[Seite 1↓]+Aus der Abteilung der Neuropädiatrie in der Klinik für Pädiatrie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

DISSERTATION

N-Methyl-D-Aspartat-Antagonisten
induzieren apoptotische Zelluntergänge
im Gehirn junger Ratten

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Michael Miksa
aus Leonberg

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. H. Ikonomidou
2. Prof. Dr. med. G.F. Hoffmann
3. Prof. Dr. med. G.B. Landwehrmeyer

Datum der Promotion:26.03.2004

Abstract (deutsch)

Der exzitatorische Neurotransmitter Glutamat spielt eine grosse Rolle in der Ge­hirn­ent­wick­lung, wie neu­ro­na­le Mi­gr­at­ion und Sy­nap­to­ge­ne­se. Ob glu­ta­mat­er­ge Sti­mu­la­tion für das Über­le­ben ent­wic­keln­der Neu­ro­nen not­wen­dig ist, war bis­lang je­doch un­be­kannt. Um zu unter­suchen, ob eine Hem­mung von Glu­ta­mat­rez­ep­toren im un­rei­fen Ge­hirn zu Neu­ro­de­ge­ne­ra­tion führt, wur­den Rat­ten im Al­ter von 0 bis 30 Ta­gen für 24 Stun­den mit dem N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA) Glu­ta­mat­rezep­tor­an­tagon­ist­en Dizocilpin (MK801) be­hand­elt. Die Dich­te neu­ro­naler De­gene­ra­tion wur­de mi­kro­sko­pisch in Kupfer-Silber- und TUNEL- ge­färb­ten Hirn­schnitt­präpa­raten ermit­telt und Un­ter­schiede mit­tels ANOVA analysiert (Signifikanzniveau p<0.05). Die phar­ma­ko­lo­gi­sche Hem­mung von NMDA-Re­zep­toren im un­reifen Rat­ten­ge­hirn führ­te zu einer aus­ge­dehn­ten Neuro­de­ge­ne­ra­tion, die in der fühen Neu­ge­boren­en­peri­ode (1. bis 8. Le­bens­tag) am stärk­sten aus­ge­prägt war. Eine elek­tro­nen­mi­kro­sko­pi­sche Unter­su­chung ve­ri­fi­zier­te die apop­to­tische Ge­ne­se des Zell­to­des. Während der physiologische Zelltod von Ge­burt an ab­nahm (von 0,67 auf 0,16 x 10⁵/mm³ am 1. und 8. Le­bens­tag) stieg die Apop­to­se­rate bei MK801-be­han­del­ten Tieren der glei­chen Al­ters­grup­pe von 1,95 auf 2,83 x 10⁵/mm³ an. Bis zum 22. Le­bens­tag fiel die MK801-in­du­zier­te Apop­tose auf das Ni­veau der un­be­han­del­ten Rat­ten ab (0,09 vs. 0,05 x 10⁵/mm³). Be­trof­fen waren haupt­säch­lich Zell­po­pu­la­tio­nen, die hohe NMDA-Re­zep­tor­dich­ten auf­wei­sen und die höchs­te Apop­to­se­rate wur­de bei 8 Ta­ge al­ten Rat­ten im Neo­kor­tex ge­fun­den, wo sie bis auf das 39-fache der phy­sio­lo­gi­schen Apop­to­se an­stieg (von 1,55% auf 26% der Ge­samt­neu­ro­nen­dich­te im parie­ta­len Kor­tex). Während der On­to­ge­ne­se scheint es somit eine vul­ne­rable Pha­se zu ge­ben, in der die NMDA-re­zep­tor­ver­mit­tel­te glu­ta­ma­terge Sti­mu­la­tion zum Über­le­ben un­rei­fer Ner­ven­zel­len un­ab­ding­bar ist und selbst eine vor­über­gehen­de Blocka­de dieser Re­zep­to­ren führt zu neu­ro­na­ler Apop­tose.

Eigene Schlagworte: Tier, Ratten, Apoptose, Gehirn, Zytologie, pharmakologische Wirkung, Wachstum & Entwicklung, Dizocilpin-maleat (MK801), pharmakologische Wirkung, Exzitatorische Neurotransmitter Antagonisten/pharmakologische Wirkung, Immunohistochemie, In-Situ-Nick-End Labeling (TUNEL), Neuronalale Degeneration, Neuronen, pharmakologische Wirkung, Metabolismus, Rezeptoren, N-methyl-D-aspartat, Antagonisten & Inhibitoren , Metabolismus

Abstract (English)

The predominant excitatory neurotransmitter glutamate plays a major role in certain aspects of neural development such as migration and synaptogenesis. However, whether developing neurons depend on glutamate for survival remains unknown. To investigate if deprivation of glutamate stimulation in the immature mammalian brain causes neuronal cell death (apoptosis), rat pups aged 0 to 30 days were treated for 24 hours with dizocilpine maleate (MK801), an N-methyl-D-aspartate-(NMDA) glutamate receptor antagonist. Density of neural degeneration was evaluated by a stereological dissector method in cupric–silver and TUNEL-stained brain slices. Groups were compared by ANOVA and significance considered at p<0.05. Pharmacological blockade of NMDA receptors triggered widespread neurodegenera­tion, with the highest occurrence in the early neonatal period (1-8 postnatal days). Ultra­struc­tural analysis revealed the apoptotic nature of neural degeneration. Although spontaneous cell deaths decreased with age from 0.67 to 0.16 x 10⁵/mm³ (p<0.05) they increased from 1.95 to 2.83 x 10⁵/mm³ (p<0.05) in MK801 treated animals (0 and 7 day-old-rats respectively). At day 22, MK801-induced apoptosis reached almost normal values (0.09 vs. 0.05 x 10⁵/mm³). Neuronal populations most severely affected included those that have high amounts of NMDA-specific receptors and was most pronounced in the cortex of 8-day-old rats where induced apoptosis increased by up to 39-fold (1.55 to 26% of total neural population in lamina II of the parietal cortex, p<0.05). It appears that during a certain stage of ontogenesis glutamatergic innervation mediated by NMDA receptors is vitally important for developing neurons and even a transient interruption triggers neuronal death.

Keywords: Animal/Rats Apoptosis Brain cytology drug effects growth & development Dizocilpine Maleate (MK801) pharmacology Excitatory Amino Acid Antagonists pharmacology Immunohisochemistry In Situ Nick-End Labeling (TUNEL) Nerve Degeneration Neurons drug effects metabolism Receptors, N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) antagonists & inhibitors metabolism

Inhaltsverzeichnis

• 1.  Einleitung
  • 1.1. Die Gehirnentwicklung: Brain growth spurt
  • 1.2. Physiologische Apoptose
    • 1.2.1. Morphologie der Apoptose
    • 1.2.2. Regulation der Apoptose
    • 1.2.3. Bedeutung der Apoptose
  • 1.3. Der Exzitatorische Neurotransmitter Glutamat
  • 1.4. Glutamatrezeptoren
    • 1.4.1.  Struktur der NMDA-Rezeptoren: Untereinheiten
    • 1.4.2. Topologie der Untereinheiten
    • 1.4.3. Heteromere Kanäle
    • 1.4.4. Verteilung der NMDA-Rezeptoruntereinheiten im Gehirn
  • 1.5. Aufgaben des Glutamats bzw. der NMDA-Rezeptoren
    • 1.5.1.  Synergistische exzitatorische Wirkung von GABAA-, AMPA und NMDA-Rezeptoren
  • 1.6. Glutamat als Neurotoxin
  • 1.7. Glutamat als trophischer Faktor
  • 1.8. Problemstellung
• 2.  Material und Methoden
  • 2.1. Untersuchungsmaterial
    • 2.1.1. Versuchstiere
    • 2.1.2. Geräte
    • 2.1.3. Pharmaka und Chemikalien
      • 2.1.3.1 Pharmaka
      • 2.1.3.2 Chemikalien
      • 2.1.3.3 Lösungen für die modifizierte Kupfer-Silberfärbung nach de Olmos [57 58]
      • 2.1.3.4 Methylgrün-Pyronin-Lösung für die Nissl-Färbung
      • 2.1.3.5 TUNEL-Färbung: kommerzielles Kit
      • 2.1.3.6 Sonstiges
  • 2.2. Versuche: Vorbereitung und Versorgung
    • 2.2.1. Pharmakonapplikation
    • 2.2.2. Narkose und Perfusion
    • 2.2.3. Präparation und Einbettung
    • 2.2.4. Vibratomschnitt
    • 2.2.5. Nissl-Färbung
    • 2.2.6. Silberfärbung nach de Olmos
    • 2.2.7. TUNEL-Färbung
    • 2.2.8. Mikroskopische Untersuchung und Auszählung
    • 2.2.9. Statistische Methoden
• 3.  Ergebnisse
  • 3.1. Massive Neurodegeneration im Gehirn 8 Tage alter Ratten nach Behandlung mit (+)MK801
  • 3.2. TUNEL-Färbung und Elektronenmikroskopie zum Nachweis der apoptotischen Natur der Neurodegeneration
  • 3.3. Entwicklungsstudie: Höchste Apoptoserate im Alter von 7 Tagen nach Gabe von (+)MK801
  • 3.4. Hemmung von AMPA- Rezeptoren: keine Erhöhung der Apoptoserate
• 4.  Diskussion
  • 4.1. Allgemeines
  • 4.2. Abhängigkeit der Apoptoseinduktion vom Entwicklungsalter
  • 4.3. Bestimmende Faktoren der Apoptoseinduktion durch (+)MK801
    • 4.3.1. Spezifität der NMDA-Antagonisten
    • 4.3.2. Proapoptotische Wirkung von GABAA-Agonisten
    • 4.3.3. Pharmakologische Eigenschaften von (+)MK801
    • 4.3.4. Verteilungsmuster der Apoptose und der NMDA-Rezeptorsubtypen
  • 4.4. Neurotoxizität von NMDA-Antagonisten bei erwachsenen Tieren
  • 4.5. Mechanismen der Apoptoseinduktion
    • 4.5.1. Intrazellulärer Kalziumspiegel
    • 4.5.2. Molekulare Mechanismen der Apoptoseinduktion
    • 4.5.3. Neuronale Wachstumsfaktoren
  • 4.6. Bedeutung der Ergebnisse im klinischen Zusammenhang
    • 4.6.1. NMDA-Antagonisten in der pädiatrischen Anästhesie
    • 4.6.2. Drogenmissbrauch werdender Mütter
    • 4.6.3. Neurodegenerative Erkrankungen und NMDA-Rezeptoren
  • 4.7. Schluss
• 5.  Zusammenfassung
• Glossar
• Lebenslauf und Publikation
• Literaturverzeichnis
• Danksagung
• Eidesstattliche Erklärung

Tabellen

• Tabelle 1 : Glutamatrezeptorsubtypen NMDA-, AMPA-, Kainat- und metabotrope Rezeptoren mit ihren Untereinheiten. Die ionotropen Rezeptoren steuern direkt Ionenkanäle, während metabotrope Rezeptoren über second messenger wirken und sekundär zu intrazellulärem Ca2+-Anstieg führen können. Modifiziert nach Dingledine [21].
• Tabelle 2: Die Apoptoserate im Hirn von 7 Tage alten Ratten wird durch den NMDA-Antagonisten (+)MK801 erhöht. Die Ratten erhielten entweder Placebo oder (+)-MK801 (0,5 mg/kg KG i.p.) nach 0, 8 und 16 Stunden und wurden nach 24 Stunden (P8) getötet. Durch die o.g. optische Unterteilungsmethode wurde jeweils in 16 Hirnregionen die Dichte der Gesamtzellzahl (in Zellen/mm³, in den nach Nissl gefärbten Hirnpräparaten) bzw. der degenerierenden Zellen (in %- Anteil der Gesamtzellzahl, de Olmos-Färbung) mit dem jeweiligen Standardfehler des Mittelwerts (± SEM) ermittelt. Die Unterschiede zwischen den behandelten und unbehandelten Tieren wurde mittels t-Test von Student auf Signifikanz überprüft. Die Asterices geben das Signifikanzniveau an: **P<0,01; ***P<0,001. CA 1 HPC: CA 1 Hippocampus, GD: Gyrus dentatus, Thal ld: laterodorsaler Thalamus, Thal md: mediodorsaler Thalamus, Thal v: ventraler Thalamus, Hypothal vm: ventromedialer Hypothalamus, Fr: frontaler Kortex, Par: parietaler Kortex, Cing: cingulärer Kortex, Rspl: retrosplenialer Kortex, jeweils Lamina II und IV.
• Tabelle 3: Spontane und (+)MK801-induzierte Apoptoseraten in Abhängigkeit vom Alter. Ratten im Alter von 0, 3 und 7 Tagen erhielten entweder 3 x 0,5 mg/kg KG (+)MK801 oder isotone Kochsalzlösung und wurden nach 24 Stunden getötet. Das Gehirn der Tiere wurde mittels de Olmos-Färbung gefärbt und in 14 verschiedenen Hirnregionen histologisch auf Neurodegeneration untersucht. Dargestellt sind die numerischen Dichten apoptotischer Neuronen pro Kubikmillimeter (N/mm³) ± SEM (standard error of means = Standardfehler). Die in Klammern angegebenen Zahlen geben den Faktor der Zunahme der Apoptoseraten in den jeweiligen Hirnarealen nach Gabe von (+)MK801 wieder.

Abbildungen

• Abbildung 1 Morphologische Gegenüberstellung von Nekrose und Apoptose. Während der Nekrose schwellen die Zellen zunächst an und die Zellorganellen werden freigesetzt, was eine Entzündungsreaktion hervorruft (links im Bild). Bei der Apoptose kommt es zur Chromatinkondensation an der Zellkernperipherie und zum Abschnüren apoptotischer Körperchen, die von Makrophagen phagozytiert werden. Graphik adaptiert nach Blom [7].
• Abbildung 2.Schema der apoptotischen Kaskade. Extrinsische Faktoren aktivieren über die Bindung an Oberflächenrezeptoren apoptoseinduzirende Caspasen, während intrinsische Faktoren über intrazelluläre Ca 2+ -Erhöhung zur Aktivierung von Caspasen führen. Alternativ wird das mitochondriale Cytochrom c (Cyt c) freigesetzt, welches mit APAF1 und ATP einen Apoptosom-Komplex bildet. Dieses löst über die Aktivierung der Caspase 9 die proteolytische Kaskade aus. Unabhängig von der Kaskade kann der Apoptose induzierende Faktor (AIF) zur DNA-Fragmentierung führen. Bcl-2 moduliert auf mitochondrialer Ebene die Apoptosenkaskade. Der permeability transition pore (PTP), ein mitochondrialer Proteinkomplex, hält normalerweise ein Potential an der inneren Mitochondrienmembran aufrecht. Die Öffnung dieses Kanals führt zur Depolarisierung und damit zur Freisetzung mitochondrialer Apoptosefaktoren (z.B. Cyt c, APAF-1 [nicht dargestellt] und AIF). Adaptiert nach Toescu [14].
• Strukturformeln 1 Strukturformeln der drei spezifischen Agonisten ionotroper Glutamatrezeptoren.
• Abbildung 3. Zwei Modellvorstellungen zur Transmembrantopologie der NMDA-Rezeptoruntereinheit. Das Signalpeptid liegt extrazellulär am N-terminalen Ende. Bei Tingleys Modell wird davon ausgegangen, dass das C-terminale Ende intrazellulär liegt, wobei das Segment M2 nur eine Schleife in die Zellmembran bildet [23].
• Abbildung 4a und b. Histologische Präparate von Hirnhemisphären im Koronarschnitt (Schwarz-Weiß-Aufnahme) acht Tage alter Ratten, 24 Stunden nachdem sie mit isotoner Kochsalzlösung (4a) oder (+)MK801 (3 x 0,5 mg/kg KG) behandelt wurden (4b). Vergrößerung 9,8fach. Die degenerierten Neuronen sind als dunkle Flecken auf hellem Hintergrund zu erkennen. Die Hirne der mit (+)MK801 behandelten Tiere zeigen in der Übersicht eine höhere Rate an degenerierten Neuronen als die Kontrolltiere. Insbesondere ist dies im parietalen und cingulärem Kortex sichtbar.
• Abbildung 5a und b. Hirnschnittpräparate acht Tage alter Ratten, 24 Stunden nachdem sie mit isotoner Kochsalzlösung (5a) oder (+)MK801 (3 x 0,5 mg/kg KG) behandelt wurden (5b). De Olmos-Färbung, Vergrößerung 98fach. In der höheren Vergrößerung (Detailaufnahme aus Lamina II des Kortex parietalis) sind die degenerierten Neuronen einzeln zu erkennen. Nach Behandlung mit (+)MK801 sieht man eine deutliche Zunahme der degenerierten Neuronen im selben Hirnareal.
• Abbildung 6. Graphische Darstellung der Anteile degenerierter Neuronen bei Tieren, die mit dem NMDA-Rezeptorantagonisten (+)MK801 behandelt wurden (dunkle Säulen), im Vergleich zur spontanen Degenerationsrate (physiologische Apoptose, helle Säulen) in verschiedenen Hirnarealen. Auf der Abszissenachse sind die Hirnareale dargestellt: CA 1 HPC: CA 1 Hippocampus, GD: Gyrus dentatus, Thal ld: laterodorsaler Thalamus, Thal md: mediodorsaler Thalamus, Thal v: ventraler Thalamus, Hypothal vm: ventromedialer Hypothalamus, Fr: frontaler Kortex, Par: parietaler Kortex, Cing: cingulärer Kortex, Rspl: retrosplenialer Kortex, jeweils Lamina II und IV. Auf der Ordinatenachse wurden die jeweiligen prozentualen Anteile der degenerierten Zellen an der Gesamtzellzahl von Neuronen in den Hirnarealen dargestellt. Insbesondere die Lamina II der frontalen, parietalen und cingulären Cortices zeigen hohe durch (+)MK801 induzierte Apoptoseraten.
• Abbildung 7a-b. Hirnschnittpräparate mit Detailansicht der Lamina II des Cortex parietalis 8 Tage alter Ratten, 24 Stunden nachdem sie entweder mit isotonischer Kochsalzlösung (3a) oder mit (+)MK801 (3 x 0,5 mg/kg KG) (3b) behandelt wurden. TUNEL-Färbung, Vergrößerung 98-fach. Die apoptotischen (TUNEL-positiven) Neuronen stellen sich als (dunkel-)braune Zellen dar. Bei den Kontrolltieren sieht man vereinzelt TUNEL-positive Zellen, während bei den mit (+)MK801 behandelten Tieren eine deutliche Zunahme des Zelluntergangs zu sehen ist. Dies entspricht dem Bild bei der Färbung nach de Olmos (siehe Abb. 1c-d).
• Abbildung 8a-d. Elektronenmikroskopische Aufnahmen einzelner degenerierter Neuronen von 8 Tage alten Ratten, 24 Stunden nachdem sie mit isotonischer Kochsalzlösung (8a und 8c) oder mit (+)MK801 (3 x 0,5 mg/kg KG) (8b und 8d) behandelt wurden. Vergrößerung 3.275-fach. Die ultrastrukturellen Veränderungen, die hier zu sehen sind, treten charakteristischerweise bei Neuronen auf, die program-mierten Zelltod durchlaufen. Die Abbildungen 8a und 8b zeigen ein frühes Stadium der Apoptose mit Chromatinkondensation im Nucleus bei noch intakter Zellkernmembran. In den Abbildungen 8c und 8d sieht man ein späteres Stadium der Apoptose, wo die Chromatinkondensation weiter fortgeschritten ist und die Zellkernmembran fragmentiert (Pfeile) und diskontinuierlich erscheint. Diese Aufnahmen wurden in der Abteilung der Psychiatrie an der Washington University, St. Louis, USA angefertigt und von Prof. J. Olney freundlicherweise zur Verfügung gestellt.
• Abbildung 9. Apoptose-Score des gesamten Gehirns verschiedener Altersgruppen. Die Ratten erhielten 3 x 0,5 mg/kg KG (+)MK801 (dunkle Kreise) oder isotonischer Kochsalzlösung (offene Kreise) in den verschiedenen postnatalen Altersstufen (P0-P21) und wurden nach 24 Stunden getötet (P1-P22). Die Dichten apoptotischer Neurone in 16 verschiedenen Hirnarealen wurden zu einem Score aufsummiert und hier graphisch dargestellt. In allen Altersstufen, P1 bis P22, induziert (+)MK801 Zelluntergänge. Diese sind hoch an P1 und P4, erfahren ein Maximum an P8 und nehmen mit zunehmender Gehirnentwicklung wieder ab. Im Vergleich dazu nimmt die spontane Apoptoserate nach der Geburt kontinuierlich ab.
• Abbildung 10. Schemata von Hirnschnitthemisphären im Alter von 1 bis 22 Tagen mit graphischer Kennzeichnung der Hirnareale, in denen neuronale Apoptose stattfindet. In den hellgrauen Feldern liegen Apoptoseraten von bis zu 10.000/mm³ vor, in den mittelgrauen Apoptoseraten von 10.000-20.000/mm³ und in den dunklen Arealen mehr als 20.000/mm³.
• Abbildung 11. Schema der untersuchten Hirnregionen. Im linken Bild sieht man einen rostralen, rechts einen caudalen Koronarschnitt durch das junge Rattengehirn.
• Abbildung 12 Die Aktivierung des NMDA-Rezeptors führt zum Kalziumeintritt in die Zelle und zur Erhöhung der intrazellulären Ca 2+ -Konzentration. Dies führt zur Aktivierung der extracellular signal regulated kinase (ERK1/2)-vermittelten Signalübermittlung von der Synapse zum Nucleus, wo das cAMP response element binding protein (CREB) phosphoryliert wird. Gleichzeitig bindet Calmodulin (CaM) Calmodulin-Kinase IV (CaMK IV) und die Calmodulin-Kinase-Kinase (CaMKK). Die CaMKK phosphoryliert und aktiviert damit die CaMK IV, die ihrerseits CREB phosphoryliert und aktiviert. Beide Kaskaden führen zur Transkription antiapoptotischer Gene, wie Wachstumsfaktoren und bcl-2 [109].