Aus dem Institut für Anatomie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Cholesterol und der
Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex

Zur Erlangung des Doctor medicinae

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Diana Mitter
aus Weimar, Thüringen

Gutachter:
1. Prof. Dr. rer. nat. Gudrun Ahnert-Hilger
2. Prof. Dr. med. Hans Bigalke
3. PD Dr. med. Scherübl

Datum der Promotion: 13.01.2003

Das Lied vom Fluss der Dinge

Wie oft Du auch den Fluss ansiehst, der träge
Dahinzieht, nie siehst du dasselbe Wasser
Nie kehrt es, das hinunterfließt, kein Tropfen von ihm
Zu seinem Ursprung zurück.
   Beharre nicht auf der Welle,
   Die sich an deinem Fuß bricht, solange er
   Im Wasser steht, werden sich
   Neue Wellen an ihm brechen.

Bertold Brecht

Zusammenfassung

In der synaptischen Vesikelmembran adulter Neuronen bildet Synaptobrevin mit Synaptophysin den Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex. Der Komplex wird im Gegensatz zum SNARE-Komplex nicht in embryonalen Membranen gebildet, sondern erst während der neuronalen Entwicklung hochreguliert. Dabei erfährt Synaptophysin wahrscheinlich eine posttranslationale Modifizierung, die durch einen niedermolekularen Faktor bewirkt wird. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex spielt eine entscheidende Rolle innerhalb der Präsynapse bei der Bereitstellung von Synaptobrevin zur Bindung seiner SNARE-Partner an der Plasmamembran. Im Zustand erhöhter exozytotischer Aktivität der Synapse beschleunigt der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex die Rekrutierung von Synaptobrevin für eine erneute Bildung des SNARE-Komplexes und ermöglicht damit schnelle Exozytose-Endozytose-Zyklen bei erhöhter präsynaptischer Stimulation. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex und der SNARE-Komplex schließen sich gegenseitig aus.

Synaptische Membranen sind aus Lipiden und Proteinen aufgebaut, welche miteinander in Wechselwirkungen stehen. Innerhalb der Membranen formieren sich Subdomänen wie Lipid Rafts die durch eine besondere Lipidzusammensetzung stabilisiert werden und mit speziellen Proteinen bevorzugt assoziieren. Durch die spezielle Organisation des Membranaufbaus können die Prozesse der Endozytose und der Exozytose zum Teil reguliert werden. Synaptische Vesikel, die zu den kleinsten Zellorganellen zählen, zeigen einen besonders hohen membranären Cholesterolgehalt. Synaptophysin ist ein integrales Membranprotein synaptischer Vesikel und konnte zusätzlich als spezifisch cholesterolbindendes Protein identifiziert werden. Durch die Assoziation mit cholesterolreichen Nanodomänen der synaptischen Vesikelmembran könnten die Funktionen von Synaptophysin bei der Membranstabilisation und im Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex der synaptischen Vesikelmembran beeinflusst werden.

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass nach Cholesterolverminderung der Membranen von CHOp38-Zellen und PC12-Zellen mittels Filipin und Methyl-ß-cyclodextrin Synaptophysin in dem Detergens Triton X-100 unlöslicher wird. Die Cholesterolverminderung der Membranen von Neuronen aus Rattengehirngewebe und Hippokampuskulturen mittels Methyl-ß-[Seite VII↓]cyclodextrin und Lovastatin führte weiterhin zu einer verminderten Bildung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes in der synaptischen Vesikelmembran. Somit scheint die Cholesterolassoziation von Synaptophysin und damit die Organisation der synaptischen Vesikelproteine innerhalb von Membrandomänen entscheidend an der Regulation der Proteininteraktionen im Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex beteiligt zu sein. Zusätzlich trägt Synaptophysin durch seine Cholesterolbindung wahrscheinlich zur Stabilisierung des hohen Krümmungsgrades der Membran der synaptischen Vesikel bei. Die Auswirkungen des verminderten Cholesterolgehaltes auf Synaptophysin und den Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex konnten auch bei homozygoten Mausmutanten für die Niemann-Pick Krankheit nachgewiesen werden.
Der Cholesterolgehalt synaptischer Vesikel ist also für die Bildung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes entscheidend und beeinflusst direkt die synaptische Effizienz.

Eigene Schlagworte: Synaptische Vesikel, Synaptophysin, Synaptobrevin, Cholesterol

Abstract

Synaptobrevin interacts with synaptophysin in membranes of adult small synaptic vesicles and forms the synaptophysin/synaptobrevin complex. In contrast to the SNARE complex the synaptophysin/synaptobrevin complex only occurs in adult rat brain but is absent in embryonic brain. Changes in the binding properties of synaptophysin are probably induced by a factor of low molecular weight and correlate with posttranslational modifications of the protein. The synaptophysin/synaptobrevin complex plays an important role within the presynaptic terminal promoting synaptobrevin to bind its SNARE partners at the plasma membrane. In times of increased synaptic activity at the synapse the synaptophysin/synaptobrevin complex accelerates the recruitment of synaptobrevin to form new SNARE complexes and allows for fast exocytotic/endocytotic cycles. The synaptophysin/synaptobrevin complex and the SNARE complex are mutually exclusive.
Major constituents of synaptic membranes are lipids and proteins which are subjected to continuous interactions. Within the membrane form specialized environments known as lipid rafts that are stabilized through tightly packed lipids and proteins that associate preferentially with these domains. The characteristic organisation of membrane structures is crucial for regulating the process of endocytosis and exocytosis. Synaptic vesicles are among the smallest cell organelles and are especially enriched in cholesterol. The integral membrane protein synaptophysin in addition was identified as a major specifically cholesterol-binding protein. Lateral association with cholesterol enriched subunits of the synaptic vesicle membrane may contribute to mediate the functions of synaptophysin in stabilising membrane structures and may in part regulate synaptophysin/synaptobrevin complex formation.
Here we show that depletion of the cholesterol content of CHOp38 cell and PC12 cell membranes by Filipin and Methyl-ß-cyclodextrin significantly changes the solubility of synaptophysin in non-ionic detergents like Triton X-100. After cholesterol depletion of adult rat brain and primary cultures of mouse hippocampus by Methyl-ß-cyclodextrin and the HMGCoA-reductase inhibitor Lovastatin the synaptophysin/synaptobrevin complex was seen to be downregulated. Thus, the synaptophysin/synaptobrevin interaction critically depends on high cholesterol content of the synaptic vesicle membrane. Thereby, synaptophysin likely contributes to stabilise the high membrane curvature of synaptic vesicles. The effects of [Seite IX↓]cholesterol depletion on functional properties of synaptophysin and the synaptophysin/synaptobrevin complex could also be shown on homozygous littermates of the mouse model of Niemann-Pick type C disease.

Our investigation indicates that the cholesterol content of synaptic vesicles appears to be important for the fusion of the synaptophysin/synaptobrevin complex and directly affects synaptic efficiency.

Keywords: small synaptic vesicles, synaptophysin, synaptobrevin, cholesterol

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Synaptische Transmission und Plastizität
  • 1.2 Schlüsselproteine der Fusion zwischen sekretorischen synaptischen Vesikeln und der Plasmamembran
    • 1.2.1 Synaptobrevin
    • 1.2.2  Syntaxin
    • 1.2.3 SNAP 25
    • 1.2.4 Der SNARE-Komplex
  • 1.3 Mögliche Modulation der Exozytose
    • 1.3.1 Synaptophysin 1
    • 1.3.2 Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex
  • 1.4 Interaktionen zwischen Proteinen und Lipiden in der Membran
    • 1.4.1 Aufbau von zellulären Membranen
    • 1.4.2 Neuronale Membranen und Cholesterol
      • 1.4.2.1  Cholesterol
      • 1.4.2.2 Interaktionen zwischen Cholesterol und Membranproteinen
    • 1.4.3 Lipid Rafts als Strukturelement zellulärer Membranen
    • 1.4.4 Veränderungen im neuronalen Cholesterolmetabolismus – das Niemann-Pick Modell
  • 1.5 Fragestellungen
• 2  Material und Methoden
  • 2.1 Material
    • 2.1.1 Antikörper
      • 2.1.1.1 Primäre Antikörper (monoklonal) gegen:
      • 2.1.1.2 Primäre Antiseren (polyklonal) gegen:
      • 2.1.1.3 Sekundäre Antikörper
    • 2.1.2 Chemikalien und Reagenzien
    • 2.1.3 Puffer und Lösungen
    • 2.1.4  Instrumente
      • 2.1.4.1 Zentrifugen
      • 2.1.4.2 Zentrifugalfiltereinheiten
      • 2.1.4.3 Elektrophorese Ausrüstung
      • 2.1.4.4 Spektrophotometer
  • 2.2  Methoden
    • 2.2.1 Herstellung von Synaptosomen und Synaptischen Vesikeln aus Rattengehirnen
      • 2.2.1.1 Synaptosomen
      • 2.2.1.2 Synaptische Vesikel
    • 2.2.2 Aufbereitung von Zelllinien und primären Zellkulturen
    • 2.2.3 Bestimmung der Proteinkonzentration
    • 2.2.4 Extraktion von Membranproteinen
    • 2.2.5  Immunpräzipitation von Proteinkomplexen
    • 2.2.6 Chemische Quervernetzung mittels Disucciminidylsuberat
    • 2.2.7 Gelelektrophorese
    • 2.2.8 Western Blot und Immundetektion
    • 2.2.9 Behandlung von Hippokampuskulturen mit Toxinen
• 3  Resultate
  • 3.1 Synaptische Proteine und ihre Komplexe in subzellulären Fraktionen adulter und embryonaler Neuronen
    • 3.1.1 Verteilung synaptischer Proteine in verschiedenen synaptischen Membranfraktionen aus adulten Rattengehirnen
    • 3.1.2 Vergleich von synaptischen Membranen adulter und embryonaler Rattengehirne
    • 3.1.3 Untersuchungen zur Funktion synaptischer Membranproteine nach Blockierung oder Stimulation synaptischer Transmission
      • 3.1.3.1 Blockade der synaptischen Transmission
      • 3.1.3.2 Stimulation der synaptischen Transmission
  • 3.2 Immunpräzipitation von synaptischen Membranproteinen nach Extraktion mit verschiedenen Detergenzien
  • 3.3 Einfluss des Cholesterolgehaltes synaptischer Membranen auf Extrahierbarkeit und Interaktion synaptischer Proteine
    • 3.3.1 Extraktion synaptischer Proteine aus Zelllinien nach Cholesterolverminderung
      • 3.3.1.1 Inkubation mit Filipin
      • 3.3.1.2  Inkubation mit Methyl-ß-cyclodextrin
    • 3.3.2 Beeinflussung synaptischer Vesikelproteine nach Veränderung des Cholesterolgehaltes
      • 3.3.2.1  Inkubation mit Methyl-ß-cyclodextrin
      • 3.3.2.2 Inkubation mit Methyl-ß-cyclodextrin und Cholesteroloxidase im Vergleich
      • 3.3.2.3 Inkubation von hippokampalen Zellkulturen mit Lovastatin
      • 3.3.2.4  Synaptischen Vesikelproteine in Niemann-Pick C1 Mäusen
• 4  Diskussion
  • 4.1 Schlüsselproteine synaptischer Transmission
  • 4.2 Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex – ein Charakteristikum synaptischer Vesikel in reifen Neuronen
  • 4.3 Synaptophysin und der Cholesterolgehalt von Membranen
    • 4.3.1 Cholesterol und seine Funktionen
    • 4.3.2 Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex nach Cholesterolverminderung
      • 4.3.2.1 Direkter Cholesterolentzug der Membran
      • 4.3.2.2 Hemmung der Cholesterolbiosynthese
      • 4.3.2.3 Das Niemann-Pick C1-Mausmodell
  • 4.4 Die Assoziation von Synaptophysin mit Cholesterol innerhalb von Nanodomänen der Vesikelmembran ist eine Voraussetzung für die Interaktion der synaptischen Vesikelproteine
• Danksagung
• Abkürzungen
• Literaturverzeichnis
• Publikationen
• Lebenslauf
• Erklärung an Eides Statt

Tabellen

• Tab. 1: Zusammensetzung der Gele
• Tab. 2. Detergenzien und ihre Eigenschaften

Bilder

• Abb. 1. Schematische Darstellung der synaptischen Proteine des SNARE-Komplexes und des Synaptopyhsin-Synaptobrevin-Komplexes. Die synaptischen Vesikel in der Präsynapse fusionieren mit der Plasmamembran unter Bildung eine transmembranären Komplexes aus Synaptobrevin, Syntaxin und SNAP 25. Synaptobrevin liegt auf der synaptischen Vesikelmembran gleichzeitig gebunden an Synaptophysin vor.
• Abb. 2. Proteine der Synaptosomenfraktion P2 und der Fraktion der synaptischen Vesikel LP2 wurden chemisch quervernetzt. Die Membranen wurden sedimentiert und mit SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion mit Antikörpern gegen Synaptophysin und gegen Synaptobrevin im Vergleich analysiert. Es wurden gleiche Mengen an Gesamtprotein aufgetragen. Die Menge der untersuchten vesikulären Proteine stieg im Verhältnis zur Gesamtproteinmenge während der Membranaufbereitung deutlich an. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex lässt sich durch Immundetektion mit Synaptobrevinantikörpern besser darstellen als mit Synaptophysinantikörpern.
• Abb. 3. Synaptische Vesikelfraktionen (LP2) wurden schrittweise hergestellt aus homogenisiertem Gesamtgehirn adulter (Abb. 3.1) und embryonaler Ratten (E20) (Abb. 3.2) und mit Antikörpern gegen Syntaxin immunpräzipitiert. Die einzelnen subzellulären Fraktionen (P2, LP1 und LP2) wurden im Vergleich untersucht für die aufgeführten synaptischen Proteine mittels SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion. Es wurden jeweils gleiche Mengen an Protein aufgetragen. Zu beachten ist die deutliche Abnahme der Komplexformation zwischen Synaptobrevin und Syntaxin mit zunehmender Isolation der synaptischen Vesikelmembranen in adultem als auch in embryonalem Rattengehirn. In embryonalen Vesikelfraktionen konnte der Komplex aus Syntaxin und Synaptobrevin nicht mehr nachgewiesen werden. Die Gesamtproteinmenge in embryonalem Rattengehirngewebe war wesentlich geringer als in adultem Gewebe.
• Abb. 4. Adulte (Abb. 4.1) und embryonale (Abb. 4.2) Synaptosomenfraktionen aus Rattengehirngewebe wurden nach Triton X-100-Extraktion mit Antikörpern gegen Syntaxin und SNAP 25 immunpräzipitiert und mittels SDS-Gelelektrophorese, Westernblot und Immundetektion dargestellt.
• Abb. 5. Ungereinigte Synaptosomenäquivalente adulter Ratten wurden durch Zugabe von SLO permeabilisiert und als Sedimente mit 100 ng/ml präaktiviertem TeTx bzw. mit 100 ng/ml LC-TeTx für 30 min inkubiert. Anschliessend wurden die Proben chemisch quervernetzt und analysiert.
• Abb. 6. Hippokampale Zellkulturen wurden nach Zugabe von 1 nM Tetanusneurotoxin zum Kulturmedium für  9 Tage im Brutschrank inkubiert. Anschliessend wurden die Zellkulturen aufbereitet und mit Antikörpern gegen Syntaxin (Abb. 6.1) und Synaptophysin (Abb. 6.2) immunpräzipitiert und dargestellt. Durch Immunpräzipitation mit Syntaxinantikörpern war in der Kontrolle der SNARE-Komplex gut darstellbar. Nach Vergiftung mit Tetanusneurotoxin verschwand Synaptobrevin in den hippokampalen Zellen und konnte weder im Immunpräzipitat (IP) noch im Überstand (S/N) nachgewiesen werden (Abb. 6.1). Nach Vergiftung verschwindet auch der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex und ist durch Immunpräzipitation mit Synaptophysin-antikörpern nur in der Kontrolle nachweisbar.
• Abb. 7. Hippokampale Zellkulturen wurden unter Zugabe von 400 nM Tetrodotoxin zum Kulturmedium für  15 min im Brutschrank inkubiert und anschliessend mit Synaptobrevinantikörpern immunpräzipitiert. Die Proben wurden sedimentiert und mittels SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion analysiert. Nach der Behandlung blieb der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex unverändert nachweisbar. Es ergaben sich keine auffälligen Veränderungen der detektierten Proteine.
• Abb. 8. Hippokampale Zellkulturen wurden nach Zugabe von 1 nM alpha-Latrotoxin oder 25 mM Kalium in Krebs-Ringer-Hepes-Puffer für 3 Stunden im Brutschrank inkubiert und anschliessend aufbereitet. Die Proben wurden mit Antikörpern gegen Synaptobrevin immunpräzipitiert, sedimentiert und zur Darstellung gebracht. Die Untersuchung ergab bei mehrmaliger Wiederholung immer das gleiche Ergebnis. Nach 3 Stunden Inkubation mit alpha-Latrotoxin konnte kein Synaptophysin mehr im Immunpräzipitat (IP) detektiert werden, obwohl das Protein in der Probe im Überstand (S/N) vorhanden war. Durch die Wirkung von alpha-Latrotoxin wurde der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes in den Zellkulturen aufgebraucht. Die Bindung von SNAP 25 an Synaptobrevin schien durch die Wirkung von alpha-Latrotoxin nicht beeinflusst. Nach Stimulation mit Kalium ergaben sich keine sichtbaren Veränderungen der Proteininteraktionen in den Proben.
• Abb. 9. Synaptische Vesikelfraktionen adulter Rattengehirne wurden mit den jeweiligen Extraktionspuffern für eine Stunde auf Eis extrahiert. Das resultierende Extrakt (E) und das Non-Extrakt (NE) wurden im Vergleich dargestellt. Der Extrakt wurde in einem zweiten Ansatz mit Synaptobrevinantikörpern präzipitiert und dann als Immunpräzipitat (IP) mit zugehörigem Überstand (S/N) analysiert und dargestellt. Nach der Detergenzienbehandlung konnten die synaptischen Proteine Synaptophysin, Synaptobrevin und  SNAP 25 jeweils im Extrakt und im Non-Extrakt zu gleichen Verhältnissen detektiert werden. Durch die Verwendung der unterschiedlichen Detergenzien ergaben sich keine Veränderungen im Löslichkeitsverhalten der Proteine. In der anschliessenden Immunpräzipitation konnten für alle drei verschiedenen Detergenzien der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex als auch Synaptobrevin im Komplex mit SNAP 25 nachgewiesen werden. Die Komplexbildung der Proteine blieb bei Verwendung der unterschiedlichen Detergenzien unbeeinflusst.
• Abb. 10. Proteinproben des aufbereiteten LP2-Äquivalentes von CHOp38-Zellen und PC12-Zellen wurden mit Filipinkonzentrationen von 100 µg/ml, 20 µg/ml und 4 µg/ml für 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschliessend mit Triton X-100 extrahiert. Die Extrahierbarkeit von Synaptophysin war nach Inkubation mit 100 µg/ml Filipin deutlich vermindert, so dass große Mengenanteile von Synaptophysin im Non-Extrakt (NE) detektierbar waren. Mit abnehmender Filipinkonzentration nahm die Detergenslöslichkeit wieder zu. Zu beachten ist die fast vollständige Löslichkeit von Synaptophysin in Triton X-100 in der Kontrollprobe. Im Gegensatz dazu ist keine Veränderung des Löslichkeitsverhaltens der SNARE-Proteine durch Filipininkubation zu erkennen.
• Abb. 11. Proteinproben des aufbereiteten LP2-Äquivalent von CHOp38-Zellen und PC12-Zellen wurden mit Konzentrationen an ß-MCD von 100 mM bis 1 mM bzw. mit 20 µg/ml Filipin für 20 min bei 37°C inkubiert und anschliessend mit Triton X-100 extrahiert. Die Detergenslöslichkeit von Synaptophysin sank deutlich nach Inkubation mit ß-MCD im Vergleich zur Kontrolle, wodurch ein großer Anteil der Proteinprobe im Non-Extrakt nachweisbar war. Dies wird bei hoher ß-MCD-Konzentration von 100 mM noch deutlicher. Die Ergebnisse ähneln dem Verhalten von Synaptophysin nach Filipininkubation (siehe auch Abb. 10).
• Abb. 12. Proteine embryonaler (E20) und adulter synaptischer Vesikelfraktionen wurden mit 37.5 mM ß-MCD für 20 min bei 37°C inkubiert und nach Triton X-100-Extraktion mit DSS chemisch quervernetzt. Die Proben wurden durch SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion mit Antikörpern gegen Synaptophysin und Synaptobrevin analysiert. Es wurden gleiche Mengen an Gesamtprotein aufgetragen. Der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex ist in adulten Gewebeproben gut nachweisbar und gar nicht oder nur in sehr geringen Spuren in den entsprechenden embryonalen Proben. Die Komplexbildung wurde durch die Wirkung von ß-MCD im adulten Gewebe deutlich reduziert. In geringerem Maße sank auch die Menge an detektierbarem Synaptobrevin (Monomer und Dimer) nach ß-MCD-Inkubation in adultem und in embryonalem Gewebe.
• Abb. 13. Proteine von adulten synaptischen Vesikelfraktionen wurden nach Inkubation mit ß-MCD für 20 min bei 37°C mit DSS chemisch quervernetzt. Die Membranen wurden anschliessend sedimentiert und mittels SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion analysiert. Die Dosisabhängigkeit der Komplexformierung ist für ß-MCD-Konzentrationen von 40 mM, 10 mM und 2.5 mM dargestellt. Zu beachten ist die deutliche Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes bei hohen Konzentrationen an ß-MCD und die gleichzeitige leichte Abnahme der Monomere und Dimere von Synaptophysin und Synaptobrevin.
• Abb. 14. Die Proteinproben der ungereinigten Fraktion der synaptischen Vesikel wurden mit 20 mM ß-MCD oder 3.75 mU Cholesteroloxidase/Sphingomyelinase inkubiert und im Vergleich mit Antikörpern gegen Synaptobrevin immunpräzipitiert oder chemisch quervernetzt. Dabei wurden in den jeweiligen Ansätzen gleiche Mengen an Protein eingesetzt. Die Immunpräzipitation zeigte eine deutliche Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes nach ß-MCD-Inkubation (Abb. 14.1) Auch nach Inkubation mit Cholesteroloxidase wurde der Komplex deutlich vermindert detektiert. Im Ansatz der chemischen Quervernetzung ergab sich nach ß-MCD-Inkubation eine Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes durch ß-MCD-Inkubation. Nach Inkubation mit Cholesteroloxidase war jedoch eine Zunahme des Komplexes zu beobachten. Synaptophysin und Synaptobrevin waren zusätzlich als Monomere und Dimere leicht erhöht im Cholesteroloxidase-Ansatz (Abb. 14.2). Die starke Abnahme der Komplexbildung von Synaptophysin mit Synaptobrevin entspricht den Ergebnissen in Abb. 13. Die Ergebnisse nach Inkubation mit Cholesteroloxidase zeigen gegensätzliche Bilder zwischen dem Ansatz nach chemischer Quervernetzung und dem entsprechenden Immunpräzipitat.
• Abb. 15. Hippokampale Zellkulturen wurden mit 5 µM Lovastatin für 7 (Abb. 15.1) bzw. 25 Stunden (Abb. 15.2) im Brutschrank inkubiert und als LP2-Äquivalent aufbereitet. Nach Immunpräzipitation mit Antikörpern gegen Synaptobrevin wurden die Proben sedimentiert und mittels SDS-PAGE, Westernblot und Immundetektion analysiert. Zu beachten ist die deutliche Verminderung des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes nach  25 Stunden Lovastatininkubation. Eine Beeinflussung der SNARE-Proteine SNAP 25 und Synaptobrevin war nicht zu erkennen.
• Abb. 16. Proteine adulter synaptischer Vesikelfraktionen von homozygoten und heterozygoten Niemann-Pick C1 Mausmutanten wurden chemisch quervernetzt und im Vergleich dargestellt. Es konnten keine Unterschiede zwischen den Heterozygoten und dem Wildtyp in Bezug auf das Verhalten der untersuchten Vesikelproteine gefunden werden. Auffällig ist jedoch die starke Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes bei den Homozygoten im Vergleich zu den Heterozygoten. Zu beachten ist hier weiterhin die gleichzeitige leichte Abnahme an Synaptophysin und Synaptobrevin im Vergleich zu den heterozygoten Mutanten.
• Abb. 17. Die Gelbanden aus Abb. 16.2 wurden durch densiometrischer Messung halbquantitativ analysiert bei n=4. Dabei wurde der Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplex bzw. das jeweilige Proteindimer im Verhältnis zu dem entsprechenden Proteinmonomer der zu untersuchenden Bande gesetzt und für heterozygote und homozygote Mausmutanten verglichen. Hiermit wird die deutliche Abnahme des Synaptophysin-Synaptobrevin-Komplexes und des Synaptobrevindimers bzw. des Synaptophysindimers belegt.