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3  Resultate

3.1 Synaptische Proteine und ihre Komplexe in subzellulären Fraktionen adulter und embryonaler Neuronen

3.1.1 Verteilung synaptischer Proteine in verschiedenen synaptischen Membranfraktionen aus adulten Rattengehirnen

Die Rohfraktionen von Synaptosomen und synaptischen Vesikeln aus Gehirnen adulter Ratten dienten als Ausgangsmaterial für eine Reihe von Experimenten in dieser Arbeit. Die einzelnen Fraktionen wurden entsprechend der Anleitung zur Aufbereitung ungereinigter Synaptosomen und ungereinigter synaptischer Vesikel (siehe Kapitel 2.2.1) gewonnen. Die jeweiligen subzellulären synaptischen Membranfraktionen wurden zunächst auf die membranspezifische Verteilung von Proteinen untersucht. Dabei sollte genauer analysiert werden, ob sich Unterschiede in der Proteinverteilung zwischen den synaptosomalen Membranen und den synaptischen Vesikelmembranen als deren Subfraktion nachweisen lassen.

Zur Überprüfung, in wieweit eine Anreicherung einzelner Proteine im Prozess der subzellulären Fraktionierung erreicht werden konnte, wurde die spezifische Verteilung der unterschiedlichen Proteine und ihrer Komplexe in den Membranfraktionen der verschiedenen Aufreinigungsschritte verglichen. Hierfür wurden die einzelnen Fraktionen im Verfahren der chemischen Quervernetzung analysiert (Abb. 2).

Der chemische Quervernetzer Disuccinimidylsuberat (DSS) verknüpft eng benachbarte Proteine in den Membranen. Indem ein Inkubationsansatz für chemisches Quervernetzen keine Extraktion mit Detergenzien erfährt und in nicht denaturierendem Laemmli-Probenpuffer aufgenommen wird, ergibt sich ein sehr genaues, den reellen Verhältnissen entsprechendes Bild der intramembranären Proteininteraktionen nach Immundetektion.

In einem längs geschnittenen Blotstreifen einer Probe nach chemischer Quervernetzung von adultem Rattengehirn ist nach Immundetektion mit Antikörpern gegen Synaptobrevin das Synaptobrevinmonomer als 18 kDa-Bande, das Synaptobrevindimer als Bande zwischen
30 kDa und 40 kDa (das kalkulierte Molekulargewicht des Synaptobrevindimer liegt bei 36 kDa) und der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex als Bande zwischen 40 und 60 kDa (das kalkulierte Molekulargewicht liegt bei 56 kDa) darzustellen. Wird der Blotstreifen mit Antikörpern gegen Synaptophysin inkubiert, so ist das Synaptophysinmonomer als 38 kDa-Bande, das Synaptophysindimer als Bande zwischen 67 und 94 kDa und ebenfalls der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex als Bande bei 56 kDa detektierbar.


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Abb. 2. Proteine der Synaptosomenfraktion P2 und der Fraktion der synaptischen Vesikel LP2 wurden chemisch quervernetzt. Die Membranen wurden sedimentiert und mit SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion mit Antikörpern gegen Synaptophysin und gegen Synaptobrevin im Vergleich analysiert. Es wurden gleiche Mengen an Gesamtprotein aufgetragen. Die Menge der untersuchten vesikulären Proteine stieg im Verhältnis zur Gesamtproteinmenge während der Membranaufbereitung deutlich an. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex lässt sich durch Immundetektion mit Synaptobrevinantikörpern besser darstellen als mit Synaptophysinantikörpern.

Dabei ist zu beachten, dass Synaptophysin als Dimer nur nach Darstellung durch DSS-vermittelte chemische Quervernetzung nachweisbar ist. Der Komplex ist mit dem Synaptophysinantikörper jedoch schlechter nachzuweisen als mit dem Synaptobrevinantikörper. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass die Bindungsstelle des Synaptophysinantikörpers nach Komplexbildung zwischen Synaptophysin und Synaptobrevin in chemisch quervernetzten Proben schlechter zugänglich ist.

Durch die Methode der chemischen Quervernetzung konnte in Abb. 2 eine Anreicherung der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin als auch eine Zunahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes mit zunehmender Aufreinigung der zellulären Membranen dargestellt werden. Damit stieg im Prozess der subzellulären Fraktionierung synaptischer Vesikel der relative Membrananteil der Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin im Verhältnis zur Gesamtproteinmenge deutlich an.

Die oben beschriebene Methode für die Isolation von Synaptosomen und synaptischen Vesikeln aus adulten Rattengehirnen (Huttner et al., 1995) konnte in gleicher Weise für die [Seite 33↓]Aufbereitung embryonaler Rattengehirne verwendet werden und führte zu entsprechenden Ergebnissen (siehe auch Abb. 3, 4, 13).

3.1.2 Vergleich von synaptischen Membranen adulter und embryonaler Rattengehirne

Durch das Verfahren der Immunpräzipitation (siehe Kapitel 2.2.5) mit Antikörpern gegen Syntaxin oder SNAP 25 kann die Bildung des SNARE-Komplexes auf der Plasmamembran und der synaptischen Vesikelmembran untersucht werden. Für die Immunpräzipitation wurden die einzelnen Proteinfraktionen mit dem Detergens Triton X-100 extrahiert und anschliessend mit den jeweiligen Antikörpern immunpräzipitiert (siehe Kapitel 3.2.1.2).

Die Immunpräzipitation wurde mit monoklonalen Antikörpern gegen Syntaxin und SNAP 25 durchgeführt. Die zugesetzten Antikörper binden an ihre Partnermoleküle im SNARE-Komplex, welche in der Proteinprobe enthalten sind. Werden in einem anschliessenden Schritt alle an Antikörper gebundenen Syntaxin-Moleküle bzw. SNAP25-Moleküle durch Sepharose-G-Beads präzipitiert, kommen auch die jeweils im Komplex gebundenen SNARE-Partner mit in das Immunpräzipitat. Somit bedeutet die Detektion von Synaptobrevin und SNAP 25 im Immunpräzipitat (IP) nach Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Syntaxin (HPC-1) also den Nachweis des SNARE-Komplexes. Das Entsprechende gilt für die Präzipitation mit Antikörpern gegen SNAP 25 (SNAP 25). Nicht präzipitierte Proteine befinden sich im Überstand (S/N).

Die Immunpräzipitation bietet nur eine qualitative Aussage und erlaubt keine Bestimmung absoluter Proteinmengen, da Antikörper nicht immer vollständig präzipitieren. Aus den Ergebnissen lassen sich hauptsächlich Verhältnisangaben über die Bildung von Proteinkomplexen im Vergleich zum Nachweis der einzelnen Proteine in der Probe machen.

Zuerst wurde untersucht, in welchem Ausmaß der exozytotische SNARE-Komplex bereits in embryonalem Rattengehirn ausgebildet ist und sich in den einzelnen Proteinfraktionen der synaptischen Vesikel im Vergleich zum adulten Gehirn nachweisen lässt. Hierzu wurden die einzelnen zellulären Subfraktionen, ausgehend von Synaptosomen (P2) bis zur Fraktion synaptischer Vesikel (LP2) im Vergleich zwischen adulten und embryonalen Rattengehirnproben durch das Verfahren der Immunpräzipitation analysiert (Abb. 3).


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Abb. 3. Synaptische Vesikelfraktionen (LP2) wurden schrittweise hergestellt aus homogenisiertem Gesamtgehirn adulter (Abb. 3.1) und embryonaler Ratten (E20) (Abb. 3.2) und mit Antikörpern gegen Syntaxin immunpräzipitiert. Die einzelnen subzellulären Fraktionen (P2, LP1 und LP2) wurden im Vergleich untersucht für die aufgeführten synaptischen Proteine mittels SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion. Es wurden jeweils gleiche Mengen an Protein aufgetragen. Zu beachten ist die deutliche Abnahme der Komplexformation zwischen Synaptobrevin und Syntaxin mit zunehmender Isolation der synaptischen Vesikelmembranen in adultem als auch in embryonalem Rattengehirn. In embryonalen Vesikelfraktionen konnte der Komplex aus Syntaxin und Synaptobrevin nicht mehr nachgewiesen werden. Die Gesamtproteinmenge in embryonalem Rattengehirngewebe war wesentlich geringer als in adultem Gewebe.

Mit zunehmender Aufreinigung der synaptischen Vesikelmembranen nahm der Anteil an den durch Syntaxinantikörper immunpräzipitierbaren SNARE-Bindungspartnern Syntaxin und Synaptobrevin deutlich ab. Es konnte weiterhin beobachtet werden, dass das SNARE-Protein SNAP 25 auch in großer Menge in der Fraktion der ungereinigten synaptischen Vesikel (LP2) vorhanden ist (Becher et al., 1999). Dies ist zum einen auf eine teilweise Kontamination der Proteinfraktionen zurückzuführen, wird aber auch durch die Verankerung von SNAP 25 und Syntaxin als Bestandteilen des SNARE-Komplexes in der Membran der synaptischen Vesikel erklärt (Walch-Solimena et al., 1995, Otto et al., 1997). Die SNARE-Proteine SNAP 25 und Syntaxin reakkumulieren nach abgeschlossenem Exozytose-Endozytose-Zyklus mit einem Hauptanteil in der Plasmamembran und zu geringen Anteilen in adultem Gewebe auch auf der synaptischen Vesikelmembran, um für eine erneute Bildung des SNARE-Komplexes in der Plasmamembran wieder aufbereitet zu werden.

In den embryonalen Gehirnproben war die Gesamtproteinmenge im Vergleich zu den adulten Proben deutlich vermindert, jedoch konnten die Bindungspartner des SNARE-Komplexes mit geringer Menge auch in der Fraktion der embryonalen Synaptosomen und im LP1 nachgewiesen werden. In der Fraktion der ungereinigten synaptischen Vesikel LP2 war im gleichen Ansatz kein Bindungskomplex zwischen Syntaxin und Synaptobrevin mehr nachweisbar.


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Die Menge synaptischer Proteine im Gesamtgehirn steigt während der Entwicklung deutlich an, was hauptsächlich auf die große Anzahl von post partum gebildeten Synapsen zurückzuführen ist. Nach Untersuchung des unterschiedlichen Proteingehaltes in embryonalen und adulten Fraktionen aus Rattengehirngewebe ergab sich die Frage nach genaueren Unterschieden in den Interaktionen der jeweiligen synaptischen Proteine und ihrer Komplexbildungseigenschaften.

Zur weiteren Untersuchung der SNARE-Proteine wurden Proteinkomplexe aus adulten und embryonalen (E20) ungereinigten Synaptosomenextrakten immunpräzipitiert und im Vergleich analysiert. (Abb. 4). Dabei soll eine Gegenüberstellung des SNARE-Komplexes in den beiden neuronalen Entwicklungsstufen nach Immunpräzipitation mit zwei verschiedenen Antikörpern erzielt werden.

In der Kontrolle der Immunpräzipitation (ohne ersten Antikörper) sind keine SNARE-Proteine im Immunpräzipitat (IP) nachweisbar, was die Spezifität des Verfahrens beweist. Auffällig ist erneut (siehe auch Abb. 3), dass die Gesamtproteinmenge der embryonalen Proteinfraktionen deutlich geringer ist im Vergleich zu den adulten Fraktionen. Der SNARE-Komplex stellt sich gut in den Immunpräzipitaten dar, in gleicher Weise durch Präzipitation mit den verschiedenen spezifischen Antikörpern. Hierbei sind keine Unterschiede zwischen embryonalen und adulten Proben zu erkennen.

Wird im ersten Schritt der Immunpräzipitation kein proteinspezifischer Antikörper hinzugegeben, können die Proteine der Probe nicht durch Sepharose G sedimentiert werden und sind nur im Überstand der Kontrolle nachweisbar. Dies beweist die hohe Spezifität des Verfahrens der Immunpräzipitation mit den verwendeten monoklonalen Antikörpern.

Wie erwartet konnten die SNARE-Komplex-Bindungspartner deutlich im Immunpräzipitat (IP) der Synaptosomenfraktion adulter Ratten nachgewiesen werden, durch Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Syntaxin und auch gegen SNAP 25, was den Nachweis des SNARE-Komplexes bedeutet.

Nach der Immunpräzipitation embryonaler Proteinproben wurde eine deutlich geringere Menge an Gesamtproteinen detektiert, die sich aber in ihrer SNARE-Komplexbildung nicht von den adulten Proteinproben unterschieden. Auch hier ließen sich Syntaxin, SNAP 25 und Synaptobrevin als Komplexformation nachweisen. Während der vesikuläre Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex nur in adultem Rattengehirngewebe gebildet wird und nicht in embryonalem Rattengehirn vorhanden ist (Becher et al., 1999), kann der SNARE-Komplex


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Abb. 4. Adulte (Abb. 4.1) und embryonale (Abb. 4.2) Synaptosomenfraktionen aus Rattengehirngewebe wurden nach Triton X-100-Extraktion mit Antikörpern gegen Syntaxin und SNAP 25 immunpräzipitiert und mittels SDS-Gelelektrophorese, Westernblot und Immundetektion dargestellt.

also bereits vor Abschluss der embryonalen Entwicklung in den synaptosomalen Membranfraktionen nachgewiesen werden. Er ist jedoch in embryonalem Gewebe noch nicht in der Membran der synaptischen Vesikel detektierbar (siehe Abb. 3).

3.1.3 Untersuchungen zur Funktion synaptischer Membranproteine nach Blockierung oder Stimulation synaptischer Transmission

Nach Analyse der synaptischen Proteine und ihrer Komplexbildung innerhalb der Membranen wurden nun weitere Untersuchungen zu deren funktionellen Wechselwirkungen durchgeführt. Dabei sollte genauer untersucht werden, inwieweit der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex auch relevant für kurzfristige plastische Veränderungen in den Neuronen ist und welchen Einfluss eine Blockade bzw. Stimulation der synaptischen Transmission auf den Komplex hat.

3.1.3.1 Blockade der synaptischen Transmission

In hippokampalen Zellkulturen wurde eine Blockade der synaptischen Transmission durch zwei verschieden wirkende Toxine erreicht. Das clostridiale Neurotoxin Tetanustoxin (TeTx) spaltet spezifisch Synaptobrevin innerhalb der Membran, wodurch die Bildung des SNARE-Komplexes und damit die Exozytose blockiert wird. Tetrodotoxin (TTx), das Gift des Kugel-Fisches, blockiert selektiv den spannungsabhängigen Natriumkanal in der Plasmamembran


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Abb. 5. Ungereinigte Synaptosomenäquivalente adulter Ratten wurden durch Zugabe von SLO permeabilisiert und als Sedimente mit 100 ng/ml präaktiviertem TeTx bzw. mit 100 ng/ml LC-TeTx für 30 min inkubiert. Anschliessend wurden die Proben chemisch quervernetzt und analysiert.

neuronaler Zellen und verhindert damit die Weiterleitung von Impulsen entlang des Axons und an erregbaren Membranen von Nervenfasern.

Die Wirkung der Tetanusneurotoxin auf die synaptischen Vesikelproteine wurde durch chemische Quervernetzung der membranständigen Proteine nach kurzzeitiger Vergiftung
(30 min) analysiert (Abb. 5). Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex war nach Einwirkung von Tetanusneurotoxin nicht mehr nachweisbar. Die Menge an Synaptobrevindimeren nahm ebenfalls durch die Toxineinwirkung deutlich ab. Zu beachten ist die kaum veränderte Menge an detektierbaren singulären Synaptobrevinmolekülen.

Dafür wurden im Vergleich permeabilisierte Synaptosomen mit präaktiviertem Tetanusneurotoxin und der leichten Kette des Tetanusneurotoxin LC-TeTx vergiftet. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex kann hier nach Spaltung von Synaptobrevin durch chemische Quervernetzung nicht mehr nachgewiesen werden. Zusätzlich ist die Menge an detektierbaren Synaptobrevindimeren nach Vergiftung deutlich vermindert, während im Vergleich zur Kontrolle die Synaptobrevinmonomere nur leicht vermindert waren.


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Abb. 6. Hippokampale Zellkulturen wurden nach Zugabe von 1 nM Tetanusneurotoxin zum Kulturmedium für
9 Tage im Brutschrank inkubiert. Anschliessend wurden die Zellkulturen aufbereitet und mit Antikörpern gegen Syntaxin (Abb. 6.1) und Synaptophysin (Abb. 6.2) immunpräzipitiert und dargestellt. Durch Immunpräzipitation mit Syntaxinantikörpern war in der Kontrolle der SNARE-Komplex gut darstellbar. Nach Vergiftung mit Tetanusneurotoxin verschwand Synaptobrevin in den hippokampalen Zellen und konnte weder im Immunpräzipitat (IP) noch im Überstand (S/N) nachgewiesen werden (Abb. 6.1). Nach Vergiftung verschwindet auch der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex und ist durch Immunpräzipitation mit Synaptophysin-antikörpern nur in der Kontrolle nachweisbar.

In Hippokampuskulturen kann nach 9 Tagen Vergiftung mit Tetanustoxin durch Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Syntaxin kein Synaptobrevin im Immunpräzipitat (IP) und im zugehörigen Überstand (S/N) mehr detektiert werden ( Abb. 6.1 ). Das nach Vergiftung gespaltene Synaptobrevin liegt also auch nicht mehr gebunden an seine SNARE- Partner in der Membran vor.

Die Spaltung von Synaptobrevin scheint jedoch keinen erkennbaren Einfluss auf die Komplexierung von Syntaxin und SNAP 25 zu haben, da sich für diese Proteine keine Veränderungen in der Detektierbarkeit ergaben.

Durch Immunpräzipitation mit Synaptophysinantikörpern kann nach 9-Tage-Vergiftung mit Tetanustoxin ebenso der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex in der Probe nicht mehr


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Abb. 7. Hippokampale Zellkulturen wurden unter Zugabe von 400 nM Tetrodotoxin zum Kulturmedium für
15 min im Brutschrank inkubiert und anschliessend mit Synaptobrevinantikörpern immunpräzipitiert. Die Proben wurden sedimentiert und mittels SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion analysiert. Nach der Behandlung blieb der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex unverändert nachweisbar. Es ergaben sich keine auffälligen Veränderungen der detektierten Proteine.

nachgewiesen werden (Abb. 6.2). Dieses Ergebnis korreliert mit den Ergebnissen nach chemischer Quervernetzung der synaptischen Vesikelproteine in Synaptosomen (siehe
Abb. 5
).

Durch die Vergiftung nimmt die Menge des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes auf den vesikulären Membranen ab. Wahrscheinlich wird das Synaptobrevin, welches im Komplex mit Synaptophysin vorliegt, und nicht das freie Synaptobrevin bevorzugt durch Tetanustoxin gespalten wird.

Hippokampale Zellkulturen wurden für 15 min im Brutschrank mit 400 nM Tetrodotoxin vergiftet und anschliessend mittels Immunpräzipitation mit Synaptobrevinantikörpern analysiert. Nach dieser kurzzeitigen Vergiftung der Kulturen konnten keine Auswirkungen auf den Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex nachgewiesen werden. Ebenso sind keine Veränderungen des Binärkomplexes zwischen Synaptobrevin und SNAP 25 zu erkennen (Abb.7).

3.1.3.2 Stimulation der synaptischen Transmission

Es wurde nun weiter untersucht, ob eine kurzfristige Stimulation der Exozytose zu einer transienten Veränderung der Interaktion der beiden Proteine führte. Hierzu wurden hippokampale Zellkulturen mit alpha-Latrotoxin (alpha-LTx) im Vergleich zu Kalium behandelt. Das Gift der Schwarzen Witwe, alpha-Latrotoxin, führt an der präsynaptischen


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Abb. 8. Hippokampale Zellkulturen wurden nach Zugabe von 1 nM alpha-Latrotoxin oder 25 mM Kalium in Krebs-Ringer-Hepes-Puffer für 3 Stunden im Brutschrank inkubiert und anschliessend aufbereitet. Die Proben wurden mit Antikörpern gegen Synaptobrevin immunpräzipitiert, sedimentiert und zur Darstellung gebracht. Die Untersuchung ergab bei mehrmaliger Wiederholung immer das gleiche Ergebnis. Nach 3 Stunden Inkubation mit alpha-Latrotoxin konnte kein Synaptophysin mehr im Immunpräzipitat (IP) detektiert werden, obwohl das Protein in der Probe im Überstand (S/N) vorhanden war. Durch die Wirkung von alpha-Latrotoxin wurde der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes in den Zellkulturen aufgebraucht. Die Bindung von SNAP 25 an Synaptobrevin schien durch die Wirkung von alpha-Latrotoxin nicht beeinflusst. Nach Stimulation mit Kalium ergaben sich keine sichtbaren Veränderungen der Proteininteraktionen in den Proben.

Nervenendigung zu einer massiven Transmitterfreisetzung (Frontali et al., 1976), wobei durch Bindung an Rezeptoren auf der präsynaptischen Plasmamembran nichtselektive Ionenströme ausgelöst werden (Wanke et al.,1986, Hurlbut et al.,1994). Zusätzlich unterbricht alpha-Latrotoxin das Recycling der synaptischen Vesikel.

Im Gegensatz zu alpha-Latrotoxin verursacht Kalium auf andere Weise eine synaptische Stimulation. Die normale extrazelluläre Kaliumkonzentration beträgt 4 mmol/l und steht einer intrazellulären Kaliumkonzentration von 155 mmol/l gegenüber. Die Zufuhr von extra-zellulärem Kalium bewirkt einen Zusammenbruch des Konzentrationsgradienten an der Plasmamembran und führt zu einer beträchtlichen Depolarisation der Nervenzelle. Diese Depolarisation führt zur Öffnung spannungsabhängiger Kalziumkanäle in der Membran und leitet damit den Prozess der Membranfusion ein.

Hippokampusneuronen wurden für 3 Stunden im Brutschrank mit 1 nM alpha-Latrotoxin im Vergleich zur Wirkung von 25 mM Kalium kurzzeitig stimuliert. Nach Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Synaptobrevin war der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex in den durch alpha-Latrotoxin stimulierten Proben nicht mehr [Seite 41↓]nachweisbar (Abb. 8.1), wobei die beiden Vesikelproteine im Überstand gut detektierbar waren (Abb. 8.2). Bei exzessiv gesteigerter synaptischer Transmission fusioniert wahrscheinlich der größte Anteil des im Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex bereitgestellten Synaptobrevins mit seinen SNARE-Partnern in der Plasmamembran. Da nun der überwiegende Teil von Synaptobrevin gebunden im SNARE-Komplex vorliegt, sind die Synaptophysinmoleküle in der Vesikelmembran als nicht komplexierte freie Proteine in Monomer- und Dimerform nachweisbar.

In der hier durchgeführten Immunpräzipitation konnten keine eindeutigen Auswirkungen auf das Verhalten von SNAP 25 gefunden werden. In weiterführenden Experimenten zur Kurzzeitstimulation mit alpha-Latrotoxin (nicht abgebildet) konnte die zu erwartende Zunahme des SNARE-Komplexes in der Synapse auch nachgewiesen werden.

Die 3-Stunden-Stimulation mit 25 mM Kalium wurde im gleichen Experiment durch Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Synaptobrevin untersucht. Die durch extrazelluläres Kalium verursachte Depolarisation der Zellen führte zu keinen erkennbaren Veränderungen in den Proteininteraktionen (Abb. 8). Wahrscheinlich gelangt nach Kaliumstimulation, anders als nach alpha-Latrotoxin-Stimulation, nur ein kleinerer Teil der synaptischen Vesikel zur Exozytose.

3.2 Immunpräzipitation von synaptischen Membranproteinen nach Extraktion mit verschiedenen Detergenzien

Biochemische Analysen zur Komplexbildung von Membranproteinen können unter Verwendung der Methode der Extraktion durchgeführt werden. Dabei wird die Löslichkeit der verschiedenen Membranproteine in nicht denaturierenden Detergenzien analysiert. Durch Vergleich der Extraktion mit ionischen und nicht ionischen Detergenzien können Aussagen über das Löslichkeitsverhalten von Proteinen in unterschiedlichen spezifischen Membransubdomänen getroffen werden, besonders in Bezug auf ihre Assoziation mit detergensresistenten Lipid Rafts (Huttner et al., 2000, Röper et al., 2000).

Im Folgenden wurde untersucht, in welchem Maß die Extrahierbarkeit der in dieser Arbeit untersuchten synaptischen Proteine von der Verwendung ionischer und nicht ionischer Detergenzien abhängig ist.

Die Extraktion der Proteinproben vor Immunpräzipitation ist notwendig, um die in den zellulären Membranen verankerten Proteine herauszulösen und der freien Bindung an zugeführte Antikörper zugänglich zu machen. Da hierbei das membranäre Milieu verändert wird, kann kein so genaues Bild von der ursprünglichen Anordnung der Proteine in den [Seite 42↓]verschiedenen Membranen gegeben werden, wie es nach chemischer Quervernetzung möglich ist.

Nach Extraktion der Membranen mit anschliessender Zentrifugation ergeben sich zwei Fraktionen, (i) das Extrakt (E), welches die im Detergens gelösten Proteine enthält, und
(ii) das Non-Extrakt (NE), in welchem sich die restlichen Bestandteile der Probe befinden. Zur anschliessenden Immunpräzipitation wurde ausschliesslich das Extrakt verwendet. Im Immunpräzipitat (IP) finden sich nur Proteine, die im Detergens extrahierbar sind und durch die zugesetzten Antikörper gebunden wurden. Die Antikörper präzipitieren jedoch nicht vollständig. Im zugehörigen Überstand (S/N) befinden sich daher neben extrahierbaren aber nicht immunpräzipitierbaren Proteinen auch Proteine, die immunpräzipitierbar sind, aber nicht durch Antikörper gebunden wurden.

Zur Untersuchung der Extrahierbarkeit von Synaptophysin, als synaptischem Vesikelprotein, und SNAP 25 bzw. Synaptobrevin, als Plasmamembranproteinen, wurden ungereinigte synaptische Vesikelmembranen adulter Rattengehirne mit dem zwitterionischen Detergens Chaps und im Vergleich mit den zwei nicht ionischen Detergenzien Triton X-100 und
n-Octyl-ß-D-glucopyranosid behandelt, die sich deutlich in ihrer kritischen Mizellenkonzentration (CMC) voneinander unterscheiden (Tab. 2).

Tab. 2. Detergenzien und ihre Eigenschaften

 

Triton X-100 1%

Chaps 1%

n-Octyl-ß-D-glucopyranosid 2%

CMC

200-900 µM

6-10 mM

20-25 mM

Ionität

nicht ionisch

zwitterionisch

nicht ionisch

Molekulargewicht

650.0

614.9

292.4

HLB (hydrophile-lipophile Balance)

13.5

 

12.6

eingesetzte Molarität

15.4 mM

16 mM

68 mM


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Abb. 9. Synaptische Vesikelfraktionen adulter Rattengehirne wurden mit den jeweiligen Extraktionspuffern für eine Stunde auf Eis extrahiert. Das resultierende Extrakt (E) und das Non-Extrakt (NE) wurden im Vergleich dargestellt. Der Extrakt wurde in einem zweiten Ansatz mit Synaptobrevinantikörpern präzipitiert und dann als Immunpräzipitat (IP) mit zugehörigem Überstand (S/N) analysiert und dargestellt. Nach der Detergenzienbehandlung konnten die synaptischen Proteine Synaptophysin, Synaptobrevin und
SNAP 25 jeweils im Extrakt und im Non-Extrakt zu gleichen Verhältnissen detektiert werden. Durch die Verwendung der unterschiedlichen Detergenzien ergaben sich keine Veränderungen im Löslichkeitsverhalten der Proteine. In der anschliessenden Immunpräzipitation konnten für alle drei verschiedenen Detergenzien der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex als auch Synaptobrevin im Komplex mit SNAP 25 nachgewiesen werden. Die Komplexbildung der Proteine blieb bei Verwendung der unterschiedlichen Detergenzien unbeeinflusst.

Durch die Behandlung der synaptischen Vesikelmembranen mit unterschiedlichen Detergenzien ergaben sich keine sichtbaren Unterschiede in der Extrahierbarkeit der synaptischen Proteine (Abb. 9.1). Sowohl Synaptophysin, als auch SNAP 25 und Synaptobrevin konnten im Extrakt und im Non-Extrakt deutlich detektiert werden. Dabei konnte durch Verwendung der Detergenzien Chaps und n-Octyl-ß-D-glucopyranosid keine Veränderung des Löslichkeitsverhaltens der Proteine im Vergleich zu Triton X-100 gefunden werden.


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In der anschliessenden Immunpräzipitation konnten für alle drei verschiedenen Detergenzien der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex und SNAP 25 mit Synaptobrevin im Komplex auf der synaptischen Vesikelmembran nachgewiesen werden. Die Komplexbildung der Proteine blieb durch die Verwendung der unterschiedlichen Detergenzien unbeeinflusst
(Abb. 9.2 ).

Basierend auf der Feststellung, dass sich keine Unterschiede in der Extrahierbarkeit und der Komplexbildung der untersuchten Proteine durch Verwendung der verschiedenen Detergenzien ergaben, wurde für die weiteren Experimente dieser Arbeit Triton X-100 in 1%iger Lösung als Detergens verwendet.

3.3 Einfluss des Cholesterolgehaltes synaptischer Membranen auf Extrahierbarkeit und Interaktion synaptischer Proteine

Ausgehend von der Eigenschaft Synaptophysins als spezifisch cholesterolbindendes Protein in der Membran synaptischer Vesikel wurde nun genauer untersucht, welche Auswirkungen die Verminderung des membranären Cholesterolgehaltes auf die Eigenschaften von Synaptophysin und die Ausbildung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes sowie auf die anderen synaptischen Proteine hat.

3.3.1 Extraktion synaptischer Proteine aus Zelllinien nach Cholesterolverminderung

Der Cholesterolgehalt in den nicht neuronalen und neuroendokrinenZellkulturen wurde durch Filipin und Methyl-ß-cyclodextrin (ß-MCD) vermindert, welche auf unterschiedliche Art den Cholesterolgehalt von Zellen senken. (i) Filipin, ein cholesterolbindendes Fluorochrom, komplexiert mit membranärem Cholesterol zu multimerischen globulären Depots innerhalb der Membran. Dabei wird der physikalische Zustand der Membran nur zu einem geringen Maße beeinflusst und die Membranfluidität weitgehend erhalten (Gimpl et al., 1997).
(ii) Methyl-ß-cyclodextrin (ß-MCD) ist dagegen ein streng oberflächenwirksames Agens, welches weder an die Membran bindet noch in die Membran eintritt. Es vermindert sehr potent und selektiv membranäres Cholesterol, vor Proteinen und anderen Lipiden. Dabei wird Cholesterol in eine zentrale, nicht polare Höhle innerhalb der Membran eingeschlossen (Pang et al., 1999). Methyl-ß-cyclodextrin bewirkt zusätzlich die selektive Freisetzung von membranassoziierten Proteinen in unterschiedlicher Weise zu dem nicht ionischen Detergens Triton X-100. Die Behandlung mit Methyl-ß-cyclodextrin kann zu einer Veränderung der zellulären Morphologie führen ohne dabei die Zelle zu lysieren (Ilangumaran et al., 1998).

Die Auswirkungen der spezifischen cholesterolvermindernden Substanzen auf die synaptischen Proteine wurden in Neuronen und verschiedenen Zellreihen untersucht.
[Seite 45↓]Die Zellreihe CHOp38 diente als Modellsystem der Analyse von Synaptophysin als integralem Membranprotein. Dabei kann das Verhalten von Synaptophysin unabhängig von den anderen in dieser Arbeit relevanten Vesikelproteinen untersucht werden, da diese Proteine nicht in der CHOp38-Zellreihe exprimiert werden. Die neuroendokrine Zellreihe PC12 ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung von neurosekretorischen Vesikeln und ermöglicht durch die gleichzeitige Exprimierung verschiedener Membranproteine Untersuchungen weiterer Vesikelproteine innerhalb der subzellulären Membranfraktionen. An diesem Zellmodell konnte die Auswirkung der Filipin-vermittelten Cholesterolverminderung auf die Extrahierbarkeit der Proteine des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes und des SNARE-Komplexes untersucht werden.

3.3.1.1 Inkubation mit Filipin

Es sollte nun genauer analysiert werden, wie die Extrahierbarkeit von Synaptophysin durch die Behandlung mit Filipin beeinflusst werden kann.

CHOp38-Zellkulturen und PC12- Zellkulturen wurden zuerst bis zum LP2-Äquivalent aufbereitet und dann mit Filipinkonzentrationen von 4 µg/ml bis 100 µg/ml inkubiert. Dazu wurde das Pellet in 50 µl bzw. 100 µl der entsprechenden Konzentration an Filipin in PBS aufgenommen und fünfmal durch eine 23G-Nadel gezogen. Die Inkubation verlief im Wasserbad bei 37°C für 1 Stunde. Anschliessend wurde den Ansätzen direkt 500 µl bzw.
1000 µl Extraktionspuffer-Triton X-100 zugesetzt und für 1 Stunde unter Schütteln auf Eis extrahiert.

Die Behandlung von CHOp38-Zellen mit einer hohen Filipinkonzentration von 100 µg/ml führte zu deutlich erhöhten Mengen an nicht extrahierbarem Synaptophysin im Vergleich zur Kontrolle. Das gleiche Ergebnis war noch bei 80 µg/ml Filipin erkennbar (Abb. nicht gezeigt). Die Detergenslöslichkeit von Synaptophysin nahm mit abnehmender Filipinkonzentration wieder zu, so dass nach Inkubation mit 20 µg/ml und 4 µg/ml Filipin nur noch geringe Mengen an nicht extrahierbarem Synaptophysin im Non-Extrakt nachweisbar waren. Der extrahierbare Anteil von Synaptophysin stellte sich jeweils im Extrakt E dar (Abb. 10).

Nach Inkubation von PC12-Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an Filipin war eine ähnliche Veränderung der Detergenslöslichkeit von Synaptophysin wie bei den
CHOp38-Zellen zu sehen. Durch Inkubation mit 100 µg/ml Filipin stieg der Anteil an nicht extrahierbarem Synaptophysin deutlich an. Nach Inkubation mit 20 µg/ml und 4 µg/ml Filipin waren im Vergleich zur Kontrolle im Non-Extrakt NE noch geringe Spuren an Synaptophysin nachweisbar (Abb. 10).


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Abb. 10. Proteinproben des aufbereiteten LP2-Äquivalentes von CHOp38-Zellen und PC12-Zellen wurden mit Filipinkonzentrationen von 100 µg/ml, 20 µg/ml und 4 µg/ml für 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschliessend mit Triton X-100 extrahiert. Die Extrahierbarkeit von Synaptophysin war nach Inkubation mit 100 µg/ml Filipin deutlich vermindert, so dass große Mengenanteile von Synaptophysin im Non-Extrakt (NE) detektierbar waren. Mit abnehmender Filipinkonzentration nahm die Detergenslöslichkeit wieder zu. Zu beachten ist die fast vollständige Löslichkeit von Synaptophysin in Triton X-100 in der Kontrollprobe. Im Gegensatz dazu ist keine Veränderung des Löslichkeitsverhaltens der SNARE-Proteine durch Filipininkubation zu erkennen.

Für die synaptischen Proteine Syntaxin, SNAP 25 und Synaptobrevin ergab sich nach Filipininkubation und anschliessender Extraktion mit Triton X-100 aus vesikulären Membranen der PC12-Zellen keine eindeutige Veränderung der Detergenslöslichkeit im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 10).

Bei der höchsten Filipinkonzentration von 100 µg/ml Filipin scheint eine leichte Zunahme der SNARE-Proteine im Non-Extrakt erkennbar, wobei die überwiegend Plasmamembran-ständigen SNARE-Proteine Syntaxin und SNAP 25 eine stärkere Veränderung ihrer Löslichkeit aufwiesen als das überwiegend Vesikel-ständige Synaptobrevin. Für die geringeren Konzentrationen an Filipin sind keine deutlichen Veränderungen in der Extrahierbarkeit der SNARE-Proteine mehr zu sehen.

Nach Filipininkubation der aufbereiteten vesikulären Membranen von CHOp38-Zelllinien und PC12-Zelllinien sank also der Anteil an in Triton X-100 extrahierbarem Synaptophysin deutlich. Synaptophysin wurde damit im Detergens unlöslicher.


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3.3.1.2  Inkubation mit Methyl-ß-cyclodextrin

Experimente mit Methyl-ß-cyclodextrin zur Verminderung des Cholesterolgehaltes zellulärer Membranen wurden an dem LP2-Äquivalent von CHOp38-Zellkulturen und PC12-Zellkulturen durchgeführt und weiterführend auch an den Fraktionen ungereinigter synaptischer Vesikel LP2 embryonaler und adulter Wistar Ratten (siehe Kapitel 3.3.2.).

Aufbereitetes LP2 wurde in 300 µl PBS resuspendiert und mit den entsprechenden Konzentration an Methyl-ß-cyclodextrin für 20 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Anschliessend wurde den Inkubationsansätzen Extraktionspuffer mit Triton X-100 zugegeben und für 1 Stunde extrahiert. Die Proben wurden im weiteren Verlauf durch chemische Quervernetzung oder Immunpräzipitation aufgearbeitet.

Bei den CHOp38-Zellen war eine deutliche Abnahme der Extrahierbarkeit von Synaptophysin nach Inkubation mit 100 mM ß-MCD erkennbar. Geringere Konzentrationen von 50 mM ß-MCD und 25 mM ß-MCD führten zu einem vermindert nachweisbaren Effekt, jedoch konnten auch hier Spuren von Synaptophysin im Non-Extrakt gefunden werden. Die Detergenslöslichkeit von Synaptophysin verhielt sich somit in CHOp38-Zellen nach ß-MCD-Inkubation ähnlich wie nach Filipininkubation (Abb. 11).

Im folgenden Schritt wurde das Verhalten der Vesikelproteine nach Behandlung von PC12-Zellen mit Methyl-ß-cyclodextrin untersucht. Die Ergebnisse der CHOp38-Zellreihe nach ß-MCD-Inkubation bezüglich Synaptophysin konnten auch an der PC12-Zellreihe belegt werden. Die Extrahierbarkeit von Synaptophysin sank nach Inkubation mit 10 mM ß-MCD bzw. 1 mM ß-MCD, was an den detektierbaren Anteilen von Synaptophysin im Non-Extrakt zu erkennen ist. Ein Vergleich der Wirkungen von 20 µg/ml Filipin mit der Wirkung von Methyl-ß-cyclodextrin zeigt die ähnliche Beeinflussung der synaptischen Proteine durch die membranäre Cholesterolverminderung (Abb. 11).

Die Untersuchung der SNARE-Proteine Syntaxin (Abb. nicht gezeigt), SNAP 25 und Synaptobrevin ergaben bei den eingesetzten Konzentrationen an Filipin und Methyl-ß-cyclodextrin keine auffälligen Veränderungen.

Durch Inkubation der vesikulären Membranen der CHOp38-Zelllinie und der PC12-Zelllinie mit Methyl-ß-cyclodextrin nahm der Anteil an in Triton X-100 extrahierbarem Synaptophysin stark ab. Die Detergenslöslichkeit von Synaptophysin wurde durch ß-MCD wie auch durch Filipin stark vermindert.


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Abb. 11. Proteinproben des aufbereiteten LP2-Äquivalent von CHOp38-Zellen und PC12-Zellen wurden mit Konzentrationen an ß-MCD von 100 mM bis 1 mM bzw. mit 20 µg/ml Filipin für 20 min bei 37°C inkubiert und anschliessend mit Triton X-100 extrahiert. Die Detergenslöslichkeit von Synaptophysin sank deutlich nach Inkubation mit ß-MCD im Vergleich zur Kontrolle, wodurch ein großer Anteil der Proteinprobe im Non-Extrakt nachweisbar war. Dies wird bei hoher ß-MCD-Konzentration von 100 mM noch deutlicher. Die Ergebnisse ähneln dem Verhalten von Synaptophysin nach Filipininkubation (siehe auch Abb. 10).

3.3.2 Beeinflussung synaptischer Vesikelproteine nach Veränderung des Cholesterolgehaltes

In den folgenden Experimenten wurde der Cholesterolgehalt von adulten und embryonalen Neuronen durch Methyl-ß-cyclodextrin und zusätzlich durch Cholesteroloxidase verändert. Cholesteroloxidase oxidiert dabei den zugänglichen Anteil an Cholesterol zu 4-Cholesten-3-on, wodurch Cholesterol in ein funktionell inaktives Steroid umgewandelt wird. Das modifizierte Cholesterol wird dabei nicht aus der Membran entfernt. Da 4-Cholesten-3-on dem Cholesterolmolekül sehr ähnlich ist, werden durch die Wirkung der Cholesteroloxidase kaum Veränderungen des physikalischen Zustandes der Plasmamembran bewirkt und die Fluidität der Membran bleibt relativ konstant (Gimpl et al., 1997). Cholesteroloxidase penetriert nicht die Membrandoppelschicht (Lange et al., 1989).

Da Methyl-ß-cyclodextrin die Extrahierbarkeit von Synaptophysin vermindert, wurden die folgenden Experimente weitgehend mit dem Verfahren der chemischen Quervernetzung durchgeführt.


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3.3.2.1  Inkubation mit Methyl-ß-cyclodextrin

Die synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin sind in großer Menge in den Proteinfraktionen aus adultem Rattengehirngewebe nachweisbar und zu einem entsprechend kleineren Anteil in den Fraktionen aus embryonalem Rattengehirngewebe (siehe Abb. 2, 3, 4). Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex formiert sich zum Abschluss der Embryonalphase im Rattengehirn und ist nur in sehr geringen Spuren bereits am
20. Embryonaltag (E20) nachweisbar. Im folgenden Experiment wurde an adulten und embryonalen Rattengehirnproben durch chemische Quervernetzung untersucht, wie die Vesikelproteine durch Methyl-ß-cyclodextrin vermittelte Cholesterolverminderung der synaptischen Vesikelmembranen beeinflusst werden.

Im Vergleich zum adulten Gehirn ist in den Proben nach chemischer Quervernetzung von embryonalen Rattengehirnen nur eine Synaptobrevinbande bei 18 kDa und eine Synaptophysinbande bei 38 kDa durch Immundetektion mit Antikörpern gegen Synaptobrevin und Synaptophysin erkennbar.

Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex kann nach chemischer Quervernetzung embryonaler Proben nicht immundetektiert werden, was darauf zurückzuführen ist, dass noch keine Komplexbildung in embryonalen Neuronen stattfindet (Becher et al., 1999). Teilweise tauchen jedoch bereits Spuren des Komplexes in den letzten Embryonaltagen auf, was auf die Ansätze der differenzierten post partum Ausreifung hindeutet. Auch die Bildung des Synaptobrevindimers nimmt während der neuronalen Reifung zu, da am Tag E20 bereits geringe Spuren des Dimers zu sehen sind (Becher et al., 1999).

Nach Behandlung mit 37.5 mM ß-MCD war deutlich weniger Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex in den adulten Proteinfraktionen detektierbar und in den embryonalen Proteinfraktionen verschwindet der Komplex vollständig, nachdem er in geringer Menge in der Kontrolle durch Immundetektion mit dem sensitiveren Synaptobrevinantikörper nachgewiesen werden konnte (Abb. 12).

Weiterhin war nach ß-MCD-Inkubation eine geringe Abnahme der Menge an Synaptobrevin in der Probe erkennbar. Das Synaptobrevindimer verhält sich in ähnlicher Weise wie das Monomer. Auch hier sinkt durch die Wirkung von 37.5 mM ß-MCD der Gehalt an Synaptobrevindimer in der Probe leicht ab. Für das Synaptophysinmonomer und das Synaptophysindimer ergeben sich durch die ß-MCD-vermittelte Cholesterolverminderung keine erkennbaren Veränderungen in diesem Ansatz.


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Abb. 12. Proteine embryonaler (E20) und adulter synaptischer Vesikelfraktionen wurden mit 37.5 mM ß-MCD für 20 min bei 37°C inkubiert und nach Triton X-100-Extraktion mit DSS chemisch quervernetzt. Die Proben wurden durch SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion mit Antikörpern gegen Synaptophysin und Synaptobrevin analysiert. Es wurden gleiche Mengen an Gesamtprotein aufgetragen. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex ist in adulten Gewebeproben gut nachweisbar und gar nicht oder nur in sehr geringen Spuren in den entsprechenden embryonalen Proben. Die Komplexbildung wurde durch die Wirkung von ß-MCD im adulten Gewebe deutlich reduziert. In geringerem Maße sank auch die Menge an detektierbarem Synaptobrevin (Monomer und Dimer) nach ß-MCD-Inkubation in adultem und in embryonalem Gewebe.

Es wurde nun weiterführend die Dosisabhängigkeit der Wirkung von Methyl-ß-cyclodextrin auf die Bildung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes untersucht. Die Abb. 13 zeigt die Verminderung der Komplexformierung zwischen Synaptophysin und Synaptobrevin in Abhängigkeit von der eingesetzten Konzentration an Methyl-ß-cyclodextrin. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex war nach Inkubation mit 40 mM ß-MCD und 10 mM ß-MCD mit deutlich geringerem Anteil in der Membran vorhanden im Vergleich zur Kontrolle. Dies wurde nach Detektion mit Synaptophysinantikörpern noch deutlicher sichtbar. Erst bei sehr geringer ß-MCD-Konzentration von 2.5 mM waren Spuren des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes durch Detektion mit Synaptophysinantikörpern wieder gut nachweisbar.

In den Untersuchungen war außerdem eine sehr geringe Abnahme der Monomere und Dimere von Synaptophysin und Synaptobrevin nach Inkubation mit hohen ß-MCD-Konzentrationen von 40 mM und 37.5 mM zu beobachten.


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Abb. 13. Proteine von adulten synaptischen Vesikelfraktionen wurden nach Inkubation mit ß-MCD für 20 min bei 37°C mit DSS chemisch quervernetzt. Die Membranen wurden anschliessend sedimentiert und mittels SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion analysiert. Die Dosisabhängigkeit der Komplexformierung ist für ß-MCD-Konzentrationen von 40 mM, 10 mM und 2.5 mM dargestellt. Zu beachten ist die deutliche Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes bei hohen Konzentrationen an ß-MCD und die gleichzeitige leichte Abnahme der Monomere und Dimere von Synaptophysin und Synaptobrevin.

3.3.2.2 Inkubation mit Methyl-ß-cyclodextrin und Cholesteroloxidase im Vergleich

Im Folgenden soll nun die Beeinflussung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes durch Inkubation mit Methyl-ß-cyclodextrin zusätzlich auch im Immunpräzipitationsansatz und vergleichend zur Wirkung der Cholesteroloxidase an synaptischen Vesikeln adulter Ratten analysiert werden.

Nach Behandlung mit 20 mM ß-MCD war die Menge an Synaptophysin im Immunpräzipitat stark vermindert im Vergleich zur Kontrolle, obwohl ausreichend Synaptophysinmoleküle in der Probe vorhanden waren (Abb. 14). Dabei änderte sich die Menge an detektierbarem Synaptobrevin in der Proteinprobe nicht auffällig. Da bereits gezeigt wurde, dass die Löslichkeit von Synaptophysin in Triton X-100 nach ß-MCD-Inkubation deutlich abnimmt, kann die verminderte Immunpräzipitation des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes auch durch die geringe Extrahierbarkeit von Synaptophysin verursacht sein. Es sollen daher die synaptischen Proteine zusätzlich nun durch chemische Quervernetzung analysiert werden.


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Abb. 14. Die Proteinproben der ungereinigten Fraktion der synaptischen Vesikel wurden mit 20 mM ß-MCD oder 3.75 mU Cholesteroloxidase/Sphingomyelinase inkubiert und im Vergleich mit Antikörpern gegen Synaptobrevin immunpräzipitiert oder chemisch quervernetzt. Dabei wurden in den jeweiligen Ansätzen gleiche Mengen an Protein eingesetzt. Die Immunpräzipitation zeigte eine deutliche Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes nach ß-MCD-Inkubation (Abb. 14.1) Auch nach Inkubation mit Cholesteroloxidase wurde der Komplex deutlich vermindert detektiert. Im Ansatz der chemischen Quervernetzung ergab sich nach ß-MCD-Inkubation eine Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes durch ß-MCD-Inkubation. Nach Inkubation mit Cholesteroloxidase war jedoch eine Zunahme des Komplexes zu beobachten. Synaptophysin und Synaptobrevin waren zusätzlich als Monomere und Dimere leicht erhöht im Cholesteroloxidase-Ansatz (Abb. 14.2). Die starke Abnahme der Komplexbildung von Synaptophysin mit Synaptobrevin entspricht den Ergebnissen in Abb. 13. Die Ergebnisse nach Inkubation mit Cholesteroloxidase zeigen gegensätzliche Bilder zwischen dem Ansatz nach chemischer Quervernetzung und dem entsprechenden Immunpräzipitat.


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Auch nach chemischer Quervernetzung des gleichen Inkubationsansatzes ergab sich eine deutliche Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes, welche bei Immundetektion mit Synaptophysinantikörpern deutlicher erkennbar war. Die Mengen der Monomere und der Dimere von Synaptophysin und Synaptobrevin schienen bei dieser
ß-MCD-Konzentration unverändert zu bleiben (Abb. 14.2).

Durch Inkubation der Proben mit 3.75 mU Cholesteroloxidase im gleichen Ansatz war nach der Immunpräzipitation eine Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes durch deutlich verminderte Präzipitation von Synaptophysin erkennbar (Abb. 14.1). Im Gegensatz dazu zeigte sich jedoch nach chemischer Quervernetzung der Proben eine deutliche Zunahme des Komplexes sowie der einzelnen Dimere und Monomere (Abb. 14.2), welche bei Synaptobrevin deutlicher war als bei Synaptophysin.

Nach Cholesterolverminderung der Membranen mittels Methyl-ß-cyclodextrin ist also durch Immunpräzipitation wie auch durch chemische Quervernetzung eine deutlich Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes erkennbar. Dabei sinkt die Menge an gebildetem Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex mit zunehmender Konzentration an Methyl-ß-cyclodextrin. Die Menge der Monomere und Dimere von Synaptophysin und Synaptobrevin in den Proben änderte sich durch die Senkung des Cholesterolgehaltes der Membranen nur bei sehr hoher ß-MCD-Konzentration.

3.3.2.3 Inkubation von hippokampalen Zellkulturen mit Lovastatin

Lovastatin führt zu einer Abnahme des gesamten Cholesterolgehaltes der Zelle durch Blockade eines frühen Schrittes der Cholesterolsynthese. Lovastatin hemmt dabei die Aktivität der HMG-CoA-Reduktase, wodurch der Gesamtgehalt der Zellen an Cholesterol während der Dauer der Inkubation abnimmt.

Für die Untersuchung der Wirkung von Lovastatin wurden reife hippokampale Zellkulturen verwendet. Diese können nach vollständiger Ausreifung als ein Modell für die Proteinverhältnisse und Proteininteraktionen in adulten Neuronen dienen. Für die Langzeitinkubation von bis zu 25 Stunden im Brutschrank konnten nur ausgereifte Zellkulturen verwendet werden, die sich bereits in einem lebenserhaltenden Nährmedium befanden. Frisch zubereitete Synaptosomenfraktionen (P2) oder ungereinigte Vesikelfraktionen (LP2) wären für die Langzeitinkubation ungeeignet. Das serumfreie Nährmedium der Zellkulturen enthält keine Lipidanteile, so dass die Versorgung der Zellen mit Lipiden ausschliesslich durch intrazelluläre Speicher und die zelleigene Synthese geregelt werden kann.


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Abb. 15. Hippokampale Zellkulturen wurden mit 5 µM Lovastatin für 7 (Abb. 15.1) bzw. 25 Stunden (Abb. 15.2) im Brutschrank inkubiert und als LP2-Äquivalent aufbereitet. Nach Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Synaptobrevin wurden die Proben sedimentiert und mittels SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion analysiert. Zu beachten ist die deutliche Verminderung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes nach
25 Stunden Lovastatininkubation. Eine Beeinflussung der SNARE-Proteine SNAP 25 und Synaptobrevin war nicht zu erkennen.

Zur Lovastatininkubationen wurden die Zellkulturen mit 5 µM Lovastatin, in 1 ml Medium pro Schale gelöst, versetzt und für 7 bzw. 25 Stunden im Brutschrank inkubiert. Die Zellen wurden anschliessend gemäß der Anleitung zur Aufbereitung von Zellkulturen (siehe Kapitel 2.2.2) behandelt. Das resultierende Sediment, bestehend aus Zellen und Membranbestandteilen, wurde in 500 µl Extraktionspuffer mit Triton X-100 aufgenommen und extrahiert.

Die Blockade der Cholesterolbiosynthese in hippokampalen Zellkulturen führte nach
25 Stunden Inkubation zu einer deutlichen Abnahme der Komplexbildung zwischen Synaptophysin und Synaptobrevin (Abb. 15.2). Dieser Effekt war daran zu erkennen, dass die Menge an detektierbarem Synaptophysin im Immunpräzipitat deutlich gegenüber der Kontrolle nach Präzipitation mit Antikörpern gegen Synaptobrevin verringert war. Dabei war jedoch Synaptophysin in großer Menge im Überstand S/N vorhanden war. Nach 7 Stunden Inkubationsdauer konnten noch keine Auswirkungen auf den Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex gefunden werden (Abb. 15.1).

Eine Inkubationszeit von 7 Stunden schien dabei noch nicht auszureichen, den Cholesterolgehalt der zellulären Membranen durch Blockade der Cholesterolsynthese zu beeinflussen. Nach 25 Stunden Lovastatininkubation war jedoch die Verminderung des Cholesterolanteils der synaptischen Vesikelmembran ausreichend groß, um zu einer Abnahme der Komplexformierung der Membranproteine Synaptophysin und Synaptobrevin zu führen.


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3.3.2.4  Synaptischen Vesikelproteine in Niemann-Pick C1 Mäusen

In den folgenden Experimenten wurde die Beeinflussung der Eigenschaften und der Komplexbildung der synaptischen Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin in homozygoten und heterozygoten Mausmutanten für NPC1 im Vergleich zum Wildtyp durch chemische Quervernetzung untersucht.

Zuerst wurde der Wildtyp, eine Maus ohne nachweisbare Mutation im NPC1-Gen, mit einem Heterozygoten Maus-Typ für die Niemann-Pick Krankheit verglichen (Abb. 16.1). Zwischen dem Wildtyp und den Heterozygoten konnte jedoch kein quantitativer Unterschied für das Vorhandensein sowohl der Vesikelproteine Synaptophysin und Synaptobrevin, als auch für die Komplexformation zwischen den beiden Proteinen gefunden werden.

Im nächsten Schritt wurden der heterozygote und der homozygote Typ für die NPC1 Mutation vergleichend analysiert (Abb. 16.2). Nach der chemischen Quervernetzung war eine starke Verminderung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes bei den homozygoten Mäusen sichtbar.

Durch densiometrische Messung der Proteinbanden, bezogen auf das jeweilige Proteinmonomer, konnte die Abnahme des Komplexes bei Homozygoten eindeutig bestätigt werden (Abb. 17). Weiterhin konnte so auch eine Abnahme des Synaptobrevindimers und des Synaptophysindimers bei den Homozygoten festgestellt werden. Bei genauer Betrachtung der Blotstreifen fällt zusätzlich eine geringe Abnahme der Monomere von Synaptobrevin und Synaptophysin bei den homozygoten Mutanten auf.

In diesen Untersuchungen war also festzustellen, dass die homozygoten Mutanten für das NPC1-Gen eine auffällige Verminderung von Synaptophysin innerhalb der cholesteroldefizienten synaptischen Vesikelmembran aufwiesen. Dies zeigte sich im Vergleich zum Wildtyp bzw. den heterozygoten Mutanten. Dabei fiel eine sehr deutliche Verminderung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes auf. Für heterozygote Mutanten wie auch für den Mauswildtyp ergaben sich keine erkennbaren Veränderungen der synaptischen Vesikelproteine.


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Abb. 16. Proteine adulter synaptischer Vesikelfraktionen von homozygoten und heterozygoten Niemann-Pick C1 Mausmutanten wurden chemisch quervernetzt und im Vergleich dargestellt. Es konnten keine Unterschiede zwischen den Heterozygoten und dem Wildtyp in Bezug auf das Verhalten der untersuchten Vesikelproteine gefunden werden. Auffällig ist jedoch die starke Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes bei den Homozygoten im Vergleich zu den Heterozygoten. Zu beachten ist hier weiterhin die gleichzeitige leichte Abnahme an Synaptophysin und Synaptobrevin im Vergleich zu den heterozygoten Mutanten.


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Abb. 17. Die Gelbanden aus Abb. 16.2 wurden durch densiometrischer Messung halbquantitativ analysiert bei n=4. Dabei wurde der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex bzw. das jeweilige Proteindimer im Verhältnis zu dem entsprechenden Proteinmonomer der zu untersuchenden Bande gesetzt und für heterozygote und homozygote Mausmutanten verglichen. Hiermit wird die deutliche Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes und des Synaptobrevindimers bzw. des Synaptophysindimers belegt.


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02.06.2005