3.  Ergebnisse

7 Tage alte Ratten wurden mit 3 x 0,5 mg/kg (+)MK801 intraperitoneal (i.p.) oder mit isotoner Kochsalzlösung (Kontrolle) behandelt. Zur Bestimmung der gesamten Neuronenzahl in den jeweiligen Hirnregionen wurden die Hirnschnittpräparate der Kontrolltiere nach Nissl gefärbt. Bei der Auszählung variierte die Zahl der Neuronen in den untersuchten Hirnregionen zwischen 133.000/mm³ im ventralen Thalamus und 284.000/mm³ im Gyrus dentatus (Tabelle 2). Zum Nachweis der Nervenzelluntergänge wurden die Hirnschnitte mit der Methode nach de Olmos gefärbt. Hier stellten sich die degenerierten Neuronen dunkelbraun bis schwarz auf einem goldgelben Hintergrund dar. Die Strukturen des Kortex, der Basalganglien und der Thalami ließen sich anhand dunklerer goldbrauner Farbschattierungen gut von der weißen Substanz unterscheiden, die sich heller darstellte, was die Orientierung in den einzelnen Hirnarealen vereinfachte. Schon bei geringer Vergrößerung der Hirnschnittpräparate waren deutliche Unterschiede zwischen den Tieren zu erkennen, die mit (+)MK801 und jenen, die mit physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurden.

	Abbildung 4a und b. Histologische Präparate von Hirnhemisphären im Koronarschnitt (Schwarz-Weiß-Aufnahme) acht Tage alter Ratten, 24 Stunden nachdem sie mit isotoner Kochsalzlösung (4a) oder (+)MK801 (3 x 0,5 mg/kg KG) behandelt wurden (4b). Vergrößerung 9,8fach. Die degenerierten Neuronen sind als dunkle Flecken auf hellem Hintergrund zu erkennen. Die Hirne der mit (+)MK801 behandelten Tiere zeigen in der Übersicht eine höhere Rate an degenerierten Neuronen als die Kontrolltiere. Insbesondere ist dies im parietalen und cingulärem Kortex sichtbar.

In der 98fachen Vergrößerung waren die degenerierten Neuronen einzeln zu erkennen und konnten mithilfe des oben beschriebenen Zählrahmens quantifiziert werden (Abbildung 4 und Abbildung 5).

	Abbildung 5a und b. Hirnschnittpräparate acht Tage alter Ratten, 24 Stunden nachdem sie mit isotoner Kochsalzlösung (5a) oder (+)MK801 (3 x 0,5 mg/kg KG) behandelt wurden (5b). De Olmos-Färbung, Vergrößerung 98fach. In der höheren Vergrößerung (Detailaufnahme aus Lamina II des Kortex parietalis) sind die degenerierten Neuronen einzeln zu erkennen. Nach Behandlung mit (+)MK801 sieht man eine deutliche Zunahme der degenerierten Neuronen im selben Hirnareal.

Die Ratten, die mit isotoner Kochsalzlösung behandelt wurden, wiesen wenige verstreute degenerierte Neuronen (physiologische Apoptose) im Prosencephalon auf. Die Dichte degenerierter Neuronen variierte bei den Kontrolltieren zwischen 284/mm³ (0,2% der Gesamtneuronendichte der untersuchten Hirnregionen) in Lamina IV des frontalen Kortex und 3.400/mm³ (1,55%) in Lamina II des frontalen Kortex. Bei den Ratten, die mit (+)MK801 behandelt wurden, kam es in spezifischen Regionen zu einer deutlichen Erhöhung der Zahl degenerierter Neuronen (Tabelle 2).

(+)MK801 verursachte eine Dichteerhöhung degenerierter Neuronen von etwa 3,3-fach im Hypothalamus (von 1.210/mm³ auf 4.000/mm³) bis zu 39,7-fach im laterodorsalen Thalamus (von 401/mm³ auf 15.920/mm³) mit Anteilen von 15-26% der gesamten Neuronenzahl in diesen Hirnregionen (besonders in der Lamina II des parietalen, frontalen und cingulären Kortex). In zwei weiteren Hirnarealen, nämlich im Subiculum und in der Lamina II des retrosplenialen Kortex, stieg der Anteil degenerierter Zellen von 1.170/mm³ - 2.100/mm³ (0,6 - 0,9%) auf ca. 21.200/mm³ - 27.110/mm³ (10,7 - 12%) an. Insgesamt war die Lamina II der verschiedenen Kortexareale am stärksten betroffen, aber in allen untersuchten Hirnregionen war der Anteil degenerierter Neuronen deutlich gegenüber der spontanen Degenerationrate erhöht (Abbildung 6).

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Tabelle 2: Die Apoptoserate im Hirn von 7 Tage alten Ratten wird durch den NMDA-Antagonisten (+)MK801 erhöht. Die Ratten erhielten entweder Placebo oder (+)-MK801 (0,5 mg/kg KG i.p.) nach 0, 8 und 16 Stunden und wurden nach 24 Stunden (P8) getötet. Durch die o.g. optische Unterteilungsmethode wurde jeweils in 16 Hirnregionen die Dichte der Gesamtzellzahl (in Zellen/mm³, in den nach Nissl gefärbten Hirnpräparaten) bzw. der degenerierenden Zellen (in %- Anteil der Gesamtzellzahl, de Olmos-Färbung) mit dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwerts (± SEM) ermittelt. Die Unterschiede zwischen den behandelten und unbehandelten Tieren wurde mittels t-Test von Student auf Signifikanz überprüft. Die Asterices geben das Signifikanzniveau an: **P<0,01; ***P<0,001. CA 1 HPC: CA 1 Hippocampus, GD: Gyrus dentatus, Thal ld: laterodorsaler Thalamus, Thal md: mediodorsaler Thalamus, Thal v: ventraler Thalamus, Hypothal vm: ventromedialer Hypothalamus, Fr: frontaler Kortex, Par: parietaler Kortex, Cing: cingulärer Kortex, Rspl: retrosplenialer Kortex, jeweils Lamina II und IV.

Die Untersuchung der beiden Zahlenreihen mit dem Student t-Test für unverbundene Stichproben mit Normalverteilung zeigte, dass die Mittelwerte für die degenerierten Zellen sich signifikant unterscheiden (P<0,001, in Tabelle 2 mit *** markiert). Nur im [Seite 29↓]ventralen Thalamus und ventromedialen Hypothalamus wurde das Signifikanzniveau P für den Student t-Test mit <0,01 (in Tabelle 2 mit ** markiert) gewählt.

	Abbildung 6. Graphische Darstellung der Anteile degenerierter Neuronen bei Tieren, die mit dem NMDA-Rezeptorantagonisten (+)MK801 behandelt wurden (dunkle Säulen), im Vergleich zur spontanen Degenerationsrate (physiologische Apoptose, helle Säulen) in verschiedenen Hirnarealen. Auf der Abszissenachse sind die Hirnareale dargestellt: CA 1 HPC: CA 1 Hippocampus, GD: Gyrus dentatus, Thal ld: laterodorsaler Thalamus, Thal md: mediodorsaler Thalamus, Thal v: ventraler Thalamus, Hypothal vm: ventromedialer Hypothalamus, Fr: frontaler Kortex, Par: parietaler Kortex, Cing: cingulärer Kortex, Rspl: retrosplenialer Kortex, jeweils Lamina II und IV. Auf der Ordinatenachse wurden die jeweiligen prozentualen Anteile der degenerierten Zellen an der Gesamtzellzahl von Neuronen in den Hirnarealen dargestellt. Insbesondere die Lamina II der frontalen, parietalen und cingulären Cortices zeigen hohe durch (+)MK801 induzierte Apoptoseraten.

Die lichtmikroskopisch untersuchten Zellen, die sich in einem frühen Stadium der Degeneration befanden, wiesen morphologische Charakteristika von Neuronen auf mit Perikarya, Axonen und teilweise sichtbaren Dendriten.

Die Untersuchung TUNEL-gefärbter histologischer Schnitte 8 Tage alter Ratten, die 24h zuvor mit (+)MK801 oder isotonischer Kochsalzlösung behandelt wurden, zeigte im Vergleich mit der Färbemethode nach de Olmos, dass in denselben Arealen TUNEL- positive Neuronen angefärbt wurden, in denen auch in der de Olmos-Färbung degenerierte Neuronen gefunden wurden. Die jeweiligen Dichten degenerierter Neuronen waren sowohl in den Placebo- als auch in den Verum-Gruppen in beiden Färbemethoden vergleichbar. Da die TUNEL-Färbung Zellen mit fraktionierter DNA anfärbt, wie sie typischerweise bei Apoptose vorkommen, nahmen wir an, dass es sich bei den betroffenen Neuronen um apoptotische Zellen handelte (Abbildung 7a und b).

	Abbildung 7a-b. Hirnschnittpräparate mit Detailansicht der Lamina II des Cortex parietalis 8 Tage alter Ratten, 24 Stunden nachdem sie entweder mit isotonischer Kochsalzlösung (3a) oder mit (+)MK801 (3 x 0,5 mg/kg KG) (3b) behandelt wurden. TUNEL-Färbung, Vergrößerung 98-fach. Die apoptotischen (TUNEL-positiven) Neuronen stellen sich als (dunkel-)braune Zellen dar. Bei den Kontrolltieren sieht man vereinzelt TUNEL-positive Zellen, während bei den mit (+)MK801 behandelten Tieren eine deutliche Zunahme des Zelluntergangs zu sehen ist. Dies entspricht dem Bild bei der Färbung nach de Olmos (siehe Abb. 1c-d).

Der endgültige Beweis der apoptotischen Natur der Zelluntergänge konnte mit der Elektronenmikroskopie erbracht werden. Es zeigte sich, dass sich der hier gefundene degenerative Prozess ultrastrukturell nicht vom physiologischen Zelltod unterscheidet, der im gesunden sich entwickelnden Gehirn vorkommt. Die Neuronen zeigten typische Charakteristika der Apoptose wie Zellschrumpfung, Chromatinkondensation und -aggregation an der Zellkernperipherie in der frühen Phase. In einer späteren Phase der Zelldegeneration zeigten die Neuronen neben der fortschreitenden nukleären Chromatinkondensation das so genannte Blebbing, also ein Abschnüren von Zellbestandteilen, die von Plasmalemm umgeben sind. Diese morphologischen [Seite 31↓]Merkmale wurden sowohl bei den Tieren gefunden, die mit isotonischer Kochsalzlösung behandelt wurden, als auch bei jenen, die (+)MK801 erhielten (Abbildung 8a-d).

	Abbildung 8a-d. Elektronenmikroskopische Aufnahmen einzelner degenerierter Neuronen von 8 Tage alten Ratten, 24 Stunden nachdem sie mit isotonischer Kochsalzlösung (8a und 8c) oder mit (+)MK801 (3 x 0,5 mg/kg KG) (8b und 8d) behandelt wurden. Vergrößerung 3.275-fach. Die ultrastrukturellen Veränderungen, die hier zu sehen sind, treten charakteristischerweise bei Neuronen auf, die program-mierten Zelltod durchlaufen. Die Abbildungen 8a und 8b zeigen ein frühes Stadium der Apoptose mit Chromatinkondensation im Nucleus bei noch intakter Zellkernmembran. In den Abbildungen 8c und 8d sieht man ein späteres Stadium der Apoptose, wo die Chromatinkondensation weiter fortgeschritten ist und die Zellkernmembran fragmentiert (Pfeile) und diskontinuierlich erscheint. Diese Aufnahmen wurden in der Abteilung der Psychiatrie an der Washington University, St. Louis, USA angefertigt und von Prof. J. Olney freundlicherweise zur Verfügung gestellt.

In der Entwicklungsstudie wurden die Unterschiede der Apoptoseraten in den verschiedenen postpartalen Altersstufen 1 bis 31 Tage untersucht (P1, P4, P8, P15, P22 und P31), jeweils 24 Stunden nachdem die Behandlung mit (+)MK801 oder physiologischer Kochsalzlösung begonnen wurde. Die Dichten apoptotischer Zellen wurden in mehreren Hirnarealen bestimmt und zum Vergleich der verschiedenen Altersgruppen zu einem Score zusammengezählt. Im Alter von 1 bis 15 Tagen löste (+)MK801 apoptotische Nervenzelluntergänge aus, aber das Verteilungsmuster war abhängig vom Entwicklungsalter der Tiere. Die Sensibilität gegenüber (+)MK801-[Seite 32↓]induzierter Apoptose war an P1 und P4 hoch, stieg zwischen P4 und P8 an und fiel steil zwischen P8 und P15 ab. Am 22. postpartalen Tag wurden bei placebobehandelten Ratten keine apoptotischen Neuronen gefunden und nur in geringer Anzahl bei Ratten, die mit (+)MK801 behandelt wurden. 31 Tage alte Ratten hatten weder in der Placebo-, noch in der Verum-Gruppe apoptotische Zelluntergänge (Abbildung 9).

	Abbildung 9. Apoptose-Score des gesamten Gehirns verschiedener Altersgruppen. Die Ratten erhielten 3 x 0,5 mg/kg KG (+)MK801 (dunkle Kreise) oder isotonischer Kochsalzlösung (offene Kreise) in den verschiedenen postnatalen Altersstufen (P0-P21) und wurden nach 24 Stunden getötet (P1-P22). Die Dichten apoptotischer Neurone in 16 verschiedenen Hirnarealen wurden zu einem Score aufsummiert und hier graphisch dargestellt. In allen Altersstufen, P1 bis P22, induziert (+)MK801 Zelluntergänge. Diese sind hoch an P1 und P4, erfahren ein Maximum an P8 und nehmen mit zunehmender Gehirnentwicklung wieder ab. Im Vergleich dazu nimmt die spontane Apoptoserate nach der Geburt kontinuierlich ab.

Die Erhöhung der Apoptoserate mit zunehmendem Alter bis zum 8. Lebenstag fand aber nicht gleichmäßig im gesamten Gehirn statt. Vielmehr unterschieden sich die Verteilungsmuster apoptotischer Neurodegeneration in den verschiedenen Altersgruppen voneinander (Abbildung 10). Die spontane Apoptose bei den neugeborenen Ratten (P1) fand in den mediodorsalen und ventralen thalamischen Nuklei statt, besonders stark ausgeprägt war sie aber im ventromedialen Hypothalamus und im Nucleus caudatus (Caudatum). Die Hirnregionen, die direkt postpartal (P1) eine nennenswerte spontane Apoptoserate aufwiesen, zeigten auch eine kräftige apoptotische Antwort auf (+)MK801, welche am stärksten im Gyrus dentatus war [Seite 33↓](17fache Erhöhung gegenüber der spontanen Apoptoserate). Im Gegensatz zu allen anderen untersuchten Altersgruppen wurden sowohl bei Placebo-, als auch bei (+)MK801-behandelten Tieren an P0 keine apoptotischen Veränderungen im zerebralen Kortex gefunden.

Tabelle 3: Spontane und (+)MK801-induzierte Apoptoseraten in Abhängigkeit vom Alter. Ratten im Alter von 0, 3 und 7 Tagen erhielten entweder 3 x 0,5 mg/kg KG (+)MK801 oder isotone Kochsalzlösung und wurden nach 24 Stunden getötet. Das Gehirn der Tiere wurde mittels de Olmos-Färbung gefärbt und in 14 verschiedenen Hirnregionen histologisch auf Neurodegeneration untersucht. Dargestellt sind die numerischen Dichten apoptotischer Neuronen pro Kubikmillimeter (N/mm³) ± SEM (standard error of means = Standardfehler). Die in Klammern angegebenen Zahlen geben den Faktor der Zunahme der Apoptoseraten in den jeweiligen Hirnarealen nach Gabe von (+)MK801 wieder.

An Tag P4 sank die Rate der spontanen Apoptose im Hypothalamus und in den mediodorsalen und ventralen thalamischen Kernen merklich, blieb auf einem mäßig [Seite 34↓]hohen Niveau in den meisten anderen Regionen und zeigte sich erstmals in neuen Regionen, wie z.B. in der Lamina II der frontalen, parietalen, cingulären und retrosplenialen Anteile des zerebralen Kortex. In dieser Entwicklungsphase löste (+)MK801 in allen untersuchten Regionen eine erhöhte Apoptoserate aus, besonders im Subiculum (8fach) und im laterodorsalen Thalamus (10-fach).

	Abbildung 10. Schemata von Hirnschnitthemisphären im Alter von 1 bis 22 Tagen mit graphischer Kennzeichnung der Hirnareale, in denen neuronale Apoptose stattfindet. In den hellgrauen Feldern liegen Apoptoseraten von bis zu 10.000/mm³ vor, in den mittelgrauen Apoptoseraten von 10.000-20.000/mm³ und in den dunklen Arealen mehr als 20.000/mm³.

	Abbildung 11. Schema der untersuchten Hirnregionen. Im linken Bild sieht man einen rostralen, rechts einen caudalen Koronarschnitt durch das junge Rattengehirn.

Am 8. postpartalen Tag (P8) sank die spontane Apoptoserate in allen Regionen auf ein mäßiges Niveau, aber die (+)MK801-induzierten Potenzierungen der Apoptose blieben in vielen Regionen hoch (14,6- bis 39,7fache Erhöhung gegenüber der spontanen [Seite 35↓]Apoptoserate im frontalen Kortex, Subiculum, retrosplenialen, parietalen und cingulären Cortices und im laterodorsalem Thalamus). Regionen, die direkt postpartal (P1) hohe spontane oder induzierte Apoptoseraten aufwiesen (Gyrus dentatus, CA1 Hippocampus, ventromedialer Hypothalamus und ventraler und mediodorsaler Thalamus), zeigten dagegen an P8 niedrige spontane und induzierte Apoptoseraten (Tabelle 3). An P15 nahm die durch (+)MK801 induzierte Apoptoserate auf etwa ein Viertel der Rate bei 8 Tage alten Tieren ab, besaß aber ein ähnliches Verteilungsmuster. An P22 reduzierte sich die induzierte Apoptoserate nochmals um ca. die Hälfte. Bei den beiden ältesten untersuchten Altersgruppen war die Rate der induzierten Apoptose jeweils 20- bis 50-fach gegenüber der jeweiligen spontanen Apoptoserate erhöht.

Zum Schluss wurde untersucht, ob der non-NMDA-Rezeptorantagonist GYKI 52466 (ein AMPA-Rezeptorblocker) ebenfalls Apoptose auslösen kann. Hierfür erhielten 7 Tage alte Ratten entweder eine oder drei Dosen à 30 mg/kg KG des AMPA-Antagonisten. Die histologischen Untersuchungen ergaben keine signifikanten Unterschiede zwischen den Tieren, die mit isotoner Natriumchloridlösung behandelt wurden, und denen, die GYKI 52466 erhalten hatten.