[Seite 16↓]

2.  Material und Methoden

2.1. Untersuchungsmaterial

2.1.1. Versuchstiere

Bei den Versuchstieren handelte es sich um junge Albinoratten (Han-Wistar) im Alter von 0, 3 ,7 ,14 ,21 und 30 Tagen, die für unser Labor vom BgVV Berlin (Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin, Diedersdorfer Weg 1, 12277 Berlin) bezogen wurden. Die Versuchs- und Kontrolltiere waren bei jedem durchgeführtem Versuch jeweils Wurfgeschwister. So konnte eine unterschiedliche Empfindlichkeit auf Medikamente durch große genetische Unterschiede möglichst gering gehalten werden. Für die Versuche wurden insgesamt 50 Tiere benötigt, 40 davon für die Versuche mit (+)MK801. Die Tiere eines Wurfes (6-10 Tiere) wurden zu ca. 2/3 auf die Therapiegruppe und zu 1/3 auf die Kontrollgruppe verteilt.

Die Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien zur Durchführung von Tierversuchen der Society for Neuroscience durchgeführt [56]. Die Tierversuche wurden vom Landesamt für technische Sicherheit und Arbeitsschutz Berlin genehmigt.

2.1.2. Geräte

Die Hirne der Ratten wurden mit einem Vibratom der Fa. Electron Microscopy Sciences, (Typ: OTS-3000-04 Tissue Slicer) geschnitten. Hierbei wurden die zu schneidenden Hirnhälften nebeneinander auf einem Behälter aufgeklebt, der in einer Phosphatpufferlösung (PBS) lag. Der Behälter mit den Hirnhälften wurde mit wählbarer Vorschubgeschwindigkeit gegen eine horizontal oszillierende Klinge bewegt, die um ca. 17° gegen die Schnittfläche nach oben gekippt war. Nach jedem Schnitt wurde die Klinge per Knopfdruck um 70µm tiefer gefahren.

Ein Kühlaggregat derselben Firma (Thermoelectric Refrigeration System) hielt das Kühlbad auf einer Temperatur von 4°C.

2.1.3. Pharmaka und Chemikalien

2.1.3.1 Pharmaka

Zwei ionotrope Glutamatrezeptorantagonisten wurden in den Versuchen verwendet:


[Seite 17↓]

(+)MK 801 (=Dizocilpin, (+)-5-methyl-10,11-dihydro-5H-dibenzo[a, d]cyclohepten-5,10-imine hydrogen maleate) (Research Biochemicals International, Natick, MA 01760, USA), ein nicht-kompetitiver NMDA-Rezeptorantagonist.


GYKI 52466 (=1-(4-Aminophenyl)-4-methyl-7,8-methylendioxy-5H-2,3-benzodiazepin) (RBI), ein AMPA-Rezeptorantagonist.

2.1.3.2 Chemikalien

Phosphatpuffer PBS

Dieser wurde als 10-fach-Konzentrat angesetzt, das lange haltbar ist.

70 ml

1M monobasisches Natriumphosphat (Natriumhydrogenphosphat-Monohydrat: NaH2PO4 .H2O, Merck, Darmstadt)

330 ml

1M dibasisches Natriumphosphat (di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat: NaH2PO4 .2H2O, Merck)

180 g

NaCl

ad 2 l

Aqua bidest.

Zum Gebrauch wurde die Stammlösung 1:10 verdünnt und bei 4°C gekühlt.


PBS-Azid

Die gebrauchsfertige Phosphatpufferlösung PBS wurde mit 50 mg/100 ml (0,05%) NaN3 (Natriumazid, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178, USA) versetzt.


Paraformaldehyd 4%ig

Dieses wurde zur Perfusion stets frisch angesetzt (max. 2 Wochen haltbar).
Ca. 1 l Aqua bidest. wurde auf 60°C erhitzt,

2 Tbl.

NaOH (Natriumhydroxid-Plätzchen, Merck) hinzu gegeben,

80 g

Paraformaldehyd (Suchardt, Hohenbrunn, Deutschland) wurde im Gemisch gelöst,

38 ml

1M monobasisches Natriumphospat (s.o.) und

162 ml

1M dibasisches Natriumphosphat hinzugefügt.

Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die Lösung mit 1M NaOH oder 1M HCl (Merck) auf einen pH-Wert von 7,3-7,4 titriert.

ad 2 l Aqua bidest. Nach dem Filtrieren wurde die Lösung bei 4°C gelagert.


[Seite 18↓]


Gelatine-Medium

1,5 g

Gelatine wurde in

250 ml

Aqua bidest. gelöst (zuvor auf ca. 50°C erhitzt) und auf Raumtemperatur abgekühlt.

0.15 g

Kalium-Chrom-Sulfat wurde hinzugefügt

ad 500 ml Aqua bidest. Lösung wurde nach Filtration bei Raumtemperatur gelagert.


Agar

2.1.3.3 Lösungen für die modifizierte Kupfer-Silberfärbung nach de Olmos [57 58]

Kupfer-Silber-Lösung

180 ml

Aqua bidest., unter Rühren wurde hinzugefügt:

1,5 g

AgNO3 (Silbernitrat, Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe)

3 ml

0,5%ige Kupfer-II-nitrat-Lösung (Cu(NO3)2.3H2O)

15 ml

0,1%iges Allantoin (5-Ureidohydantoin, Sigma)

9 ml

Boratpuffer (0,2M Borsäure mit 0,05M Natriumtetraborat bis zu einem pH-Wert von 8,5 titriert)

17 ml

Ethanol absolut (Mallinckrodt Baker B.V., 7412 VA Deventer, Holland)

9 ml

Pyridin (Merck)

Diese Lösung wurde auf 40°C aufgewärmt und wegen Empfindlichkeit vor Licht geschützt.


Aceton (Merck)



Silber-Diamin

24 g

AgNO3 (Silbernitrat) wurde in

120 ml

Aqua bidest. gelöst und mit

60 ml

0,4%iger NaOH (die Lösung wurde braun) und

30 ml

NH4OH (Ammoniumhydroxid, Sigma) versetzt (die Lösung klarte auf).


[Seite 19↓]

Reduktionslösung

135 ml

Aqua bidest., unter Rühren wurde hinzugefügt:

15 ml

Ethanol absolut

180 µl

37%iges Formaldehyd (Sigma)

10,5 mg

Zitronensäure (Sigma)

Bleichlösung: 0,3%-iges Kaliumferrizyanid

0,45 g

K3Fe(CN)6 (Sigma) wurde in

150 ml

Aqua bidest. gelöst.

Stabilisierungslösung: 0,1%iges Natriumthiosulfat (Sigma)

0,2 g

Na2S2O3 wurde in

200 ml

Aqua bidest. gelöst.

2.1.3.4 Methylgrün-Pyronin-Lösung für die Nissl-Färbung

9 ml

2%ige Methyl-Grün-Lösung (wässrig)

4 ml

2%iges Pyronin Y oder G

14 ml

Glycerol und

23 ml

Essigsäure-Puffer (pH 4,8) wurden unter Rühren gemischt.

2.1.3.5 TUNEL-Färbung: kommerzielles Kit

ApopTag®, Oncor Appligene, Heidelberg

2.1.3.6 Sonstiges

Als weitere Materialien wurden laborübliche Behälter, Kocher, Wagen etc. verwendet.

2.2. Versuche: Vorbereitung und Versorgung

Die Versuchstiere wurden nach Entzug vom Muttertier – je ein Wurf zusammen – in einem Brutkasten bei konstant 37°C gehaltenund alle 6-8 h in Abhängigkeit vom Alter der Ratten mit halbisotonischer 5%-iger Glukoselösung (Pädiafusin II) s.c. versorgt. Die 3 Tage alten Tiere bekamen je 0,3-0,5 ml, die 7 Tage alten je 0,5 ml und die 14 Tage [Seite 20↓]alten je 0,7 ml Elektrolytlösung pro Dosis injiziert. Die 21 und 30 Tage alten Ratten erhielten Wasser aus der Flasche und Trockenfutter.

Die Tiere eines Wurfes wurden mit Nummern gekennzeichnet und gewogen. Dabei wurde darauf geachtet, dass das Durchschnittsgewicht der Versuchs- und Kontrollgruppen ungefähr gleich verteilt war.

2.2.1. Pharmakonapplikation

Sieben Tage alten Ratten wurde intraperitoneal (i.p.) isotone Kochsalzlösung (Kontrolle) oder je 0,5mg/kg Körpergewicht der NMDA-Antagonist Dizocilpin ((+)MK801) zu den Zeitpunkten 0 (1. Gabe), 8 und 16 Stunden appliziert. Das Injektionsvolumen betrug jeweils 10 ml/kg KG. Diese Dosis wurde angewendet, weil sie in früheren Experimenten mit 7 Tagen alten Ratten eine ausgeprägte apoptotische Neurodegeneration ausgelöst hatte. Nach 24 Stunden wurden die Tiere getötet. In der Entwicklungsstudie wurde ebenso mit den Tieren im Alter von 0, 3, 14, 21 und 30 Tagen verfahren.

In einem abschließendem Versuch erhielten 7 Tage alte Ratten 3 x 30 mg/kg des AMPA-Antagonisten GYKI 52466 i.p. zu den Zeitpunkten 0, 8 und 16 Stunden.

2.2.2. Narkose und Perfusion

Zur Perfusion wurden die Ratten zunächst mit einer Überdosis an 10%igem Chloralhydrat (0,1 ml/10g KG s.c.) narkotisiert. Der Arbeitsbereich wurde mit den notwendigen Instrumenten und einem Infusionssystem ausgestattet, bestehend aus heparinisiertem PBS (100 IE Heparin/100ml PBS) und Paraformaldehyd- Lösung (beides auf ca. 4°C gekühlt). Die Ratten wurden nach sicherer Narkose auf der Arbeitsfläche fixiert. Der Thorax wurde beidseits lateral durchtrennt, das Zwerchfell vom Rippenbogen scharf abgetrennt und das noch schlagende Herz stumpf freipräpariert. Der rechte Vorhof wurde breit eingeschnitten gefolgt von einem Einschnitt in die linke Herzkammer an der Herzspitze. Eine stumpfe Kanüle wurde vorsichtig durch die linke Herzkammer in die Aorta vorgeschoben und mit einer kleinen Klemme fixiert.

Mit 10 ml heparinisiertem PBS wurde das Blut aus dem großen Kreislauf gespült: das Tier wurde blass und die Leber je nach Vorhofschnitt blutleer und gebläht. Anschließend wurde die Fixierung mit 10 ml Paraformaldehyd im Bolus eingeleitet. Nach Erfolg, der durch das Steifwerden des Tieres beobachtet werden konnte, wurde [Seite 21↓]es noch weitere 10 Minuten mit dem 4°C kalten Paraformaldehyd mit maximaler Geschwindigkeit infundiert.

2.2.3. Präparation und Einbettung

Der Kopf der perfundierten Ratte wurde vom Rumpf abgetrennt und die Kalotte mit einem sagittalem Hautschnitt freigelegt. Ohne das Hirn zu beschädigen wurde die Kalotte mit einem Sagittalschnitt und zusätzlichen Orthogonalschnitten eröffnet und das Gehirn mit einem Spatel aus der Schädelbasis herausgelöst.

Zur Konservierung wurden die Hirne zunächst in toto für 2-4 Tage in Paraformaldehyd bei 4°C gelagert und anschließend in einer Ausgussform mit einer Rasierklinge in vier Teile geschnitten:

Der erste Schnitt führte koronar durch die Mitte des Gehirns. Schließlich wurden das Kleinhirn und das Riechhirn vom Cerebrum abgetrennt. Die Präparate lagerten nochmals für 1-3 Tage in Paraformaldehyd, bevor sie in das antimikrobielle PBS-Azid überführt wurden, wo eine längere Lagerung möglich war.

Zur Einbettung wurde die benötigte Menge Agar abgemessen und unter Rühren zum Schmelzen aufgekocht und unter weiterem Rühren wieder auf ca. 40°C abgekühlt. Die Großhirnhälften wurden gleichzeitig für einige Minuten auf Laborpapier getrocknet. Anschließend wurden sie mit der Schnittfläche nach unten auf eine Petrischale aufgelegt, die auf ein Kühlelement gesetzt wurde, um die Hirnhälften an das Glas anfrieren zu lassen (ca. 2 Minuten). Der abgekühlte Agar wurde dann zügig in die Petrischale gegossen, bis alle Präparate komplett bedeckt waren. Die Schale wurde zum Verfestigen des Agars auf dem Kühlelement belassen. Aus dem Agar wurden dann Quader herausgeschnitten, die die einzelnen Präparateteile beinhalteten. Diese wurden wiederum in PBS-Azid gefüllten (beschrifteten) Gläsern bis zur weiteren Verarbeitung im Kühlschrank aufbewahrt.

2.2.4. Vibratomschnitt

Die eingelegten Großhirn-Präparate wurden zum Trocknen mehrere Minuten auf Papier gelegt. Auf das sorgfältig gereinigte und getrocknete Vibratom-Tischchen wurde dünn Sekundenkleber aufgetragen und dieser mit einer Klinge geglättet. Die beiden in Agar eingebetteten Hirnhälften wurden mit der Schnittfläche nach unten nebeneinander auf [Seite 22↓]die präparierte Fläche gelegt und leicht angedrückt. Anschließend härtete der Kleber noch ca. 5 Minuten aus.

Pro Gehirn wurden je zwei beschriftete 24-Well-Platten auf Kühlelemente gestellt und jede mit PBS-Azid bzw. Paraformaldehydlösung gefüllt. Das Kühlsystem des Vibratoms wurde auf eine Solltemperatur von 4°C eingestellt und der Schlitten des Vibratoms mit PBS gefüllt. Der Präparatetisch wurde in die PBS-Lösung eingetaucht und eingespannt und die Hirnhälften in 70µm-Schritten geschnitten. Etwa jeder 7. Schnitt, entsprechend 490µm-Abständen von Schnittmitte zu Schnittmitte, wurde zur Silberfärbung für mindestens 4 Tage in 4%ige Paraformaldehydlösung überführt, der Rest zur TUNEL-Färbung oder als Reserve in PBS-Azid. Die Präparate wurden anschließend im Kühlschrank bei 4°C gelagert.

2.2.5. Nissl-Färbung

Zur Ermittlung der gesamten Neuronendichte in verschiedenen Hirnarealen wurden die Präparate nach Nissl gefärbt. Hierzu wurden die Hirnschnittpräparate zunächst gewässert und mit Essigsäure-Puffer (pH 4,8) gespült. Schließlich wurden sie für 30 Minuten in der Methylgrün-Pyronin-Lösung (MGP) inkubiert. Danach wurden die Schnitte wieder mit Aqua bidest. gespült, auf Objektträger mittels Gelatine-Medium aufgetragen und mit aufsteigenden Alkoholkonzentrationen entwässert. Die Zellkerne stellten sich grün bis blau-grün und das Zellplasma rot dar [59 60].

2.2.6. Silberfärbung nach de Olmos

Die Schnitte wurden schließlich mit der Silberimprägnierung nach de Olmos [58] gefärbt, die degenerierte Zellen markiert. Hierbei reagiert das Plasma der degenerierten Zellen mit dem Silbernitrat, das durch die durchlässig gewordene Zellmembran in die Zelle eindringen kann. Dazu müssen die verwendeten Gefäße möglichst frei von Anionen sein. Dies wurde durch Einweichen aller Glasgefäße in rauchender Salpetersäure für 15 min erreicht. Anschließend wurde jedes Gefäß gründlich mit Aqua bidest. ausgespült. Sämtliche Lösungen wurden frisch angesetzt, und für die Spülvorgänge wurde ausschließlich Aqua bidest. verwendet.


[Seite 23↓]

Alle zu färbenden Schnitte eines Tieres wurden in eine Petrischale überführt und drei mal gewaschen. Da die Silberlösungen lichtempfindlich sind, wurde die Inkubation im Dunkeln und die Arbeitsschritte unter Vermeidung direkten Lichts durchgeführt.

  1. Zunächst wurden die Schnitte für 1 Stunde bei 40°C in Kupfer-Silber-Lösung und dann ca. 48 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
  2. Die Präparate wurden mit frischem Aceton für 3 Minuten gewaschen bevor
  3. erneut für 35 Minuten mit Silber-Diamin inkubiert wurde.
  4. Die Schnitte wurden für 1 Minute in Reduktionslösung geschwenkt und
  5. anschließend zwei mal mit Aqua bidest. gewaschen.
  6. Dann wurden sie in 3%igem Kaliumferrizyanid für ca. 2-3 Minuten gebleicht und
  7. wiederum zwei mal mit Aqua bidest. gespült,
  8. schließlich in 0,1%iger Natriumthiosulfatlösung für 1 min. stabilisiert und noch
  9. 3 mal mit Aqua bidest. gewaschen.

Die jetzt goldgelb gefärbten Hirnschnittpräparate wurden unter Verwendung von Gelatine-Medium auf Objektträger überführt und für 24 Stunden luftgetrocknet. Die Objektträger wurden mit graduell steigenden Alkoholkonzentrationen (70%iger Ethanol bis Ethanol absolut, zuletzt Xylol) entwässert und gedeckt. Die degenerierten Neuronen stellten sich dunkelbraun bis schwarz auf einem goldgelben Hintergrund dar.

2.2.7. TUNEL-Färbung

Charakteristischerweise wird bei der Apoptose die DNA in Fragmente gespalten, die sich jeweils um 200 Basenpaare unterscheiden und daher in der Gelelektrophorese ein typisches Leitermuster bilden. Gavrieli beschrieb eine histologische Färbungsmethode zur Darstellung solcher DNA-Fragmente, die TUNEL-Färbung (TUNEL = t erminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d U TP n ick- e nd l abeling) [61].

Dies ist eine Färbemethode zur Erkennung apoptotischer Zellen, da die terminale Deoxynucleotidyl-Transferase (tDT) die 3'OH-Enden der DNA-Fragmente mit biotinylierten Polydesoxyuridylnukleotiden verbinden, die ihrerseits über eine [Seite 24↓]avidingekoppelte Peroxidase die Farbreaktion vermittelt. Die Färbung wurde mit Hilfe des kommerziellen ApopTag®- Kits durchgeführt. Die hydrierten Proben wurden hierbei mit 0,002 %iger Proteinase K-Lösung 15 min. lang inkubiert und nach einigen Spülungen mit Aqua bidest., 3 %igem Methanol, PBS und Ausgleichspuffer für 1 Stunde bei 37°C mit terminaler Deoxynucleotidyl-Transferase inkubiert. Nach Stoppen der Reaktion mit dem Stop/Wash-Puffer und erneutem Spülen (PBS) wurden die Präparate für 30 min. in Anti-Dioxigenin-Peroxidase inkubiert. Nach erneutem Spülen wurde noch zwei mal für 10-15 min. mit 0,05 %iger Diaminobenzidin-(DAB) Lösung gefärbt und mit Methylgrün 10% für 2-5 min. gegengefärbt. Das Resultat waren dunkelbraune Kerne von allen Zellen, die DNA-Fragmentierung zeigten. Das Zytoplasma intakter Zellen wurde mit Methylgrün angefärbt.

2.2.8. Mikroskopische Untersuchung und Auszählung

Um systematische Fehler weitgehend auszuschließen, wurde die Dichte der degenerierten Neuronen durch eine unabhängige Person mittels einer fraktionierten stereologischen Dissektionsmethode (unbiased stereological dissector method) ermittelt [62]: Hierzu wurde das zu untersuchende Hirn jedes Tieres in 16 Regionen mit einem fixen Zählrahmen von 50 x 50 µm Fläche unterteilt (Fraktionierung) und die Zellen in verschiedenen Fokussierungsebenen (stereologische Dissektion) des 70 µm dicken Schichtpräparates ausgezählt. Die ausgezählten Hirnregionen waren: CA 1 Hippocampus (CA 1 HPC), Gyrus dentatus (GD), laterodorsaler Thalamus (Thal ld), mediodorsaler Thalamus (Thal md), ventraler Thalamus (Thal v), ventromedialer Hypothalamus (Hypothal vm), Subiculum, Caudatum, jeweils Lamina II und IV des frontalen Kortex (Fr), parietalen Kortex (Par), cingulären Kortex (Cing) und retrosplenialen Kortex (Rspl). Die verschiedenen Hirnareale wurden mit Hilfe eines Atlanten des sich entwickelnden Rattengehirnes aufgefunden [63]. Es wurden zufällig 8-10 Felder ausgesucht und die Anzahl der (degenerierten) Zellen pro mm³ ermittelt (Das Volumen konnte mit der bekannten Schichtdicke von 70 µm und der Fläche der Zählfelder von 50 x 50 µm bestimmt werden.).

Verschiedene Autoren vertreten die Meinung, die oben genannte TUNEL-Färbung sei zu unspezifisch zur Entdeckung apoptotischer Zellen. Unter anderem haben Charriaut-Marlange und Grasl-Kraupp in ihren Experimenten mit Neuronen und Hepatozyten gezeigt, dass auch nekrotische Zellen in der TUNEL-Färbung positiv reagieren können, [Seite 25↓]und vorgeschlagen, diesen Test nicht als alleinigen Nachweis für Apoptose zu verwenden [64 65]. Ishimaru hatte schon zuvor apoptotische von nekrotischen Neuronen morphologisch abgegrenzt [3] und mit der Elektronenmikroskopie eine zuverlässigere Methode zum Nachweis von apoptotischen Neuronen beschrieben. Daher führten wir zur Bestätigung der Apoptose in den untersuchten Hirnschnitten eine Elektronenmikroskopie durch. Dafür wurden die Hirne in einem Plastik-Medium eingebettet, was unter dem Lichtmikroskop und dem Elektronenmikroskop die Untersuchung und Beurteilung aus dem selben Block ermöglichte. Die Hirnschnittpräparate wurden graduell entwässert und in Araldit eingebettet. Es wurden 1µm dicke Schnitte angefertigt und mit Methylenblau/Azur II gefärbt. Für die Elektronenmikroskopie wurden interessante Areale auf ca. 1 x 2 mm zurechtgeschnitten und mit einem Ultramikrotom Schnitte von 60-70 nm angefertigt. Diese wurden auf ein Schlitzgitter aufgebracht, mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und unter einem JEOL 100C Transmissionselektronenmikroskop untersucht [66].

2.2.9. Statistische Methoden

Aus den jeweiligen Wurfgruppen wurde aus der Dichte der degenerierten Zellen der jeweiligen Hirnregion der arithmetische Mittelwert (MV = m ean v alue), und der Standardfehler (SEM = s tandard e rror of m eans) errechnet. Außerdem wurden die Abweichungen der Mittelwerte mit dem t-Test von Student für unverbundene Stichproben bei Normalverteilung auf Signifikanz überprüft. Das Signifikanzniveau P wurde bei 0,001 bzw. 0,01 gesetzt und t für die verschiedenen Freiheitsgrade bestimmt [67]. Das für die beiden zu vergleichenden Gruppen errechnete T wurde mit t verglichen und bei T>t ein signifikanter Unterschied festgestellt.

Um das gesamte Ausmaß an Nervenzelldegeneration bei verschiedenen Tieren vergleichen zu können, wurde ein Score aus der Summe aller Dichtewerte degenerierter Neuronen aus 16 Hirnregionen gebildet. Zur Erfassung eines signifikanten Unterschieds in der Entwicklungsstudie (Auswirkung von (+)MK801 in Abhängigkeit vom Entwicklungsalter der Ratten) wurde mit Hilfe der errechneten Gesamtscores eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA = one way an alysis o f va riance) durchgeführt [68]. So konnten die verschiedenen Altersgruppen auf einmal auf signifikante Mittelwertsunterschiede untersucht werden.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 3.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
08.06.2004