Meyer, Hellmuth-Alexander: Identifizierung und Charakterisierung evolutionär konservierter Komponenten des Protein-Translokationsapparates im Endoplasmatischen Retikulum

26

Kapitel 4. Ergebnisse

4.1 Der ER-Signalpeptidase Komplex der Hefe

In Pro- sowie Eukaryonten werden Signalsequenzen von sekretorischen Proteinen durch spezifische Signalpeptidasen abgespalten. Man faßt diese Klasse von Peptidasen als Typ I Signalpeptidasen zusammen. Im Gegensatz zu den monomeren Signalpeptidasen der Prokaryonten bestehen die eukaryontischen ER-Signalpeptidasen aus heteromeren Proteinkomplexen.

Der Säuger SP-Komplex, gewonnen aus Hundepankreas, setzt sich aus 5 verschiedenen Membranproteinen zusammen (Evans et al., 1986), im Vogel (Huhn) ist ein Komplex aus mindestens zwei Membranproteinen beschrieben (Baker und Lively, 1987). Auch die Signalpeptidase der Hefe S. cerevisiae besteht aus einem heteromeren Proteinkomplex, von dem zu Beginn der vorliegenden Arbeit zwei Proteine bekannt waren. Einerseits das Protein Sec11p, für das Böhni et al. (1988) zeigen konnten, daß es essentiell für die Spaltungsaktivität der ER-Signalpeptidase ist, und andererseits Spc1p, das mit Sec11p assoziiert ist und als Suppressor einer temperatursensitiven SEC11-Mutante gefunden wurde (Fang et al., 1996). Dieser Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der biochemischen Aufreinigung des Signalpeptidase-Komplexes (SP-Komplex) aus der Hefe und der anschließenden molekularen und funktionalen Charakterisierung von neu gefundenen Untereinheiten.

4.1.1 Die Signalpeptidase der Hefe ist ein heteromerer Protein-Komplex

4.1.1.1 Aufreinigung der Signalpeptidase aus der Hefe S. cerevisiae

Die Aufreinigung der Signalpeptidase aus der Hefe S. cerevisiae erfolgte in einem mehrstufigen Reinigungsprozeß. Der Verbleib der Signalpeptidase in den einzelnen Aufreinigungsschritten konnte durch einen modifizierten Spaltungsassay nach YaDeau und Blobel (1989) verfolgt werden. Als Substrat wurde PräPro-alpha-Faktor benutzt, der in vitro in Gegenwart von [35S]-L-Methionin synthetisiert wurde. Inkubierte man den PräPro-alpha-Faktor mit in Digitonin solubilisierten Mikrosomen, so wurde durch die enthaltene Signalpeptidase das Signalpeptid vom restlichen Protein abgespalten. Die prozessierte und nicht prozessierte Form des PräPro-alpha-Faktor konnten anschließend durch ihre unterschiedliche Größe im SDS-PAGE voneinander getrennt und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht werden (Abb. 7, Bahn 1). Im weiteren Verlauf des Projektes war der Nachweis der Signalpeptidase auch durch Immunoblotting möglich, da Antikörper gegen die bekannten sowie neu gefundenen Untereinheiten des Hefe-SP-Komplexes erzeugt wurden.

Zum Zweck der Signalpeptidase-Aufreinigung wurden Hefemikrosomen in einem Hochsalz-Digitonin-Puffer solubilisiert, wobei sich die Lipidschicht vollständig auflöst und integrale Membranproteine sowie luminale Proteine in Lösung gehen (Panzner et al., 1995). Ribosomen, ribosomenassoziierte Proteine sowie Proteinaggregate wurden danach durch Zentrifugation abgetrennt, wobei die Signalpeptidaseaktivität vollständig im Digitoninüberstand verblieb (Abb. 7, Bahn 3). Anschließend wurde der Überstand über Concanavalin A Sepharose gegeben, wobei alpha-D glycosylierte Proteine an die Concanavalin A Matrix banden. Nach intensivem Waschen der Säule wurden die gebundenen Proteine durch Zugabe von 1 M alpha-D Methylmannosid von der Concanavalin A Matrix eluiert. Die Signalpeptidase bindet an die Concanavalin A Sepharose (Abb. 7, Bahn 5), was vermuten läßt, daß mindestens eine der Untereinheiten des SP-Komplexes ein Glycoprotein ist. Anschließend wurde das Eluat an Q-Sepharose (Anionenaustauscher) chromatographiert, wobei die Signalpeptidase hauptsächlich im Durchlauf zu finden war (Abb. 7, Bahn 6). Danach erfolgte die Bindung des Q-Durchlaufs an SP-Sepharose (Kationenaustauscher), wobei die Signalpeptidase an die Säule band (Abb. 7, Bahn 9).

Eluierte man anschließend die Signalpeptidase mit einem linearen Salzgradienten wieder von der Kationenaustauscher-Säule, so fand man bei 300 bis 350 mM Kaliumacetat (Abb. 8 A, Fraktionen 13 bis 15) im in vitro Spaltungsassay die höchste Aktivität, sowie auch im Immunoblot die stärksten Signale der beiden SP-Untereinheiten Sec11p und Spc1p. Die Fraktion 14 wurde daraufhin gefällt, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und Coomassie-gefärbt. Sechs Proteinbanden mit molaren Massen von etwa 29, 25, 20, 18, 19 und 12 kDa wurden sichtbar (Abb. 8 B).


27

Abb. 7: Aufreinigung des Hefe-SP-Komplexes (Teil 1).
Nachweis der Signalpeptidase während der Aufreinigungsprozedur durch einen enzymatischen in vitro Spaltungsassay mit [35S]-markiertem PräPro-alpha-Faktor als Substrat. Hefemikrosomen (Bahn 1) wurden in 2,5 % (w/v) Digitonin, H50 K400 Mg10 Gly10 DTT2 Pi solubilisiert und anschließend die unlöslichen Bestandteile abgetrennt (Bahn 2: Pellet). Der resultierende Digitoninüberstand (Bahn 3) wurde über Nacht an Concanavalin A-Sepharose gebunden (Bahn 4: Durchlauf, Bahn 5: Elution). Das Eluat wurde dann über Q-Sepharose gegeben (Bahn 6: Stepelution mit H50 Dig1 Gly10 Mg10 K1500 DTT5 Pi, Bahn 7: Durchlauf) und anschließend der Durchlauf an SP-Sepharose gebunden (Bahn 6: Durchlauf, Bahn 7: Stepelution mit H50 Dig1 Gly10 Mg10 K500 DTT5 Pi). Von jeder Fraktion wurden 20 eq (Bahn 1 bis 4) bzw. 40 eq (Bahn 5 bis 7) entsprechend dem Ausgangsmaterial für den in vitro Spaltungsassay eingesetzt. Anschließend wurden die Proben mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Die obere Bande ist PräPro-alpha-Faktor (pp-alpha-F), die untere ist Pro-alpha-Faktor (p-alpha-F). Die Mikrosomen sowie das Digitonin- Pellet wurden für den Spaltungsassay jeweils zuvor in 2,5 % (w/v) Digitonin, H50 K400 Mg10 Gly10 DTT2 Pi aufgenommen.

Abb. 8: Aufreinigung des Hefe-SP-Komplexes (Teil 2).
A) Letzter Schritt der SP-Komplex Aufreinigung: die Elution des Signalpeptidase-Komplexes von SP-Sepharose mit einem linearen Salzgradienten von 0 bis 500 mM Kaliumacetat. Die einzelnen Fraktionen wurden mit dem in Abb. 7 beschriebenen enzymatischen Spaltungsassay auf Signalpeptidaseaktivität untersucht, wobei von jeder Fraktion 300 eq entsprechend dem Ausgangsmaterial eingesetzt wurden. Zusätzlich erfolgte der Nachweis der Signalpeptidase mittels Immunoblotting mit Antikörpern gegen Sec11p und Spc1p. Desweiteren wurde mittels Immunoblotting auch das Elutionsverhalten der beiden neu gefundenen Proteine Spc2p und Spc3p (siehe B) analysiert.
B) Coomassiefärbung des angereicherten SP-Komplexes. Fraktion 14 der SP-Sepharose Elution (siehe B) wurde mit 40 % Polyethylenglycol gefällt und das Pellet mit Methanol und Aceton gewaschen. Die Probe wurde dann mittels SDS-PAGE aufgetrennt und nach dem Transfer auf eine Nitrocellulosemembran Coomassie Blau gefärbt. Die 6 deutlichsten Banden wurden durch Edman Abbau analysiert: Die SP-Untereinheiten Spc1p und Sec11p sowie drei weitere Proteine (Spc2p, Spc3p und „*“) konnten dabei identifiziert werden (siehe Text).


28

4.1.1.2 Identifizierung von Proteinen aus der aufgereinigten SP-Komplex-Fraktion

Aus den einzelnen Protein-Banden des aufgereinigten SP-Komplexes (Abb. 8 B) wurden N-terminale und/oder nach Spaltung interne Aminosäuresequenzen ermittelt. Die 29 kDa Bande (in Abb. 8 B mit „?“ markierte Bande) wurde als Concanavalin A identifiziert, es handelte sich dabei wahrscheinlich um ein Reinigungsartefakt. Wie in Material und Methoden beschrieben, wurde auf die Zugabe von zusätzlichen zweiwertigen Kationen während der Concanavalin A-Bindung verzichtet, um eine Protease-Aktivität im Digitoninextrakt zu reduzieren. Ein Teil des Concanavalin A konnte sich dadurch anscheinend von der Säule lösen und lag so als Kontamination in späteren Fraktionen vor.

Die aus der 25 kDa Bande (in Abb. 8 B als „Spc3p“ bezeichnete Bande) ermittelte N-terminale Aminosäuresequenz konnte mit Hilfe der Yeast Protenome Database einem 184 As langen unbekannten Protein zugeordnet werden (Sequenz siehe in Abb. 9), was im weiteren Verlauf der Arbeit als Spc3p bezeichnet wurde.

Aus der 20 kDa großen Proteinbande (in Abb. 8 B als „Spc2p“ bezeichnete Bande) wurden nach Trypsinspaltung mehrere interne Aminosäuresequenzen ermittelt, die alle einem 178 As langen, bisher unbekannten Protein aus der Yeast Protenome Datenbase zuzuordnen waren (Sequenz siehe in Abb. 10). Das Protein wurde im weiteren Verlauf der Arbeit als Spc2p bezeichnet.

Die 18 kDa Bande sowie die etwas darüber laufende feine 19 kDa Bande konnten beide als Sec11p identifiziert werden. Die Doppelbande könnte darauf hinweisen, daß ein geringer Teil der Sec11p Population als Glycoprotein vorliegt. Bei der 12 kDa Bande handelte es sich um Spc1p. Die Aminosäuresequenzanalysen wurden freundlicherweise von Frau Dr. R. Kraft und Frau S. Kostka am Max-Delbrück-Centrum durchgeführt.

4.1.1.3 Molekulare Charakterisierung von Spc2p und Spc3p

Das Protein Spc3p ist 184 Aminosäuren groß und besitzt ein nahe am N-Terminus liegendes Transmembransegment. Im Mittelteil sowie kurz vor dem C-terminalen Ende von Spc3p befindet sich jeweils eine potentielle N-Glycosylierungsstelle. Von Herrn Dr. E. Hartmann durchgeführte Genbankvergleiche führten zur Identifizierung homologer Proteine in verschiedenen anderen eukaryontischen Organismen (Abb. 9).

Spc3p besitzt 26 % Identität zur Säuger SP-Untereinheit SPC22/23 (Evans et al., 1986). Desweiteren gehört zur SPC22/23 Proteinfamilie auch das gp23, das von Baker und Lively (1987) im dimeren SP-Komplex aus Huhn gefunden wurde. Die Existenz von homologen SPC22/23-Sequenzen in C. elegans, S. pombe sowie A. thaliana (persönliche Mitteilung von Dr. E. Hartmann) sowie die hier gezeigte Coreinigung von Spc3p mit der Signalpeptidaseaktivität lassen vermuten, daß die Proteine der SPC22/23-Familie ein integraler Bestandteil aller eukaryontischen SP-Komplexe sind.

Anhand von Sequenzvergleichen konnte auch das Spc2p der Hefe einem Protein aus dem Säuger SP-Komplex zugeordnet werden. Spc2p ist zu 20 % identisch mit der Säuger-Untereinheit SPC25 (Abb. 10). In weiteren Genbankvergleichen wurden auch homologe Proteine zur SPC25 Untereinheit in C. elegans, A. thaliana und S. pombe gefunden. Alle diese Proteine besitzen jeweils zwei Transmembrandomänen, wobei für das SPC25 aus Hund gezeigt werden konnte, daß sich N- sowie C-Terminus im Cytoplasma befinden (Kalies und Hartmann, 1996). Der Abstand zwischen den beiden Membranankern ist sehr gering, wodurch der Hauptanteil des Proteins im Cytosol liegt. Die Säuger SP-Untereinheit SPC25 unterscheidet sich etwas vom Spc2p sowie den anderen gefundenen homologen Proteinen. Das Säugerprotein besitzt am N-Terminus einen glycinreichen Bereich, der in den anderen Proteinen fehlt.


29

Abb. 9: Spc3p ist ein Mitglied der SPC22/23 Proteinfamilie.
Aminosäuresequenz-Alignment von CfSP22/23 (Hund), GgSP22/23 (Huhn), CeSP22/23 (C. elegans), SpSP22/23 (S. pombe) und ScSpc3p (S. cerevisiae). Identische Aminosäuren im Alignment werden durch Sterne markiert, ähnliche mit Doppelpunkten. Die grau unterlegten As geben die potentiellen Transmembranbereiche wieder, schwarz umrahmte Boxen bezeichnen potentielle N-Glycosylierungsstellen. Unterstrichene Aminosäuren entsprechen dem ansequenzierten Bereich, der zur Identifizierung von ScSpc3p führte. Das Alignment wurde freundlicherweise von Herrn Dr. E. Hartmann zur Verfügung gestellt.

Abb. 10: Spc2p ist ein Mitglied der SPC25 Proteinfamilie.
Aminosäuresequenz-Alignment von HsSPC25 (Mensch), CfSPC25 (Hund), CeSPC25 (C. elegans), AtSPC25 (A. thaliana), SpSpc25 (S. pombe) und ScSpc2p (S. cerevisiae). Identische Aminosäuren im Alignment werden durch Sterne markiert, ähnliche mit Doppelpunkten. Die grau unterlegten Aminosäuren geben die vom Programm TopPred2 vorausgesagten Transmembranbereiche wieder. Die unterstrichenen Aminosäuren entsprechen den ansequenzierten Bereichen, die zur Identifizierung des Proteins führten. Das Alignment wurde freundlicherweise von Herrn Dr. E. Hartmann zur Verfügung gestellt.


30

4.1.1.4 Spc3p ist ein Glycoprotein

Alle bekannten Proteine der SPC22/23 Familie besitzen potentielle N-Glycosylierungsstellen. Für das SPC22/23 aus dem Säuger konnte gezeigt werden, daß es glycosyliert in der Zelle vorliegt (Evans et al.,1986). Um zu untersuchen, ob auch Spc3p glycosyliert ist, wurde aufgereinigter SP-Komplex mittels SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose transferiert, anschließend wurde dann die Nitrocellulose mit Concanavalin A konjugierter Peroxidase inkubiert.

Auf der Höhe von Spc3p wurde ein glycosyliertes Protein detektiert (Abb. 11, Bahn 1). Um das Ergebnis zu verifizieren, wurde in einem weiteren Experiment aufgereinigter SP-Komplex einer N-Glycosidase F-Behandlung unterzogen und mittels Immunoblotting analysiert (Abb. 11, Bahn 3). Verglichen mit unbehandeltem SP-Komplex (Abb. 11, Bahn 2) erkennt man, daß die Spc3p Bande nach N-Glycosidase F-Behandlung im SDS-PAGE von 25 kDa sich auf ca. 20 kDa verschiebt. Spc1p als Kontrolle hingegen läuft im SDS-Gel in Bahn 2 und 3 gleich. Der Shift von ca. 5 kDa deutet darauf hin, daß beide N-Glycosylierungsstellen glycosyliert waren. Die auftretende Doppelbande von Spc3p in Bahn 3 war wahrscheinlich das Resultat einer nicht vollständigen N-Glycosidase F- Spaltung.

Der Membrananker von Spc3p befindet sich in der Nähe des N-Terminus des Proteins, wogegen beide N-Glycosylierungsstellen hinter dem Membrananker auf der C-terminalen Seite liegen. Man kann also davon ausgehen, daß der kurze N-Terminus des Proteins im Cytoplasma liegt und der Hauptteil des Proteins sich im Lumen des ER befindet. Durchgeführte Proteaseschutzexperimente bestätigten diese Annahme (Daten nicht gezeigt).

Abb. 11: Spc3p ist ein Glycoprotein.
Aufgereinigter SP-Komplex (entsprechend 500 eq Ausgangs-RM) wurde im SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Anschließend wurde die Nitrocellulose mit Concanavalin A konjugierter Peroxidase inkubiert (Bahn 1) Alternativ wurde SP-Komplex mit N-Glycosidase F inkubiert und anschließend mittels SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert (Bahn 3). Bahn 2 zeigt unbehandelten SP-Komplex. Als Antikörper wurden anti-Spc3p und anti-Spc1p verwendet.


31

4.1.1.5 Spc2p und Spc3p sind integrale Bestandteile des SP-Komplexes der Hefe

Unabhängig von der säulenchromatographischen Aufreinigung der Signalpeptidase sollte auch durch Coimmunopräzipitationsexperimente gezeigt werden, daß der SP-Komplex mindestens aus den vier Untereinheiten Sec11p, Spc1p, Spc2p und Spc3p besteht.

Rauhe Mikrosomen aus Hefe wurde dafür in Hochsalzdigitoninpuffer solubilisiert und Ribosomen und Ribosomen assoziierte Proteine anschließend durch Zentrifugation abgetrennt. Der Digitoninextrakt wurde mit anti-Spc1p Antikörpern inkubiert und das resultierende Immunopräzipitat mittels SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert (Abb. 12).

Es zeigte sich, daß unter den gewählten Bedingungen die anti-Spc1p Antikörper neben Spc1p und Sec11p auch den Großteil von Spc2p und Spc3p copräzipitierten. Sec62p als Kontrollprotein wurde dagegen nicht präzipitiert, es befand sich vollständig im Überstand. Coimmunopräzipitationen mit anti-Spc2p Antikörpern ergaben ein ähnliches Bild (Abb. 21).

Abb. 12: Coimmunopräzipitation mit Anti Spc1p Antikörpern.
50 eq Hefemikrosomen wurden in 2,5 % Digitonin, H50 Gly10 Mg10 K400 Pi solubilisiert und anschließend die unlöslichen Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt. Der resultierende Digitoninextrakt wurde auf H50 Dig1,5 Gly10 Mg2 K100 Pi eingestellt, 5 µl affinitätsgereinigte Anti-Spc1p Antikörper hinzugegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Mittels Protein A Sepharose wurden die Antikörper eingesammelt, gewaschen und die gebundenen Proteine mit SDS-Probenpuffer eluiert. Die Proben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblotting mit Antikörpern gegen die angegebenen Proteine analysiert. Ausgang (Bahn 1), Coimmunopräzipitat (Bahn 2), Überstand (Bahn 3). („*“ Kreuzreaktionsbande der anti-Spc3p Antikörper mit einem unbekannten Protein.)


32

4.1.2 Analyse der Funktion von Spc3p

4.1.2.1 Spc3p ist essentiell für das Zellwachstum

Um die Funktion des Spc3p Proteins in der Hefe S. cerevisiae näher zu charakterisieren, wurde eine Deletionsmutante von SPC3 hergestellt. Die SPC3-Deletion wurde nach einer modifizierten Methode von Schneider et al. (1995) in den diploiden Stamm DF5 eingeführt. Der entstandene diploide Stamm mit einem deletierten SPC3-Locus wurde anschließend sporuliert und jeweils die separierten Sporen von ausgewählten Tetraden auf Vollmedium angezogen. Es zeigte sich, daß bei allen untersuchten Tetraden (10 Stück) nur maximal zwei der möglichen vier Sporen auskeimten. Mittels PCR konnte außerdem nachgewiesen werden, daß alle ausgekeimten Sporen das intakte Wildtyp SPC3-Allel enthielten (Daten nicht gezeigt). Spc3p scheint somit essentiell für das Überleben der Hefe zu sein.

4.1.2.2 Spc3p ist essentiell für die Prozessierung von Transportproteinen

Haploide Zellen mit deletiertem SPC3 Locus wurden gerettet durch die Einführung eines Plasmides (pGal10Spc3), welches SPC3 unter der Kontrolle eines Gal10 Promotors exprimiert. Der Gal10 Promotor wird durch Galaktose im Medium aktiviert und durch Glucose vollständig repremiert (Johnston und Davis, 1984). Man besitzt somit die Möglichkeit, gezielt SPC3 an- bzw. abzuschalten, wodurch weitere Studien bezüglich der Funktion von Spc3p in der Zelle möglich werden. Der gerettete Deltaspc3 Stamm (yHM1 mit pGal10Spc3) wurde über Nacht in galaktosehaltigem Minimalmedium kultiviert. Anschließend wurden die Zellen geerntet, gewaschen und in neues Medium überführt. Als Kohlenstoffquellen dienten dabei Glucose (Abb. 13 A, weiße Meßpunkte) oder ein Gemisch aus Galaktose und Saccharose (Abb. 13 A, schwarze Meßpunkte). Die im Galaktose-Medium enthaltene Saccharose hat dabei keine Einfluß auf die induzierende Wirkung der Galaktose (persönliche Mitteilung von Herrn Dr. T. Sommer). In mehreren unabhängigen Experimenten konnte gezeigt werden, daß jeweils nach 10 h die Wachstumsrate der Zellen in der Kultur mit Glucose-Medium stark abnahm und nach 18 h vollständig zum erliegen kam.

Parallel zur Bestimmung der Wachstumskurven wurde in den Deltaspc3 Zellen die in vivo Prozessierung von Kar2p untersucht. Die Prä-Form des Kar2p besitzt eine N-terminale Signalsequenz, die nach dem Transport des Proteins ins Lumen des ER von der Signalpeptidase abgespalten wird. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten wurden Zellen aus der reprimierten Kultur geerntet und für 10 min in vivo mit [35S] Methionin markiert. Nach der Markierung wurden die Zellen aufgeschlossen und PräKar2p sowie das prozessierte Kar2p mittels anti-Kar2p Antikörpern immunopräzipitiert. Die Immunopräzipitate wurden dann mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die markierten Proteine durch Autoradiographie (Abb. 13 B) und einem Phosphorimager analysiert. Es zeigte sich, daß nach 8 Stunden Repression von SPC3 ca. 40 % des Kar2p Proteins als Präprotein vorlagen und nach 12 Stunden Repression sogar ca. 90 % nicht mehr prozessiert wurden. Der Verlust von Spc3p bewirkt also eine Präprotein-Akkumulati8on, was wahrscheinlich die Ursache für den beobachteten Zelltod ist.


33

Abb. 13: SPC3 ist essentiell für die Präprotein-Prozessierung des Kar2p.
A) Wachstumskurven des Stammes yHM1(Deltaspc3) mit pGal10Spc3. Der Stamm wurde bei 30 °C in Minimalmedium mit 2 % Saccharose und 0,5 % Galaktose (SSGal) vorinkubiert (_ und schwarze Linie). Ein Teil der Zellen wurde dann in Minimalmedium mit 2 % Glucose (SD) umgesetzt (_ und graue Linie), was die Expression von SPC3 repremiert. Das Zellwachstum in den Kulturen wurde durch Messung der optischen Dichte bei 600 nm bestimmt.
B) Autoradiographie einer Anti-Kar2p Immunopräzipitation nach metabolischer Zellmarkierung. Zellen des Stamms yHM1(Deltaspc3) mit pGal10Spc3 wurden nach Wechsel in SD Minimalmedium nach 0, 4, 8 oder 12 h geerntet und für 10 min mit [35S] Methionin in vivo markiert. Anschließend wurden Zellextrakte präpariert und Kar2-Protein immunopräzipitiert. Die Präzipitate wurden mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. „PräKar2p“ ist die Präproteinform von Kar2p.

4.1.2.3 Der Verlust von Spc3p destabilisiert den SP-Komplex

Die oben gezeigte Akkumulation von Präproteinen kann unterschiedliche Ursachen haben. Neben dem Verlust der eigentlichen Signalpeptidaseaktivität gibt es auch die Möglichkeit, daß ein durch die Spc3p Depletion verursachter Translokationsdefekt vorliegt. Dabei würde das Präprotein im Cytosol akkumulieren und so nicht zugänglich für die ER-Signalpeptidase sein. Um die Möglichkeit eines solchen Transportdefektes auszuschließen, wurde die Spaltungsaktivität der Signalpeptidase in vitro im modifizierten Spaltungsassay nach YaDeau und Blobel (1989) untersucht. Zu diesem Zweck wurden wiederum Zellen des geretteten Deltaspc3 Stammes (yHM1 mit pGal10Spc3) zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Umsetzen in Glucosemedium geerntet. Aus den Zellen wurden Mikrosomen präpariert und mittels Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62p kalibriert. Sec62p ist eine essentielle Komponente des Sec-Komplexes (siehe Einleitung) und kann als Marker für die Menge an vorhandenem ER in der Membranpräparation herangezogen werden (siehe auch Ergebnisteil zu Spc2p). Anschließend wurde Digitoninextrakt aus den Mikrosomen hergestellt und in vitro die Aktivität der Signalpeptidase bestimmt (Abb. 14 A). Nach 9 Stunden Repression von SPC3 begann die Signalpeptidaseaktivität abzunehmen. Sie betrug nach 15 Stunden nur noch ca. 1/6 des Ausgangswertes. Die Präkursor-Akkumulation ist also auf einen Defekt der Signalpeptidaseaktivität zurückzuführen, hervorgerufen durch den Verlust von Spc3p.


34

Neben der in vitro Spaltungsaktivität wurde auch untersucht, ob sich die Depletion von Spc3p auf die anderen Untereinheiten des Komplexes auswirkt. Die Zusammensetzung des SP-Komplexes während der Spc3p Depletion wurde durch SDS-PAGE und Immunoblotting ermittelt (Abb. 14 B). Es zeigte sich, daß nicht nur Spc3p herunter reguliert wurde, sondern parallel auch die Menge an Spc1p und Sec11p in der Membran stark abnahm und zwar bis unter die jeweilige Nachweisgrenze der Antikörper. Auch die Menge an Spc2p verringert sich während des Abschaltens von Spc3p, stabilisiert sich dann jedoch auf einem niedrigeren Niveau (Abb. 14 B, 9 bis 15 Stunden). Der Verlust von Spc3p hat also einen direkten Einfluß auf die Stabilität der restlichen Untereinheiten des SP-Komplexes und somit auch auf die Signalpeptidaseaktivität. Das auch nach 15 Stunden Repression von Spc3p noch eine geringe Spaltungsaktivität nachweisbar war, obwohl Sec11p als auch Spc3p im Immunoblot nicht mehr detektierbar waren, kann an einer Kontamination der Mikrosomen mit mitochondrialem Material gelegen haben. Die mitochondriale innere Membran Protease IMP2 (Behrens et al., 1991), die homolog zur E. coli Leaderpeptidase LepB ist, besitzt eine ähnliche Substratspezifität wie die ER-Signalpeptidase.

Abb. 14: Auswirkung der Spc3p Depletion auf die in vitro Spaltungsaktivität und die Stabilität des SP-Komplexes. Zellen des Stammes yHM1 (Deltaspc3) mit Plasmid pGal10Spc3 wurden vorinkubiert in YPGal und anschließend in YPD Medium überführt. Zu den Zeitpunkten 0, 3, 6, 9, 12 und 15 Stunden wurden jeweils ein Aliquot entnommen und RM präpariert. Die Wildtypmembranen (wt) wurden aus dem diploiden Hefestamm DF5 präpariert. Alle Membranen wurden durch quantitatives Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62p normalisiert. A) Spaltungsassay mit [35S]- markiertem PräPro-alpha-Faktor als Substrat. Digitoninextrakt entsprechend 20 eq Wildtyp (wt) RM wurde jeweils eingesetzt, 3 Stunden bei 25 °C inkubiert, anschließend präzipitiert, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und im Phosphorimager analysiert. pp-alpha-F steht für PräPro-alpha-Faktor und p-alpha-F für die prozessierte Form Pro-alpha-Faktor. B) Relative Menge an Untereinheiten des SP-Komplexes. Immunoblot mit Antikörpern gegen Spc1p, Spc2p, Spc3p und Sec11p.


35

4.1.2.4 Sec11p kann die Funktion von Spc3p nicht ersetzen

Die SP-Untereinheit Sec11p ist ein essentielles Hefeprotein, das Sequenzhomologien zur Leaderpeptidase der Prokaryonten aufweist (Böhni et al., 1988; van Dijl et al., 1992). Da der Verlust von Spc3p zur Destabilisierung und Abnahme des ganzen SP-Komplexes führte, konnte nicht ausgeschlossen werden, daß die auftretenden Effekte bei der Spc3p-Depletion ursächlich auf den parallelen Verlust von Sec11p zurückzuführen waren. Um diese Frage zu testen, wurde untersucht, ob eine Überexpression von Sec11p im Deltaspc3 Stamm yHM1 die Zellen retten kann. Dazu wurde ein Plasmid (pMet3Sec11), auf dem SEC11 unter der Kontrolle eines Met3 Promotors expremiert wird, in den Deltaspc3 Stamm yHM1 transformiert. Der Stamm yHM1 enthielt außerdem das Plasmid pGal10Spc3, um Spc3p gezielt abschalten zu können. Zusätzlich wurde pMet3Sec11 als Kontrolle in den Deltasec11 Stamm yHM2 transformiert, um sicherzustellen, daß das plasmidkodierte SEC11 funktionell ist. Das Zellwachstum der Stämme wurde anschließend bei induziertem Met3-Promotor getestet, und zwar auf Minimalmedium-Platten mit Glucose oder Galaktose als Kohlenstoffquelle (Abb. 15 A). Es zeigte sich, daß Sec11p alleine die Depletion von SPC3 auf Glucose Medium nicht komplementieren konnte, obwohl Sec11p beim Ausstreichen der yHM1 Zellen, die die Plasmide pGal10Spc3 und pMet3Sec11 enthielten, stark überexprimiert war (Abb. 15 B).

Abb. 15: Überexpression von Sec11p komplementiert nicht den Verlust von Spc3p.
A
) Der Stamm yHM1(?spc3) wurde mit den Plasmiden pMet3Sec11 und pGal10Spc3 transformiert. Als Kontrollen wurden der Stamm yHM2 (?sec11) mit pMet3Sec11, der Stamm yHM1 (?spc3) mit pGal10Spc3 und der Wildtypstamm DF5 verwendet. Alle Stämme wurden über Nacht in Flüssig-Minimalmedium mit Galaktose angezogen und anschließend auf Minimalmedium Agar-Platten mit Glucose (SD) oder Galaktose (SGal) ausgestrichen und 3 Tage bei 30 °C inkubiert. Das Schaubild links gibt die Position der Stämme auf den Platten an.
B) Zellen des Stammes yHM1 (?spc3) mit pGal10Spc3 und pMet3Sec11 wurden bis zu einer OD600 von 0,6 in Minimalmedium mit Galaktose angezogen, dann Membranen präpariert und die Menge an Sec11p, Spc2p und Spc3p mittels Immunoblotting analysiert. Als Kontrolle dienten Wildtypmembranen aus dem Stamm DF5.


36

Aus dem Befund ergeben sich zwei Möglichkeiten. Entweder ist das überexpremierte Sec11p alleine nicht ausreichend, um die Spaltungsfunktion der Signalpeptidase auszuüben, oder aber die essentielle Funktion von Spc3p hat primär nichts mit der eigentlichen Signalprozessierung zu tun und kann dementsprechend auch nicht von Sec11p komplementiert werden. Bei der ersten Annahme, daß Sec11p weitere Untereinheiten des SP-Komplexes für die enzymatische Aktivität benötigt, handelt es sich wahrscheinlich um Spc3p, da Spc1p sowie Spc2p beide nicht essentiell für die Hefe sind (Fang et al., 1996; Mullins et al., 1996 und diese Arbeit) und der DeltaSpc1/DeltaSpc2 Stamm im in vitro Spaltungsassay immer noch Spaltungsaktivität zeigt (siehe Ergebnisteil zu Spc2p).Um zu überprüfen, ob Spc3p aktiv an der Signalsequenzspaltung beteiligt ist, wurde wiederum im Deltaspc3 Stamm, welcher gleichzeitig Sec11p überexprimiert, SPC3 abgeschaltet und dann zu unterschiedlichen Zeitpunkten in vitro die Spaltungsaktivität ermittelt. Wenn Sec11p alleine für die Spaltung der Signalsequenz verantwortlich ist, sollte auch nach der Depletion von Spc3p noch die Spaltungsaktivität vorhanden sein.

Bei dem Experiment wurden Zellen des Deltaspc3 Stammes yHM1, welche die Plasmide pMet3Sec11 sowie pGal10Spc3 enthielten, in Flüssigkultur angezogen. Dabei wurde das Minimalmedium so gewählt, daß auf beide Plasmide selektioniert wurde und daß der Met3- und Gal10-Promotor induziert waren. Anschließend wurden die Zellen in glucosehaltiges Medium überführt, um den Gal10-Promoter vor dem SPC3-Gen auszuschalten. Der Met3-Promotor vor dem SEC11-Gen war weiterhin angeschaltet. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Mediumwechsel wurden Mikrosomen präpariert und auf gleiche Mengen Sec62p kalibriert. Anschließend wurde in vitro die Spaltungsaktivität ermittelt (Abb. 16 A) und mittels Immunoblotting die relativen Mengen der verschiedenen SP-Untereinheiten bestimmt (Abb. 16 B).

Abb. 16: Überexpression von Sec11p verhindert nicht den Verlust der Signalpeptidaseaktivität in vitro. Zellen des Stammes yHM1 (Deltaspc3) mit den Plasmiden pGal10Spc3 und pMet3Sec11 wurden in SSGal Minimalmedium (2 % Saccharose, 1 % Galaktose, -ura, -trp, -met) angezogen und anschließend in SD Minimalmedium (2 % Glucose, -ura, -trp, -met) überführt. Zu verschieden Zeitpunkten nach dem Wechsel (0, 5, 10 und 15 Stunden) wurden Zellen geerntet und entsprechend der in Abb. 14 beschriebenen Methode analysiert. Als Kontrolle wurden Wildtypmembranen (wt) aus dem diploiden Stamm DF5 isoliert. A) in vitro Spaltungsassay mit [35S]-markiertem PräPro-alpha-Faktor (pp-alpha-F) als Substrat. Pro-alpha-Faktor (p-alpha-F) ist die prozessierte Form des PräPro-alpha-Faktors (pp-alpha-F). B) Relative Menge an Untereinheiten des SP-Komplexes. Immunoblot mit Antikörpern gegen Spc1p, Spc2p, Spc3p und Sec11p.


37

Es zeigte sich, daß wiederum parallel zum Verlust von Spc3p auch die Spaltungsaktivität der Signalpeptidase stark abnahm. Nach 10 Stunden Repression war Spc3p im Immunoblot nicht mehr detektierbar, Sec11p hingegen war zu diesem Zeitpunkt noch in vergleichbarer Menge wie in der Wildtyp Membran vorhanden (Abb. 16 B), zeigte dabei jedoch keine stimulierende Wirkung auf die Spaltungsaktivität (Abb. 16 A). Nach 15 Stunden Repression von SPC3 waren auch Sec11p, Spc1p und Spc2p kaum noch im Westernblot detekierbar. Ursache ist wahrscheinlich, daß zu diesem Zeitpunkt die Zellen schon so extrem geschädigt waren, das eine reguläre Expression und/oder Insertion der Proteine in die Membran verhindert wurde.

Im Gegensatz zu den monomeren Leaderpeptidasen der Prokaryonten benötigt Sec11p anscheinend Spc3p, um katalytisch aktiv zu sein. Durch Komplementationsexperimente mit C- oder N-terminal verkürzten Spc3p Varianten konnte gezeigt werden, daß der gesamte N-terminale, cytosolisch gelegene Teil von Spc3p (14 Aminosäuren) nicht essentiell für die Funktion von Spc3p ist. Verkürzt man hingegen das luminal gelegene C-terminale Ende von Spc3p um 24 Aminosäuren, so führt dies zum Zelltod (Daten nicht gezeigt).

4.1.3 Analyse der Funktion von Spc2p

4.1.3.1 Spc2p ist unter normalen Wachstumsbedingungen nicht essentiell

Im Labor unseres Kooperationspartners Herrn Dr. N. Green von der Vanderbilt University konnte gezeigt werden, daß sowohl Spc1p als auch Spc2p nicht essentiell für das Überleben der Hefe sind. Die Einzeldeletionsstämme Deltaspc1 und Deltaspc2, sowie der Doppeldeletionsstamm Deltaspc1/Deltaspc2 zeigten bei Inkubationstemperaturen bis 38 °C keine Unterschiede zum Wildtypstamm. Inkubierte man jedoch den Deltaspc2 Stamm oder den Deltaspc1/Deltaspc2 Stamm bei 42 °C, wurde in vivo eine nicht lethale Akkumulation von sekretorischen Vorstufenproteinen beobachtet. Desweiteren konnte in der Arbeitsgruppe gezeigt werden, daß die Zellen der beiden Stämme nach längerer Inkubation bei 42 °C eine verminderte Überlebensfähigkeit im Vergleich zu gleichbehandelten Wildtypzellen aufwiesen. Die Kombination einer temperatursensitiven SEC11 Mutante (sec11-7) mit einer SPC2 Deletion erwies sich außerdem als synthetisch lethal (Fang et al., 1995 und Mullins et al., 1996).

4.1.3.2 Depletion von Spc2p destabilisiert den SP-Komplex und vermindert die Signalpeptidaseaktivität in vitro

Die Daten aus dem Labor von Herrn Dr. N. Green zeigten, daß unter Hitzeschock-Bedingungen (42 °C) der Verlust von Spc2p zur Präproteinakkumulation und verminderter Zellvitalität führte. Die in diesem Zusammenhang durchgeführten in vivo Spaltungsexperimente konnten jedoch nicht die Frage beantworten, ob die Präproteinakkumulation auf eine verminderte enzymatische Aktivität oder eine geringere Stabilität des Restkomplexes im Deltaspc2 Stamm zurückzuführen ist.

Um den Einfluß von Spc2p auf den restlichen SP-Komplex näher zu charakterisieren, wurden die von Herrn Dr. N. Green zur Verfügung gestellten Deletionsstämme HFY403 (Deltaspc2) sowie HFY401 (Deltaspc1) und HFY404 (Deltaspc1/Deltaspc2) unter normalen Aufzuchtbedingungen auf ihre Signalspaltungsaktivität in vitro und auf die Zusammensetzung des SP-Komplexes hin untersucht. Diese Untersuchungen erfolgten in enger Zusammenarbeit mit Herrn W. Antonin, sie wurden teilweise im Rahmen seiner Diplomarbeit durchgeführt und maßgeblich von mir betreut.

Um die Untereinheiten-Zusammensetzung des SP-Komplexes in den oben genannten Deletionsstämmen sowie einem entsprechenden Wildtypstamm zu ermitteln, wurden die Stämme bei 30 °C in Vollmedium angezogen und anschließend aus den Zellen Mikrosomen präpariert, die dann mittels Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62 kalibriert wurden. Die kalibrierten Membranen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblot mit Antikörpern gegen Sec11p, Spc1p, Spc2p und Spc3p analysiert. Durch die Verwendung von [35S]-markierten sekundären Antikörpern sowie eines Phosphorimagers war es möglich, die jeweiligen Proteinmengen der Untereinheiten in Relation zum Wildtyp-Level semi-quantitativ zu bestimmen (Abb. 17).


38

Es zeigte sich, daß die Mengen an Sec11p und Spc3p im Deltaspc2 Stamm sowie auch im Deltaspc1/Deltaspc2 Stamm nur etwa der Hälfte des Wildtypniveau entsprachen. Im Deltaspc1 Stamm hingegen verblieben die restlichen Untereinheiten auf Wildtypniveau. Desweiteren war zu beobachten, daß in den Mikrosomen des Deltaspc2 Stammes Spc1p vollkommen fehlte, obwohl die Menge an SPC1 mRNA weiterhin dem Wildtypniveau entsprach (Daten nicht gezeigt). Spc2p scheint somit einen großen Einfluß auf die Stabilität des SP-Komplexes zu besitzen. Die Menge der beiden essentiellen Untereinheiten Spc3p und Sec11p reduzierte sich auf die Hälfte. Die Depletion von Spc2p verhindert auch, das Spc1p stabil in der Membran verbleibt.

Abb. 17: Expressionsniveau von SP-Untereinheiten in verschiedenen Deletionsstämmen.
Mikrosomen aus den Stämmen DF5 (wt), HFY403 (Deltaspc2), HFY401 (Deltaspc1) und HFY404 (Deltaspc1/Deltaspc2) wurden mittels Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62p kalibriert. Anschließend wurden jeweils die Proteinmengen von Spc1p, Spc2p, Spc3p und Sec11p bestimmt und in Relation zum wt-Stamm DF5 gesetzt (1 entspricht wt-Niveau). Die Quantifikation der Proteinmengen erfolgte nach SDS-PAGE und Immunoblot mit Hilfe von [35S] markierten sek. Antikörpern sowie einem Phosphorimager von Fuji. Die dargestellten Daten wurden der Diplomarbeit von Herrn W. Antonin entnommen.

Als nächstes wurde in vitro die Spaltungsaktivität der einzelnen Deletionsstämme untersucht (Abb. 18). Die verwendeten Mikrosomen wurden dafür auf gleiche Mengen der beiden essentiellen Untereinheiten Spc3p und Sec11p kalibriert, um die oben beschriebenen Mengenunterschiede an SP-Komplexen in den einzelnen Stämmen auszugleichen. Wir fanden, daß die Depletion von Spc1p keinen Einfluß auf die Spaltungsaktivität hatte, jedoch die Depletion von Spc2p zu einer Halbierung der Signalpeptidaseaktivität führte. Auch der Deltaspc1/Deltaspc2 Doppeldeletionsstamm zeigte eine Reduktion der Aktivität auf etwa die Hälfte.

Abb. 18: In vitro Spaltungsaktivität des Deltaspc2, Deltaspc1 und Deltaspc2/Deltaspc1 Stammes im Vergleich zum Wildtypstamm. [35S]-markierter PräPro-alpha-Faktor wurde als Substrat für den in vitro Spaltungsassay eingesetzt. Mikrosomen der Stämme Df5 (wt), HFY403 (Deltaspc2), HFY401 (Deltaspc1) und HFY404 (Deltaspc1/Deltaspc2) waren zuvor auf gleiche Mengen Spc3p und Sec11p kalibriert worden. Die Quantifizierung der Menge an prozessiertem alpha-Faktor erfolgte nach SDS-PAGE mittels eines Phosphorimagers (Fuji). Die dargestellten Daten wurden der Diplomarbeit von Herrn W. Antonin entnommen.


39

Im Deltaspc2 sowie im Deltaspc1/Deltaspc2 Stamm bestand der SP-Komplex nur noch aus Spc3p und Sec11p. Da für den in vitro Spaltungsassay die Mikrosomen zuvor in einem Detergenz solubilisiert wurden, konnte nicht ausgeschlossen werden, daß ein Teil des Rumpfkomplexes dissoziiert oder denaturiert. Durch die Bindung von Digitoninextrakt aus solubilisierten Mikrosomen des Deltaspc1/Deltaspc2 Stammes an Concanavalin A Sepharose konnte jedoch gezeigt werden, daß nicht nur das glycosylierte Spc3p vollständig an die Matrix bindet, sondern auch Sec11p. Dieses ist nur möglich, wenn Sec11p noch vollständig mit Spc3p assoziiert ist (Daten nicht gezeigt).

Auch eine partielle Denaturierung des Komplexes erscheint unwahrscheinlich, da eine reduzierte Spaltungsaktivität auch beobachtet wurde, wenn anstelle von Digitonin eine Reihe anderer Detergenzien benutzte wurden, wie Triton X-100, DeoxyBigChap, Oktylglycosid oder auch Saponin (persönliche Mitteilung von W. Antonin). Saponin ist unter den gewählten Bedingungen ein sehr mildes Detergenz, das nicht in der Lage ist, die ER-Membran vollständig aufzulösen. Die integralen Membranproteine verbleiben nativ in der perforierten Membran (Panzner et al., 1995).

Um ausschließen zu können, daß die bisher beschriebenen Effekte des untersuchten Deltaspc2 Stammes nicht auf sekundären genetischen Defekten der Ursprungssporen beruhten, wurde der Stamm HFY403 mit einem plasmidkodierten SPC2 Gen komplementiert, das unter der Kontrolle eines Gal10 Promotors stand (pGal10Spc2). Somit war es möglich, Spc2p gezielt an- bzw. abzuschalten und beide Zustände miteinander zu vergleichen. Zellen des komplementierten Deletionsstammes wurden dafür in Flüssigmedium mit Galaktose angezogen und anschließend für 10 Stunden in Medium mit Glucose inkubiert, wodurch SPC2 repremiert wurde. Danach wurden die Zellen wiederum für 6 Stunden in Medium mit Galaktose inkubiert, was die Expression von Spc2p wieder induzierte. Zu verschiedenen Zeitpunkten des Experiments wurden aus den Zellen Mikrosomen präpariert und mittels Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62p kalibriert.

Der induzierte Deltaspc2 Stamm (mit pGal10Spc2) zeigte im in vitro Spaltungsassay keinen Unterschied zum isogenen Wildtypstamm (Abb. 17 A, 0 Stunden). Durch den verwendeten Gal10 Promotor war Spc2p zu diesem Zeitpunkt stark überexprimiert, die Mengen an Spc1p und Spc3p entsprachen jedoch dem Wildtypniveau. Die Menge von Sec11p konnte leider nicht bestimmt werden, da zum Zeitpunkt der Experimente keine funktionsfähigen anti-Sec11p Antikörper mehr zur Verfügung standen. Bei der anschließenden Repremierung von Spc2p zeigte sich, daß zeitlich versetzt auch die Mengen von Spc1p sowie Spc3p abnahmen. Nach 8 Stunden Repression von Spc2p war in der Membran neben Spc2p auch kein Spc1p mehr nachweisbar, die Menge an Spc3p hatte sich auf die Hälfte des Wildtyplevels reduziert und veränderte sich auch nach 10 Stunden Repression von Spc2p nicht mehr. Die ermittelte in vitro Signalpeptidaseaktivität betrug zu diesen Zeitpunkten nur noch ca. ein Viertel der Ausgangsaktivität (Abb. 19 A, Mittelwert aus Zeitwert 8 h und 10 h). Der Unterschied um Faktor 2 zur oben beschriebenen Aktivitätsabnahme im Deltaspc2 Stamm ohne Komplementation beruhte darauf, daß die Mikrosomen in den beiden Experimenten auf unterschiedliche Proteine kalibriert waren. Im Abschaltexperiment wurde auf gleiche Mengen Sec62p kalibriert, wodurch sich zwei Effekte summierten: erstens die Reduzierung der Menge des Rumpf-SP-Komplexes (Sec11p und Spc3p) auf die Hälfte des Wildtypniveaus und der Umstand, daß der Rumpfkomplex nur noch die halbe Spaltungsaktivtät des Wildtyp-Komplexes besitzt. Bei der vorherigen Untersuchung des Deltaspc2 Stammes ohne Komplementationsexperiment war auf gleiche Mengen an Rumpfkomplex kalibriert, wodurch nur die verminderte Aktivität des Rumpfkomplexes gemessen wurde.

Die Deletion von SPC2 führte dazu, daß Spc1p nicht mehr in den SP-Komplex integriert werden konnte. Ist nun der Verlust von Spc2p alleine oder erst die Kombination mit Spc1p für die beobachtete Abnahme an Spaltungsaktivität im Deltaspc2 Stamm verantwortlich? Das Abschaltexperiment zeigte deutlich, daß erst der Verlust beider Untereinheiten zum Aktivitätsverlust führt. Nach vier Stunden Repression im Glucosemedium betrug die Expression von Spc2p nur noch ca. 10 % des Wildtyps, die Menge an Spc1p hingegen war noch nicht reduziert und die in vitro Spaltungsaktivität entsprach dem Wildtypniveau. Erst mit der Abnahme von Spc1p (und Spc3p) nahm auch die Spaltungsaktivität ab (Abb. 19, Zeitwert 6 bis 10 Stunden). Spc2p war zu diesen Zeitpunkten im Immunoblot schon nicht mehr nachweisbar. Da der Verlust von Spc1p alleine keine Auswirkungen auf die in vitro Spaltungsaktivität hat (siehe Abb. 18: Deltaspc1 Stamm), müßten beide Proteine gemeinsam für die beobachtete Reduzierung der in vitro Spaltungsaktivität im Deltaspc2 Stamm verantwortlich sein.


40

Abb. 19: Abschaltexperiment Spc2p.
Zellen des Deltaspc2 Stammes HFY403 mit dem Plasmid pGal10Spc2 wurden in Galaktose-Vollmedium (YPGal) bei 30 °C inkubiert (Zeitwert: 0 h). Anschließend wurden die Zellen für 10 Stunden in Glucose-Vollmedium (YPD) bei 30 °C inkubiert (Repression von Spc2p), um danach für 6 Stunden in Galaktose-Vollmedium (YPGal) inkubiert zu werden (Induktion von Spc2p). Während des Experimentes wurden jeweils in Abständen von 2 Stunden Aliquots entnommen und Mikrosomen präpariert. Diese, sowie Mikrosomen aus dem wt-Stamm SEY62.10 wurden mittels Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62p kalibriert.
A) in vitro Spaltungsassay mit [35S]- markierten PräPro-alpha-Faktor als Substrat. Mikrosomen entsprechend 40 eq wurden eingesetzt. Die Quantifizierung der Menge an prozessiertem alpha-Faktor erfolgte nach SDS-PAGE mit einem Phosphorimager. Im oberen Teil der Abbildung ist die entsprechende Autoradiographie des SDS-Gels dargestellt.
B) Bestimmung der Mengen von Spc1p, Spc2p und Spc3p relativ zum Wildtyp. Die Quantifizierung der Proteinmengen nach SDS-PAGE und Immunoblot erfolgte mit Hilfe von [35S]-markierten sek. Antikörpern sowie einem Phosphorimager. Der Wert 1 entspricht wt-Niveau.


41

4.1.3.3 Die Depletion von Spc2p verringert die Menge an Sbh2p in der Zelle

Im oben durchgeführten Abschaltexperiment wurden die Expressionsniveaus der einzelnen Untereinheiten des SP-Komplexes im zeitlichen Verlauf analysiert. Die präparierten Mikrosomen wurden hierfür auf jeweils gleiche Mengen Sec62p kalibriert. Während des Depletions-Experimentes konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden, daß sich die Menge an Sec62p vielleicht doch in Abhängigkeit von Spc2p verändert und somit Sec62p nicht als Standard benutzt werden kann. Als Kontrolle wurden daher die Expressionsniveaus von weiteren Proteinen des Translokationsapparates mittels Immunoblotting ermittelt (siehe Abb. 20).

Abb. 20: Die Depletion von Spc2p verändert die Menge an Sbh2p in der Zelle.
Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden während des Abschaltexperimentes (siehe Abb. 19) Mikrosomen präpariert und mittels Immunoblotting auf gleiche Mengen Sec62p kalibriert. Anschließend wurden die Expressionsniveaus von Spc2p, Sbh2p, Sec72p, Sbh1p, Sec61p und Ssh1p mittels SDS-PAGE und Immunoblotting bestimmt und in Relation zum wt-Stamm SEY62.10 gesetzt (1 entspricht wt-Niveau). Die Quantifizierung der Proteinmengen im Immunoblot erfolgte mit Hilfe von [35S]-markierten sek. Antikörpern sowie einem Phosphorimager von Fuji (Sec62p, Spc2p, Sbh2p, Sec61p und Ssh1p) oder mittels Peroxidase gekoppelten sek. Antikörpern, dem ECL-System und einem Lumineszenzvideosystem von Raytest (Sbh1p und Sec72p).


42

Getestet wurden die Expressionsniveaus von Sec61p, Sec72p, Ssh1p, Sbh1p, sowie Sbh2p (Zuordnung der einzelnen Proteine zu den verschiedenen Translokationssubkomplexen der Hefe siehe Faltblatt im Anhang: Abb. 35). Wie aus der Abbildung zu entnehmen ist, blieben die Proteinmengen von Sec72p, Sec61p, Sbh1p und Ssh1 (der alpha-Untereinheit des Ssh1-Komplexes) während der Depletion von Spc2p konstant. Alle diese Proteine verhielten sich dementsprechend wie Sec62p. Überraschenderweise zeigte jedoch Sbh2p, die beta-Untereinheit des Ssh1-Komplexes, ein anderes Verhalten. Während der Repression von Spc2p nahm die Menge an Sbh2p in der Membran zeitversetzt mit ab, und zwar um bis zu 80 % der ursprünglichen Wildtypmenge. Bei der anschließenden Reinitiation der Spc2p Synthese stieg die Menge an Sbh2p in der Membran wieder auf das anfängliche Wildtypniveau zurück. Der gleiche Effekt, daß Spc2p die Menge an Sbh2p in der Membran beeinflußt, konnte auch im reinem Deltaspc2 Stamm sowie im Deltaspc1/Deltaspc2 Stamm beobachtet werden. In beiden Fällen ist die Menge an Sbh2p, verglichen mit der Sbh2p Menge eines entsprechenden isogenen Wildtypstammes, in gleicher Größenordnung wie im Abschaltexperiment reduziert. Im Deltaspc1 Stamm hingegen konnte keine Abnahme von Sbh2p beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).

4.1.3.4 Der SP-Komplex interagiert physisch mit Sbh1p und Sbh2p

Die Menge an Spc2p in der Membran scheint einen direkten Einfluß auf die Menge an Sbh2p zu haben. Finke et al. (1996) konnten zeigen, daß Sbh2p in vivo instabil wird, wenn es nicht mit einer alpha-Untereinheit wie Ssh1p oder Sec61p assoziiert ist. Da beim Verlust von Spc2p eine Abnahme von Sbh2p zu beobachten ist, kann man vermuten, daß auch der SP-Komplex über die Spc2p-Unteinheit physisch mit Sbh2p interagiert. Um eine solche physische Interaktion zwischen der Signalpeptidase und Sbh2p in der Hefe nachzuweisen, wurden Coimmunopräzipitations-Experimente durchgeführt.

Abb. 21: Coimmunopräzipitation von Sbh1p und Sbh2p mit Antikörpern gegen Spc1p und Spc2p.
Aus Mikrosomen des wt-Stammes (Sey62.10) sowie des Deltaspc2 Stammes (HFY403) wurden Digitoninextrakte präpariert. Zu den Digitoninextrakten wurden an Protein A-Sepharose gekoppelte Antikörper gegen Spc1p oder Spc2p hinzugeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die gebundenen Proteine wurden anschließend mit SDS-Probenpuffer eluiert. Proben des Ausgangs (T=Total), der Coimmunopräzipitate (IP) sowie der Überstände (Ü) wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblotting mit Antikörpern gegen die angegebene Proteine analysiert.


43

Aus Zellen des Deltaspc2 Stammes bzw. des entsprechenden Wildtypstammes wurden jeweils Mikrosomen präpariert und in einem Hochsalz-Digitonin-Puffer solubilisiert. Anschließend wurden durch Zentrifugation Ribosomen sowie ribosomenassoziierte Proteine pelletiert. Zum resultierenden Überstand wurden Antikörper gegen Spc1p oder Spc2p, die jeweils an Protein A-Sepharose gekoppelt waren, hinzugegeben und für 8 Stunden bei 4 °C inkubiert. Nach intensivem Waschen der Beads wurden die gebundenen Proteine durch SDS-Probenpuffer eluiert und mittels SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert. Wie aus Abb. 21 zu entnehmen ist, konnten in den Wildtyp-Membranen sowohl mit anti-Spc1p als auch mit anti-Spc2p Antikörpern jeweils die anderen Untereinheiten des SP-Komplexes coimmunopräzipitiert werden, sowie zusätzlich auch eine geringe Menge (ca. 5 bis 10 % der Gesamtmenge) an Sbh2p und Sbh1p (Abb. 21, Bahn 3 und Bahn 5). Anzumerken bleibt dabei, daß zwar die beta-Untereinheit des Sec61-Komplexes coimmunopräzipitiert wurde, jedoch nicht die alpha-Untereinheit, obwohl unter den verwendeten Pufferbedingungen der trimere Sec61-Komplex stabil war (Daten nicht gezeigt). Daß die gebundene Proteine Sbh2p und Sbh1p spezifisch mit dem SP-Komplex assoziiert sind, zeigt die Kontrolle mit Material aus dem Deltaspc2 Stamm. Wäre die Interaktion von Sbh2p und Sbh1p auf eine unspezifische Bindung an die Antikörper zurückzuführen, so müßten auch im Deltaspc2 Stamm die beiden Proteine im Immunopräzipitat zu finden sein, was jedoch nicht der Fall war.

4.2 Identifizierung einer Sec-Komplex ähnlichen Struktur im Säuger

Beim Transport von Proteinen durch die Membran des ER sind mindestens 20 verschiedene Polypeptide direkt oder indirekt beteiligt (Kalies und Hartmann, 1998). In allen bisher untersuchten Eukaryonten bildet dabei der Sec61-Komplex die zentrale Pore für den Translokationsprozeß. In Säugerzellen erfolgt der Proteintransport durch die ER-Membran fast ausschließlich cotranslational. Kleine sekretorische Proteine werden jedoch auch im Säugersystem ribosomenunabhängig ins ER transportiert (Zimmermann et al., 1990; Klappa et al., 1991). Im Gegensatz zum molekular und mechanistisch gut untersuchten posttranslationalen Transport in der Hefe S. cerevisiae ist es beim Säuger bisher ungeklärt, welche Komponenten für diesen Transportmodus benötigt werden.

In diesem Teil der Arbeit wurde die molekulare Umgebung von nicht Ribosomen assoziierten Sec61-Komplexen aus Säugerzellen untersucht, mit dem Ziel, mögliche Komponenten eines posttranslationalen Transportkomplexes zu identifizieren.

4.2.1 Identifizierung und Klonierung von Sec62p und Sec63p homologen Proteinen im Säuger

Ausgangspunkt war die Fragestellung, ob in Abwesenheit von Ribosomen noch Proteine mit dem trimeren Sec61-Komplex im Säuger assoziiert sind. Um dies zu untersuchen, wurden rauhe Mikrosomen aus Rinderpankreas durch eine Hochsalz-Puromycin-Behandlung von Ribosomen befreit und die resultierenden PK-RM in einem Hochsalz Digitoninpuffer solubilisiert. Anschließend wurden nicht gelöste Aggregate durch Zentrifugation abgetrennt und der resultierende Überstand an eine anti-Sec61beta Antikörpersäule gebunden. Nach intensivem Waschen der Säule wurden die gebundenen Proteine durch Zugabe großer Mengen des Peptides, gegen das die anti-Sec61beta Antikörper der Säule gerichtet waren, wieder eluiert. Die im Eluat enthaltenen Proteine wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und durch Coomassiefärbung sichtbar gemacht (Abb. 22, Bahn 4). Die Coomassiefärbung des Eluats zeigte, daß außer dem Sec61-Komplex (im Gel repräsentiert durch Sec61alpha und Sec61beta) noch zwei weitere Proteinbanden mit molaren Massen von ca. 80 kDa und ca. 97 kDa vorhanden waren.


44

Abb. 22: Identifizierung von Sec63p im Säuger.
Rinder PK-RM wurden mit 2,5 % Digitonin in H50 K500 Mg10 Gly10 ß-Me5 Pi solubilisiert und anschließend die nicht gelösten Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt. Der resultierende Extrakt wurde an eine anti-Sec61beta-Antikörpersäule gebunden. Nach intensivem Waschen der Säule mit 0,5 % Digitonin in H50 K250 Mg10 Gly10 ß-Me5 Pi (wash) wurde das gebundene Material durch Zugabe großer Mengen des Peptides, gegen das die Antikörper gerichtet waren, von der Säule eluiert (Eluat). Proben entsprechend 20 eq (Extrakt und Durchlauf) oder 450 eq (wash und Eluat) des Ausgangsmaterials wurden mittels SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend Coomassie gefärbt. Aus den Proteinbanden des Eluats wurden nach Spaltung mit Trypsin und anschließendem Edman-Abbau interne Aminosäuresequenzen ermittelt. Aus der 80 kDa Bande (BiP) ergaben sich die Peptide TKPYIQVDVG und AVEEKI, welche beide dem Protein BiP zuzuordnen waren. Die ermittelten Peptidsequenzen aus der 97 kDa Bande (Sec63) sind in Abb. 23 dargestellt.

Aus den Proteinbanden wurden nach Trypsinspaltung durch Edman-Abbau interne Aminosäuresequenzen ermittelt. Die 80 kDa Proteinbande konnte als das zur Hsp70 Familie gehörende luminal vorkommende BiP identifiziert werden. Die aus der 97 kDa Bande ermittelten Peptidsequenzen (siehe in Abb. 23 die mit „o“ markierten Bereiche) korrespondierten mit einer Gruppe von menschlichen „expressed sequence tags“ aus der „GenBank“ Datenbank (persönliche Mitteilung von Dr. E. Hartmann). Ausgehend von diesem Sequenzmaterial war es im Labor von Herrn Dr. S. Prehn möglich, eine cDNA zu klonieren und zu sequenzieren, dessen Proteinsequenz alle ermittelten Peptidsequenzen aus der 97 kDa Bande enthielt. Sequenzvergleiche ergaben, daß das neu gefundene Säugerprotein Homologien zum Sec63p der Hefe aufzeigte (ca. 20 % identische Aminosäuren), weshalb es im Folgenden als Sec63 bezeichnet wird.

Wie das Sec63p der Hefe besitzt auch das humane Sec63 drei potentielle Transmembranbereiche sowie eine DnaJ-homologe Domäne zwischen dem zweiten und dritten Membrananker. Die vorhergesagte Orientierung des humanen Sec63 in der Membran ist dabei identisch zu der des Hefe-Proteins (Skowronek et al., 1999). Die stärkste Homologie zwischen beiden Proteinen findet man vom zweiten bis zum Ende des dritten Membranankers (40 % Identität zwischen Hefe und Mensch). Interessanterweise sind jedoch einige der Aminosäurereste der DnaJ-homologen Domäne des Sec63p der Hefe, die essentiell für die Interaktion von Sec63p mit Kar2p sind (Schlenstedt et al., 1995), im humanen Sec63 nicht konserviert. Das humane Sec63 besitzt außerdem im Bereich des C-Terminus ein zusätzliches Aminosäuremotiv, das man auch im C-Terminus von 200 kDa Proteinen der U5 snRNPs findet (Lauber et al., 1996).


45

Abb. 23: Alignment des Säuger Sec63 mit homologen Sequenzen aus anderen Organismen: HsSec63 (H. sapiens); CeSec63 (C. elegans); AtSec63 (A. thaliana) und ScSec63: (S. cerevisiae, Sec63p). Identische Aminosäuren im Alignment werden durch Sterne markiert, ähnliche mit Doppelpunkten. Die grau unterlegten Aminosäuren geben vorhergesagte Transmembransegmente wieder. Die DnaJ-homologe Domäne ist schwarz umrandet. Die unterstrichenen Regionen zeigen den Bereich zwischen den verschiedenen Sec63 Proteinen an, der am stärksten konserviert ist. Die durch Edman-Abbau ermittelten Sequenzen aus dem aufgereinigten Säugerprotein werden durch „o“ angezeigt. Das Alignment wurden freundlicherweise von Herrn Dr. E. Hartmann zur Verfügung gestellt.


46

Die Existenz eines humanen Sec63-Proteins ließ vermuten, daß auch Homologe zu den anderen Komponenten des Sec62/Sec63 Subkomplexes der Hefe im Säuger zu finden sind. Herrn Dr. E. Hartmann war es möglich, in der „GenBank“ Datenbank Teile eines humanen Sec62p Homologen zu identifizieren. Die vollständige Sequenz des Proteins wurde dann wiederum über eine klonierte und sequenzierte cDNA im Labor von Herrn Dr. S. Prehn ermittelt (Abb. 24). Homologe Proteine zu Sec71p oder Sec72p konnten jedoch bis heute nicht im Säuger identifiziert werden.

Abb. 24: Alignment des Säuger Sec62 mit homologen Sequenzen aus anderen Organismen: HsSec62 (H. sapiens); DmSec62 (D. melanogaster, Dtrp1); CeSec62 (C. elegans); SpSec62 (S. pombe) und ScSec62 (S. cerevisiae, Sec62p). Identische Aminosäuren im Alignment werden durch Sterne markiert, ähnliche mit Doppelpunkten. Die grau unterlegten Aminosäuren geben vorhergesagte Transmembransegmente wieder. Das Alignment wurden freundlicherweise von Herrn Dr. E. Hartmann zur Verfügung gestellt.

Das Sec62p Homologe im Menschen besitzt wie das der Hefe zwei putative Transmembransegmente (Abb. 24). Die Bereiche der stärksten Homologie befindet sich in den flankierenden Regionen der Membrananker und der dazwischen liegenden luminalen Domäne (34 % Identität zwischen Hefe und Mensch). Die C- bzw. N-terminalen Bereiche der beiden Proteine sind kaum konserviert. Das humane Sec62 besitzt C-terminal zusätzliche Sequenzmotive, die dem Hefe Sec62p fehlen. Interessanterweise besitzen auch die Sec62p homologen Proteine aus anderen höheren Organismen (D. melanogaster und C. elegans) dort zusätzliche Sequenzmotive, während sie bei einem weiteren Vertreter der Hefen (S. pombe) fehlen.


47

4.2.2 Charakterisierung des Sec63/Sec61 Subkomplexes

Wie oben gezeigt, findet man BiP und Sec63 assoziiert mit dem trimeren Sec61-Komplex. Vergleicht man die Intensitäten der einzelnen Coomassiebanden in Abb. 22, Bahn 4, miteinander, so fällt auf, daß die Proteinmenge an Sec63 und BiP im Verhältnis zur Menge an Sec61alpha um ein Vielfaches geringer ist. Anscheinend ist nicht jeder Sec61-Komplex mit Sec63 oder BiP assoziiert. Eine mögliche Erklärung könnte sein, daß für das Immunopräzipitationsexperiment PK-RM als Ausgangsmaterial verwendet wurden. Dadurch sind nach Görlich und Rapoport (1993) im präparierten Digitoninextrakt neben freiem Sec61-Komplex zum großen Teil auch solche Sec61-Komplexe enthalten, die vor der Hochsalz-Puromycin Behandlung fest mit Ribosomen assoziiert waren. Man kann somit vermuten, daß im Digitoninextrakt nur eine Teilpopulation des Sec61-Komplexes mit Sec63 bzw. BiP assoziiert ist.

Wenn es unterschiedliche Populationen von Sec61-Komplexen im Säuger gibt, sollte es möglich sein, diese Komplexe voneinander zu trennen. Vom reinen trimeren Sec61-Komplex aus Hundepankreas ist bekannt, daß er in einem Digitonin-Niedrigsalzpuffer nicht an den Anionenaustauscher Q-Sepharose bindet (Görlich und Rapoport, 1993). Der heptamere Sec-Komplex der Hefe hingegen bindet daran (Panzner et al., 1995). Zur Isolierung eines Sec63/Sec61-Subkomplexes wurde daraufhin folgendes Experiment durchgeführt. PK-RM aus Rinderpankreas wurden in einem Digitoninpuffer mit 0,5 M Kaliumacetat solubilisiert und nicht gelöste Bestandteile durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand wurde anschließend über eine HiTrap Q-Sepharose-Säule von Pharmacia gegeben. Nach intensivem Waschen der Säule wurden die gebundenen Proteine stufenweise mit zunehmenden Salzkonzentrationen von 0,6 bis 1,2 M Kaliumacetat eluiert. Aliquots der einzelnen Fraktionen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblotting und Coomassiefärbung analysiert (Abb. 25 A).

Wie zu erwarten, befand sich der Großteil des Sec61-Komplexes im Durchlauf der Q-Säule (Abb. 25 A, Bahn 2). Ein kleiner Teil des Sec61-Komplexes (bis zu 5 % der Gesamtmenge) wurde jedoch an die Q-Säule gebunden. Dieser Teil des Sec61-Komplex eluiert bei 1,0 M Kaliumacetat wieder von der Q-Säule, zusammen mit der Hauptmenge des Sec63 (Abb. 25 A, Bahn 6). Die anschließende Bindung der 1,0 M Kaliumacetat Fraktion an eine anti-Sec61beta Antikörpersäule ergab, daß ein Teil des Sec63 (ca. 30 % der Gesamtmenge des Proteins) assoziiert mit dem Sec61-Komplex vorlag (Abb. 25 B, Bahn 3). Desweiteren konnte gezeigt werden, daß im umgekehrten Fall das gesamte Sec61alpha aus dieser Fraktion an eine anti-Sec63 Antikörpersäule band (Daten nicht gezeigt).

Der aus der 1,0 M Kaliumacetat Fraktion isolierte Sec61/Sec63 Komplex wurde auch mittels SDS-PAGE und Coomassiefärbung analysiert (Abb. 25 B, Bahn 3). Es zeigte sich, daß außer Sec61alpha und Sec63 keine signifikanten Mengen von weiteren Proteinen im Coomassiegel vorhanden waren (Sec61beta und Sec61gamma sind aufgrund ihrer Größe aus dem Gel herausgelaufen). Das molare Verhältnis von Sec61alpha zu Sec63 im Sec61/Sec63 Subkomplex konnte über semiquantitatives Immunoblotting aus vier unabhängigen Komplexpräparationen ermittelt werden (Daten nicht gezeigt). Ein Sec61alpha ist dabei im Sec61/Sec63 Subkomplex mit ein bis zwei Sec63 Molekülen assoziiert.

Neben Sec61alpha und Sec63 wurde auch der Verbleib von Sec62 auf der Q-Säule untersucht. Sec62 befand sich dabei im Durchlauf der Q-Säule und in der 0,6 M Kaliumacetat Fraktion (Abb. 25 A, Bahn 2 und 4). Immunopräzipitationen aus beiden Fraktionen mit anti-Sec62 Antikörpern ergaben, daß in beiden Fällen keine weiteren Proteine außer Sec62 präzipitiert werden konnten (Daten nicht gezeigt).


48

Abb. 25: Alternative Aufreinigung des Sec63/Sec61-Komplexes.
A) Die in Digitonin solubilisierten und von unlöslichem Material befreiten Rinder-PK-RM (Total) wurden über eine HiTrap Q Säule gegeben. Nach dem Waschen der Säule (wash) wurden die gebundenen Proteine schrittweise durch zunehmende Salzkonzentrationen eluiert. Aliquots der einzelnen Aufreinigungsschritte wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend Coomassie gefärbt (oberer Teil) oder im Immunoblot mit den Antikörpern gegen die angegebenen Proteine (unterer Teil) analysiert. „KAc“ steht für Kaliumacetat. B) Die 1 M KAc Fraktion (Total) wurde über eine anti-Sec61beta Antikörpersäule gegeben. Nach dem Waschen der Säule wurden die gebundenen Proteine durch Zugabe großer Mengen des Peptides gegen das die Antikörper gerichtet waren, eluiert (Eluat). Aliquots der einzelnen Fraktionen wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch Coomassiefärbung des Gels (oberer Teil) oder Immunoblotting mit Antikörpern gegen die angegebenen Proteine (unterer Teil) analysiert. Bahn 3 der Coomassiefärbung enthält dabei 20x mehr Material als Bahn 1 und 2. Bei der Immunoblotanalyse enthält Bahn 3 die 2,5fache Menge an Material wie Bahn 1 und 2.

4.2.3 Sec62 und Sec63 sind nicht mit membrangebundenen Ribosomen assoziiert

Nach Görlich et al. (1992) ist der Großteil des Säuger Sec61-Komplexes im ER fest mit Ribosomen assoziiert. Da die bisherigen Untersuchungen mit PK-RM durchgeführt wurden, kann nicht ausgeschlossen werden, daß Sec63 und Sec62 in rauhen Mikrosomen nicht doch mit Sec61-Komplex assoziiert sind, welcher gleichzeitig auch Ribosomen bindet. Im folgenden sollte daher untersucht werden, ob sich Sec63 und Sec62 wie Ribosomen assoziierte Membranproteine (RAMPs) verhalten.

Rauhe Membranen aus Rinderpankreas wurden in einem 450 mM Kaliumacetat-Puffer mit Digitonin oder DeoxyBigChap solubilisiert und anschließend durch eine Saccharosegradienten Zentrifugation aufgetrennt. Die Gradienten wurden fraktioniert und Aliquots der einzelnen Fraktionen mittels SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert. Da keine Antikörper gegen ribosomale Proteine zur Verfügung standen, wurden Fraktionen, in denen Ribosomen enthalten waren, anhand des für Ribosomen typischen Protein-Bandenmusters im Coomassiegel identifiziert (Daten nicht gezeigt).


49

In den mit Digitonin solubilisierten RM (Abb. 26 A) befand sich der Großteil von Sec61alpha und Sec61beta sowie ca. 50 % von TRAPalpha gemeinsam mit den Ribosomen in den Fraktionen 1 bis 10. Sec62, Sec63, das TRAM Protein, die 25 kDa Untereinheit des Säuger SP-Komplexes sowie eine geringe Menge an Sec61-Komplex befanden sich hingegen in den ribosomenfreien Fraktionen 11 bis 19. Ein ähnliches Bild ergab sich bei den in DeoxyBigChap solubilisierten RM (Abb. 26 B), jedoch mit dem Unterschied, daß TRAPalpha vollständig in den ribosomenfreien Fraktionen zu finden war. Desweiteren zeigte sich, daß die Solubilisierung mit DeoxyBigChap zu etwas mehr freiem, nicht ribosomenassoziierten Sec61-Komplex führt als die Verwendung von Digitonin. In beiden Fällen waren Sec62 und Sec63 unter den gewählten Bedingungen nicht mit Ribosomen assoziiert. Das Ergebnis läßt jedoch nur sehr begrenzte Rückschlüsse auf eine mögliche Beteiligung von Sec62 und Sec63 an co- oder posttranslationalen Transportprozessen zu, da man nach der Solubilisierung der Membran auch das für den cotranslationalen Transport benötigte TRAMp vollständig in den ribosomenfreien Fraktionen findet (siehe Abb. 26 sowie Görlich and Rapoport (1993)).

Abb. 26: Sec62 und Sec63 sind keine ribosomenassoziierten Membranproteine.
50 eq Rinder-RM wurden in einem Hochsalz-Digitonin-(A) oder Hochsalz-DeoyxBigCHAP-(B) Puffer solubilisiert und anschließend durch eine Saccharose-Gradienten-Zentrifugation aufgetrennt. Die einzelnen Fraktionen der Gradienten wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblotting mit den angegebenen Antikörpern analysiert. Fraktionen, die ribosomale Proteine enthielten, sind mit einem schwarzen Kasten umrahmt. „P“ steht für Pellet.


50

4.2.4 Sec62 und Sec63 sind assoziiert mit dem Sec61-Komplex

Wie die oben durchgeführten Saccharose-Gradienten-Zentrifugationen zeigten, waren sowohl Sec63 als auch Sec62 nach Solubilisierung der Membranen nicht mit Ribosomen assoziiert. Für den aus PK-RM aufgereinigten Sec63/Sec61-Komplex würde das bedeuten, daß der Komplex auch in der Membran vor der Puromycin-Hochsalzbehandlung nicht mit Ribosomen assoziiert vorliegt. Wenn diese Annahme richtig ist, sollte es möglich sein, genau wie beim Sec-Komplex der Hefe, den Säuger Sec63/61 Komplex aus solubilisierten RM zu isolieren, nachdem man die Ribosomen und die RAMPs abgetrennt hat. Zu diesem Zweck wurden Rinder-RM zuerst einer Saponin-Extraktion bei 0,8 M Salz unterzogen, um integrale Membranproteine anzureichern (Panzner et al., 1995), und anschließend in einem Digitonin Hochsalzpuffer solubilisiert. Nach Abtrennung der RAMPs durch Zentrifugation wurde der ribosomenfreie Überstand über eine anti-Sec63 Antikörpersäule bzw. über eine anti-Sec62 Antikörpersäule gegeben. Die gebundenen Proteine wurden von der Säule eluiert, mittels SDS-PAGE aufgetrennt und die coomassiegefärbten Banden durch Peptidsequenzierung analysiert. Im Fall der anti-Sec63 Antikörpersäule konnten Sec63, Sec61alpha, Sec61beta, Sec61gamma und eine Kontamination von Immunoglobulinen im Eluat identifiziert werden (Abb. 27 A, Bahn 1). Im Eluat der anti-Sec62 Antikörpersäule hingegen waren außer Sec62 keine weiteren Proteine in signifikanten Mengen enthalten (Abb. 27 A, Bahn 2).

Abb. 27: Ein Teil des Sec61-Komplexes ist mit Sec62 und Sec63 assoziiert.
A) Analyse von Proteinen, die mit Sec63 (Bahn 1) oder Sec62 (Bahn 2) in Digitonin solubilisierten RM assoziiert sind. 2500eq Saponin-Hochsalz gewaschener Rinder-RM wurden in 2,5 % Digitonin, H50 K500 Mg10 Gly10 beta-Me5 Pi solubilisiert und anschließend Ribosomen und RAMPs abgetrennt (30 min, 100.000 rpm im TLA 100.3 Rotor). Der Überstand wurde über eine anti-Sec63 Antikörpersäule bzw. eine anti-Sec62 Antikörpersäule gegeben. Die gebundenen Proteine wurden entweder durch Zugabe von 1 % Triton X-100 in 100 mM Glycin pH 2,2 (Bahn 1) oder bei pH 7,8 mit einem Überschuß an Peptid, gegen welches die Antikörper gerichtet waren (Bahn 2), eluiert. Die Eluate wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend Coomassie-gefärbt. Die einzelnen Proteinbanden wurden durch Edman-Abbau mit vorheriger Trypsin-Spaltung analysiert.
B) Coimmunopräzipitation von Sec62 und Sec63 mit dem Sec61-Komplex. Rinder-RM wurden in 1,5 % DeoxyBigCHAP, H50 K450 Mg12,5 Gly10 beta-Me5 Pi solubilisiert und unlösliches Material durch eine „Low-Speed“ Zentrifugation abgetrennt. Vom Extrakt (Total) wurden anschließend Ribosomen und RAMPs durch Zentrifugation abgetrennt (Pellet). Der resultierende Überstand wurde nach Verdünnung mit einem Volumen H50 an eine anti-Sec63 Antikörpersäule bzw. eine anti-Sec61beta Antikörpersäule gebunden (Durchlauf und Eluat). Aliquots (entsprechend 2,5 eq RM) der einzelnen Fraktionen sowie der Eluate der Antikörpersäulen wurden mittels SDS-PAGE und Immunoblotting mit Antikörpern gegen die angegebenen Proteine analysiert. Bahn 8 (Eluat x2) enthält die doppelte Menge an Material.


51

Um Bedingungen zu finden, unter denen Sec62 mit anderen Proteinen assoziiert ist, wurden verschiedene andere Detergenzien getestet, unter anderem auch DeoxyBigCHAP. Rinder-RM wurden dazu in einem DeoxyBigCHAP-Hochsalz-Puffer solubilisiert und die RAMPs durch Zentrifugation abgetrennt. Der resultierende Überstand (Abb. 27 B, Bahn 3) wurde anschließend an eine anti-Sec63 Antikörpersäule bzw. an eine anti-Sec61beta Antikörpersäule gebunden und die gebundenen Proteine nach intensivem Waschen der Antikörpersäulen wieder eluiert. Aliquots aller Fraktionen wurden anschließend mittels SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert. Es zeigte sich, daß unter diesen Bedingungen die anti-Sec61beta Antikörper nicht nur Sec61alpha und Sec63 präzipitierten, sondern zusätzlich auch Sec62 (Abb. 27 B, Bahn 5). Umgekehrt war es auch mit den anti-Sec63 Antkörpern möglich, teilweise Sec61alpha, Sec61beta sowie Sec62 zu coimmunopräzipitieren (Abb. 27 B, Bahn 7 und 8), andere Proteine des Translokationsapparates wie die alpha-Untereinheit des SRP-Rezeptors oder TRAM waren dagegen nicht im Eluat enthalten. Diese Daten lassen vermuten, daß Sec63 und Sec62 zusammen mit dem trimeren Sec61-Komplex im Säuger einen eigenständigen, nicht ribosomenassoziierten Komplex bilden.

Um mögliche weitere Interaktionspartner mit dem neu gefundenen Komplex aus Sec63, Sec62 und Sec61-Komplex zu finden, wurden Quervernetzungsexperimente durchgeführt. Rauhe Membranen aus Rind oder Hund wurden mit dem chemischen Crosslinker BMH (Bis-Maleinimidhexan) inkubiert und anschließend mittels SDS-PAGE und Immunoblotting mit anti-Sec62 Antikörpern analysiert. Mehrere Quervernetzungsprodukte zwischen Sec62 und anderen Proteinen konnten dabei beobachtet werden (Abb. 28, Bahn 4). Die Quervernetzungseffizienz variierte je nach RM-Präparation, jedoch waren immer die gleichen Quervernetzungsmuster zu finden (Daten nicht gezeigt). Das häufigste Quervernetzungsprodukt, in dem bis zu 30 % des Sec62 quervernetzt war, konnte durch Immunopräzipitation mit anti-Sec62 Antikörpern und anschließender Peptidsequenzierung der entsprechenden Coomassiebande als Sec61beta identifiziert werden (Daten nicht gezeigt). Die anderen, schwächeren Crosslink-Produkte konnten leider nicht identifiziert werden. Da Sec61beta Bestandteil des Sec61-Komplexes ist, handelte es sich bei dem Quervernetzungsprodukt um keine neu hinzugekommene Komponente, es bestätigte jedoch die vorherigen Ergebnisse aus dem Coimmunopräzipitationexperimenten.

Ein zentraler Punkt der bisherigen Untersuchungen war neben der Zusammensetzung des neu gefundenen Komplexes die Frage, ob der Komplex mit Ribosomen assoziiert ist. Die bisher gezeigten Daten bezüglich der Ribosomenassoziation bezogen sich immer auf Komplexe, die zuvor durch Detergenzbehandlung aus der Membran herausgelöst wurden. Folglich wäre es denkbar, daß sich Sec62 und Sec63 bei der Solubilisierung der Membran von cotranslationalen Transportkomplexen ablösen. Ein ähnliches Verhalten ist vom. TRAM-Protein bekannt, das im Detergenzextrakt nicht mehr mit dem Sec61-Komplex assoziiert ist (Görlich und Rapoport, 1993). Man könnte daher vermuten, daß in der Membran auch cotranslational aktive Komplexe jeweils mit Sec63 und Sec62 assoziiert sind, jedoch durch das Auflösen der Membran diese Interaktion zerstört wird, was auch erklären würde weshalb man im Detergenzextrakt einen hohen Anteil an freiem Sec62 und Sec63 findet.

Insofern sollte geklärt werden, ob das in der Membran mit dem Sec62 quervernetzte Sec61beta zu einen ribosomenassoziiertem oder freiem Sec61-Komplex gehört. Durch die chemische Quervernetzung zwischen Sec62 und Sec61beta wird quasi der Zustand in der Membran „eingefroren“, die Dissoziation des Sec62 vom Sec61-Komplex bei der Solubilisierung der Membran wird somit verhindert.

Konkret wurden RM aus Hundepankreas nach der Quervernetzungsreaktion mit BMH in einem Digitonin Hochsalzpuffer solubilisiert. Durch Zentrifugation wurden die Ribosomen sowie die RAMPs von den restlichen Proteinen abgetrennt. Aliquots von Überstand, Pellet sowie vom Ausgangsmaterial wurden anschließend mittels SDS-PAGE und Immunoblotting mit Antikörpern gegen Sec62 analysiert. Sämtliche Crosslink-Produkte des Sec62 sowie auch das restliche freie Sec62 befanden sich im ribosomenfreien Überstand (Abb. 28, Bahn 5 im Vergleich zu Bahn 6). Die Analyse der gleichen Proben im Immunoblot mit anti-Sec61beta Antikörpern hingegen zeigte, daß fast alle Sec61beta Quervernetzungsprodukte in der Pelletfraktion zu finden waren (Abb. 28, Bahn 9). Unter anderem war in der RAMP-Fraktion auch das von Kalies et al. (1998) beschriebene Quervernetzungsprodukt zwischen Sec61beta und SPC25 zu finden.


52

Die Signalpeptidase-Untereinheit SPC25 gehört jedoch ohne Quervernetzungsreaktion nicht zu den RAMPs (siehe Abb. 26 A sowie Kalies et al., 1998). Wenn auch das Sec61beta aus der Sec61beta-Sec62 Quervernetzung zu einem ribosomenassoziierten Sec61-Komplex gehören sollte, müßte die entsprechende Quervernetzungsbande in der Pellet-Fraktion zu finden sein. Wie jedoch aus Abb. 28, Bahn 8 ersichtlich ist, befand sich das Sec61beta-Quervernetzungsprodukt, welches nach dem Laufverhalten im SDS-PAGE dem Sec62-Sec61beta Quervernetzungsprodukt entsprach, vollständig im ribosomenfreien Überstand. Man kann also davon ausgehen, daß das Sec62-Sec61beta Quervernetzungsprodukt nicht ribosomenassoziiert ist.

Abb. 28: Der Sec62-Sec61beta Crosslink ist nicht ribosomenassoziiert.
Hunde RM wurden mit 50 µM Bis-Maleinimidhexan (BMH) behandelt. Proben der quervernetzten RM sowie scheinbehandelter RM wurden in 2 % Digitonin und H50 K500 M10 Gly10 ß-Me5 Pi solubilisiert und anschließend für 5 min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert (14.000 rpm). Der Extrakt (E) wurde danach für 10 min bei 100.000 rpm (TLA100 Rotor) zentrifugiert und der resultierende Überstand (Ü) sowie das Pellet (P) mittels SDS-PAGE und Immunoblotting mit anti-Sec62 oder anti-Sec61beta-Antikörpern analysiert. Die Zuordnung der bekannten Sec61beta-Crosslinkprodukte im Immunoblot mit anti Sec61beta Antikörpern erfolgte nach den Daten von Kalies et al. (1998).


53

4.2.5 Zelluläre Expression und Lokalisation von Sec62 und Sec63

Neben der Suche nach Interaktionspartnern von Sec62 und Sec63 interessierte auch die Frage, in welchen Geweben die beiden Proteine exprimiert werden. Aus verschiedenen Organen der Ratte sowie des Rinds wurden zu diesem Zweck angereicherte Membranfraktionen präpariert und mittels SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert. Beide Proteine wurden in allen getesteten Geweben exprimiert, wobei Proben aus Organen, die viel ER besitzen (Pankreas- und Lebergewebe) die stärksten Signale im Westernblot zeigten (Abb. 29 A).

Abb. 29: Sec62 und Sec63 sind im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert.
A) Nachweis von Sec62 und Sec63 in verschiedenen Geweben. Jeweils 70 µg angereicherte Membranfraktionen aus verschiedenen Rattengeweben oder 3 eq RM aus unterschiedlichen Rindergeweben wurden im SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend im Immunoblot mit den angegebenen Antikörpern analysiert.
B) Zellfraktionierung von Rinder-Lebergewebe. Das Gewebe wurde wie in Material und Methoden beschrieben aufgearbeitet. Proben der einzelnen Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE und Immunoblotting mit den angegebenen Antikörpern analysiert. Der Immunoblot mit anti TRAPalpha Antikörpern zeigte, daß die Fraktion glatter Mikrosomen frei von rauhem ER ist. Das Existenz von P450 (CytP450) in der glatten Mikrosomenfraktion weist darauf hin, daß glattes ER enthalten ist.


54

Um näheres über die intrazelluläre Lokalisierung von Sec62 und Sec63 zu erfahren, wurde eine Zellfraktionierung mit Rinderleber als Ausgangsmaterial durchgeführt. Anschließend wurden Proben der einzelnen Fraktionen im SDS-PAGE aufgetrennt und mittels Immunoblot mit den angegebenen Antikörpern analysiert (Abb. 29 B). Der größte Teil von Sec62 und Sec63 ist nicht mit dem Kern oder den Mitochondrien assoziiert, sondern befindet sich im postmitochondrialen Überstand. Bei der anschließenden Auftrennung des postmitochondrialen Überstandes in rauhe und übrige Membranen (siehe Material und Methoden) zeigte sich, daß im Gegensatz zu Sec61alpha, die beiden Proteine Sec62 und Sec63 nicht ausschließlich im rauhen ER lokalisiert waren, sondern auch in den übrigen Membranen. Im Fall des Sec62 war sogar mehr als die Hälfte des Proteins in den übrigen Membranen lokalisiert.

Die Existenz von P450 in den übrigen Membranen (Abb. 29 B, Bahn 6) sowie die Tatsache, daß Lebergewebe prinzipiell große Mengen an glattem ER enthält, läßt vermuten, daß der überwiegende Teil der übrigen Membranen aus glattem ER besteht. Durchgeführte Immunofluoreszenz-Experimente an HepG2-Zellen zeigten außerdem, daß sowohl anti-Sec62 als auch anti-Sec63 Antikörper jeweils ein typisches retikuläres Netzwerk anfärben und zwar vergleichbar mit dem Bild, daß man mit Antikörpern gegen ein luminales ER-Protein (in diesem Fall: Protein Disulfid Isomerase) findet (Daten nicht gezeigt). Sec62 und Sec63 scheinen somit sowohl im glatten als auch im rauhen ER lokalisiert zu sein.

Um abschließend die Menge von Sec62 und Sec63 in rauhen ER-Membranen aus Rinderpankreas zu bestimmen, wurden quantitative Immunoblotanalysen durchgeführt, wobei aufgereinigtes Sec62, Sec63 sowie Sec61-Komplex als Standards dienten (Daten nicht gezeigt). Ein Äquivalent (Definition siehe Walter et al., 1981) RM enthält dabei 0,35-0,65 pmol Sec62 und 0,25-0,5 pmol Sec63. Außerdem wurde auch die Menge an Sec61alpha in den RM bestimmt, sie betrug zwischen 1,1 und 1,6 pmol pro Äquivalent.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Fri Feb 7 16:58:24 2003