Meyer, Hellmuth-Alexander: Identifizierung und Charakterisierung evolutionär konservierter Komponenten des Protein-Translokationsapparates im Endoplasmatischen Retikulum

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Kapitel 2. Einleitung

Die eukaryontische Zelle besitzt verschiedenste Kompartimente, in denen Stoffwechselwege effektiv und ohne gegenseitige Beeinflussung ablaufen können. Jedes dieser Kompartimente wie z. B. Zellkern, Endoplasmatisches Retikulum (ER), Golgi-Apparat, Mitochondrien oder Peroxisomen, ist von mindestens einer Membran umschlossen, die sich aus Lipiden und Proteinen zusammensetzt. Da Membranen Diffusionsbarrieren darstellen, müssen spezifische Transportmechanismen den Austausch von Metaboliten mit der Umgebung gewährleisten. Der Transport von Proteinen durch die Membran benötigt dabei komplexere Translokationssysteme als der Austausch von Ionen oder Stoffwechselprodukten.

Man kennt heute eine Reihe von Translokationssystemen in Pro- sowie Eukaryonten, die den zielgerichteten Transport von Proteinen durch Membranen ermöglichen. Viele dieser Translokationssysteme sowie auch die jeweiligen Transportsubstrate weisen gemeinsame Charakteristika auf. Die zu transportierenden Proteine enthalten in ihren Aminosäuresequenzen ein Sortierungssignal, wodurch sie an die Oberflächen der jeweiligen Bestimmungsorganellen zielgeleitet werden. An der Zielmembran angelangt, sorgt ein „Targeting-System“ dafür, daß die Proteine zum eigentlichen Translokationskanal weitergeleitet werden. Der Translokationskanal besteht aus einem porenbildenden Membranproteinkomplex, der sich zum Zielkompartiment hin öffnen kann. Der Transport durch die Membran ist energieabhängig, die Energie wird dabei in Form von ATP oder GTP bereitgestellt. Nach dem Membrandurchtritt werden die Proteine im Zielkompartiment gefaltet und gegebenenfalls noch weiter modifiziert. Translokationssysteme, die nach diesen Grundzügen funktionieren, wurden unter anderem in Mitochondrien, Plastiden sowie dem Endoplasmatischen Retikulum gefunden.

2.1 Transport von Proteinen in das Lumen des ER

In Eukaryonten werden Proteine des Sekretorischen Weges vom Cytoplasma über die ER-Membran zuerst ins Lumen des ER transportiert (Palade, 1975). Von dort aus erfolgt der Weitertransport in andere Kompartimente wie Golgi-Apparat, Lysosomen, Endosomen oder zur Plasmamembran über Vesikulations- und Fusionsvorgänge. Gleiches gilt auch für Membranproteine, deren endgültiger Bestimmungsort eines der oben genannten Kompartimente ist. Die Membranproteine werden zuerst in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums inseriert und über Transportvesikel zum Zielkompartiment transportiert.

2.1.1 Transportsignale für den Transport ins ER

Proteine, die für den Transport ins ER bestimmt sind, besitzen in ihrer Aminosäuresequenz ein Signal, das sie spezifisch zur ER-Membran zielleitet (Signalhypothese: Blobel und Dobberstein, 1975). Bei sekretorischen Proteinen besteht das Signal aus einem 15 bis 40 Aminosäuren langen N-terminal lokalisierten Signalpeptid. Obwohl die Primärstruktur der Signalsequenz nicht konserviert ist, können drei verschiedene Bereiche unterschieden werden: ein zentraler hydrophober Kern wird N-terminal von positiv geladenen Aminosäuren und C-terminal von polaren Aminosäuren flankiert (von Heijne, 1985; Haeuptle et al. 1989). In den meisten Fällen wird die Signalsequenz nach dem Membrandurchtritt proteolytisch vom eigentlichen Protein abgespalten. Die Schnittstelle wird dabei durch kleine Aminosäurereste in den Positionen -3 und -1 der C-terminalen polaren Region der Signalsequenz definiert (von Heijne, 1990).

In der Hefe S. cerevisiae wurde gezeigt, daß die Signalsequenz nicht nur den Transportprozeß initiiert, sondern auch festlegt, wie das entsprechende Protein ins ER transportiert wird (Feldheim und Schekman, 1994; Ng et al., 1996). Man unterscheidet zwischen einem cotranslationalen Mechanismus, bei dem Proteine während ihrer Synthese an membrangebundenen Ribosomen durch die Membran gelangen, und einem posttranslationalen Mechanismus, bei dem zuerst vollständig im Cytoplasma synthetisierte Proteine durch die Membran transportiert werden. Proteine mit hydrophoberen Signalsequenzen werden bevorzugt cotranslational und Proteine mit hydrophileren Signalsequenzen überwiegend posttranslational transportiert (Ng et al., 1996).


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Bei Membranproteinen, die keine Signalsequenz besitzen, übernimmt gewöhnlich die erste Transmembrandomäne die Funktion der Signalsequenz. Das auch als Signalankersequenz bezeichnete Segment zeichnet sich durch einen längeren hydrophoben Kernbereich, sowie eine fehlende Signalpeptidaseschnittstelle gegenüber der normalen Signalsequenz aus (Wickner und Lodish, 1985; Lipp et al., 1989; Andersson und von Heijne, 1994; Spiess, 1995).

Der Großteil der Proteine, die zum ER transportiert werden, besitzt N-terminal orientierte Signal- oder Signalankersequenzen. Jedoch gibt es auch integrale Membranproteine, die ohne N-terminale Signalsequenz in die ER Membran inseriert werden. Bei diesen Proteinen erfolgt die Erkennung über ein C-terminal gelegenes hydrophobes Segment. Wie diese Proteine in die ER-Membran inserieren, ist bisher jedoch noch nicht geklärt (Kutay et al. 1993, 1995).

2.1.2 Der cotranslationale Proteintransport in das ER

Beim cotranslationalen Proteintransport werden die Proteine noch während ihrer Synthese am Ribosom durch die ER-Membran transportiert (Abb. 1). Der Transportprozeß beginnt mit der spezifischen Erkennung der N-terminalen Signalsequenz. Sobald die Signalsequenz an der Oberfläche des Ribosoms erscheint, wird sie vom Signalsequenzerkennungspartikel (SRP) gebunden, das im Säuger aus sechs Proteinen und einer 7s RNA besteht (Walter und Blobel, 1980; 1981; 1982; von Heijne, 1995). Das gebundene SRP interagiert dabei nicht nur mit der Signalsequenz, sondern auch mit dem Ribosom, wodurch die Synthesegeschwindigkeit der naszierenden Polypeptidkette drastisch herabgesetzt wird. Das SRP ist somit in der Lage, das Ribosom zur ER-Membran zielzuleiten, ohne daß vorher das zu transportierende Protein fertiggestellt wird (Walter et al., 1981). An der ER-Membran angelangt, interagiert der Komplex aus Ribosom, naszierender Peptidkette und SRP auf zweifache Weise mit der Membran. Zum einen wird das SRP von seinem membranständigen Rezeptor (SRP-Rezeptor) gebunden (Meyer et al., 1982; Gilmore et al., 1982), zum anderen interagiert das Ribosom direkt mit dem tunnelbildenden Sec61-Komplex (Görlich et al., 1992a; Kalies et al., 1994, Jungnickel und Rapoport, 1995; Prinz et al., 2000). Nachdem SRP und SRP-Rezeptor aneinander gebunden haben, löst sich das SRP unter GTP-Hydrolyse vom Ribosom und übergibt die naszierende Polypeptidkette an den eigentlichen Translokationsapparat (Connolly und Gilmore, 1989; Rapiejko und Gilmore, 1997).

Im Säugersystem konnte in Rekonstitutionsexperimenten gezeigt werden, daß neben dem SRP-Rezeptor nur noch zwei weitere Komponenten in der Membran benötigt werden, um Proteine in vitro cotranslational zu transportieren. Es handelt sich dabei um das TRAM-Protein (translocating chain-associated membrane protein) und um den heterotrimeren Sec61-Komplex (Görlich und Rapoport, 1993). Quervernetzungsexperimente sowie elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten, daß der Sec61-Komplex den Kanal bildet, durch den die Proteine hindurchtransportiert werden. Die Kanalpore wird dabei von 3 bis 4 heterotrimeren Sec61-Komplexen gebildet, die im elektronenmikroskopischen Bild als ringförmige Struktur erscheinen (Abb. 2 B) (High et al., 1991, 1993; Kellaris et al., 1991; Mothes et al., 1994, 1998; Nicchitta et al., 1995; Hanein et al., 1996).

Die Insertion der naszierenden Kette in den Translokationskanal erfolgt in zwei Schritten. Zu Beginn des Translokationsprozesses ist die Bindung zwischen Sec61-Komplex und Ribosom relativ schwach. Die Ribosomen können durch eine Hochsalzbehandlung von der Membran abgewaschen werden. Erst wenn die naszierenden Kette eine Länge von ca. 70 Aminosäuren erreicht hat und eine funktionelle Signalsequenz vorhanden ist, wird die Bindung zwischen Ribosom und Sec61-Komplex hochsalzresistent. Gleichzeitig öffnet sich der Translokations-
kanal zur luminalen Seite des ER (Crowley et al., 1994; Jungnickel und Rapoport, 1995). Durch elektronenmikroskopische Aufnahmen konnte gezeigt werden, daß das Ribosom so auf der Membranpore sitzt, daß der Sec61-Kanal eine Verlängerung des Ribosomenkanals darstellt (Beckmann et al., 1997). Die GTP-abhängige Synthese der naszierenden Kette am Ribosom reicht als alleinige Kraft aus, um die naszierende Polypeptidkette ins Lumen des ER zu transportieren.


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Abb. 1: Modell des cotranslationalen Proteintransportes durch die ER-Membran in Säugerzellen.
(1)
Die Signalsequenz der wachsenden Polypeptidkette wird vom SRP erkannt und gebunden. Gleichzeitig interagiert das SRP auch mit dem Ribosom, wodurch es zu einem Elongationsarrest kommt. (2) Der Komplex aus Ribosom, naszierender Polypeptidkette und SRP bindet an die ER-Membran, wobei das SRP mit seinem membranständigen Rezeptor und das Ribosom mit dem Sec61-Komplex interagiert. (3) Unter GTP-Hydrolyse wird die Signalsequenz vom SRP auf den Sec61-Komplex übertragen. Es erfolgt ein zweiter Signalsequenzerkennungsschritt durch den Sec61-Komplex. (4) Der Translokationskanal öffnet sich zum ER-Lumen. Der N-Terminus der naszierenden Kette liegt in einer Haarnadelkonformation vor, wobei der eine Teil der Schleife von der Signalsequenz und der andere Teil von den C-terminal nachfolgenden Abschnitten der Polypeptidkette gebildet wird. Die Signalsequenz interagiert dabei mit Sec61alpha, TRAMp und Membranlipiden. Durch die weitere Elongation der Polypeptidkette wird der C-terminale Bereich der Schleife durch die Membran geschoben. Die Signalsequenz wird dabei vom restlichen Protein durch den Signalpeptidase-Komplex (SP-Komplex) abgespalten. (5) Anschließend wird die restliche naszierende Polypeptidkette direkt durch den von Ribosom und Sec61-Komplex gebildeten Kanal ins Lumen des ER transportiert.

2.1.2.1 Der Sec61-Komplex

Zentrale Komponente des eukaryontischen ER-Translokationsapparates ist der heterotrimere Sec61-Komplex, der im Säuger aus den Untereinheiten Sec61alpha, Sec61beta und Sec61gamma gebildet wird (Abb. 2A). Bei Sec61alpha handelt es sich um ein multimembranspannendes Protein mit 10 Transmembransegmenten, wobei der C- und N-Terminus jeweils im Cytoplasma lokalisiert sind. Die große Anzahl an Transmembranbereichen prädestiniert die alpha-Untereinheit dazu, den eigentlichen Translokationskanal zu bilden. Sec61beta und Sec61gamma besitzen jeweils nur eine Transmembrandomäne nahe dem luminal liegenden C-Terminus (Görlich et al. 1992a; Görlich und Rapoport, 1993). Beide Proteine gehören außerdem zu der Gruppe von Membranproteinen, die nicht über eine N-terminale Signal(anker)sequenz, sondern über ein C-terminal gelegenes hydrophobes Segment in die Membran inserieren werden (Hartmann et al., 1994).


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Abb. 2: Der Sec61-Komplex aus Säugerzellen.
A) Schematische Darstellung des Sec61-Komplexes. Der Komplex besteht aus den drei Membranproteinen Sec61 alpha, beta und gamma. Die Transmembransegmente der Proteine sind als graue Zylinder dargestellt. B) Errechnete elektronenmikroskopische Durchschnittsdarstellung der Sec61-Pore aus 125 Einzelobjekten. Die Masseschwerpunkte sind durch schwarze Punkte gekennzeichnet. Die Ringstruktur in der Membran setzt sich aus drei bis vier Sec61-Komplexen zusammen (Hanein et al., 1996).

In einer Vielzahl von eukaryontischen Organismen wurden homologe Proteine zu den Untereinheiten des Säuger Sec61-Komplexes identifiziert. In der Hefe S. cerevisiae wird der Komplex aus den Untereinheiten Sec61p, Sbh1p (Sec sixty-one beta homolog) und Sss1p (Sec-sixty-one suppressor) gebildet (siehe Faltblatt im Anhang: Abb. 35). Durch Deletionsmutanten konnte gezeigt werden, daß die Proteine Sec61p und Sss1p essentiell für das Überleben der Hefezelle sind (Stirling et al., 1992; Esnault et al., 1993). Sss1p ist das Hefe-Homologe zur gamma-Untereinheit des Säugers (43% identische Aminosäuren). Die beiden Proteine sind so stark konserviert, daß das Sec61gamma in Hefezellen die Funktion des Sss1p ersetzen kann (Hartmann et al., 1994).

Mittels chemischer Quervernetzungsexperimente konnte gezeigt werden, daß Sss1p mit den Transmembranbereichen TM6, TM7 und TM8 von Sec61p interagiert (Wilkinson et al., 1996). Von Sec61p ist desweiteren bekannt, daß die Transmembrandomänen TM2 und TM7 des Proteins mit einer im Kanal gebundenen Signalsequenz quervernetzt werden können (Plath et al., 1998). Die Bindungsstellen von Sss1p bzw. einer gebundenen Signalsequenz am Sec61p überlappen somit teilweise. Nach einem von Plath et al. (1998) vorgestellten Modell fungiert Sss1p als „Ersatz-Signalsequenz“, die in Abwesenheit eines Transportsubstrates den Kanal verschließt. Während der Signalsequenzerkennung wird Sss1p durch die Signalsequenz des Transportsubstrates verdrängt, wobei sich der Kanal für den Polypeptidtransport öffnet. Die beta-Untereinheit des Sec61-Komplexes, Sbh1p, ist für das Überleben der Hefe nicht essentiell. Auch sind die Homologien zwischen den beta-Untereinheiten der Sec61-Komplexe aus Säuger und Hefe weniger deutlich ausgeprägt (22 % identische Aminosäuren) als bei den beiden anderen Untereinheiten (Finke et al., 1996).

In der Hefe S. cerevsiae existiert noch ein zweiter Komplex, der Homologien zum Sec61-Komplex besitzt. Es handelt sich um den Ssh1-Komplex, bestehend aus Ssh1p (Sec sixty-one homolog), Sbh2p (Sec sixty-one beta homolog) und Sss1p (siehe Faltblatt im Anhang: Abb. 35). Die Untereinheit Ssh1p ist homolog zum Sec61p (32 % identische Aminosäuren) und Sbh2p zu Sbh1p (52% identische Aminosäuren). Sss1p findet man sowohl im Ssh1- als auch im Sec61-Komplex der Hefe. Da die alleinige Deletion des SEC61-Gens für die Zelle lethal ist, scheint der Ssh1-Komplex die Funktion des Sec61-Komplex in der Hefe nicht ersetzten zu können. Hingegen sind SSH1 und SBH2 nicht für das Überleben der Zelle essentiell (Finke et al., 1996).


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Im Gegensatz zum Sec61-Komplex kann der Ssh1-Komplex nicht mit dem Sec62/63 Subkomplex (siehe 2.1.3) assoziieren. Der Ssh1-Komplex ist daher wahrscheinlich nur am cotranslationalen Transport in der Zelle beteiligt, während der Sec61-Komplex sowohl für co- als auch für posttranslationalen Transport zur Verfügung steht. Es wird vermutet, daß der Ssh1-Komplex in der ER-Membran eine regulatorische Funktion übernimmt, indem er das Verhältnis zwischen co- und posttranslationalem Transport in der Zelle beeinflußt (Panzner et al., 1995; Finke et al., 1996).

Homologe Proteine zum Säuger Sec61alpha sowie Sec61gamma wurden nicht nur in Eukaryonten gefunden, sondern auch in Archaebakterien, Eubakterien und Chloroplasten. Die bakteriellen Homologen von Sec61alpha und Sec61gamma, SecY und SecE, bilden zusammen mit SecG den bakteriellen SecYEG Komplex, der essentiell für den Proteintransport durch die Plasmamembran der Bakterienzelle ist. Der Sec61-Komplex gehört somit zu einer Gruppe von Translokationskomplexen, die sich wahrscheinlich sehr früh in der Evolution entwickelt haben und in allen Reichen vertreten sind (Pohlschröder et al., 1997).

2.1.2.2 Das TRAM Protein

Im Säugersystem wird für den erfolgreichen Transport bestimmter Testsubstrate in vitro neben dem Sec61-Komplex und dem SRP-Rezeptor auch noch das TRAMp-Protein benötigt (Görlich et al., 1992b). Ob ein Protein TRAMp-abhängig transportiert wird, hängt von der Beschaffenheit der jeweiligen Signalsequenz ab (Voigt et al., 1996). Neben der Interaktion von TRAMp mit der Signalsequenz spielt das Protein auch eine Rolle bei der cotranslationalen Integration von Membranankern in die Lipidschicht (High et al., 1993; Mothes et al., 1994; Do et al., 1996; Knight und High, 1998; Heinrich et al., 2000), sowie beim so genannten „pausing“-Prozeß. Der „pausing“-Prozeß beschreibt das Phänomen, daß in einigen Fällen der cotranslationale Transport diskontinuierlich verläuft. Spezifische Signale im Protein führen zum zeitweiligen Stop des Transports der Polypeptidkette durch die Membran, wobei jedoch gleichzeitig die Synthese des Proteins am Ribosom normal weiterläuft. „Pausing“ findet nur abhängig vom TRAMp statt (Hedge et al., 1998). Die während des „pausing“-Prozeß im Cytoplasma akkumulierten Domänen des zu transportierenden Proteins müssen nach Wiederaufnahme der Translokation wahrscheinlich posttranslational ins Lumen des ER transportiert werden. In welcher Form dies geschieht und welche Faktoren in der Säugerzelle dafür benötigt werden, ist bisher noch unbekannt.

2.1.3 Der posttranslationale Proteintransport in das ER

Im Gegensatz zum cotranslationalen Transport werden beim posttranslationalen Transport die Proteine vollständig im Cytoplasma synthetisiert und erst anschließend durch die ER-Membran transportiert. Der Großteil der heute vorhandenen Erkenntnisse über diese Form des Transportes stammt aus Untersuchungen, die in der Hefe S. cerevisiae durchgeführt wurden.

Wie bereits erwähnt, bestimmt die Signalsequenz, ob ein sekretorisches Protein co- oder posttranslational in das ER transportiert wird. Bei hydrophileren Signalsequenzen scheint die Affinität des SRP zur Signalsequenz geringer ausgeprägt zu sein, wodurch es zu keiner festen Bindung und somit zu keinem Translationsarrest kommt. Das Protein wird vollständig im Cytoplasma synthetisiert und vom Ribosom abgelöst. Um das Transportsubstrat in einem translokationskompetenten Zustand zu halten, binden wahrscheinlich cytosolische Chaperone der Hsp70-Familie (Deshaies et al., 1988; Chirico, 1992). Über den nachfolgenden Prozeß der Zielleitung des Proteins zur ER-Membran ist wenig bekannt. Die gebundenen cytosolischen Faktoren scheinen jedoch für den eigentlichen Transport durch die ER-Membran keine essentielle Rolle zu spielen, da durch Harnstoff denaturierter PräPro-alpha-Faktor in vitro genau so effizient posttranslational transportiert wird wie das native Protein (Chirico et al., 1988).

Rekonstitutionsexperimente mit aufgereinigten Komponenten aus Hefemikrosomen zeigten, daß neben dem luminalen Chaperon Kar2p und ATP ein spezieller Membrankomplex benötigt wird, um in vitro posttranslational PräPro-alpha-Faktor zu transportieren. Bei diesem Komplex handelt es sich um den hetero-heptameren Sec-Komplex, der sich aus dem trimeren Sec61-Komplex und dem tetrameren Sec62/Sec63-Komplex zusammensetzt (Deshaies et al. 1991; Panzner et al., 1995; Wittke et al., 1999). Der Sec-Komplex bildet dabei, ähnlich wie das Ribosom mit dem Sec61-Komplex, ringförmige Strukturen in der Membran aus (Hanein et al., 1996).


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Der eigentliche posttranslationale Transport der Proteine durch die ER-Membran erfolgt in zwei Schritten (Abb. 3). Zuerst bindet das zu transportierende Protein, Kar2p- und ATP-unabhängig an den Sec-Komplex, wobei die cytosolisch liegenden Komponenten des Sec62/Sec63-Subkomplexes wahrscheinlich eine Art „Signalsequenz-Antenne“ in der Membran bilden (Lyman und Schekman, 1997; Dünnwald et al., 1999). Durch Quervernetzungsstudien konnte gezeigt werden, daß die Signalsequenz des Proteins während dieser Phase von der großen Untereinheit des Sec61-Komplexes erkannt und gebunden wird (Plath et al., 1998). Im zweiten Schritt des Transportprozesses wird die gebundene Polypeptidkette wie beim cotranslationalen Transport durch den vom Sec61-Komplex gebildeten Kanal bewegt, wobei für einen effizienten Transport zusätzlich Kar2p und ATP benötigt werden. Beim Kar2p handelt es sich um ein Hsp70 homologes Protein, das sowohl in vivo als auch in vitro für den posttranslationalen Transport benötigt wird (Vogel et al., 1990; Sanders et al., 1992; Panzner et al., 1995). Die ATP gebundene Form des Kar2p bindet an die im Lumen des ER liegende DnaJ homologe Domäne des Sec63p Proteins aus dem Sec62/63-Subkomplex und wird unter ATP-Hydrolyse mit geringer Sequenzspezifität auf die Polypeptidkette des zu translozierenden Proteins übertragen (Lyman und Schekman, 1997; Matlack et al., 1997; Misselwitz et al. 1998).

Abb. 3: Modell des posttranslationalen Proteintransportes durch die ER-Membran der Hefe S. cerevisiae. (1) Das zu transportierende Protein wird vollständig im Cytoplasma synthetisiert und durch cytosolische Chaperone in einem translokationskompetenten Zustand gehalten. Die Signalsequenz des Proteins wird in einem ATP und Kar2p unabhängigen Schritt vom Sec-Komplex erkannt und gebunden. (2) Der N-Terminus der Polypeptidkette inseriert vermutlich in Form einer Haarnadel in den vom Sec61-Subkomplex gebildeten Translokationskanal. (3) Die eigentliche Translokation der Polypeptidkette durch die ER-Membran erfolgt in einem ATP- und Kar2p- abhängigen Prozeß. Das luminal vorkommende Kar2p wird durch die DnaJ Domäne des Sec63p zur Bindung von Peptiden aktiviert. Sobald die zu transportierende Polypeptidkette auf der luminale Seite der ER-Membran heraustritt, wird Kar2p unter ATP-Spaltung auf diese Bereiche übertragen, wodurch ein zurückgleiten der Kette verhindert wird (molekulare Ratsche). Durch das sukzessive Binden von weiteren Kar2p Proteinen wird die ungerichtete Brownsche Molekularbewegung der Polypeptidkette im Translokon in einen gerichteten Transportprozeß umgewandelt.


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Für das Modellprotein PräPro-alpha-Faktor konnte in vitro gezeigt werden, daß der Transport durch die ER-Membran nach dem Prinzip der Brownschen Ratsche erfolgt (Matlack et al., 1999). Das Transportsubstrat kann infolge der Brownsche Molekularbewegung im Translokonskanals frei in beide Richtungen diffundiert. Erst durch die Anlagerung des luminalen Kar2p an die Polypeptidkette entsteht ein gerichteter Transportprozeß, da im Lumen befindliche Bereiche der Polypeptidkette durch das gebundene Kar2p nicht mehr in den Kanal zurückgleiten können. Durch das sukzessive Binden von weiteren Kar2p Proteinen an die Polypeptidkette erfolgt der Transport des Proteins ins Lumen des ER.

2.1.3.1 Der Sec-Komplex

Der Sec-Komplex setzt sich aus dem trimeren Sec61-Komplex und dem tetrameren Sec62/63-Subkomplex zusammen (Abb. 4). Letzterer besteht aus den Proteinen Sec62p, Sec63p, Sec71p sowie Sec72p (Deshaies et al., 1991; Panzner et al., 1995; Wittke et al., 1999). Während der Sec61-Komplex die Pore in der Membran bildet, übernimmt der Sec62/63-Subkomplex zusätzliche Funktionen, die für den posttranslationalen Transport benötigt werden. Defekte im Sec62/63-Subkomplex führen teilweise zur Akkumulation von Vorstufenproteinen im Cytosol. Der Verlust von SEC62 oder SEC63 ist lethal, Zellen mit delektiertem SEC71 oder SEC72 sind hingegen noch lebensfähig (Rothblatt et al., 1989; Green et al., 1992; Kurihara und Silver, 1993; Fang und Green, 1994).

Abb. 4: Schematische Darstellung des Sec-Komplexes der Hefe S. cerevisiae.
Der heptamere Sec-Komplex setzt sich aus zwei Subkomplexen zusammen, dem trimeren Sec61-Komplex und dem tetrameren Sec62/63-Subkomplex. Die Transmembransegmente der Proteine sind als graue Zylinder dargestellt. Die DnaJ-homologe Domäne des Sec63p interagiert mit dem luminalen Chaperon Kar2p. Sec71p liegt als Glycoprotein in der Membran vor, was durch die angehefteten Kreise symbolisiert wird. Sec72p wird wahrscheinlich über die Bindung zum Glycoprotein Sec71p in der ER-Membran verankert.

Sec62p ist ein 32 kDa großes Protein und besitzt zwei Transmembranbereiche. Der C- sowie der N- Terminus des Proteins sind im Cytoplasma lokalisiert. Durch die eng beieinander liegenden Membrananker befindet sich der Hauptteil des Proteins im Cytosol. Sec62p ist essentiell für das Überleben der Hefezelle. Membranen einer temperatursensitiven Sec62-Mutante zeigen in vitro je nach Testsubstrat unterschiedlich starke Transportdefekte (Deshaies et al., 1989,1990).


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Sec71p ist ein integrales Membranprotein mit nur einem Transmembranbereich. Der N-Terminus des Proteins liegt im ER-Lumen und ist zweifach glycosyliert. Der Deltasec71 Stamm ist lebensfähig, zeigt jedoch ein temperatursensitives Wachstum und in vivo Translokationsdefekte (Feldheim et al., 1993; Fang und Green, 1994). Sec71p scheint für die Stabilität von Sec72p eine wichtige Rolle zu spielen, da im Deltasec71 Stamm neben Sec71p auch kein Sec72p in der Membran nachzuweisen ist. Feldheim und Schekman (1994) konnten in diesem Zusammenhang zeigen, daß Sec72p mit einer Halbwertzeit von 12 min in der Zelle abgebaut wird, wenn Sec71p in der Membran fehlt.

Im Gegensatz zu den anderen Komponenten des Sec-Komplexes ist Sec72p kein Membranprotein. Das 21 kDa große Sec72p befindet sich auf der cytosolischen Seite der ER-Membran. Die Bindung zwischen Sec72p und den restlichen Komponenten des Sec-Komplexes ist sehr stark, selbst Hochsalz oder Alkali-Behandlung der Membran führt nicht zur Dissoziation von Sec72p vom restlichen Komplex (Feldheim et al., 1994). Im Vergleich zum SEC71-Deletionsstamm, zeigt der SEC72 Deletionsstamm kein temperatursensitives Wachstum. Desweiteren sind auch die in vivo Translokationsdefekte schwächer ausgeprägt als im SEC71 Deletionsstamm (Fang und Green, 1994). In Quervernetzungsexperimenten konnte gezeigt werden, daß die C-terminale Hälfte der Signalsequenz des PräPro-alpha-Faktors während der Bindung an den Sec-Komplex mit Sec62p sowie Sec71p und Sec72p interagiert (Münsch et al., 1992; Lyman und Schekman, 1997). In einem vom Lyman und Schekman (1997) vorgestellten Modell übernimmt Sec62p zusammen mit Sec71p und Sec72p dabei die Funktion einer Signalsequenzantenne für posttranslationale Transportsubstrate.

SEC63 wurde wie auch SEC61 und SEC62 als essentielles Gen in Screens auf Mutanten mit Defekten in der Translokation gefunden (Rothblatt et al., 1989). Das 75 kDa große Sec63p besitzt drei Transmembranbereiche, wobei der N-Terminus des Proteins sich im Lumen des ER befindet und der C-Terminus im Cytoplasma. In der luminalen Schleife zwischen dem zweiten und dritten Membrananker befindet sich eine DnaJ-homologe Domäne (Sadler et al., 1989; Feldheim et al., 1992). Sec63p interagiert über seine DnaJ-Domäne mit dem luminal vorkommenden Hsp70 Homologen Kar2p und bildet so mit die Grundlage für den posttranslationalen Translokationsprozeß nach dem oben vorgestellten Prinzip der Brownschen Ratsche (Scidmore et al., 1993; Matlack et al., 1997, 1999).

Der Sec62/63 Subkomplex ist essentiell für den posttranslationalen Transport in der Hefe. Ng und Walter (1996) konnten interessanterweise zeigen, daß bestimmte Mutationen im SEC63 Gen oder die Deletion von SEC71 oder SEC72 in der Hefe nicht nur Translokationsdefekte hervorrufen, sondern außerdem die jeweiligen haploiden Hefezellen Defekte im Karyogamieverhalten aufweisen. Dabei handelt es sich um das Phänomen, daß nach der Verschmelzung von haploiden Zellen die Fusion der beiden Zellkerne gestört ist. Die Autoren gehen davon aus, daß die beobachteten Karyogamie-Defekte nicht primär auf Translokationsdefekte zurückzuführen sind, da Mutationen in Sec61p oder Sec62p die Zellkernfusion nicht beeinträchtigen.

Auch im Säugersystem werden bestimmte Proteine posttranslational durch die ER-Membran transportiert. Dabei handelt es sich vor allem um Proteine, die zu kurz sind, um während ihrer Synthese am Ribosom fest mit SRP interagieren zu können (Schlenstedt und Zimmermann, 1987; Müller und Zimmermann, 1988; Zimmermann et al., 1990; Klappa et al., 1991).

Bisher konnten jedoch noch keine zum Sec62/63-Subkomplex analogen Komponenten im Säuger isoliert werden. Die Existenz von ähnlichen Strukturen wie dem Sec-Komplex in höheren Eukaryonten ist jedoch wahrscheinlich. So wurde in der Fruchtfliege D. melanogaster das Protein Dtrp1 (Drosophila translocation protein 1) identifiziert, das nicht nur ein struktur-, sondern sogar auch ein funktionshomologes Protein zum Sec62p der Hefe darstellt (Noel und Cartwright, 1994).

In E. coli erfolgt der posttranslationale Transport von Proteinen durch die Plasmamembran mittels des SecYEG-Komplex und der cytosolisch orientierten ATPase SecA. Das SecA Protein besitzt dabei keinerlei Homologien zu den Untereinheiten des Sec62/63-Subkomplexes. SecA bindet an das Transportsubstrat und schiebt es durch eine Konformationsänderung in den SecYEG-Komplex. Durch die wiederholte Insertion von SecA in die Membran wird das Transportsubstrat dann schrittweise in den periplasmatischen Raum transportiert. Die für den Transportprozeß benötigte Energie wird durch ATP-Hydrolyse bereitgestellt (Joly und Wickner, 1993; Economou und Wickner, 1994; Economou et al., 1995).


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2.1.4 Posttranslationale Modifikationen der Polypeptidkette

Noch während des Transportprozesses durch die ER-Membran wird die Polypeptidkette modifiziert. Sobald die Signalsequenzschnittstelle in das Lumen des ER gelangt, wird das Signalpeptid durch den Signalpeptidase-Komplex (SP-Komplex) spezifisch vom eigentlichen Protein abgespalten. Die Abspaltung der hydrophoben Signalsequenz vom eigentlichen Protein ist für die Zelle essentiell, der Verlust der Signalpeptidaseaktivität führt zum Tod der Zelle (Böhni et al., 1988; Dalbey et al., 1997).

Eine weitere Form der Modifikation im ER-Lumen ist die kovalente Anheftung von Zuckermolekülen an ausgewählte Proteine. Die N-glycosidische Kopplung von Oligosacchariden an die Polypetidkette wird durch den Oligosaccharyltransferase-Komplex (OST-Komplex) vermittelt. Das Oligosaccharid wird enzymatisch auf einen Asparaginrest übertragen, der in der Sequenzfolge Asn-X-Ser oder Asn-X-Thr im Polypeptid vorkommt (X steht dabei für eine beliebige Aminosäure außer Prolin). Die Anheftung der Oligosaccharide erfolgt noch während der Translokation des Proteins durch die ER-Membran, wodurch sichergestellt wird, daß die zu glycosylierenden Stellen für den OST-Komplex optimal zugänglich sind (Kornfeld und Kornfeld., 1985; Varki, 1993; Mellquist et al., 1998; Knauer und Lehle, 1999).

2.1.4.1 Der Signalpeptidase-Komplex

Die Signalpeptidase spaltet im Lumen des ER das Signalpeptid von der restlichen Polypetidkette ab. Im Säuger setzt sich das Enzym aus fünf Membranproteinen zusammen (Abb. 5). Die Untereinheiten SPC12, SPC18, SPC21, SPC22/23 und SPC25 wurden jeweils nach ihren molaren Größen in der SDS-PAGE benannt (Evans et al., 1986). Drei Proteine, SPC18, SPC21 und SPC22/23 besitzen jeweils nur ein Transmembransegment, wobei der N-Terminus im Cytosol und der Großteil des Proteins zusammen mit dem C-Terminus im Lumen des ER lokalisiert ist. Bei SPC18 und SPC21 handelt es sich um fast identische Proteine, sie stellen mit 80 % übereinstimmenden Aminosäuren Isoformen zueinander dar. SPC22/23 ist ein Glycoprotein, das im SDS-PAGE als Doppelbande bei 22 kDa und 23 kDa läuft. Die Masse von SPC22/23 ohne Glycosylierung beträgt 19 kDa (Shelness und Blobel, 1990; Gregory et al., 1993). Die Untereinheiten SPC25 und SPC12 besitzen je zwei Transmembransegmente, wobei die C- und N-Termini der Proteine im Cytoplasma lokalisiert sind. Desweiteren ist der Abstand zwischen den Membranankern in beiden Proteinen so gering, daß SPC25 und SPC12 kaum luminale Bereiche besitzen (Kalies und Hartmann, 1996). SPC18 und SPC21 sind vermutlich Bestandteile des aktiven Zentrums der Signalpeptidase (siehe weiter unten).

Abb. 5: Schematische Darstellung des ER-Signalpeptidase-Komplexes aus Säugerzellen.
Der Komplex besteht im Säuger aus fünf Membranproteinen. Die Transmembransegmente der Proteine sind als graue Kästen dargestellt. SPC22/23 liegt als Glycoprotein vor, was durch den angehefteten Kreis symbolisiert wird.


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Außer im Säuger wurde die Signalpeptidase auch im Vogel und in der Hefe näher analysiert. Aus Huhn-Oviduktzellen wurde ein Signalpeptidase-Komplex gereinigt, der nur aus den zwei Membranproteinen gp23 und p19 besteht. gp23 ist homolog zur Säuger-Untereinheit SPC22/23 und p19 ist homolog zu SPC18 (Baker und Lively, 1987; Lively et al., 1994).

Auch die Hefe S. cerevisiae besitzt einen heteromeren Signalpeptidase-Komplex (SP-Komplex) (YaDeau et al., 1991). Zu Beginn der vorliegenden Arbeit waren zwei Proteine Sec11p und Spc1p charakterisiert. Das zur Säuger-Untereinheit SPC18 homologe Sec11p ist direkt an der Signalpeptidabspaltung beteiligt. Bestimmte Mutationen im Sec11p führen zur Akkumulation von Präkursoren, und der Verlust des Gens ist für die Hefezelle lethal (Böhni et al., 1988). Das nicht essentielle Spc1p ist homolog zur SPC12 Untereinheit des Säugers. Spc1p kann teilweise eine temperatursensitive SEC11 Mutante supprimieren, außerdem konnte biochemisch gezeigt werden, daß Spc1p mit Sec11p in einem Komplex vorliegt (Fang et al., 1996).

Alle Signalpeptidasen, die N-terminale Signalpeptide abspalten, werden in der Gruppe der Typ I Signalpeptidasen zusammengefaßt. Dazu gehören unter anderem die bakteriellen Leaderpeptidasen, die mitochondrialen Signalpeptidasen der inneren Membran sowie die ER-Signalpeptidasen. Die Substratspezifität der Typ I Signalpeptidasen ist stark konserviert: prokaryontische Leaderpeptidasen können Signalsequenzen von eukaryontischen Transportsubstraten abspalten, so wie auch umgekehrt eukaryontische Signalpeptidasen prokaryontische Transportsubstrate prozessieren (Talmadge et al., 1980; Lingappa et al., 1984; Dalbey et al., 1997). Im Gegensatz zu den eukaryontischen Signalpeptidasen bestehen jedoch die prokaryontischen Leaderpeptidasen jeweils nur aus einem Membranprotein, deren bekanntester Vertreter die Leaderpeptidase LepB aus E. coli ist (Zwizinski und Wickner, 1980). Sequenzvergleiche ergaben, daß mehrere Regionen im Hefe Sec11p sowie auch in den Säuger-Untereinheiten SPC21 und SPC18 Homologien zur bakteriellen Leaderpeptidase aufweisen (van Dijl et al.,1992). Mittels Punktmutations-Studien an prokaryontischen Leaderpeptidasen konnte gezeigt werden, daß ein konservierter Serin-Rest sowie ein Lysin-Rest essentiell für die Spaltungsaktivität sind. Die Kristallstrukturanalyse der Leaderpeptidase aus E. coli ergab, daß Serin 90 zusammen mit Lysin 145 das aktive Zentrum der Peptidase bildet (Black, 1993; Paetzel et al., 1997; Sung und Dalbey, 1992; Tschantz et al., 1993; Paetzel et al., 1998). Im Gegensatz zu klassischen Serin-Proteasen fungiert in den Leaderpeptidasen wahrscheinlich Lysin anstelle von Histidin als Base bei der Spaltungsreaktion. Interessanterweise ist in den eukaryontischen ER-Signalpeptidasen zwar der Serin-Rest konserviert, jedoch befindet sich im Sequenz-Alignment in der Position des Lysin ein Histidin (Dalbey et al., 1997). Punktmutations-Studien an Sec11p ergaben außerdem, daß keines der im Protein vorkommenden Lysine essentiell für die Spaltungsaktivität ist. Als essentiell für die Spaltung wurden hingegen Serin 44, Histidin 83, Asparaginsäure 103 und Asparaginsäure 109 identifiziert, was eher für eine klassische Serin-Protease spricht (van Valkenburgh et al., 1999). Bemerkenswert ist jedoch in diesem Zusammenhang, daß die ER-Signalpeptidasen von keinem der klassischen Serin-Protease-Inhibitoren inhibiert werden (Jackson und Blobel, 1980).


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2.2 Zielsetzung

In den letzten Jahren gelang es, die Hauptkomponenten der im rauhen ER befindlichen Translokationsapparate (Translokon) zu identifizieren. Bei vielen der gefundenen Subkomplexe des Translokons ist inzwischen bekannt, an welchen generellen Teilschritten des Proteintransportes sie beteiligt sind. Der posttranslationale Transport von löslichen Proteinen wurde vor allem in der Hefe S. cerevisiae untersucht, wohingegen der cotranslationale Transport von löslichen und Membranproteinen hauptsächlich im Säuger analysiert wurde. Ein Vergleich der eukaryontischen ER-Translokationsapparate aus Hefe und Säuger zeigt, daß viele der bekannten Subkomplexe konserviert in beiden Organismen vorkommen. Es gibt aber auch Komponenten, die bisher nur exklusiv in einer der beiden Spezies identifiziert wurden. Zu diesen Subkomplexen gehören in der Hefe der Sec-Komplex sowie im Säuger das TRAM-Protein als auch der TRAP-Komplex. Desweiteren kennt man Subkomplexe wie z.B. die Signalpeptidase, die zwar in beiden Organismen vorkommen, deren Untereinheitenkomposition jedoch variiert.

Ziel dieser Arbeit war es, in der Hefe sowie im Säuger neue Faktoren des ER-Translokons zu isolieren, wobei nach Subkomplexen bzw. Untereinheiten von Subkomplexen gesucht werden sollte, die bisher nur in einem der beiden Modellorganismen beschrieben worden sind. Im Säuger sollte nach Komponenten gesucht werden, die an posttranslationalen Translokationsprozessen beteiligt sein könnten. Im Gegensatz zur Hefe S. cerevisiae ist im Säuger bisher vollkommen unklar, wie und mit welchen Faktoren der posttranslationale Transport über die ER-Membran vonstatten geht. Da der Sec61-Komplex die zentrale Pore für den posttranslationalen sowie den cotranslationalen Translokationsprozeß in der Hefe bildet, ist es wahrscheinlich, daß auch im Säuger der posttranslationale Transport von Proteinen über den Sec61-Komplex erfolgt. Mittels biochemischer Methoden sollte untersucht werden, ob ribosomenfreier Sec61-Komplex (ähnlich wie in der Hefe) mit anderen Proteinen assoziiert ist. Anschließend sollten die assoziierten Proteine identifiziert und näher charakterisiert werden, wobei der Frage nachgegangen werden sollte, ob im Säuger eine dem Sec-Komplex der Hefe ähnliche Struktur existiert.

In der Hefe S. cerevisiae sollte der Signalpeptidase-Komplex näher untersucht werden. Im Säuger besteht der Komplex aus fünf Untereinheiten, in der Hefe sind bisher nur zwei Untereinheiten bekannt. Um neue Untereinheiten in der Hefe zu identiifizieren sollte die ER-Signalpeptidase biochemisch aufgereinigt und die enthaltenen Proteine ansequenziert werden. Anschließend sollten neu gefundene Untereinheiten durch genetische sowie biochemische Methoden näher charakterisiert werden, um so neue Einblicke in die Funktionsweise der eukaryontischen Signalpeptidasen zu erlangen.


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Fri Feb 7 16:58:24 2003