Meyer, Hellmuth-Alexander: Identifizierung und Charakterisierung evolutionär konservierter Komponenten des Protein-Translokationsapparates im Endoplasmatischen Retikulum

16

Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Chemikalien, Enzyme und Medien

Chemikalien wurden, soweit nicht anders vermerkt, von den Firmen Merck, Serva, BioRAD, Boehringer Mannheim, Fluka oder Sigma bezogen. Säulenmaterialien zur Proteinaufreinigung oder Nachreinigung von Detergenzien waren von Pharmacia, BioRAD und Sigma. Restriktionsendonukleasen und andere DNA modifizierende Enzyme waren von New England Biolabs oder Boehringer Mannheim. Für Bakterien- und Hefemedien wurden Substanzen von Difco, Gibco-BRL und Merck eingesetzt.

3.1.2 Puffer und Lösungen

Aufgrund der Vielzahl von verwendeten Puffern wurde eine Kurzschreibweise eingeführt. Den am häufigsten benutzten Chemikalien wurden Buchstabenkürzel zugeordnet, wobei die tiefergestellten Zahlen jeweils die verwendeten Konzentrationen wiedergeben. Die einzeln verwendeten Puffer und Lösungen sind jeweils im Methoden bzw. Ergebnisteil der Arbeit aufgeführt.

H a

a mM Hepes pH 7,8

Dig b

b % (w/v) Digitonin

dBC c

c % (w/v) DeoxyBigChap

T d

d % (v/v) Triton x-100

K e

e mM Kaliumacetat

Mg f

f mM Magnesiumacetat

Gly g

g % (v/v) Glycerin

S h

h mM Saccharose

E i

i mM EDTA

ß-Me j

j mM beta-Mercaptoethanol

DTT k

k mM DTT

Pi

Protease Inhibitor Mix

 

1:1000 eingesetzt, bestehend aus:

 

10 mg/ml Leupeptin (Boehringer)

 

2 mg/ml Pepstatin (Sigma)

 

5 mg/ml Chymostatin (Boehringer)


17

3.1.3 Detergenzien

Detergenzien wurden bezogen von Calbiochem (DeoxyBigChap), Merck (Digitonin), BHM (Natriumdodecylsulfat (SDS)), Roth (Saponin) und Sigma (Digitonin, Triton X-100 und Tween 20). Detergenzien aus Naturprodukten wurden vor ihrer Verwendung einer weiteren Reinigungsprozedur unterzogen, wobei Digitonin nach Görlich et al. (1992a) und Saponin nach Panzner et al. (1995) aufgearbeitet wurde.

3.1.4 Lipide

Lipidgemische aus Phosphatidylcholin (PC) und Phosphatidylethanolamin (PE) im Verhältnis 4 zu 1 wurden nach Görlich und Rapoport (1993) präpariert. Die Endkonzentrationen betrugen 16 mg/ml PC, 4 mg/ml PE, in 50 mM Hepes pH 7,5; 16 % (v/v) Glycerin, 10 mM DTT und 3 % (w/v) DeoxyBigChap. Beide Lipide wurden von Sigma bezogen.

3.1.5 Versuchsorganismen

3.1.5.1 Escherichia coli Stämme

M15 [pREP4]

NalS, StrS, rifS,lac -, ara -, gal -,mtl -, F -, recA +, uvr +, [pREP4(kanamycinR)] (Qiagen)

Top 10

mcrA, D(mrr-hsdRMS-mcrBC), F80, DlacDM15, D1acX74, dcoR, rec Al, araD139 D(ara,leu) 7697 galU, galK L-rpsL (streptamycinr) end Al, nupG (Invitrogen Corporation)

3.1.5.2 Saccharomyces cerevisiae Stämme

DF5

mat alpha/a; trp1-1(am)/trp1-1(am); leu2-3,112/leu2-3,112; ura3-52/ura3-52; his3-Delta200/his3-Delta200; lys2-801/lys2-801 (Meyer und Hartmann, 1997)

HFY401

mat alpha; Deltaspc1::TRP1; ade2-101; his3-Delta200; leu2-3,112; lys2-801; trp1-Delta901; ura3-52 (Fang et al., 1996)

HFY403

mat alpha; Deltaspc2::URA3; his3-D200; leu2-3,112; lys2-801; trp1-Delta901; ura3-52 (Mullins et al., 1996)

HFY404

mat alpha; Deltaspc1::TRP1; Deltaspc2::URA3; ade2-101; his3-Delta200; leu2-3,112; trp1-Delta901; ura3-52 (Mullins et al., 1996)

HMY1

mat a; Deltaspc3 trp1-1(am); leu2-3,112; ura3-52; his3-Delta200; lys2-801 (diese Arbeit)

HMY2

mat alpha; Deltasec11::Leu; trp1-1(am); leu2-3,112; ura3-52; his3-Delta200; lys2-801 (diese Arbeit)

SEY6210

mat a; his3-Delta200; leu2-3,112; lys2-801; suc2-Delta9; trp1-Delta901;; ura3-52 GAL (Robinson et al., 1988)

3.1.5.3 Säugetiere

Zur Aufreinigung von Membranfraktionen wurden Gewebe aus Hund (Canis familiaris), Maus (Mus musculus), Ratte (Rattus norvegicus) und Rind (Bos taurus) verwendet.


18

3.1.6 Antikörper

Die Affinitätsaufreinigung von peptidspezifischen polyklonalen Antikörpern aus Kaninchenantiseren erfolgte nach Görlich et al. (1992). Folgende Antikörper wurden verwendet:

Hefe-Proteine

Antigene Peptidsequenz

Quelle

Kar2p

rekombinantes Protein

Panzner et al. (1995)

Sbh1p

CPTPPGGQRTLQKRK

Panzner et al. (1995)

Sbh2p

AASVPPGGQRICO

Finke et al. (1996)

Sec11p (N-terminal)

MNLRFELQKC

diese Arbeit

Sec61p (C-terminal)

CLVPGFSDLM

Panzner et al. (1995)

Sec62p

CNKKKAINEKAQN

Panzner et al. (1995)

Sec72p

rekombinantes Protein

C. Unger (Berlin)

Spc1p (C-terminal)

CKIEINVDQYD

diese Arbeit

Spc1p (N-terminal)

MSEILQDYQRKLC

diese Arbeit

Spc2p

CHNVLDTKKNE

diese Arbeit

Spc3p

rekombinantes Protein

diese Arbeit

Ssh1p

CNQVLGVPGAM

Finke et al. (1996)

Säuger-Proteine

Antigene Peptidsequenz

Quelle

Sec61alpha

CKEQSEVGSMGALLF

Görlich et al. (1993)

Sec61beta

PGPTPSGTNC

Görlich et al. (1992)

Sec62 (C-terminal)

CTPKSSHEKS

diese Arbeit

Sec63

CTNKNRTKGGWQQKSKGPKKT

diese Arbeit

Sec63

rekombinantes Protein

diese Arbeit

SPC25

CHDSLATERKIK

Kalies & Hartmann (1996)

SRPRalpha

KKFEDSEKAKKPVRC

Labor Hartmann

TRAM

CADSPRNKEKSS

Görlich et al. (1992)

TRAP alpha

CLPRKRAQKRSVGSDE

Prehn et al. (1989)


19

3.1.7 Plasmide

pCBsec11::LEU

Plasmid enthält ein Deletionskonstrukt zur Deletion des SEC11 Gens.Böhni et al. (1988)

pGal10Spc2

SPC2 unter Kontrolle eines Gal10 Promotors im Plasmid pRS414.diese Arbeit

pGal10Spc3

SPC3 unter Kontrolle eines Gal10 Promotors im Plasmid pRS414.diese Arbeit

pMet3Sec11

SEC11 unter Kontrolle eines Met3 Promotors im Plasmid pRS426.diese Arbeit

pMPY-3xHA

Templateplasmid zur Erzeugung eines PCR Deletionskonstruktes nach Schneider et al. (1995) Schneider et al. (1995)

pRS414

E. coli/S. cerevisiae Vektor, ausgestattet mit einem Tryptophan-Markergen und einem ARS-CEN Replikationselement für Hefe. Sikorski et al. (1989)

pRS426

E. coli/S. cerevisiaeVektor, ausgestattet mit einem Uracil-Markergen und einem 2µ Replikationselement für Hefe. Sikorski et al. (1989)

pSP65alphaF

E. coli Vektor mit dem PräPro-alpha-Faktor Gen hinter einem SP6-PromotorRothblatt et al., (1987)

pQE30

E. coli Expressionsvektor für N-terminale His6-Fusionsproteine.Qiagen GmbH


20

3.2 Methoden

3.2.1 Molekularbiologische Methoden

Plasmid-DNA aus E. coli wurde entweder nach der Methode von Birnboim und Doly (1979) oder mit dem Qiagen-Plasmid-Kit nach der Vorschrift des Herstellers isoliert. Das Schneiden von DNA mit Endonukleasen, die Ligation von DNA-Fragmenten und andere Grundtechniken der molekularen Genetik erfolgten nach Sambrook et al. (1989). Die Transformation von Escherichia coli mit Plasmid-DNA erfolgte durch Elektroporation (Dower et al., 1988). Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) wurde zur Amplifikation von DNA-Fragmenten benutzt. Je nach Anwendung wurde Pfu-Polymerase (Klonierung von PCR-Produkten) von Stratagene oder Taq-Polymerase (analytische PCR) von Boehringer Mannheim verwendet. Zur Sequenzierung von DNA wurde anfangs das „fmol-PCR-Sequenzierungskit“ von Promega und später das „Thermo Sequenase Fluoreszenzkit“ von Amersham benutzt.

3.2.2 Hefegenetische Methoden

3.2.2.1 Transformation von S. cerevisiae mit Plasmid-DNA.

S. cerevisiae Zellen wurden unter Zugabe von Polyethylenglykol und Lithiumacetat nach der Methode von Gietz und Schiestl (1991) transformiert.

3.2.2.2 Herstellung von Hefe-Deletionsmutanten

Die von Schneider et al. (1995) entwickelte Methode, um Hefe-Gene mit einem Protein-Tag zu versehen, wurde so modifiziert, daß sie sich auch zur Deletion von ganzen Genen eignet. Der Vorteil dieser Methode liegt darin, daß nach erfolgreicher Deletion des gewünschten Gens der Selektionsmarker wieder aus dem Genom entfernt werden kann.

Im folgenden ist die Prozedur für die Deletion des Hefe Gens SPC3 beschrieben: Mittels PCR wurde aus dem Plasmid pMPY-3xHA ein Fragment amplifiziert, welches ein URA3 Gen enthielt, das an beiden Enden von einen 3xHA-Tag und 40 bp komplementär zur Start- bzw. Endregion von SPC3 flankiert wurde (Abb. 6 A). Der diploide Hefestamm DF5 wurde mit dem PCR-Fragment nach der Lithiumacetat-Methode transformiert und auf Uracil-freien Selektionsplatten ausplattiert. Über die homologen Flanken konnte eine Rekombination in einen der beiden chromosomalen Genorte von SPC3 stattfinden, wobei das SPC3 Gen durch das URA3 Gen ersetzt wurde (Abb. 6 B). Damit für weitere Selektionsexperimente der URA3-Marker wieder zur Verfügung stand, wurden positive Transformanten auf Uracil haltiges Medium überführt, wobei ein Teil der Zellen durch ein Rekombinationsereignis zwischen den beiden flankierenden 3xHA-Tags das URA3 Gen verlor. Auf den Verlust des Uracil-Markergens konnte mit Hilfe von 5-Fluor Orotsäure (5-FOA) gezielt selektioniert werden (Boeke et al. 1987) (Abb. 6 C). Der erhaltene diploide Stamm mit einem deletierten SPC3 Locus wurde anschließend für 2 Tage sporuliert und die vereinzelten Sporen 5 Tage bei 30 °C auf Vollmedium angezogen (Abb. 6 D).


21

Abb. 6: Herstellung einer SPC3-Deletionsmutante.
Schematische Darstellung der Methode zur Deletion von SPC3 aus einem diploiden Hefestamm. Beschreibung siehe Text.


22

3.2.3 Proteinanalytische Methoden

3.2.3.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Proteine können entsprechend ihres Molekulargewichtes mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt werden (Laemmli, 1970). Die aufzutrennenden Proteinproben wurden vor dem Auftrag 10 bis 15 min bei 65 °C in SDS-Probenpuffer (2 % (w/v) SDS, 60 mM Tris Base, 10 % (v/v) Glycerol und 50 mM DTT) denaturiert. Als Gelelektrophoresepuffer wurde 25 mM Tris-Base, 192 mM Glycin, 0,1 % (w/v) SDS verwendet, der Lauf erfolgte bei 50 mA. Nach der Elektrophorese wurden die aufgetrennten Proteine entweder auf Nitrocellulose übertragen (Westernblot) oder mit 10 %iger (w/v) Essigsäure fixiert (Coomassiefärbung oder Autoradiographie).

3.2.3.2 Coomassiefärbung

SDS-Gele wurden kurz in 10 % (v/v) Essigsäure fixiert und dann mit Coomassiefärbelösung (2 g/l Coomassie Brillant Blue R250 in 20 % (v/v) Methanol, 10 % (v/v) Essigsäure) gefärbt. Entfärbt wurde mit demselben Gemisch, jedoch ohne Farbstoff.

3.2.3.3 Autoradiographie

SDS-Gele wurden kurz in 10 % (v/v) Essigsäure fixiert, danach in H2O gewässert und mit Hilfe eines Vakuumtrockners auf Papier getrocknet. Die im Gel enthaltene Radioaktivität wurde anschließend durch auflegen eines Röntgenfilms (Kodak) oder einer Phosphorimagerplatte (Fuji) detektiert.

3.2.3.4 Westernblot

Proteine wurden zur weiteren Untersuchung von SDS-Polyacrylamidgelen entsprechend Görlich et al. (1992a) auf Nitrocellulose (0,45 µm Porengröße) oder Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membranen transferiert. Die übertragenen Proteine wurden entweder durch Immunfärbung mit Antikörpern sichtbar gemacht, oder einzelne Proteinbanden wurden ausgeschnitten und einer Aminosäuresequenzierung (Edman-Abbau) unterworfen. Immunoblotanalysen wurden entsprechend Görlich et al. (1992a) durchgeführt, wobei das ECL-Nachweissystem (Amersham oder NEN) verwendet wurde. Handelte es sich bei den Proben um Immunopräzipitations-Experimente, so wurde anstelle von sekundären anti-Rabbit-Antikörpern Protein A Peroxidase (Sigma) verwendet.

3.2.4 Biochemische Methoden

3.2.4.1 In vitro Transkription und Translation

Für Aktivitätsmessungen der Signalpeptidase wurde das Vorstufenprotein des alpha-Faktors (PräPro-alpha-Faktor) (Kurjan und Herskowitz, 1982) mit [35S] L-Methionin radioaktiv markiert. Dazu wurde in vitro zuerst die entsprechende mRNA transkribiert und anschließend das dazugehörende Protein translatiert. Das für das ?-Faktor-Vorstufenprotein kodierende Plasmid pSP65?F (Rothblatt et al., 1987) wurde mit der Restriktionsendonuklease Sal I linearisiert und anschließend mit dem Transkriptionssystem von Promega und SP6-RNA-Polymerase die mRNA transkribiert. Die Translation der Transkripte erfolgte in Anwesenheit von [35S] L-Methionin für 45 min bei 30 °C im Retikulozyten-Lysat von Promega. Anschließend wurde die Synthese durch Zugabe von 2 mM Cycloheximid gestoppt und die Ribosomen durch Zentrifugation (10 min bei 100.000 rpm im TLA100-Rotor) abgetrennt. Der Überstand wurde mit 70 % (w/v) Ammoniumsulfatlösung gefällt. Das resultierende Pellet wurde in Wasser resuspendiert und anschließend einer TCA-Fällung unterzogen um dann in 1 % (w/v) SDS aufgenommen zu werden.


23

3.2.4.2 In vitro Signalpeptidase Spaltungsassay

Zum Nachweis der enzymatischen Aktivität der Signalpeptidase wurde ein modifizierter in vitro Spaltungsassay nach YaDeau et al. (1989) verwendet. Aus Zellen der zu untersuchenden Hefestämme wurden rauhe Mikrosomen (RM) präpariert und auf gleiche Mengen Sec62p normalisiert. Digitoninextrakt entsprechend 20 eq RM wurde nach Panzner et al. (1995) hergestellt und mittels eines Ausgleichspuffers auf 50 mM Triethanolamin, pH 8,0; 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonsäurefluorid), 0,32 mg/ml PC; 0,08 mg/ml PE; 120 mM KAc und 0,2 % (w/v) Digitonin eingestellt. Als Substrat wurde [35S] markierter PräPro-alpha-Faktor hinzugegeben und 2 Stunden bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proben gefällt, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und mit Hilfe eines Phoshorimagers (Fuji BAS2000) die Menge an prozessiertem alpha-Faktor bestimmt.

3.2.4.3 N-Glycosidase F Spaltungsassay und ConA-Blot

Der Nachweis von Glycoproteinen im Signalpeptidase-Komplex erfolgte durch N-Glycosidase F Behandlung oder durch Westernblot mit ConA Peroxidase (Sigma). 15 µl aufgereinigter Hefe SP-Komplex (entsprechend 500 eq Ausgangs-RM) wurde für 5 min bei 62 °C in 1 % SDS inkubiert, anschließend wurden 85 µl H20 E12 T1 ß-Me4 hinzugegeben sowie 1 Unit N-Glycosidase F (Boehringer Mannheim). Die Probe wurde 8 Stunden bei 37 °C inkubiert und danach mittels SDS-PAGE und Immunoblot analysiert.

Beim ConA-Blot wurde der aufgereinigte Hefe SP-Komplex (entsprechend 500 eq Ausgangs-RM) im SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Die nicht geblockte Membran wurde danach mit Concanavalin A (ConA), das an eine Peroxidase gekoppelt war, inkubiert. Nach intensivem Waschen der Nitrocellulosemembran wurden die Glycoproteine mit Hilfe des ECL-Nachweissystem detektiert.

3.2.4.4 Protein-Quervernetzung mittels Bismaleinimidhexan

Bismaleinimidhexan (BMH) ist ein homobifunktionelles Quervernetzungsreagenz, bei dem zwei reaktive Maleinimidgruppen durch ein Hexanskelett von 1,6 nm Länge verbunden sind. BMH kann eingesetzt werden, um reduzierte Cysteine querzuvernetzen. Rauhe Mikrosomen aus Säugergewebe in H50 K150 M5 S200 Pi wurden mit 50 µM Bismaleinimidhexan (Pierce) (Stocklösung 1 mM Bismaleinimidhexan in Dimethylformamid) für 25 min bei 0 °C inkubiert. Anschließend wurde die Quervernetzungsreaktion durch Zugabe von 280 mM ß-Mercaptoethanol gestoppt.

3.2.5 Proteinbiochemische Methoden

3.2.5.1 Herstellung von rauhen Mikrosomen sowie Puromycin/Hochsalz behandelten rauhen Mikrosomen

Die Präparation von rauhen Mikrosomen (RM) aus Hunde- oder Rinderpankreasgewebe erfolgte nach Görlich und Rapoport (1993). Rauhe Mikrosomen aus S. cerevisiae wurden entsprechend Panzner et al. (1995) präpariert. Von Ribosomen befreite RM (PK-RM) wurden durch Puromycin und Hochsalzbehandlung nach der Methode von Görlich und Rapoport (1993) hergestellt.

3.2.5.2 Zellfraktionierung

Zellfraktionierung zur Gewinnung von glatten und rauhen ER-Membranen aus Lebergewebe wurde entsprechend Kreibich et al. (1978) durchgeführt. 10 g Rinderleber wurden im Verhältnis 1 zu 10 (w/v) mit dem Puffer H50 K25 Mg5 S250 ß-Me5 Pi in einem Teflon-Homogenisator homogenisiert. Nicht aufgeschlossenes Material wurde durch Zentrifugation (13 min bei 1.750 rpm, Sigma 3K12 Zentrifuge) abgetrennt. Der resultierende Überstand wurde 13 min bei 3.850 rpm (Sigma 3K12 Zentrifuge) zentrifugiert, wobei Kerne und Zellbruchstücke sedimentieren. Mitochondriales Material wurde anschließend aus dem Überstand durch Zentrifugation für 10 min bei 17.000 rpm (Ti-60 Rotor) abgetrennt.


24

Die im postmitochondrialen Überstand enthaltenen rauhen und glatten ER-Membranen lassen sich aufgrund ihrer unterschiedlichen Dichte voneinander trennen. Der postmitochondriale Überstand wurde dazu auf 1,35 M Saccharose und H50 K25 Mg5 ß-Me5 Pi eingestellt und auf einen Stufengradienten bestehend aus 1,5 M Saccharose in H50 K25 Mg5 ß-Me5 Pi und 2,0 M Saccharose in H50 K25 Mg5 ß-Me5 Pi gelegt. Anschließend wurde der Gradient überschichtet mit 1,0 M Saccharose in H50 K25 Mg5 ß-Me5 Pi und für 17 Stunden bei 45.000 rpm (Ti45-Rotor) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die rauhen ER-Membranen aus der 1,5 - 2,0 M und die glatten ER-Membranen aus der 1,35 -1,0 M Interphase abgenommen und jeweils mit 1 Volumen Puffer H50 K25 Mg5 ß-Me5 Pi verdünnt. Durch Zentrifugation für 2 Stunden bei 45.000 rpm (Ti45-Rotor) wurden die Membranfraktionen pelletiert und jeweils in gleichen Mengen Puffer H50 K25 Mg5 S250 ß-Me5 Pi aufgenommen.

3.2.5.3 Saccharose-Gradienten-Zentrifugation

Saccharose-Gradienten-Zentrifugation zur Auftrennung von in Detergenz gelösten Proteinen wurde ähnlich zu Görlich et al. (1992a) durchgeführt. 50 eq rauhe Mikrosomen aus Rind wurden mit 2 % (w/v) Digitonin oder 1 % (w/v) DeoxyBigChap in H50 K450 Mg8 Pi in einer Endkonzentration von 0,4 eq/µl solubilisiert. Nach 3 min Zentrifugation bei 14.000 rpm in einer Mikrofuge wurde der Überstand auf einen 25 % - 50 % (w/v) Saccharosegradienten mit 2 % Digitonin oder 1 % DeoxyBigChap sowie H50 K500 Mg10 Pi gegeben und 1 Stunde bei 55.000 rpm (TLS55 Rotor) und 4 °C zentrifugiert. Anschließend wurde der Gradient fraktioniert und die Fraktionen mittels SDS-PAGE und Westernblot analysiert.

3.2.5.4 Aufreinigung von Proteinen mit einem 6xHis-Motiv

Rekombinante Proteine, die ein 6xHis-Motiv tragen, können durch Affinitätsreinigung an Nickel-Nitrilo-tri-Essigsäure (NTA) isoliert werden (Janknecht et al., 1991). NTA chelatiert 4 der 6 möglichen Bindungsstellen an einem Ni2+ Ion. An die freien Bindungsstellen der Ni2+ Ionen bindet das 6xHis-Motiv. Diese Bindung kann durch Absenken des pH-Wertes, oder Zugabe von Imidazol aufgehoben werden, wodurch das Protein von der NTA-Matrix eluiert. Die Konstruktion von rekombinanten Proteinen mit 6xHis-Motiv erfolgte mit Hilfe des Qiagen-Expressions-Kits. Als Expressionsplasmid wurde pQE-30 verwendet. Die Überexpression der Proteine im E. coli Stamm M15 [pREP4] sowie die Aufreinigung der exprimierten Proteine unter denaturierenden Bedingungen erfolgte nach Angaben des Herstellers (Qiagen). Die rekombinanten Proteine wurden zur Immunisierung von Kaninchen zwecks Antikörperproduktion verwendet. Auf diese Weise wurden Antikörper gegen das Hefeprotein Spc3p (rekombinantes Protein mit der Sequenz des luminalen Anteils von SPC3) und gegen das Säuger Sec63 (rekombinantes Protein mit der Sequenz von As 448 bis As 595 des Säuger Sec63) erzeugt.

3.2.5.5 Reinigung des ER-Signalpeptidase-Komplexes aus Hefe

Bei der Ausarbeitung des Reinigungsprotokolles wurde auf Arbeiten von Panzner et al. (1995) und Fang et al. (1996) zurückgegriffen. 80.000 bis 100.000 eq rauhe Mikrosomen aus dem S. cerevisiae Stamm DF5 wurden in 2,5 % (w/v) Digitonin, H50 K400 Mg10 Gly10 DTT2 Pi (Digitoninhochsalzpuffer) in einer Konzentration von 1 eq/µl extrahiert, wobei sich die Lipidschicht vollständig auflöst und integrale Membranproteine sowie luminale Proteine in Lösung gehen. Ribosomen, ribosomenassoziierte Proteine sowie Proteinaggregate wurden anschließend durch Zentrifugation (60 min, 60.000 rpm im Ti70 Rotor bei 4 °C) vom Überstand abgetrennt.

Der resultierende Überstand (Digitoninextrakt) wurde über Nacht bei 4 °C an 7 ml Concanavalin A-Sepharose (Pharmacia Biotech Inc.) gebunden. Die Bindung erfolgte ohne Zugabe von Ca2+ und Mn2+ Ionen, die normalerweise zugesetzt werden, um den tetrameren Con A Komplex zu stabilisieren. Durch den Verzicht auf diese zweiwertigen Kationen konnte eine im Digitoninextrakt vorhandene spezifische Protease-Aktivität stark reduziert werden, was zu einer höheren Ausbeute an SP-Komplex führte. Nach intensivem Waschen der Säule mit dem Niedrigsalzpuffer H50 Dig1 Gly10 DTT2 Pi erfolgte die Elution des SP-Komplexes von der Con A-Säule bei 25 °C mittles 1 M alpha-Methylmannosid in H50 Dig1 Gly10 DTT2 Pi.


25

Die so gewonnene Glycoprotein-Fraktion wurde bei 4 °C an 5 ml HiTrap Q-Sepharose (Pharmacia Biotech Inc.) gebunden, wobei sich anschließend der SP-Komplex im Durchlauf der Säule befand. Um den Komplex weiter anzureichern, wurde der Durchfluß der Q-Säule an 1 ml SP-Sepharose (Pharmacia Biotech Inc.) gebunden und die SP-Sepharose Säule anschließend mit einem linearen Salzgradienten von 0 bis 500 mM KAc in H50 Dig1 Gly10 DTT2 Pi eluiert. Der SP-Komplex eluiert bei ca. 300 mM KAc von der SP-Sepharose Säule.

3.2.5.6 Coimmunopräzipitation von Sbh2p mit dem SP-Komplex

Hefe Mikrosomen aus Wildtypzellen und Deltaspc2 Zellen wurden jeweils in 1,5 % (w/v) Digitonin, H20 K375 Mg10 Gly10 Pi in einer Konzentration von 0,5 eq/µl solubilisiert und anschließend Ribosomen, ribosomenassoziierte Proteine sowie ungelöste Bestandteile abzentrifugiert (1 h bei 4 °C und 70.000 rpm im TLA100.3 Rotor). Der resultierende Überstand wurde dann mit 4 Volumen H20 Dig1,5 verdünnt und affinitätsgereinigte Antikörper gegen Spc1p oder Spc2p, die jeweils an Protein A-Sepharose gekoppelt waren, hinzugegeben. Nach 8 Stunden Inkubation bei 4 °C wurden die Protein A-Sepharose Beads 8 mal mit H20 Dig1,5 K100 Gly2,5 gewaschen und die gebundenen Proteine mit SDS-Probenpuffer eluiert.

3.2.5.7 Aufreinigung des Säuger Sec63/Sec61 Komplexes

Rinder PK-RM wurden in 2,5 % (w/v) Digitonin, H50 K500 Mg10 Gly10 ß-Me5 Pi in einer Konzentration von 0,75 eq/µl solubilisiert und anschließend unlösliche Bestandteile abzentrifugiert (1,5 h bei 4 °C und 70.000 rpm im Ti70 Rotor). Der resultierende Überstand wurde über eine HiTrap Q Säule (Pharmacia) gegeben und anschließend die Säule mit H50 Dig0,5 K500 Mg10 Gly10 ß-Me5 gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden stufenweise mit ansteigenden Salzkonzentrationen von 0,6 bis 1,2 M Kaliumacetat in H50 Dig0,5 Mg10 Gly10 ß-Me5 Pi eluiert. Das Eluat bei 1,0 M Kaliumacetat wurde, mit zwei Volumen des Puffers H50 Dig0,5 Mg10 Gly10 ß-Me5 Pi verdünnt und anschließend an eine anti-Sec61ß Antikörpersäule gebunden. Nach Waschen der Säule mit Puffer H50 Dig0,5 K300 Mg10 Gly10 ß-Me5 Pi wurden die gebundenen Proteine bei 25 °C durch Zugabe des Peptides (1mg/ml), gegen das der Antikörper gerichtet war, eluiert.

3.2.5.8 Coimmunopräzipitation von Sec62 und Sec63 mit dem Sec61-Komplex

Rinder-RM wurden in einer Konzentration von 0,26 eq/µl in 1,5 % DeoxyBigChap, H50 K450 Mg12,5 Gly10 ß-Me5 Pi solubilisiert. Unlösliches Material wurde anschließend durch eine Zentrifugation in der Eppendorfzentrifuge abgetrennt (3 min, 14.000 rpm bei 4 °C). Der Extrakt wurde dann für 20 min bei 75.000 rpm und 4 °C zentrifugiert (TLA 100.3-Rotor), wodurch Ribosomen und RAMPs pelletiert wurden. Der resultierende Überstand wurde mit einem Volumen 50 mM HEPES-KOH (pH 7,8) verdünnt und affinitätsgereinigte Antikörper gegen Sec61ß oder Sec63, die jeweils an Protein A-Sepharose gekoppelt waren, hinzugegeben. Die Proben wurden für 10 Stunden bei 4 °C im Überkopfschüttler inkubiert und anschließend die Beads mehrmals mit 0,7 % DeoxyBigChap, H50 K250 Mg7,5 Gly10 ß-Me5 Pi gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden danach mit SDS-Probenpuffer eluiert. Aliquots aller Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und im Immunoblot analysiert.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Feb 7 16:58:24 2003