Meyer, Hellmuth-Alexander: Identifizierung und Charakterisierung evolutionär konservierter Komponenten des Protein-Translokationsapparates im Endoplasmatischen Retikulum

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Kapitel 5. Diskussion

5.1 Die Signalpeptidase

Anfang der 70er Jahre entdeckte man, daß sekretorische Proteine im Cytoplasma als Vorstufenproteine mit einer abspaltbaren Signalsequenz synthetisiert werden. In den 80er Jahren gelang es, die für die proteolytische Abspaltung des Signalpeptids verantwortliche Signalpeptidase sowohl in der Plasmamembran von E. coli (Zwizinski und Wickner, 1980) als auch in der ER-Membran von Säugern (Evans et al., 1986) zu identifizieren. Die Substratspezifitäten der pro- und eukaryontischen Signalpeptidase sind dabei fast identisch. Weiterführende Studien in den 90er Jahren beschäftigten sich mit der molekularen Aufklärung des enzymatischen Mechanismus. Den bisherigen Höhepunkt der Forschung stellt die ermittelte Kristallstruktur des löslichen Anteils der prokaryontischen Leaderpeptidase aus E. coli dar (Paetzel et al., 1998). Je mehr man über die pro- und eukaryontische Signalpeptidase in Erfahrung brachte, um so mehr Unterschiede wurden zwischen den beiden Enzymen offensichtlich. Pro- und eukaryontische Signalpeptidasen besitzen verschiedene Katalyse-Mechanismen. Auch bestehen die eukaryontischen Signalpeptidasen der ER-Membran, im Gegensatz zu den prokaryontischen Leaderpeptidasen, aus heteromeren Proteinkomplexen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von ausgewählter Untereinheiten des Signalpeptidase-Komplexes aus S. cerevisiae untersucht, wobei sich neue Einblicke in die Funktionsweise der eukaryontischen Signalpeptidasen ergaben.

5.1.1 Eukaryonten besitzen einen konservierten ER-Signalpeptidase-Komplex

In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, daß die ER-Signalpeptidase der Hefe S. cerevisiae aus mindestens vier Untereinheiten besteht. Neben den schon bekannten Untereinheiten Sec11p und Spc1p konnten durch die säulenchromatische Aufreinigung des Komplexes Spc2p und Spc3p als weitere Untereinheiten identifiziert werden. Alle vier Untereinheiten bilden zusammen den SP-Komplex, was auch durch Coimmunopräzipitationsexperimente mit anti-Spc1p sowie anti-Spc2p Antikörpern bestätigt werden konnte. Bei Spc2p und Spc3p handelt es sich um Proteine, die zu den Säuger SP-Untereinheiten SPC25 bzw. SPC22/23 homolog sind. Vergleicht man unter Einbeziehung der neu gefundenen Hefe-Untereinheiten die SP-Komplexe aus Hefe, Hund und Vogel miteinander, zeigt sich, daß die eukaryontischen Signalpeptidasen im Prinzip eine stark konserviert Untereinheiten-Komposition aufweisen (Siehe Abb. 30).

Abb. 30: Untereinheiten der biochemisch isolierten SP-Komplexe aus Hefe, Hund und Vogel.
Die zueinander homologen Untereinheiten aus den verschiedenen Komplexen befinden sich jeweils auf gleichen Ebenen. Die Pfeile mit den angegebenen Zahlen geben die jeweilige prozentuale Identität zwischen den Hefe- und Hundeproteinen wieder. Glycosylierte Proteine sind durch einen Stern markiert. Quellen: Böhni et al., 1988; Kalies und Hartmann, 1996 und Dalbey et al., 1997.


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Der tetramere SP-Komplex der Hefe und auch der pentamere SP-Komplex des Säugers enthalten jeweils zwei Membranproteine, deren Polypeptidketten hauptsächlich cytosolisch orientiert sind. In der Hefe handelt es sich dabei um Spc1p und Spc2p im Säuger um SPC12 und SPC25. Da die Abspaltung der Signalsequenzen im Lumen des ER erfolgt, ist eine direkte Beteiligung dieser Untereinheiten an der eigentlichen enzymatischen Reaktion unwahrscheinlich. Wahrscheinlicher ist, daß beide Proteine andere Aufgaben im SP-Komplex übernehmen (näheres siehe unter 5.1.3. und 5.1.4.). Die Existenz von sequenzhomologen Proteinen zu Spc1p und Spc2p in den Genomen von anderen Eukaryonten wie C. elegans oder A. thaliana unterstreicht den konservierten Charakter der beiden Untereinheiten im SP-Komplex. Zu beachten ist jedoch, daß die von Baker und Lively (1987) biochemisch aufgereinigte ER-Signalpeptidase aus Huhn-Oviduktzellen keine entsprechenden Untereinheiten enthielt. Nach Auskunft von Herrn Dr. Lively könnte es jedoch so sein, daß das bei der Aufreinigung verwendete Detergenz (NP-40) eine Dissoziation der beiden Untereinheiten vom Rumpfkomplexes bewirkt hat. Auf alle Fälle existieren auch im Huhn-Genom sequenzhomologe Proteine zu Spc1p und Spc2p (persönliche Information von Dr. E. Hartmann).

Außer den beiden hauptsächlich cytosolisch orientierten Untereinheiten besitzt die Signalpeptidase der Hefe zwei weitere Membranproteine, deren Polypeptidketten maßgeblich im Lumen des ER lokalisiert sind. Es handelt sich dabei um Sec11p und Spc3p. Interessanterweise findet man im Hund drei Proteine mit entsprechender Orientierung, einerseits SPC22/23, welches homolog zum Spc3p ist, und andererseits zwei zum Sec11p der Hefe homologe Proteine, SPC18 und SPC21. Durch Genbankenscreens konnte gezeigt werden, daß viele eukaryontische Spezies wie Huhn, Mensch, Ratte und Frosch jeweils zwei homologe Isoformen zum Sec11p Protein im Genom besitzen (Dalbey et al., 1997). Die Hefe S. cerevisiae hingegen besitzt nur Sec11p und keine weiteren Isoformen des Proteins (Goffeau et al., 1996). Gleiches gilt interessanterweise auch für die Invertebraten C. elegans und D. melanogaster (persönliche Mitteilung von Dr. E. Hartmann). Scheinbar erfolgte die Verdoppelung der Untereinheit im Genom erst mit der Evolution der höheren Eukaryonten.

Man geht heute davon aus, daß Sec11p die katalytisch aktive Untereinheit des Hefekomplexes darstellt (näheres siehe unter 2.2.3. sowie 5.1.2.). Unklar ist hingegen, weshalb in höheren Eukaryonten zwei Isoformen des Sec11p Proteins im Komplex vorkommen und welche Funktion damit verbunden ist. Theoretisch wäre denkbar, daß SPC18 und SPC21 unterschiedliche Substratspezifitäten aufweisen, ähnlich wie es für die Signalpeptidasen Imp1p und Imp2p aus der inneren mitochondrialen Membran gezeigt werden konnte (Nunnari et al., 1997). Auch wäre es möglich, daß die beiden Proteine nicht gemeinsam im gleichen Komplex vorkommen, sondern entweder SPC18 oder SPC21 alleine mit den drei anderen Untereinheiten assoziiert ist. Die Identifizierung der Säuger-ER-Signalpeptidase durch Evans et al. (1986) erfolgte durch säulenchromatographische Aufreinigung. Da jedoch die beiden Isoformen fast identisch sind, kann nicht ausgeschlossen werden, daß die aufgereinigte Signalpeptidase nicht aus einem pentameren Komplex, sondern aus zwei sich in einer Untereinheit unterscheidenden, tetrameren Komplexen bestand. Coimmunopräzipitationsexperimente mit anti-SPC21 bzw. anti-SPC18 Antikörpern, die diese Frage hätten klären können, wurden leider nicht durchgeführt.

Die zweite überwiegend luminal orientierte Untereinheit des SP-Komplexes der Hefe ist das oben schon erwähnte Spc3p. Das Protein liegt als Glycoprotein in der Membran vor und zeigt somit die gleiche Modifikation wie die entsprechenden homologen Untereinheiten aus Säuger und Vogel (Lively et al. 1994,). Interessanterweise besitzen alle bisher in eukaryontischen Sequenzdatenbanken vorhandenen Spc3p-homologe Proteine potentielle Glycosylierungsstellen in ihrer Aminosäuresequenz. Somit ist nicht nur die Untereinheit selber konserviert, sondern wahrscheinlich auch ihr glycosylierter Zustand in der Membran.


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5.1.2 Sec11p und Spc3p werden für die katalytische Aktivität der ER-Signalpeptidase benötigt

Neben Sec11p ist auch die Spc3p Untereinheit des Hefe SP-Komplexes essentiell für das Überleben der Zelle. Die Deletion von SPC3 bewirkt den Verlust der Spaltungsaktivität, was sich in vivo als lethal wirkende Präkursor-Akkumulation manifestiert. Somit zeigt die Depletion von SPC3 ähnliche Effekte, wie sie auch schon für SEC11 beschrieben wurden (Böhni et al., 1988). Die Analyse des verbleibenden SP-Komplexes während des SPC3 Abschaltexperimentes ergab, daß Spc3p eine wichtige Rolle für die Stabilität des SP-Komplexes in der Membran spielt. Der Verlust von Spc3p führt zur einer drastischen Abnahme von Spc1p und Sec11p in der ER-Membran, wohin gegen Spc2p sich bei einer niedrigeren Konzentration stabilisiert. Insofern war unklar, ob die beobachteten Spaltungsdefekte bei der Spc3p-Depletion nicht primär auf den parallelen Verlust der eigentlichen katalytisch aktiven Sec11p Untereinheit zurückzuführen waren. Weitere Experimente zeigten jedoch, daß eine Überexpression von Sec11p in einem Deltaspc3 Stamm die Zellen nicht retten kann. Im komplementierten Deltaspc3 Stamm mit zusätzlich überexprimiertem Sec11p zeigte sich auch, daß nach dem Abschalten von SPC3 der noch vorhandene restliche Komplex aus Sec11p, Spc1p und Spc2p keine Spaltungsaktivität besaß, die über das Hintergrundniveau hinaus ging. Die Menge an Sec11p in der Membran entsprach zu diesem Zeitpunkt noch etwa der normalen wt-Menge.

Anzumerken ist jedoch, daß die gleichzeitige Überexpression von Sec11p und Spc3p am Anfang des Abschaltexperimentes nicht zu einer signifikant höheren in vitro Signalpeptidaseaktivität führte. Eine mögliche Ursache dafür könnte die limitierte Menge der beiden nicht überexprimierten Untereinheiten Spc1p und Spc2p sein. Die beiden Proteine sind zwar nicht essentiell für die Hefe, jedoch kann man davon ausgehen, daß sie die Bildung eines stabilen und aktiven Minimalkomplexes aus Sec11p und Spc3p in der Membran begünstigen (siehe auch 5.1.3.). Desweiteren kann nicht ausgeschlossen werden, daß für die richtige Assemblierung und Stabilisierung der beiden essentiellen Untereinheiten des Komplexes weitere Komponenten des Translokationsapparates benötigt werden, die sich wiederum in dieser Situation als limitierend auswirken könnten.

Die Entdeckung, daß neben Sec11p auch Spc3p essentiell für die Spaltungsreaktion ist, wirft die Frage auf, wie ähnlich eukaryontische und prokaryontische Signalpeptidasen zueinander sind. Die Sec11p Untereinheit entspricht wahrscheinlich primär der monomeren Leaderpeptidase der Prokaryonten, wobei jedoch festzuhalten ist, daß die allgemeine Ähnlichkeit zwischen Sec11p und LepB aus E. coli sehr gering ist. Die verwandschaftliche Beziehung zwischen den beiden Proteinen ist vielmehr durch drei separate homologe Regionen begründet (Box I, II und III), die man sowohl im periplasmatischen Anteil von LepB als auch im luminalen Anteil von Sec11p findet (Dalbey und van Heijne, 1992; van Dijl et al., 1992). Die Box I enthält das für die enzymatische Aktivität essentielle Serin, welches man bei allen Typ I Signalpeptidasen findet (Sung und Dalbey, 1992; van Valkenburgh et al., 1999). Box II umfaßt einen Sequenzbereich, dessen zentraler Bestandteil ein Lysin bei den prokaryontischen bzw. ein Histidin bei den eukaryontischen Signalpeptidasen ist, wobei der jeweilige Aminosäurerest essentiell für die Spaltungsreaktion ist (Tschantz et al., 1993; van Valkenburgh et al., 1999). Die Box III, die nicht am katalytischen Zentrum beteiligt ist, ist am wenigsten konserviert. Der innerhalb der prokaryontischen Leaderpeptidasen gut konservierten Region kann man im Sec11p der Hefe nur einen Bereich von 4 Aminosäuren zuordnen (Sung und Dalbey, 1992).

Welche Rolle spielt Spc3p bei der Spaltungsreaktion? Prinzipiell kann nicht ausgeschlossen werden, daß Spc3p nur als Faltungshilfe oder Stützgerüst für das eigentlich katalytisch aktive Sec11p benötigt wird. Wahrscheinlicher ist jedoch, daß Spc3p an der Spaltungsreaktion beteiligt ist. Man findet am C-Terminus von Spc3p eine hydrophobe Region, die auch bei allen anderen bisher identifizierten Spc3p-homologen Proteinen anzutreffen ist. Durch C-terminal verkürzte Varianten von Spc3p konnte gezeigt werden, daß dieser Bereich des Proteins essentiell für das Überleben der Zelle ist. Es wäre denkbar, daß diese Domäne eine Rolle bei der Substratbindung spielt, entweder alleine oder in Kombination mit Sec11p.


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Aufgrund der Kristallstrukturdaten der Leaderpeptidase von E. coli weiß man, daß sich der periplasmatische Anteil des Enzyms aus zwei verschiedenen Domänen zusammensetzt (Paetzel et al., 1998). Die katalytisch aktive Domäne des Proteins enthält dabei die beiden konservierten Boxen I und II, wohingegen Box III in der anderen Domäne lokalisiert ist. Folgt man ferner den von van Valkenburgh et al. (1999) durchgeführten Sequenzvergleichen zwischen der prokaryontischen Leaderpeptidase aus E. coli und Sec11p sowie Spc3p, so ergibt sich folgendes interessantes Bild: Im luminalen Anteil von Spc3p gibt es Sequenzhomologien zur nicht katalytischen Domäne der Leaderpeptidase einschließlich der Box III (siehe Abb. 31). Desweiteren ist das 167 Aminosäuren lange Sec11p nur halb so lang wie die 323 Aminosäuren messende Leaderpeptidase, wobei vor allem der Sequenzbereich der nicht katalytischen Domäne zwischen den Boxen II und III im Sec11p fehlt. Damit liegt die Vermutung nahe, daß die luminalen Anteile von Sec11p und Spc3p die beiden verschieden Domänen des periplasmatischen Teils der prokaryontischen Leaderpeptidase repräsentieren. Zusammen bilden sie die funktionell aktive Signalpeptidase in der ER-Membran.

Abb. 31: Schematische Darstellung von LepB, Sec11p und Spc3p.
In den Proteinen sind jeweils die Positionen der für Typ I Signalpeptidasen charakteristischen konservierten Boxen I bis III durch Umrahmungen dargestellt. Die zusätzlich mit „?“ gekennzeichneten Boxen deuten an, daß in diesen Fällen nur schwache Homologien existieren. Die grau unterlegten Bereiche in den Proteinen LepB und Spc3p stellen den homologe Bereiche zwischen den beiden Proteinen dar (nach Valkenburgh et al., 1999). Die schwarzen Abschnitte im Protein stellen die Transmembransegmente dar.

Eine Ursache des komplexeren Aufbaus der eukaryontischen Signalpeptidasen könnte sein, daß der Komplex in der ER-Membran neben der eigentlichen Spaltung von Signalsequenzen noch andere proteolytische Funktionen übernimmt. Auffällig ist dabei, daß die Substratspezifität der ER-Signalpeptidasen weiter gefächert ist als die der prokaryontischen Leaderpeptidasen. So konnte in vivo gezeigt werden, daß in Hefen Signalsequenzen prozessiert werden, die direkt nach der Schnittstelle ein Prolin besitzen (Plath und Hartmann, unveröffentlichte Daten). Die Leaderpeptidase aus E. coli ist hingegen nicht in der Lage, eine solche Signalsequenz abzuspalten (Nielsson und von Heijne, 1992).Außerdem gibt es Hinweise, daß die ER-Signalpeptidase am Abbau der Signalpeptide beteiligt ist (Lyko et al., 1995), sowie Untersuchungen, daß der SP-Komplex bei der Degradation von bestimmten Membranproteinen benötigt wird (Mullins et al., 1995). Die ER-Signalpeptidase scheint also neben der Prozessierung von Signalsequenzen auch beim Abbau von hydrophoben Proteinfragmenten aus der Doppellipidmembran eine Rolle zu spielen. Zu erwähnen ist außerdem, daß man in vielen Membranproteinen kryptische, unvollständige Signalpeptidase-Schnittstellen findet. Denkbar wäre in diesem Zusammenhang also, daß zwei Untereinheiten für die katalytische Aktivität benötigt werden, zum Zwecke der Regulation oder Substraterkennung, damit nicht unspezifisch intakte Membranproteine gespalten werden.


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5.1.3 Spc1p und Spc2p unterstützen die Spaltungsaktivität des SP-Komplexes

Die Untereinheiten Spc1p und Spc2p des SP-Komplexes sind beide nicht essentiell für das Überleben der Zelle. Die Einzeldeletionsstämme sowie der Doppeldeletionsstamm beider Proteine zeigen bei Inkubationstemperaturen bis 38 °C keine Unterschiede zu den entsprechenden Wildtypstämmen. Inkubiert man jedoch den Deltaspc2 Stamm oder den Deltaspc1/Deltaspc2 Stamm bei 42 °C, so findet man in vivo eine nicht lethale Akkumulation von sekretorischen Vorstufenproteinen (Mullins et al., 1996). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß für die beobachtete Präkursorakkumulation wahrscheinlich zwei verschiedene Effekte verantwortlich sind. Einerseits wurde demonstriert, daß der Verlust von SPC2 zu einer Reduzierung der Konzentration der anderen Untereinheiten in der Membran führt. Dieses Phänomen ist unabhängig von der Inkubationstemperatur der Zellen (persönliche Mitteilung von W. Antonin). Die Proteinmengen von Sec11p und Spc3p reduzieren sich auf die Hälfte des entsprechenden Wildtypniveaus, und Spc1p ist überhaupt nicht mehr in der ER-Membran nachweisbar. Zweitens konnte im in vitro Spaltungsassay gezeigt werden, daß der Komplex aus Sec11p und Spc3p ohne Spc1p und Spc2p für das getestete Substrat eine um die Hälfte reduzierte Spaltungsaktivität besitzt, verglichen mit der entsprechende Menge (bezogen auf Sec11p und Spc3p) des vollständigen tetrameren SP-Komplexes. Was genau diese verstärkende Wirkung von Spc1p und Spc2p hervorruft, ist nicht geklärt. Denkbar ist, daß die membranspannenden Regionen von Spc1p und Spc2p unterstützend bei der Bindung der hydrophoben Signalsequenz mitwirken. Desweiteren wäre möglich, daß der Minimalkomplex aus Sec11p und Spc3p durch Spc1p und Spc2p in seiner funktionellen Konformation stabilisiert wird. Für Spc1p konnte in diesem Zusammenhang schon gezeigt werden, daß die Überexpression des Proteins teilweise eine lethale temperatursensitive Sec11p Mutante subprimiert (Fang et al., 1996).

Der Verlust von Spc2p führt also zu einer verminderten Anzahl an SP-Minimalkomplexen, die außerdem in ihrer Aktivität eingeschränkt sind. Da sich beide Effekte summieren, sollte der Deltaspc2 Stamm bzw. der Deltaspc1/Deltaspc2 Stamm jeweils nur noch ein Viertel der Spaltungsaktivität eines entsprechenden Wildtypstammes besitzen. Da unter normalen Wachstumsbedingungen keine in vivo Präkursorakkumulation in den Stämmen zu beobachten ist, kann man davon ausgehen, daß die verbliebene Aktivität der Signalpeptidase ausreicht, um alle Signalpeptide noch während des Translokationsprozesses abzuspalten. In einer Streßsituation, wie sie die Inkubation bei 42 °C darstellt, ist die reduzierte Spaltungsaktivität anscheinend nicht mehr ausreichend, um sämtliche der nun viel zahlreicher ins ER transportierten Proteine zu prozessieren.

5.1.4 Der SP-Komplex interagiert mit der Translokationspore

Die Signalsequenzen von sekretorischen Proteinen werden noch während der Translokation vom eigentlichen Protein abgespalten (Perara et al., 1986). Daß die Signalpeptidase sich dabei in unmittelbarer Nähe der Translokationspore befindet, konnten Kalies et al. (1998) in chemischen Quervernetzungsexperimenten mit Mikrosomen aus Säuger zeigen. Konkret demonstrierten sie, daß während des cotranslationalen Transportes die ß-Untereinheit des Sec61-Komplexes mit der SPC25-Untereinheit des SP-Komplexes quervernetzt werden kann. Anhand der Quervernetzungsdaten konnte jedoch nicht geklärt werden, ob die relative Nähe zwischen den beiden Komplexen auf eine direkte Interaktion der beiden Komponenten zurückzuführen ist, oder auf die Tatsache, daß beide Komplexe gleichzeitig, aber unabhängig voneinander, mit dem Ribosom interagieren.

In der vorgelegten Arbeit konnte nun durch Coimmunopräzipitationsexperimente gezeigt werden, daß der SP-Komplex der Hefe mit den ß-Untereinheiten des Sec61- sowie des Ssh1-Komplexes interagiert, und zwar ohne daß Ribosomen benötigt werden. Im Detail zeigten die Coimmunopräzipitationen, daß sich mit anti-Spc1p bzw. anti-Spc2p Antikörpern ca. 5 bis 10 % der Gesamtmenge der jeweiligen beiden ß-Untereinheiten, jedoch überhaupt nicht die alpha-Untereinheit des Sec61p-Komplexes fällen ließ. Dieses verwundert natürlich, da unter den gewählten Pufferbedingungen der Sec61p-Komplex normalerweise stabil ist. Eine Erklärung für dieses Phänomen könnte sein, daß ein Teil der Sbh1p bzw. Sbh2p Population nicht mit Sec61p bzw. Ssh1p-Komplexen assoziiert ist, sondern unabhängig davon mit dem SP-Komplex. Einen weiteren Hinweis, daß diese Hypothese zumindest für Sbh2p gilt, zeigten die Abschaltexperimente im Deltaspc2 Stamm. Finke et al. (1996) konnten zeigen, daß im Gegensatz zu Sbh1p, Sbh2p in vivo instabil wird, wenn es nicht mit einer alpha-Untereinheit wie Sec61p oder Ssh1p interagieren kann. In dieser Arbeit wurde demonstriert, daß ein ähnlicher Effekt auftritt, wenn man die Menge an Spc2p in der Zelle reduziert. Konkret wurde gezeigt, daß nach dem vollständigem Verlust von Spc2p die Menge


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an Sbh2p in der Membran nur noch 20 % des entsprechenden Wildtypniveaus beträgt. Schaltet man anschließend die Expression von Spc2p wieder an, so erholt sich auch die Menge an Sbh2p auf das ursprüngliche Wildtypniveau zurück. Somit liegt die Vermutung nahe, daß der SP-Komplex mit Sbh2p über die Spc2p Untereinheit interagiert. Spc1p, das im Deltaspc2 Stamm auch vollständig in der Membran fehlt, spielt hingegen bei der Interaktion mit Sbh2p keine tragende Rolle, da im Deltaspc1 Stamm keine Reduzierung der Menge an Sbh2p beobachtet werden konnte. Durch den Wegfall der Spc2p Untereinheit hat wahrscheinlich ein Teil der Sbh2p-Population keinen Interaktionspartner mehr und wird in der Membran instabil. Interessant ist in diesem Zusammenhang die extrem starke Abnahme der Sbh2p Menge um 80 %, was vermuten läßt, daß in der Membran eine größere Menge an Sbh2p vorhanden ist, die primär nicht fest mit dem trimeren Ssh1-Komplex assoziiert ist. Über die Funktion von Sbh1p bzw. Sbh2p am SP-Komplex kann man nur spekulieren. Es wäre denkbar, daß die beiden Proteine als eine Art Vermittler zwischen dem SP-Komplex und den Sec61 bzw. Ssh1-Komplex fungieren (Siehe Abb. 32)

Abb. 32: Mögliche Funktion von Sbh2p bei der Interaktion mit dem SP-Komplex.
In der ER-Membran liegt nicht die gesamte Population von Sbh2p fest assoziiert im Ssh1-Komplex vor, sondern ein Teil interagiert über Spc2p mit dem SP-Komplex. Dadurch wird es wahrscheinlich dem SP-Komplex erleichtert, während des Translokationsprozesses engen Kontakt zu der im Translokationskanal befindlichen Signalsequenz aufzunehmen. Desweiteren kann nicht ausgeschlossen werden, daß es freies Sbh2p in der Membran gibt.


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5.2 Identifizierung eines Sec-Komplex ähnlichen Translokationskomplexes im Säuger

5.2.1 Säuger-Sec61alpha ist assoziiert mit Sec62 und Sec63

Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente zeigen, daß in der ER-Membran von Säugern ein Membranproteinkomplex existiert, der Ähnlichkeiten zum Sec-Komplex der Hefe aufweist. Der neu gefundene Komplex besteht aus dem trimeren Secc61-Komplex sowie zwei weiteren Membranproteinen, die Homologien zum Sec62p bzw. zum Sec63p der Hefe besitzen. Der heptamere Sec-Komplex der Hefe und der neu gefundene pentamere Säuger Sec61/62/63 Komplex weisen jedoch neben den strukturellen Ähnlichkeiten auch einige interessante Unterschiede auf.

Zum einem findet man signifikante Sequenzhomologien zwischen Hefe und Säuger Sec62 bzw. Sec63 nur in den putativ luminalen Anteilen der Polypeptidketten sowie in den cytosolischen Bereichen nahe der Membrananker. Die weiter distal liegenden cytosolischen Bereiche der Proteine aus Hefe und Säuger unterscheiden sich sehr stark voneinander. Die beiden Säugerproteine besitzen zusätzliche Sequenzmotive. Besonders interessant ist dabei ein Motiv im Sec63, welches man auch im C-Terminus von 200 kDa Proteinen der U5 snRNPs findet und das dort wahrscheinlich mit RNA interagiert (Lauber et al., 1996)

Außerdem war es in der vorliegenden Arbeit nicht möglich, weder mit biochemischen Ansätzen noch durch Sequenz-Datenbanksuche, Säuger-Homologe zu Sec71p oder Sec72p zu finden. Sec71p und Sec72p sind in der Hefe am Erkennungsschritt der Signalsequenzen im Cytoplasma beteiligt, wobei jedoch ihre Funktion für das Überleben der Zelle nicht essentiell ist. Denkbar wäre es, daß die zusätzlichen cytosolischen Bereiche des Säuger Sec62 bzw. des Sec63 Proteins die beiden Hefe-Proteine in ihrer Funktion ersetzen. Endgültig kann jedoch die Frage nach der Existenz von Sec71p und Sec72p homologen Proteinen im Säuger hier nicht geklärt werden.

Weitere Punkte, in dem sich der Säuger Sec61/62/63 Komplex vom Sec-Komplex der Hefe unterscheidet, sind die relative Anzahl von Komplexen in der ER-Membran, sowie die generelle Stabilität des Komplex nach Solubilisierung der Membran. In der Hefe liegt ca. ein Drittel aller Sec61-Komplexe assoziiert mit dem Sec62/Sec63 Subkomplex vor. Außerdem findet man in mit Digitonin solubilisierten Hefe-Mikrosomen keine freien Sec62/Sec63 Subkomplexe, alle Sec62/Sec63 Subkomplexe sind fest mit Sec61-Komplexen assoziert (persönliche Mitteilung von Dr. S. Panzner).

Bei Mikrosomen aus Rinderpankreas hingegen sind nach der Solubilisierung nur ca. 5 % des Sec61alpha mit Sec63 assoziiert. Die gewählten Solubilisierungsbedingungen entsprachen dabei im Prinzip der Präparation des Sec-Komplexes aus der Hefe nach Panzner et al. (1995), wobei jedoch im Säuger noch ca. 2/3 der Sec63-Menge als freies, nicht mit Sec61alpha assoziiertes Protein im Detergenzextrakt enthalten ist. Berücksichtigt man, daß in den isolierten Sec61-/Sec63 Komplexen das Verhältnis zwischen Sec61alpha zu Sec63 1:1 bis 1:2 betrug, so würde die Gesamtmenge des Sec63 in der Membran ausreichen, um maximal mit 15 % der Sec61-Komplexe assoziiert zu sein, ein deutlich geringerer Anteil als in der Hefe.

Im Gegensatz zu Sec63, wo eine Teilpopulation des Proteins in Lösung fest mit dem Sec61-Komplex assoziiert bleibt, ist die Interaktion von Sec62 mit dem Sec61-Komplex sehr viel labiler. Unter optimierten Bedingungen wurden nur maximal 15 % des Sec62 bei Coimmunopräzipitation mit anti-Sec61beta Antikörper mitgefällt. Quervernetzungsexperimente ergaben unabhängig davon, daß ca. 30 % der Sec62 Population mit ca. 5 % der Sec61beta Population in der Membran vernetzt werden konnten. Das läßt vermuten, daß Sec62 und Sec63 wahrscheinlich in etwa in gleichen Mengen im pentameren Komplex vorkommen. Unterstützt wird diese Annahme durch die Tatsache, daß die ermittelten Proteinkonzentrationen von Sec62 (0,35-0,65 pmol/eq) und Sec63 (0,25-0,5 pmol/eq) in RM aus Rinderpankreas die gleiche Größenordnung haben.


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Säuger Sec62 und Sec63 wurden in allen getesteten Geweben exprimiert, wobei in Geweben mit hohem ER-Anteil auch die größten Mengen der beiden Proteine zu finden waren. Interessanterweise befanden sich Sec62 und Sec63 jedoch nicht nur im rauhen ER, sondern insbesondere Sec62 auch im glatten ER. Über die funktionelle Bedeutung der Proteine im glatten ER ist bisher noch nichts bekannt. Der Sec61-Komplex findet sich nicht im glatten ER und steht somit als Interaktionspartner nicht zur Verfügung. Die Beobachtung, daß die Membranen des glatten ER Sec62 enthalten, wird durch die Tatsache unterstützt, daß sich im Nebennierengewebe große Mengen an Sec62 Protein befinden (persönliche Mitteilung von Herrn H. Grau), und daß große Mengen an Sec62 mRNA nicht nur in Leber- und Pankreasgewebe zu finden sind, sondern auch in Muskelgewebe (Daimon et al., 1997).

5.2.2 Mögliche Funktion des pentameren Säuger- Sec61/62/63 Komplexes

Die Funktion des pentameren Sec61/62/63 Komplex in der ER-Membran ist unklar. Anhand der vorliegenden strukturellen Daten kann man nur spekulieren, an welchen Transportprozessen der Komplex beteiligt sein könnte. An erster Stelle steht die Möglichkeit, daß der Sec61/62/63 Komplex den posttranslationalen Transport in der ER-Membran von Säugern vermittelt (Abb. 33 A). Prinzipiell besitzt der Komplex alle Untereinheiten, die auch in der Hefe essentiell notwendig sind, um diese Art von Transport durchzuführen. Dabei ist jedoch zu bedenken, daß sich die cytosolischen Bereiche des Sec61/62/63 Komplexes von denen des Sec-Komplexes der Hefe sehr stark unterscheiden. Auch werden sekretorische Proteine wie PräPro-alpha-Faktor oder PräPro-OmpA zwar in vitro posttranslational durch die ER-Membran von Hefen transportiert, jedoch nicht in rauhe Mikrosomen von Säugerzellen (Wiedmann et al., 1988). In der Säugerzelle erfolgt der Transport von Proteinen ins ER hauptsächlich cotranslational. Die einzigen bekannten Substrate, für die in vitro gezeigt werden konnte, daß sie in einem SRP-unabhängigen Prozeß über die Säuger ER-Membran gelangen, sind kurze Membranprotein-Präkusoren wie M13 procat (Watts et al., 1983) oder kurze Präkursoren von hydrophoben sekretorischen Proteinen wie z.B. PräPro-Cecropin (Zimmermann et al., 1990). Für PräPro-Cecropin gibt es Hinweise, daß Membranproteine den Transport des Substrates durch die Säuger ER-Membran bewerkstelligen (Zimmermann et al., 1986; Klappa et al., 1994), während in E. coli gezeigt werden konnte, daß M13 procat auch ohne zusätzliche Membrankomponenten durch die Membran transportiert wird (Wolfe et al., 1985). Die Beteiligung des Sec61/62/63 Komplexes am Transport von kurzen sekretorischen Proteinen muß jedoch noch gezeigt werden.

Abb. 33: Mögliche Funktion des pentameren Säuger- Sec61/62/63 Komplexes.


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Eine weitere mögliche Funktion des Komplexes könnte der sogenannte Rücktransport von Proteinen sein (Abb. 33 B). In eukaryontischen Zellen werden falsch gefaltete Proteine aus dem Lumen des ER über den Sec61-Komplex zurück ins Cytoplasma transportiert, wo sie dann in einem Ubiquitin- und Proteasom-abhängigen Prozeß abgebaut werden (Wiertz et al., 1996; Pilon et al., 1997; Schmitz et al., 2000). In der Hefe wurde gezeigt, daß neben dem Sec61-Komplex auch Sec63p sowie Kar2p am Rücktransport beteiligt sind (Plemper et al., 1997; Gillece et al., 2000). Da im Säuger fast alle Proteine cotranslational ins ER transportiert werden, könnte der Sec61/62/63 Komplex hauptsächlich den Rücktransport übernehmen. Das könnte erklären, warum die vorwiegend luminalen Bereiche von Sec62 und Sec63 zu den Hefeproteinen konserviert sind, und warum Sec71p und Sec72p im Säuger fehlen.

Die in der Arbeit durchgeführten Experimente zeigten, daß Sec62 und Sec63 jeweils nur mit Sec61-Komplexen assoziiert waren, die keine Ribosomen gebunden hatten. Jedoch kann mit diesem Befund nicht ausgeschlossen werden, daß die beiden Proteine nicht eine unterstützende Rolle beim cotranslationalen Transport spielen. Ihre Anwesenheit würde vor allem bei den cotranslationalen Transportvorgängen Sinn machen, bei denen die Ribosomen nicht fest an die Translokationspore gebunden sind (Abb. 33 C). Beim sogenannten „pausing“-Prozeß pausieren die Polypeptidketten bestimmter sekretorischer Proteine zeitweise im Translokationskomplex, ohne daß die Synthese der Proteine am Ribosom angehalten wird (Hedge et al., 1998). Die nachfolgenden Bereiche der naszierenden Kette akkumulieren im Cytoplasma, wobei die feste Bindung zwischen Ribosom und Sec61-Komplex gelockert werden muß. Nach Wiederaufnahme der Translokation müssen diese Bereiche de facto posttranslational ins Lumen des ER transportiert werden, was mittels Sec63, Sec62 und BiP bewerkstelligt werden könnte. Dieses Modell könnte auch erklären, weshalb der Großteil von Sec62 und Sec63 nicht permanent in Komplex mit dem Sec61-Komplex gebunden ist. Beide Proteine interagieren jeweils nur temporär mit den cotranslationalen Translokationsporen um bestimmte zusätzliche Funktionen bereitzustellen. Neben dem „pausing“-Prozeß wäre in diesem Zusammenhang auch denkbar, daß Sec62 und Sec63 eine Rolle beim Verschließen von freien, nicht ribosomenassoziierten Sec61-Komplexen spielen (Abb. 33 D). Hamman et al. (1998) konnten zeigen, daß freie Sec61-Poren auf der luminalen Seite durch BiP verschlossen werden. Die Übertragung von BiP auf den Sec61-Komplex könnte dabei durch die DnaJ Domäne von Sec63 initiiert werden.

Weiterführende Studien müssen zeigen, ob und welche der aufgezählten Funktionsvarianten der neu Komplex im Säuger einnimmt.

5.3 Evolutionär konservierte Komponenten des ER-Translokationsapparates

Die in der Arbeit vorgestellten Ergebnisse unterstreichen, daß die eukaryontische ER-Translokationsmaschinerie hochgradig konserviert ist. Zum einen konnte gezeigt werden, daß die Signalpeptidase aus der Hefe S. cerevisiae in ihrer Untereinheitenkomposition der Signalpeptidase aus Säugerzellen entspricht. Beide SP-Komplexe unterscheiden sich nur insofern, daß im Säuger zwei homologe Isoformen zum Sec11p der Hefe existieren.

Desweiteren war es möglich, eine zum Sec-Komplex der Hefe ähnliche Struktur im Säuger zu identifizieren. Der Komplex besteht aus dem trimeren Sec61-Komplex, sowie zwei weiteren Proteinen, die Homologien zu Sec62p und Sec63p der Hefe aufzeigen. Die Funktion des Sec61/62/63 Komplexes im Säuger ist bisher noch unklar. Weiterführende Studien müssen zeigen, ob der neu gefundene Komplex funktionshomolog zum Sec-Komplex der Hefe ist.

Abschließend sind in Abb. 34 die wichtigsten Komponenten für den Proteintransport durch die eukaryontische ER-Membran (bei Säugern und der Hefe S. cerevisiae) sowie durch die prokaryontische Plasmamembran (bei E. coli) vergleichend zusammengefaßt. Die in dieser Arbeit neu gefundenen Untereinheiten sind rot hervorgehoben.


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Abb. 34: Vergleich der wichtigsten Komponenten für den Proteintransport durch die eukaryontische ER-Membran bei Säugerzellen und Hefe (S. cerevisiae) bzw. der prokaryontischen Plasmamembran der Eubakterien (E. coli). Die in der Arbeit neu gefundenen Untereinheiten sind rot hervorgehoben.


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Abb. 35: Ausgewählte Subkomplexe des ER-Translokons aus Hefe und Säuger
A) In der Hefe S. cerevisiae sowie im Säuger bildet der trimere Sec61-Komplex (bläulich eingefärbt) die Zentrale Pore für den cotranslationalen Transport von Proteinen durch die ER-Membran. Die Hefe S. cerevisiae besitzt darüber hinaus noch den Ssh1-Komplex dessen Untereinheiten Homologe zu den Untereinheiten des Sec61-Komplexes darstellen. Der posttranslationale Transport von Proteinen durch die ER-Membran erfolgt in der Hefe mittels des Sec-Komplex. Der Sec-Komplex setzt sich aus dem trimeren Sec61-Komplex und dem tetrameren Sec62/63-Subkomplex (rötlich eingefärbt) zusammen. Das luminal Hsp70-Homologe Kar2p (gelb) wird für den effizenten Transport der Proteine benötigt. In Säugermembranen wurde ein Komplex identifiziert, der strukturelle Ähnlichkeiten zum Sec-Komplex der Hefe aufweist, es konnte jedoch noch nicht gezeigt werden, das der Sec61/62/63-Komplex Funktionshomolog zum Sec-Komplex ist.
B) In der Hefe so wie im Säuger besteht die Signalpeptidase aus einem heteromern Membranprotein-Komplex (gelb-bräunlich eingefärbt).


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