[Seite 16↓]

2  Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Antikörper

2.1.1.1 Primäre Antikörper (monoklonal) gegen:

SNAP 25

Sternberger Monoclonals (Baltimore, MD, USA)

Synaptobrevin 2 (Cl 69.1)

R. Jahn (Göttingen, Deutschland) (Edelmann 1995)

Synaptophysin (Cl 7.2)

R. Jahn (Göttingen, Deutschland) (Jahn 1985)

Syntaxin (HPC-1)

Sigma (St. Louis, MO, USA)

2.1.1.2 Primäre Antiseren (polyklonal) gegen:

Munc 18

Synaptic Systems (Göttingen, Deutschland)

2.1.1.3 Sekundäre Antikörper

Pferd anti-Maus IgG, Peroxidase-gekoppelt

Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA)

Ziege anti-Hase IgG, Peroxidase-gekoppelt

Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA)

2.1.2 Chemikalien und Reagenzien


[Seiten 17 - 18↓]

2-Mercaptoethanol Sigma

(St. Louis, MO, USA)

Acrylamid Stock-Lösung 30 %

Roth (Karlsruhe, Deutschland)

BCA ( b i c inchoninic a cid) (Natriumbicinchoninate-4,4-Dicarboxy-

2,2'-Bichinolin)

Sigma (St. Louis, MO, USA)

BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-Indoyl-Phosphat)

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Bisacrylamid Stock-Lösung 30 %

Roth (Karlsruhe, Deutschland)

BSA (Bovines Serumalbumin)

Sigma (St. Louis, MO, USA)

CHAPS (3-([3-Cholamidopropyl]-Dimethylammonio)-1-Propansulfonat)

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Cholesteroloxidase

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Cholsäure

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Dimethylformamid (DMF)

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Dimethylsulfoxid (DMSO)

Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Disucciminidylsuberat (DSS)

Sigma (St. Louis, MO, USA)

DMEM

Biochrom (Berlin, Deutschland)

DNAse 1

Boehringer Mannheim (Deutschland)

ECLTM (enhanced chemiluminescence)

Amersham (Buckinghamshire, UK)

EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)

Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Eupergit C1Z Kugeln

Roehm Pharma (Weiterstadt, Deutschland)

Filipin

Sigma (St. Louis, MO, USA)

HAM’s

Biochrom (Berlin, Deutschland)

HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-

2-ethan-sulfonsäure)

Sigma (München, Deutschland)

Hybond C Nitrozellulosemembran für Westernblots

Amersham (Buckinghamshire, UK)

IPTG (Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid)

Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Lovastatin

Sigma (München, Deutschland)

Lysozym

Sigma (St. Louis, MO, USA)

LMW (low molecular weight marker)

Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden)

Mannitol

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Methyl-ß-cyclodextrin (ß-MCD)

Sigma (München, Deutschland)

NBT (Nitroblau Tetrazoliumchlorid)

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Ni-NTA Superflow (Nickelkügelchen)

Quiagen (Santa Clarita, CA, USA)

n- Octyl-ß-D-glucopyranosid

ULTROL® Grade (Bad Soden, Deutschland)

Pipes (Piperazine-N,N‘-bis(2-ethanesulfonic acid);1,4-Piperazinediethanesulfonic acid)

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Ponceau S

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Proteaseinhibitoren:

 

Aprotinin

Boehringer Mannheim (Deutschland)

Leupeptin

Boehringer Mannheim (Deutschland)

Pepstatin A

Boehringer Mannheim (Deutschland)

PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid)

Roth (Karlsruhe, Deutschland)

Protein G Sepharose 4 fast flow

Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden)

Roti-Meßkitt zur Bestimmung der Proteinkonzentration

Roth (Karlsruhe, Deutschland)

SDS (sodium dodecyl sulfat)

Boehringer Mannheim (Deutschland)

Sphingomyelinase,

Sigma (St. Louis, MO, USA)

Triton X-100

Roth (Karlsruhe, Deutschland)

2.1.3 Puffer und Lösungen


[Seiten 19 - 21↓]

Antikörper Lösung

1.5 % Bovines Serumalbumin in TS-Puffer

AP-Puffer

(für Immundetektion auf Western Blots)

1 ml 1.0 M Tris, pH 9.5

1 ml 0.5 M MgCl2

1 ml 1.5 M NaCl

7 ml H2O

AP-Entwicklungslösung
(für Immundetektion auf Western Blots)

50.0 µl NBT (75 mg NBT in 700 µl Dimethylformamid)

37.5 µl BCIP (50 mg BCIP in 1 ml Dimethylformamid)

Blotto
(blocking solution)

5.0 % fettarmes Milchpulver

0.1 % Tween 20 in TS-Puffer

Cholesteroloxidase Stocklösung

200 U/ml Cholesteroloxidase

100 mM Pipes

1 M NaCl, pH 6,0

Cholesteroloxidase Verdünnungspuffer

140 mM NaCl

4,7 mM KCl

1,2 mM MgSO4

15 mM Hepes

pH 7,4

1 mU/ml Sphingomyelinase

10 mM Mannitol

Farbentwicklerlösung

2 ml 3 mg/ml alpha-Chloronaphthol in DMSO

10 ml TS

10 µl Hydrogenperoxid 30 %

Coomassie Blau-Lösung

1 g Coomassie Brilliantblau R-250 in 0.5 l Methanol und 0.5 l Azetylsäure

Dialysepuffer

120 mM NaCl

20 mM Tris pH 7.4

1,5 % Cholsäure

Elektrophoresepuffer (10 X)

30 g Tris

144 g Glyzin

10 g SDS auf insgesamt 1 l, unter Verwendung von dH2O

(keine pH-Anpassung nötig)

Extraktionspuffer

140 mM KCl

20 mM HEPES-KOH, pH 7.3

2 mM EDTA

1 % Triton X-100

Krebs Ringer-Hepes-Puffer

140.0 mM NaCl

5.0 mM NaHCO3

1.0 mM MgCl2

1.2 mM Na2HPO4

10.0 mM Glukose

20.0 mM Hepes, pH 7.4

Natriumpuffer

10.0 mM Glukose

5.0 mM KCl

140.0 mM NaCl

5.0 mM NaHCO3

1.0 mM MgCl2

1.2 mM Na2HPO4

20.0 mM HEPES, pH 7.4

Phosphatgepufferte Salzlösung
(PBS, Phosphate Buffered Saline Solution)

140.0 mM NaCl

2.7 mM KCl

10.0 mM Na2HPO4

1.8 mM KH2PO4 pH 7.4

Ponceau-Lösung

0.5 % w/v Ponceau S

3.0 % v/v Trichloroacetessigsäure

Probenpuffer Laemmli (3 X)

12.48 ml Sammelgelpuffer (4 X)

1.50 ml 0.1 M EDTA (Na-Salz) pH 6.8-7.0

15 g Saccharose

5.00 ml 1.5 M DTT auf insgesamt 50 ml, unter Verwendung von dH2O

Trenngelpuffer (4 X)

181.7 g Tris pH 8.8

4.0 g SDS auf insgesamt 1 l, unter Verwendung von dH2O und Filter

TS-Puffer (10 X)
(Tris-gepufferte Salzlösung)

20 mM Tris

150 mM NaCl pH 7.5 (mittels HCl)

Lösung A

(für BCA-Assay)

1.00 % BCA-Dinatrium

1.70 % NaHCO3

0.16 % Na2-Tartrat

0.40 % NaOH

0.95 % NaHCO3in dH2O, pH 11.25

Lösung B

(für BCA-Assay)

4 % CuSO4*5H2O

Sammelgelpuffer (4 X)

 

60.5 g Tris pH 6.8

4.0 g SDS auf insgesamt 1 l, unter Verwendung von dH2O und Filter

Saccharoselösung

0.32 M Saccharose in dH2O

Sphingomyelinase Stocklösung

40 mU/ml Sphingomyelinase

50 % (v/v) Glycerol in PBS

Western Blot-Puffer
(für halbtrockenen Transfer)

48 mM Tris

386 mM Glyzin

3.7 g / l 10 % SDS

800 ml H2O

200 ml Methanol (keine pH-Anpassung nötig)

Medium für Zellkulturen

DMEM

5 % fetales Kälberserum

10 % Pferdeserum

1 % Glutamin

1 % Penicillin / Streptomycin

HAM’s und DMEM 1:1 Fertigmedium (Medium für neuronale Primärkulturen)

10 mM Hepes

Putreszin

Insulin

0.5 mM Glutamin

Fettsäuren (Arachidonsäure)

Selenium

Progesteron

10-12 M Östradiol

10-7 M Corticostron

10-8 M Trijodthyronin

Penicillin / Streptomycin


[Seite 22↓]

2.1.4  Instrumente

2.1.4.1 Zentrifugen

Beckman L-70 Ultrazentrifuge

Palo Alto, CA, USA

Rotoren:

Type 70 Ti

 

SW 40 Ti

Beckman OptimaTM TL Ultrazentrifuge

Palo Alto, CA, USA

Rotor:

TLA-100.4

Beckman J2-HS

Palo Alto, CA, USA

Rotor:

JA-14

Eppendorf Zentrifuge 5402

Hamburg, Deutschland

Eppendorf Zentrifuge 5417 C

Hamburg, Deutschland

2.1.4.2 Zentrifugalfiltereinheiten

Centricon-10

(Molekulargewichtgrenze von 10 kDa)

Millipore, Bedford, MA, U.S.A.

Centricon-3

(Molekulargewichtgrenze von 3 kDa)

Millipore, Bedford, MA, U.S.A.

2.1.4.3 Elektrophorese Ausrüstung

Trans-Blot SD halbtrockene Elektrophoreseeinheit

Bio-Rad (Hercules, CA, USA)

Power/Pac 200 power supply

Bio-Rad (Hercules, CA, USA)

Mini-PROTEAN II Elektrophorese Zelle

Bio-Rad (Hercules, CA, USA)

2.1.4.4 Spektrophotometer

Dynatech MR 5000 Elisa-Leser

Dynatech (Ashford, United Kingdom)

UV-1202 UV-VIS Spektrophotometer

Shimadzu (Kyoto, Japan)


[Seite 23↓]

2.2  Methoden

2.2.1 Herstellung von Synaptosomen und Synaptischen Vesikeln aus Rattengehirnen

2.2.1.1 Synaptosomen

Synaptosomen wurden als isolierte freie Nervenendigungen aus Gesamtgehirnen adulter und embryonaler Wistar Ratten nach der Methode von Edelmann et al. (1995) hergestellt. Für die Mehrheit der Experimente war die Aufbereitung des Gesamtgehirnes einer adulten Ratte ausreichend bzw. wurden alle 10 bis 18 Embryonen einer schwangeren Ratte am Embryonaltag 20 (E20) verwendet.

Die Ratte wurde mit Ether gut anästhesiert und umgehend dekapitiert. Schnellstmöglich wurde das adulte Gehirn präpariert und in eisgekühlte, mit Wasserstoffperoxid (0.2 %) angereicherte Saccharoselösung (320 mM) gegeben. Die Embryonen schwangerer Ratten wurden auf Eis gebettet, um die embryonalen Gehirne nacheinander freizulegen und in o.g. Saccharoselösung zu sammeln. Alle weiteren Schritte wurden bei 4°C durchgeführt, wobei mit adulten und embryonalen Gehirnen gleich verfahren wurde.

Die Rattengehirne wurden in 10 ml Saccharoselösung (320 mM) mit einem Dounce-Homogenisator (9 Hübe bei 900 rpm) homogenisiert in Gegenwart der Proteaseinhibitoren Aprotinin (1 µg/ml), Leupeptin (2 µg/ml), Pepstatin (2 µg/ml) und PMSF (0.2 mM). Anschliessend wurde das Homogenat in der Beckmann-Zentrifuge (Rotor Ti 70) für 10 min bei 3.500 rpm zentrifugiert. Das daraus resultierende Sediment, welches Zellkerne und nicht lysierte Zellen enthält, wurde verworfen. Der resultierende Überstand (PNÜ=PNS oder p ost n uclear s upernatant) wurde erneut für 15 min bei 11.500 rpm zentrifugiert, wodurch man das P2, eine ungereinigte Synaptosomenfraktion, erhält. Das P2-Sediment wurde zum Waschen in 10 ml Saccharoselösung mit den Proteaseinhibitoren resuspendiert und erneut für 10 min bei 3.500 rpm zentrifugiert.

2.2.1.2 Synaptische Vesikel

Synaptische Vesikel wurden gewonnen aus dem gewaschenen Synaptosomensediment P2 gemäß dem Verfahren nach Huttner et al. (1983). Alle Teilschritte wurden bei 4°C ausgeführt.

Das gewaschene Synaptosomensediment P2 wurde in 1 ml mit Wasserstoffperoxid angereicherter Saccharoselösung aufgenommen und mit 9 ml eiskaltem destillierten Wasser, den o.g. Proteaseinhibitoren (im Verhältnis 1:1000) und Hepes-NaOH-Puffer (10 mM) mit
pH 7.0 versetzt. Das Lysat wurde mit dem Dounce-Homogenisator (3 Hübe bei 2000 rpm) homogenisiert und in der Beckmann-Zentrifuge (Rotor Ti 70) für 20 min bei 17.000 rpm zentrifugiert. Daraus resultierte das erste Lysesediment LP1 (first l ysate p ellet), welches [Seite 24↓]überwiegend Plasmamembranen enthält. Der zugehörige erste Lyseüberstand LS1 (first l ysate s upernatant) wurde im nächsten Schritt auf Ultrazentrifugenröhrchen verteilt und in der Beckmann-Zentrifuge (Rotor TLA 100.4) für 30 min bei 80.000 rpm zentrifugiert. Damit ergab sich ein Sediment ungereinigter synaptischer Vesikel bzw. das zweite Lysesediment LP2 (second l ysate p ellet). Der zugehörige Überstand LS2 entspricht dem Zytosol der lysierten Synaptosomen.

2.2.2 Aufbereitung von Zelllinien und primären Zellkulturen

Membranfraktionen wurden aus der CHO-Zelllinie ( c hinese h amster o varien cell line) CHOp38, einer mit Synaptophysin (38 kDa) permanent transfizierten CHO-Linie, der Phäochromozytom-Zelllinie PC12 aus adulten Ratten (Ahnert-Hilger et al., 1992) und von hippokampalen primären Neuronenkulturen gewonnen. Die CHOp38-Kulturen und PC12-Kulturen wurden je nach Versuchsansatz am Tag 3-5 nach Aussaat, die Hippokampuskulturen am Tag 19-23 nach Aussaat verarbeitet.

Das Kulturmedium wurde von den Petrischalen abgesaugt und die Zellen einmal mit kaltem sterilem PBS gespült. Anschliessend wurden die Zellen in je 1 ml sterilem PBS pro Schale (Durchmesser 40 mm bis 800 mm) vorsichtig mit Hilfe eines Zellschabers vom Boden abgelöst und entsprechend dem Ansatz in Zentrifugenröhrchen gesammelt. Anschliessend wurden die Zellen für 5 min bei 2000 rpm in der Beckmann-Zentrifuge zentrifugiert. Das resultierende Sediment mit den Zellen konnte für weitere Inkubations- bzw. Experimentieransätze verwendet werden.

Zur Herstellung von Membranen der Zellen wurde das Zellsediment in 200 µl PBS aufgenommen und mit 1.8 ml destilliertem Wasser (Verhältnis 1:9) versetzt. Zusätzlich wurden die Proteaseinhibitoren im Verhältnis 1:1000 und Hepes-NaOH im Verhältnis 1:100 gemäß der LP2-Aufbereitung von Rattengehirnen (siehe Kapitel 2.2.1) zugesetzt. Der Ansatz wurde im Dounce-Homogenisator (9 Hübe bei 900 rpm) homogenisiert und in der Tischzentrifuge für 10 min bei 14.000 rpm zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde gemäß dem Experimentierplan auf Ultrazentrifugenröhrchen verteilt und für 30 min bei 80.000 rpm zentrifugiert. Das entstandene Sediment enthält unter anderem vesikuläre Membranen. Es entspricht in seiner Aufarbeitung dem zweiten Lysesediment von Rattengehirnen.

2.2.3 Bestimmung der Proteinkonzentration

Die Proteinkonzentrationen wurden gemäß der BCA-Methode ( b io c inchoninic a cid) nach Smith et al. (1985) bestimmt. Die Berechnung der Endkonzentration erfolgte anhand einer [Seite 25↓]Eichkurve, die mit 5 bis 7 doppelt gemessenen BSA-Standardlösungen ( b ovine s erum a lbumine) aufgestellt wurde. Die verwendeten Rinderserum-Albumin-Konzentrationen lagen zwischen 20 µg/ml und 400 µg/ml. Das BSA-Reagenz wurde dabei in PBS gelöst und verdünnt.

Die zu untersuchenden Proben wurden in doppeltem Ansatz 1:50 und 1:100 mit Saccharoselösung (320 mM) verdünnt. In jeweils doppelter Auftragung wurden die BSA-Standardkonzentrationen und Proteinproben in die Schalen einer 96- Schalen-Mikrotiterplatte (je 20 µl pro Schale) pipettiert. Zu jeder Probe wurden 200 µl des BCA-Reagenz (Bicinchoninsäure-haltige BCA-Lösung A und Kupferionen-haltige BCA-Lösung B im Verhältnis 50:1) gegeben. Die erhaltenen Lösungen wurden für 30 min bei 60°C inkubiert und nach zwei Minuten Abkühlung konnte die Extinktion der Proben im Photometer gemessen werden. Im alkalischen Milieu werden die zweiwertigen Kupferionen durch anwesende Proteine zu einwertigen Kupferionen reduziert, die mit Bicinchoninsäure einen violetten, bei 550 nm absorbierenden Farbkomplex geben. Die Proteinkonzentrationen der Proben wurden mittels der Eichkurve bestimmt.

2.2.4 Extraktion von Membranproteinen

Zur Extraktion wurden die zu untersuchenden Proteine mit Detergenzien aus dem Membranverband herausgelöst. Als Detergenzien wurden Triton X-100, Chaps 1% und
n-Octyl-ß-D-glucopyranosid 2%, in Extraktionspuffer gelöst, verwendet. Die Probe wurde mit dem jeweiligen Detergens versetzt und die Probensedimente resuspendiert. Die Extraktionsansätze wurden für 1 Stunde bei 4°C geschüttelt.

Zur Abtrennung nicht extrahierbarer Anteile wurden die Proben anschliessend zentrifugiert. Dazu wurden P2-Proben in der Tischzentrifuge für 15 min bei 11.500 rpm, LP1-Proben in der Ultrazentrifuge für 20 min bei 17.000 rpm und LP2-Proben in der Ultrazentrifuge für 30 min bei 80.000 rpm zentrifugiert. Der resultierende Überstand entspricht dem Extrahierbaren E (Extrakt), das Sediment entspricht dem nicht Extrahierbaren NE (Non-Extrakt). Jeweils ein Teil des Extraktes und des Non-Extraktes wurde in Laemmli-Probenpuffer (Standardprozedur Laemmli et al., 1970) aufgenommen und mittels SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion analysiert oder der Proteinextrakt wurde weiterführend mit der Methode der Immunpräzipitation behandelt (siehe Kapitel 2.2.5) und dann als Immunpräzipitat (IP) mit zugehörigem Überstand (S/N) untersucht.


[Seite 26↓]

2.2.5  Immunpräzipitation von Proteinkomplexen

Zur Untersuchung von Proteininteraktionen und Komplexbildungen kann die Methode der Immunpräzipitation genutzt werden. Sie wurde von Edelmann et al. (1995) erstmals für die Immunpräzipitation des SNARE-Komplexes und des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes aus gereinigten Synaptosomenfraktionen adulter Rattengehirne beschrieben. Das Verfahren ist in gleicher Weise anwendbar auf Experimente mit Fraktionen von ungereinigten Synaptosomen (P2), ungereinigten synaptischen Vesikeln (LP2) und anderen membranhaltigen Proben.

Im ersten Schritt der Immunpräzipitation wurde das Proteinextrakt E hergestellt (siehe Kapitel 2.2.4). Im zweiten Schritt wurden jeweils 100 µl des Extraktes mit 1 µl Antikörper versetzt. Wir verwendeten dazu monoklonale Aszites-Antikörper gegen Synaptobrevin
(Cl 69.1), Synaptophysin (7.2), SNAP 25 (SNAP 25) und Syntaxin (HPC-1). Die Inkubation erfolgte über Nacht (16-18 Stunden) bei 4°C unter ständiger Rotation. Anschliessend wurden zu jeder Probe 20 µl Sepharose-G-Suspension (Sepharose G in Triton X-100 (1% v/v) im Verhältnis 3:1 gelöst) gegeben und erneut für 1 Sunde bei 4°C unter Rotation inkubiert. Die monoklonalen Antikörper binden an die Sepharose-G-Beads und werden damit aus der Lösung in die Immunpräzipitate (IP) gezogen, indem die Beads in der Tischzentrifuge für
1 min bei 2000 rpm in das Sediment zentrifugiert wurden. Der verbleibende Überstand entspricht dem nicht Präzipitierbaren (S/N). Das resultierende Sediment, welches dem Immunpräzipitat (IP) entspricht, wurde vor der weiteren Verarbeitung dreimal mit Triton-Extraktionspuffer (1% v/v) gewaschen. Immunpräzipitat (IP) und zugehöriger Überstand (S/N) wurden in Laemmli-Probenpuffer (s.o.) aufgenommen und mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, Westernblot und Immundetektion analysiert.

2.2.6 Chemische Quervernetzung mittels Disucciminidylsuberat

Synaptische Vesikelproteine wurden mit DSS (Disucciminidylsuberat) chemisch quervernetzt. Hierzu wurden nach Aufbereitung der synaptischen Vesikel das Vesikelsediment LP2 in PBS bzw. dem jeweiligen Inkubationsansatz resuspendiert und mit DSS versetzt. Dieser chemische Quervernetzer, in DMSO (Dimethylsulfoxid) gelöst, wurde mit einer Endkonzentration von 0,5 mM dem Reaktionsansatz hinzugefügt. Nach 45min Schütteln bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von Tris-HCL pH 7.4 (Endkonzentration 100 mM) und nochmaligem Schütteln bei Raumtemperatur für 30 min gestoppt. Danach konnten die Membranen durch Zentrifugieren in der Ultrazentrifuge für
30 min bei 80.000 rpm sedimentiert werden. Das Pellet wurde in nicht denaturierendem [Seite 27↓]Laemmli-Probenpuffer, d.h. Probenpuffer ohne Zugabe von DTT, resuspendiert und mittels SDS-PAGE und Immundetektion analysiert.

2.2.7 Gelelektrophorese

Die Proteinproben wurden in einer eindimensionalen Gelelektrophorese nach einem denaturierenden SDS-Polyacrylamidgel-System in Gegenwart von 0,1 % SDS (SDS-PAGE) aufgetrennt. Dazu wurden die Proteinproben in Laemmli-Probenpuffer aufgenommen und vor dem Auftragen auf das Gel mindestens eine Minute bei 95°C gekocht, um vorhandene endogene Proteasen zu inaktivieren. Dithiothreitol (DTT) wurde zur Lösung der Proteinproben in Laemmli verwendet, mit Ausnahme der Proben nach chemischer Quervernetzung, um Disulfidbrücken zu spalten. Da der verwendete Quervernetzer DSS benachbarte Membranproteine unter Bildung von Sulfidbindungen verknüpft, wurden diese Proben unter nicht denaturierenden Bedingungen in Laemmli-Probenpuffer ohne Zugabe von DTT gelöst. Das zugesetzte negativ geladene SDS wird durch die Proteine der Probe proportional zu deren Ladung gebunden, und bewirkt die Ausbildung einer identischen Ladungsdichte. Dadurch laufen die Proteine im Gel nicht in Abhängigkeit von ihrer Ladung, sondern von ihrem Gewicht. Proben der Experimente nach chemischer Quervernetzung und Extrakte bzw. Non-Extrakte wurden zusätzlich vor dem Auftragen auf das Gel fünfmal durch eine 23G-Kanüle gezogen.

Das Polyacrylamidgel (Tab.1) ist innerhalb des Elektophoresegerätes aufgebaut aus einem Trenngel (separating gel) und einem darüber gesetzten Sammelgel (stacking gel). Zur Polymerisierung von Trenn- und Sammelgel wurde Temed (Tetra-methyl-ethylendiamin) und 10 % Ammoniumpersulfat verwendet.

Tab. 1: Zusammensetzung der Gele

 

Sammelgel 3.75 %

Trenngel 12 %

   

Tris I (0.5 M Tris, 0.4 % SDS)

0.5 ml

 

Tris II (1.5 M Tris, 0.4 % SDS)

 

2.00 ml

Acrylamid Stocklösung

0.25 ml

3.20 ml

Bisacrylamid Stocklösung

0.1 ml

1.28 ml

H2O

1.15 ml

1.52 ml

Temed

2.6 µl

8 µl

Ammoniumpersulfat 10 %

20 µl

75 µl


[Seite 28↓]

Die Proteinproben wurden in definierten kleinen Volumina in die einzelnen Geltaschen pipettiert und die jeweiligen Proteine wurden anschliessend elektrophoretisch getrennt. Die Proteine durchlaufen dabei die Gelelektrophorese vertikal in Richtung Anode mit einer angelegten Spannung von 80 V für das Sammelgel und 150-180 V für das Trenngel. In jedem Gel läuft ein LMW-Markerstandard ( l ow m olecular w eight marker) mit, der in den unterschiedlichen Laufhöhen die Molekulargewichte 94 kDa, 67 kDa, 43 kDa, 30 kDa,
20 kDa und 14 kDa anzeigt. Für das Verfahren wurden 12%ige Gele mit 0.75mm-spacern verwendet. Elektrophoresekammern wurden mit SDS-Elektrophoresepuffer (running buffer) gefüllt.

2.2.8 Western Blot und Immundetektion

Die in der Gelelektrophorese aufgetrennten Proteinbanden wurden im Western-Blot-Verfahren auf eine Hybond-C-Nitrozellulosemembran übertragen. Dieser Proteintransfer lief in einer Halbfeuchtkammer für 20 min bei 0.3 A/Gel unter Verwendung von Semidry Blotpuffer ab.

Das Prinzip der Immundetektion basiert auf der Bindung eines spezifischen Erstantikörpers an die jeweilige Proteinbande auf dem Blotstreifen, die durch Bindung eines enzymgekoppelten Zweitantikörpers, der gegen den ersten gerichtet ist, sichtbar gemacht wird. Damit können spezifische Proteine in einer Probe nachgewiesen werden.

Die Hybondmembranen wurden nun in TS-Puffer gewaschen und dann in Ponceau-S-Lösung für 1-2 min gefärbt. Überschüssige Färbelösung wurde mit destilliertem Wasser abgewaschen. So konnten die verschiedenen Banden des LMW-Markers und der aufgetrennten Proben auf der Hybondmembran deutlich sichtbar gemacht werden. An den Markerbanden orientierend wurden Membranstreifen spezifischer Proteingrössen horizontal bzw. vertikal herausgeschnitten, die die zu untersuchenden Proteine trugen.

In der sich anschliessenden Immundetektion wurden die markierten Membranstreifen für
1 Stunde bei Raumtemperatur bzw. über Nacht bei 4°C in Blotto (blocking solution) inkubiert. Die Inkubation der abgesättigten Blotstreifen mit dem ersten Antikörper, in Antikörperlösung aufgenommen, erfolgte nun über Nacht (10-14 Stunden) bei 4°C. Die Inkubation mit dem zweiten Antikörper (Anti-Maus-AK), in Antikörperlösung aufgenommen, erfolgte bei Raumtemperatur für 1-2 Stunden. Nach jedem Inkubationsschritt wurden die einzelnen Blotstreifen viermal für 15 min separat gewaschen. Alle Inkubationsschritte erfolgten unter kontinuierlichem Schütteln.


[Seite 29↓]

Vor der ECL-Entwicklung wurden die Streifen für 5-60 min bei Raumtemperatur in TS-Puffer geschwenkt. Zur Aktivierung der Meerrettich-Peroxidase des zweiten Antikörpers wurden die Blotstreifen in ECL-Lösung für 1 min inkubiert und schnell in der Dunkelkammer einem Film exponiert. Dadurch entstand eine Schwarzfärbung des Filmes an Stellen antikörpermarkierter Proteinbanden. Anschliessend wurden die Proteinbanden der Blotstreifen in Chloronaphthollösung angefärbt und kurz in TS-Puffer gespült.

2.2.9 Behandlung von Hippokampuskulturen mit Toxinen

Zellkulturen hippokampaler Neuronen wurden am Tag 19-23 nach Aussaat im Brutschrank durch Zugabe von Toxinen zum Inkubationsmedium steril 8 und 9 Tage oder unsteril 15 min und 3 Stunden vergiftet bzw. mit Kalium stimuliert. In den Experimentieransätzen wurden die Toxine Tetanusneurotoxin (TeTx), Tetrodotoxin (TTx) und alpha-Latrotoxin (alpha-LTx) verwendet. Dabei wurde Tetanusneurotoxin einmal als leichte Kette des Tetanustoxins LC-TeTx im Vergleich zu der Wirkung des präaktivierten Toxins an permeabilisierten Fraktionen ungereinigter Synaptosomenäquivalente eingesetzt (siehe Kapitel 2.2.9.1). In einem weiteren Experiment wurden Hippokampuskulturen für 9 Tage mit 1 nM komplettem Tetanus-neurotoxin inkubiert und anschliessend aufbereitet und analysiert. Tetrodotoxin wurde an Hippokampuskulturen im Brutschrank zur 15-min-Stimulation mit einer Konzentration von 400 nM eingesetzt. Hippokampusneuronen wurden im Brutschrank zusätzlich mit 1 nM alpha-Latrotoxin vergleichend zur Wirkung von 25 mM Kalium stimuliert. Die Experimente zur Stimulation der neuronalen Transmission mit Kalium und alpha-Latrotoxin wurden im Unterschied zu den anderen Vergiftungsansätzen unter Verwendung des Probenpuffers Krebs-Ringer-Hepes durchgeführt.

Die in den Petrischalen vergifteten Zellen wurden nach dem Prinzip der Aufbereitung von Zellkulturen (siehe Kapitel 2.2.2) weiter behandelt. Das resultierende Zellsediment wurde in je 300-450 ml Triton X-100 1% resuspendiert und für 1 Stunde bei 4°C unter kräftigem Schütteln extrahiert. Zur Trennung extrahierbarer und nicht extrahierbarer Bestandteile wurden die Proben bei 2000 rpm für 2-5 min in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Das Extrakt wurde durch Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Synaptobrevin (Cl 69.1), Synaptophysin (7.2) oder Syntaxin (HPC-1) weiter analysiert (siehe Kapitel 2.2.5).

In einem weiteren Ansatz zur Vergiftung permeabilisierter Fraktionen von Synaptosomenäquivalenten von hippokampalen Zellen wurden die Zellkulturen zur Isolation der Fraktion des ungereinigten Synaptosomenäquivalentes (siehe Kapitel 2.2.2) aufbereitet und die jeweiligen Sedimente wurden in den verschiedenen Probenansätzen in 100 µl PBS aufgenommen.


[Seite 30↓]

Zum Permeabilisieren der Zellmembranen, z.B. bei Synaptosomen, wurden die Probenansätze mit 5 µl SLO + DTT (250 mM) versetzt und 10 min auf Eis geschüttelt. Anschliessend wurden die Proben für 10 min bei 14.000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert. Die resultierenden Sedimente enthielten die permeabilisierten Synaptosomenäquivalente und standen für die weitere Toxinbehandlung zur Verfügung. Der jeweilige Überstand wurde verworfen.

Die permeabilisierten Synaptosomenäquivalente wurden mit 100 ng/ml präaktiviertem Tetanusneurotoxin und mit 100 ng/ml der leichten Kette des Tetanusneurotoxin LC-TeTx im Vergleich für 30 min bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Zur Präaktivierung des Toxins wurden gleiche Mengen an Toxinlösung und 20 mM-Stammlösung DTT angesetzt und für
30 min bei 37°C geschüttelt. Nach abgeschlossener Vergiftung wurden die Proben für 10 min bei 14.000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugiert und das resultierende Sediment weiter verarbeitet. Die Proteinproben wurden zur Analyse der Proteininteraktionen einem Ansatz zur chemischen Quervernetzung unter Verwendung von DSS unterzogen (siehe Kapitel 2.2.6) und mittels SDS-PAGE (siehe 2.2.7), Westernblot und Immundetektion (siehe Kapitel 2.2.8) analysiert.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
02.06.2005