenz des Proteins wird in einem ATP und Kar2p unabhängigen Schritt vom Sec-Komplex erkannt und gebunden. (2) Der N-Terminus der Polypeptidkette inseriert vermutlich in Form einer Haarnadel in den vom Sec61-Subkomplex gebildeten Translokationskanal. (3) Die eigentliche Translokation der Polypeptidkette durch die ER-Membran erfolgt in einem ATP- und Kar2p- abhängigen Prozeß. Das luminal vorkommende Kar2p wird durch die DnaJ Domäne des Sec63p zur Bindung von Peptiden aktiviert. Sobald die zu transportierende Polypeptidkette auf der luminale Seite der ER-Membran heraustritt, wird Kar2p unter ATP-Spaltung auf diese Bereiche übertragen, wodurch ein zurückgleiten der Kette verhindert wird (molekulare Ratsche). Durch das sukzessive Binden von weiteren Kar2p Proteinen wird die ungerichtete Brownsche Molekularbewegung der Polypeptidkette im Translokon in einen gerichteten Transportprozeß umgewandelt.
Abb. 4: Schematische Darstellung des Sec-Komplexes der Hefe S. cerevisiae.
Der heptamere Sec-Komplex setzt sich aus zwei Subkomplexen zusammen, dem trimeren Sec61-Komplex und dem tetrameren Sec62/63-Subkomplex. Die Transmembransegmente der Proteine sind als graue Zylinder dargestellt. Die DnaJ-homologe Domäne des Sec63p interagiert mit dem luminalen Chaperon Kar2p. Sec71p liegt als Glycoprotein in der Membran vor, was durch die angehefteten Kreise symbolisiert wird. Sec72p wird wahrscheinlich über die Bindung zum Glycoprotein Sec71p in der ER-Membran verankert.
Abb. 5: Schematische Darstellung des ER-Signalpeptidase-Komplexes aus Säugerzellen.
Der Komplex besteht im Säuger aus fünf Membranproteinen. Die Transmembransegmente der Proteine sind als graue Kästen dargestellt. SPC22/23 liegt als Glycoprotein vor, was durch den angehefteten Kreis symbolisiert wird.
Abb. 6: Herstellung einer SPC3-Deletionsmutante.
Schematische Darstellung der Methode zur Deletion von SPC3 aus einem diploiden Hefestamm. Beschreibung siehe Text.
Abb. 7: Aufreinigung des Hefe-SP-Komplexes (Teil 1).
Nachweis der Signalpeptidase während der Aufreinigungsprozedur durch einen enzymatischen in vitro Spaltungsassay mit [35S]-markiertem PräPro-alpha-Faktor als Substrat. Hefemikrosomen (Bahn 1) wurden in 2,5 % (w/v) Digitonin, H50 K400 Mg10 Gly10 DTT2 Pi solubilisiert und anschließend die unlöslichen Bestandteile abgetrennt (Bahn 2: Pellet). Der resultierende Digitoninüberstand (Bahn 3) wurde über Nacht an Concanavalin A-Sepharose gebunden (Bahn 4: Durchlauf, Bahn 5: Elution). Das Eluat wurde dann über Q-Sepharose gegeben (Bahn 6: Stepelution mit H50 Dig1 Gly10 Mg10 K1500 DTT5 Pi, Bahn 7: Durchlauf) und anschließend der Durchlauf an SP-Sepharose gebunden (Bahn 6: Durchlauf, Bahn 7: Stepelution mit H50 Dig1 Gly10 Mg10 K500 DTT5 Pi). Von jeder Fraktion wurden 20 eq (Bahn 1 bis 4) bzw. 40 eq (Bahn 5 bis 7) entsprechend dem Ausgangsmaterial für den in vitro Spaltungsassay eingesetzt. Anschließend wurden die Proben mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Die obere Bande ist PräPro-alpha-Faktor (pp-alpha-F), die untere ist Pro-alpha-Faktor (p-alpha-F). Die Mikrosomen sowie das Digitonin- Pellet wurden für den Spaltungsassay jeweils zuvor in 2,5 % (w/v) Digitonin, H50 K400 Mg10 Gly10 DTT2 Pi aufgenommen.
Abb. 8: Aufreinigung des Hefe-SP-Komplexes (Teil 2).
A) Letzter Schritt der SP-Komplex Aufreinigung: die Elution des Signalpeptidase-Komplexes von SP-Sepharose mit einem linearen Salzgradienten von 0 bis 500 mM Kaliumacetat. Die einzelnen Fraktionen wurden mit dem in Abb. 7 beschriebenen enzymatischen Spaltungsassay auf Signalpeptidaseaktivität untersucht, wobei von jeder Fraktion 300 eq entsprechend dem Ausgangsmaterial eingesetzt wurden. Zusätzlich erfolgte der Nachweis der Signalpeptidase mittels Immunoblotting mit Antikörpern gegen Sec11p und Spc1p. Desweiteren wurde mittels Immunoblotting auch das Elutionsverhalten der beiden neu gefundenen Proteine Spc2p und Spc3p (siehe B) analysiert.
B) Coomassiefärbung des angereicherten SP-Komplexes. Fraktion 14 der SP-Sepharose Elution (siehe B) wurde mit 40 % Polyethylenglycol gefällt und das Pellet mit Methanol und Aceton gewaschen. Die Probe wurde dann mittels SDS-PAGE aufgetrennt und nach dem Transfer auf eine Nitrocellulosemembran Coomassie Blau gefärbt. Die 6 deutlichsten Banden wurden durch Edman Abbau analysiert: Die SP-Untereinheiten Spc1p und Sec11p sowie drei weitere Proteine (Spc2p, Spc3p und „*“) konnten dabei identifiziert werden (siehe Text).
Abb. 9: Spc3p ist ein Mitglied der SPC22/23 Proteinfamilie.
Aminosäuresequenz-Alignment von CfSP22/23 (Hund), GgSP22/23 (Huhn), CeSP22/23 (C. elegans), SpSP22/23 (S. pombe) und ScSpc3p (S. cerevisiae). Identische Aminosäuren im Alignment werden durch Sterne markiert, ähnliche mit Doppelpunkten. Die grau unterlegten As geben die potentiellen Transmembranbereiche wieder, schwarz umrahmte Boxen bezeichnen potentielle N-Glycosylierungsstellen. Unterstrichene Aminosäuren entsprechen dem ansequenzierten Bereich, der zur Identifizierung von ScSpc3p führte. Das Alignment wurde freundlicherweise von Herrn Dr. E. Hartmann zur Verfügung gestellt.
Abb. 10: Spc2p ist ein Mitglied der SPC25 Proteinfamilie.
Aminosäuresequenz-Alignment von HsSPC25 (Mensch), CfSPC25 (Hund), CeSPC25 (C. elegans), AtSPC25 (A. thaliana), SpSpc25 (S. pombe) und ScSpc2p (S. cerevisiae). Identische Aminosäuren im Alignment werden durch Sterne markiert, ähnliche mit Doppelpunkten. Die grau unterlegten Aminosäuren geben die vom Programm TopPred2 vorausgesagten Transmembranbereiche wieder. Die unterstrichenen Aminosäuren entsprechen den ansequenzierten Bereichen, die zur Identifizierung des Proteins führten. Das Alignment wurde freundlicherweise von Herrn Dr. E. Hartmann zur Verfügung gestellt.
Abb. 11: Spc3p ist ein Glycoprotein.
Aufgereinigter SP-Komplex (entsprechend 500 eq Ausgangs-RM) wurde im SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Anschließend wurde die Nitrocellulose mit Concanavalin A konjugierter Peroxidase inkubiert (Bahn 1) Alternativ wurde SP-Komplex mit N-Glycosidase F inkubiert und anschließend mittels SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert (Bahn 3). Bahn 2 zeigt unbehandelten SP-Komplex. Als Antikörper wurden anti-Spc3p und anti-Spc1p verwendet.
Abb. 12: Coimmunopräzipitation mit Anti Spc1p Antikörpern.
50 eq Hefemikrosomen wurden in 2,5 % Digitonin, H50 Gly10 Mg10 K400 Pi solubilisiert und anschließend die unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt. Der resultierende Digitoninextrakt wurde auf H50 Dig1,5 Gly10 Mg2 K100 Pi eingestellt, 5 µl affinitätsgereinigte Anti-Spc1p Antikörper hinzugegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Mittels Protein A Sepharose wurden die Antikörper eingesammelt, gewaschen und die gebundenen Proteine mit SDS-Probenpuffer eluiert. Die Proben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblotting mit Antikörpern gegen die angegebenen Proteine analysiert. Ausgang (Bahn 1), Coimmunopräzipitat (Bahn 2), Überstand (Bahn 3). („*“ Kreuzreaktionsbande der anti-Spc3p Antikörper mit einem unbekannten Protein.)
Abb. 13: SPC3 ist essentiell für die Präprotein-Prozessierung des Kar2p.
A) Wachstumskurven des Stammes yHM1(Deltaspc3) mit pGal10Spc3. Der Stamm wurde bei 30 °C in Minimalmedium mit 2 % Saccharose und 0,5 % Galaktose (SSGal) vorinkubiert (_ und schwarze Linie). Ein Teil der Zellen wurde dann in Minimalmedium mit 2 % Glucose (SD) umgesetzt (_ und graue Linie), was die Expression von SPC3 repremiert. Das Zellwachstum in den Kulturen wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm bestimmt.
B) Autoradiographie einer Anti-Kar2p Immunopräzipitation nach metabolischer Zellmarkierung. Zellen des Stamms yHM1(Deltaspc3) mit pGal10Spc3 wurden nach Wechsel in SD Minimalmedium nach 0, 4, 8 oder 12 h geerntet und für 10 min mit [35S] Methionin in vivo markiert. Anschließend wurden Zellextrakte präpariert und Kar2-Protein immunopräzipitiert. Die Präzipitate wurden mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. „PräKar2p“ ist die Präproteinform von Kar2p.
Abb. 14: Auswirkung der Spc3p Depletion auf die in vitro Spaltungsaktivität und die Stabilität des SP-Komplexes. Zellen des Stammes yHM1 (Deltaspc3) mit Plasmid pGal10Spc3 wurden vorinkubiert in YPGal und anschließend in YPD Medium überführt. Zu den Zeitpunkten 0, 3, 6, 9, 12 und 15 Stunden wurden jeweils ein Aliquot entnommen und RM präpariert. Die Wildtypmembranen (wt) wurden aus dem diploiden Hefestamm DF5 präpariert. Alle Membranen wurden durch quantitatives Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62p normalisiert. A) Spaltungsassay mit [35S]- markiertem PräPro-alpha-Faktor als Substrat. Digitoninextrakt entsprechend 20 eq Wildtyp (wt) RM wurde jeweils eingesetzt, 3 Stunden bei 25 °C inkubiert, anschließend präzipitiert, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und im Phosphorimager analysiert. pp-alpha-F steht für PräPro-alpha-Faktor und p-alpha-F für die prozessierte Form Pro-alpha-Faktor. B) Relative Menge an Untereinheiten des SP-Komplexes. Immunoblot mit Antikörpern gegen Spc1p, Spc2p, Spc3p und Sec11p.
Abb. 15: Überexpression von Sec11p komplementiert nicht den Verlust von Spc3p.
A
) Der Stamm yHM1(?spc3) wurde mit den Plasmiden pMet3Sec11 und pGal10Spc3 transformiert. Als Kontrollen wurden der Stamm yHM2 (?sec11) mit pMet3Sec11, der Stamm yHM1 (?spc3) mit pGal10Spc3 und der Wildtypstamm DF5 verwendet. Alle Stämme wurden über Nacht in Flüssig-Minimalmedium mit Galaktose angezogen und anschließend auf Minimalmedium Agar-Platten mit Glucose (SD) oder Galaktose (SGal) ausgestrichen und 3 Tage bei 30 °C inkubiert. Das Schaubild links gibt die Position der Stämme auf den Platten an.
B) Zellen des Stammes yHM1 (?spc3) mit pGal10Spc3 und pMet3Sec11 wurden bis zu einer OD600 von 0,6 in Minimalmedium mit Galaktose angezogen, dann Membranen präpariert und die Menge an Sec11p, Spc2p und Spc3p mittels Immunoblotting analysiert. Als Kontrolle dienten Wildtypmembranen aus dem Stamm DF5.
Abb. 16: Überexpression von Sec11p verhindert nicht den Verlust der Signalpeptidaseaktivität in vitro. Zellen des Stammes yHM1 (Deltaspc3) mit den Plasmiden pGal10Spc3 und pMet3Sec11 wurden in SSGal Minimalmedium (2 % Saccharose, 1 % Galaktose, -ura, -trp, -met) angezogen und anschließend in SD Minimalmedium (2 % Glucose, -ura, -trp, -met) überführt. Zu verschieden Zeitpunkten nach dem Wechsel (0, 5, 10 und 15 Stunden) wurden Zellen geerntet und entsprechend der in Abb. 14 beschriebenen Methode analysiert. Als Kontrolle wurden Wildtypmembranen (wt) aus dem diploiden Stamm DF5 isoliert. A) in vitro Spaltungsassay mit [35S]-markiertem PräPro-alpha-Faktor (pp-alpha-F) als Substrat. Pro-alpha-Faktor (p-alpha-F) ist die prozessierte Form des PräPro-alpha-Faktors (pp-alpha-F). B) Relative Menge an Untereinheiten des SP-Komplexes. Immunoblot mit Antikörpern gegen Spc1p, Spc2p, Spc3p und Sec11p.
Abb. 17: Expressionsniveau von SP-Untereinheiten in verschiedenen Deletionsstämmen.
Mikrosomen aus den Stämmen DF5 (wt), HFY403 (Deltaspc2), HFY401 (Deltaspc1) und HFY404 (Deltaspc1/Deltaspc2) wurden mittels Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62p kalibriert. Anschließend wurden jeweils die Proteinmengen von Spc1p, Spc2p, Spc3p und Sec11p bestimmt und in Relation zum wt-Stamm DF5 gesetzt (1 entspricht wt-Niveau). Die Quantifikation der Proteinmengen erfolgte nach SDS-PAGE und Immunoblot mit Hilfe von [35S] markierten sek. Antikörpern sowie einem Phosphorimager von Fuji. Die dargestellten Daten wurden der Diplomarbeit von Herrn W. Antonin entnommen.
Abb. 18: In vitro Spaltungsaktivität des Deltaspc2, Deltaspc1 und Deltaspc2/Deltaspc1 Stammes im Vergleich zum Wildtypstamm. [35S]-markierter PräPro-alpha-Faktor wurde als Substrat für den in vitro Spaltungsassay eingesetzt. Mikrosomen der Stämme Df5 (wt), HFY403 (Deltaspc2), HFY401 (Deltaspc1) und HFY404 (Deltaspc1/Deltaspc2) waren zuvor auf gleiche Mengen Spc3p und Sec11p kalibriert worden. Die Quantifizierung der Menge an prozessiertem alpha-Faktor erfolgte nach SDS-PAGE mittels eines Phosphorimagers (Fuji). Die dargestellten Daten wurden der Diplomarbeit von Herrn W. Antonin entnommen.
Abb. 19: Abschaltexperiment Spc2p.
Zellen des Deltaspc2 Stammes HFY403 mit dem Plasmid pGal10Spc2 wurden in Galaktose-Vollmedium (YPGal) bei 30 °C inkubiert (Zeitwert: 0 h). Anschließend wurden die Zellen für 10 Stunden in Glucose-Vollmedium (YPD) bei 30 °C inkubiert (Repression von Spc2p), um danach für 6 Stunden in Galaktose-Vollmedium (YPGal) inkubiert zu werden (Induktion von Spc2p). Während des Experimentes wurden jeweils in Abständen von 2 Stunden Aliquots entnommen und Mikrosomen präpariert. Diese, sowie Mikrosomen aus dem wt-Stamm SEY62.10 wurden mittels Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62p kalibriert.
A) in vitro Spaltungsassay mit [35S]- markierten PräPro-alpha-Faktor als Substrat. Mikrosomen entsprechend 40 eq wurden eingesetzt. Die Quantifizierung der Menge an prozessiertem alpha-Faktor erfolgte nach SDS-PAGE mit einem Phosphorimager. Im oberen Teil der Abbildung ist die entsprechende Autoradiographie des SDS-Gels dargestellt.
B) Bestimmung der Mengen von Spc1p, Spc2p und Spc3p relativ zum Wildtyp. Die Quantifizierung der Proteinmengen nach SDS-PAGE und Immunoblot erfolgte mit Hilfe von [35S]-markierten sek. Antikörpern sowie einem Phosphorimager. Der Wert 1 entspricht wt-Niveau.
Abb. 20: Die Depletion von Spc2p verändert die Menge an Sbh2p in der Zelle.
Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden während des Abschaltexperimentes (siehe Abb. 19) Mikrosomen präpariert und mittels Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62p kalibriert. Anschließend wurden die Expressionsniveaus von Spc2p, Sbh2p, Sec72p, Sbh1p, Sec61p und Ssh1p mittels SDS-PAGE und Immunoblotting bestimmt und in Relation zum wt-Stamm SEY62.10 gesetzt (1 entspricht wt-Niveau). Die Quantifizierung der Proteinmengen im Immunoblot erfolgte mit Hilfe von [35S]-markierten sek. Antikörpern sowie einem Phosphorimager von Fuji (Sec62p, Spc2p, Sbh2p, Sec61p und Ssh1p) oder mittels Peroxidase gekoppelten sek. Antikörpern, dem ECL-System und einem Lumineszenzvideosystem von Raytest (Sbh1p und Sec72p).
Abb. 21: Coimmunopräzipitation von Sbh1p und Sbh2p mit Antikörpern gegen Spc1p und Spc2p.
Aus Mikrosomen des wt-Stammes (Sey62.10) sowie des Deltaspc2 Stammes (HFY403) wurden Digitoninextrakte präpariert. Zu den Digitoninextrakten wurden an Protein A-Sepharose gekoppelte Antikörper gegen Spc1p oder Spc2p hinzugeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die gebundenen Proteine wurden anschließend mit SDS-Probenpuffer eluiert. Proben des Ausgangs (T=Total), der Coimmunopräzipitate (IP) sowie der Überstände (Ü) wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblotting mit Antikörpern gegen die angegebene Proteine analysiert.
Abb. 22: Identifizierung von Sec63p im Säuger.
Rinder PK-RM wurden mit 2,5 % Digitonin in H50 K500 Mg10 Gly10 ß-Me5 Pi solubilisiert und anschließend die nicht gelösten Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt. Der resultierende Extrakt wurde an eine anti-Sec61beta-Antikörpersäule gebunden. Nach intensivem Waschen der Säule mit 0,5 % Digitonin in H50 K250 Mg10 Gly10 ß-Me5 Pi (wash) wurde das gebundene Material durch Zugabe großer Mengen des Peptides, gegen das die Antikörper gerichtet waren, von der Säule eluiert (Eluat). Proben entsprechend 20 eq (Extrakt und Durchlauf) oder 450 eq (wash und Eluat) des Ausgangsmaterials wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend Coomassie gefärbt. Aus den Proteinbanden des Eluats wurden nach Spaltung mit Trypsin und anschließendem Edman-Abbau interne Aminosäuresequenzen ermittelt. Aus der 80 kDa Bande (BiP) ergaben sich die Peptide TKPYIQVDVG und AVEEKI, welche beide dem Protein BiP zuzuordnen waren. Die ermittelten Peptidsequenzen aus der 97 kDa Bande (Sec63) sind in Abb. 23 dargestellt.
Abb. 23: Alignment des Säuger Sec63 mit homologen Sequenzen aus anderen Organismen: HsSec63 (H. sapiens); CeSec63 (C. elegans); AtSec63 (A. thaliana) und ScSec63: (S. cerevisiae, Sec63p). Identische Aminosäuren im Alignment werden durch Sterne markiert, ähnliche mit Doppelpunkten. Die grau unterlegten Aminosäuren geben vorhergesagte Transmembransegmente wieder. Die DnaJ-homologe Domäne ist schwarz umrandet. Die unterstrichenen Regionen zeigen den Bereich zwischen den verschiedenen Sec63 Proteinen an, der am stärksten konserviert ist. Die durch Edman-Abbau ermittelten Sequenzen aus dem aufgereinigten Säugerprotein werden durch „o“ angezeigt. Das Alignment wurden freundlicherweise von Herrn Dr. E. Hartmann zur Verfügung gestellt.
Abb. 24: Alignment des Säuger Sec62 mit homologen Sequenzen aus anderen Organismen: HsSec62 (H. sapiens); DmSec62 (D. melanogaster, Dtrp1); CeSec62 (C. elegans); SpSec62 (S. pombe) und ScSec62 (S. cerevisiae, Sec62p). Identische Aminosäuren im Alignment werden durch Sterne markiert, ähnliche mit Doppelpunkten. Die grau unterlegten Aminosäuren geben vorhergesagte Transmembransegmente wieder. Das Alignment wurden freundlicherweise von Herrn Dr. E. Hartmann zur Verfügung gestellt.
Abb. 25: Alternative Aufreinigung des Sec63/Sec61-Komplexes.
A) Die in Digitonin solubilisierten und von unlöslichem Material befreiten Rinder-PK-RM (Total) wurden über eine HiTrap Q Säule gegeben. Nach dem Waschen der Säule (wash) wurden die gebundenen Proteine schrittweise durch zunehmende Salzkonzentrationen eluiert. Aliquots der einzelnen Aufreinigungsschritte wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend Coomassie gefärbt (oberer Teil) oder im Immunoblot mit den Antikörpern gegen die angegebenen Proteine (unterer Teil) analysiert. „KAc“ steht für Kaliumacetat. B) Die 1 M KAc Fraktion (Total) wurde über eine anti-Sec61beta Antikörpersäule gegeben. Nach dem Waschen der Säule wurden die gebundenen Proteine durch Zugabe großer Mengen des Peptides gegen das die Antikörper gerichtet waren, eluiert (Eluat). Aliquots der einzelnen Fraktionen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch Coomassiefärbung des Gels (oberer Teil) oder Immunoblotting mit Antikörpern gegen die angegebenen Proteine (unterer Teil) analysiert. Bahn 3 der Coomassiefärbung enthält dabei 20x mehr Material als Bahn 1 und 2. Bei der Immunoblotanalyse enthält Bahn 3 die 2,5fache Menge an Material wie Bahn 1 und 2.
Abb. 26: Sec62 und Sec63 sind keine ribosomenassoziierten Membranproteine.
50 eq Rinder-RM wurden in einem Hochsalz-Digitonin-(A) oder Hochsalz-DeoyxBigCHAP-(B) Puffer solubilisiert und anschließend durch eine Saccharose-Gradienten-Zentrifugation aufgetrennt. Die einzelnen Fraktionen der Gradienten wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblotting mit den angegebenen Antikörpern analysiert. Fraktionen, die ribosomale Proteine enthielten, sind mit einem schwarzen Kasten umrahmt. „P“ steht für Pellet.
Abb. 27: Ein Teil des Sec61-Komplexes ist mit Sec62 und Sec63 assoziiert.
A) Analyse von Proteinen, die mit Sec63 (Bahn 1) oder Sec62 (Bahn 2) in Digitonin solubilisierten RM assoziiert sind. 2500eq Saponin-Hochsalz gewaschener Rinder-RM wurden in 2,5 % Digitonin, H50 K500 Mg10 Gly10 beta-Me5 Pi solubilisiert und anschließend Ribosomen und RAMPs abgetrennt (30 min, 100.000 rpm im TLA 100.3 Rotor). Der Überstand wurde über eine anti-Sec63 Antikörpersäule bzw. eine anti-Sec62 Antikörpersäule gegeben. Die gebundenen Proteine wurden entweder durch Zugabe von 1 % Triton X-100 in 100 mM Glycin pH 2,2 (Bahn 1) oder bei pH 7,8 mit einem Überschuß an Peptid, gegen welches die Antikörper gerichtet waren (Bahn 2), eluiert. Die Eluate wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend Coomassie-gefärbt. Die einzelnen Proteinbanden wurden durch Edman-Abbau mit vorheriger Trypsin-Spaltung analysiert.
B) Coimmunopräzipitation von Sec62 und Sec63 mit dem Sec61-Komplex. Rinder-RM wurden in 1,5 % DeoxyBigCHAP, H50 K450 Mg12,5 Gly10 beta-Me5 Pi solubilisiert und unlösliches Material durch eine „Low-Speed“ Zentrifugation abgetrennt. Vom Extrakt (Total) wurden anschließend Ribosomen und RAMPs durch Zentrifugation abgetrennt (Pellet). Der resultierende Überstand wurde nach Verdünnung mit einem Volumen H50 an eine anti-Sec63 Antikörpersäule bzw. eine anti-Sec61beta Antikörpersäule gebunden (Durchlauf und Eluat). Aliquots (entsprechend 2,5 eq RM) der einzelnen Fraktionen sowie der Eluate der Antikörpersäulen wurden mittels SDS-PAGE und Immunoblotting mit Antikörpern gegen die angegebenen Proteine analysiert. Bahn 8 (Eluat x2) enthält die doppelte Menge an Material.
Abb. 28: Der Sec62-Sec61beta Crosslink ist nicht ribosomenassoziiert.
Hunde RM wurden mit 50 µM Bis-Maleinimidhexan (BMH) behandelt. Proben der quervernetzten RM sowie scheinbehandelter RM wurden in 2 % Digitonin und H50 K500 M10 Gly10 ß-Me5 Pi solubilisiert und anschließend für 5 min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert (14.000 rpm). Der Extrakt (E) wurde danach für 10 min bei 100.000 rpm (TLA100 Rotor) zentrifugiert und der resultierende Überstand (Ü) sowie das Pellet (P) mittels SDS-PAGE und Immunoblotting mit anti-Sec62 oder anti-Sec61beta-Antikörpern analysiert. Die Zuordnung der bekannten Sec61beta-Crosslinkprodukte im Immunoblot mit anti Sec61beta Antikörpern erfolgte nach den Daten von Kalies et al. (1998).
Abb. 29: Sec62 und Sec63 sind im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert.
A) Nachweis von Sec62 und Sec63 in verschiedenen Geweben. Jeweils 70 µg angereicherte Membranfraktionen aus verschiedenen Rattengeweben oder 3 eq RM aus unterschiedlichen Rindergeweben wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend im Immunoblot mit den angegebenen Antikörpern analysiert.
B) Zellfraktionierung von Rinder-Lebergewebe. Das Gewebe wurde wie in Material und Methoden beschrieben aufgearbeitet. Proben der einzelnen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE und Immunoblotting mit den angegebenen Antikörpern analysiert. Der Immunoblot mit anti TRAPalpha Antikörpern zeigte, daß die Fraktion glatter Mikrosomen frei von rauhem ER ist. Das Existenz von P450 (CytP450) in der glatten Mikrosomenfraktion weist darauf hin, daß glattes ER enthalten ist.
Abb. 30: Untereinheiten der biochemisch isolierten SP-Komplexe aus Hefe, Hund und Vogel.
Die zueinander homologen Untereinheiten aus den verschiedenen Komplexen befinden sich jeweils auf gleichen Ebenen. Die Pfeile mit den angegebenen Zahlen geben die jeweilige prozentuale Identität zwischen den Hefe- und Hundeproteinen wieder. Glycosylierte Proteine sind durch einen Stern markiert. Quellen: Böhni et al., 1988; Kalies und Hartmann, 1996 und Dalbey et al., 1997.
Abb. 31: Schematische Darstellung von LepB, Sec11p und Spc3p.
In den Proteinen sind jeweils die Positionen der für Typ I Signalpeptidasen charakteristischen konservierten Boxen I bis III durch Umrahmungen dargestellt. Die zusätzlich mit „?“ gekennzeichneten Boxen deuten an, daß in diesen Fällen nur schwache Homologien existieren. Die grau unterlegten Bereiche in den Proteinen LepB und Spc3p stellen den homologe Bereiche zwischen den beiden Proteinen dar (nach Valkenburgh et al., 1999). Die schwarzen Abschnitte im Protein stellen die Transmembransegmente dar.
Abb. 32: Mögliche Funktion von Sbh2p bei der Interaktion mit dem SP-Komplex.
In der ER-Membran liegt nicht die gesamte Population von Sbh2p fest assoziiert im Ssh1-Komplex vor, sondern ein Teil interagiert über Spc2p mit dem SP-Komplex. Dadurch wird es wahrscheinlich dem SP-Komplex erleichtert, während des Translokationsprozesses engen Kontakt zu der im Translokationskanal befindlichen Signalsequenz aufzunehmen. Desweiteren kann nicht ausgeschlossen werden, daß es freies Sbh2p in der Membran gibt.
Abb. 33: Mögliche Funktion des pentameren Säuger- Sec61/62/63 Komplexes.
Abb. 34: Vergleich der wichtigsten Komponenten für den Proteintransport durch die eukaryontische ER-Membran bei Säugerzellen und Hefe (S. cerevisiae) bzw. der prokaryontischen Plasmamembran der Eubakterien (E. coli). Die in der Arbeit neu gefundenen Untereinheiten sind rot hervorgehoben.
Abb. 35: Ausgewählte Subkomplexe des ER-Translokons aus Hefe und Säuger
A) In der Hefe S. cerevisiae sowie im Säuger bildet der trimere Sec61-Komplex (bläulich eingefärbt) die Zentrale Pore für den cotranslationalen Transport von Proteinen durch die ER-Membran. Die Hefe S. cerevisiae besitzt darüber hinaus noch den Ssh1-Komplex dessen Untereinheiten Homologe zu den Untereinheiten des Sec61-Komplexes darstellen. Der posttranslationale Transport von Proteinen durch die ER-Membran erfolgt in der Hefe mittels des Sec-Komplex. Der Sec-Komplex setzt sich aus dem trimeren Sec61-Komplex und dem tetrameren Sec62/63-Subkomplex (rötlich eingefärbt) zusammen. Das luminal Hsp70-Homologe Kar2p (gelb) wird für den effizenten Transport der Proteine benötigt. In Säugermembranen wurde ein Komplex identifiziert, der strukturelle Ähnlichkeiten zum Sec-Komplex der Hefe aufweist, es konnte jedoch noch nicht gezeigt werden, das der Sec61/62/63-Komplex Funktionshomolog zum Sec-Komplex ist.
B) In der Hefe so wie im Säuger besteht die Signalpeptidase aus einem heteromern Membranprotein-Komplex (gelb-bräunlich eingefärbt).

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Fri Feb 7 16:58:24 2003