1. EINLEITUNG

↓1

Die Herzinsuffizienz bezeichnet den pathophysiologischen Zustand, in dem eine gestörte kardiale Funktion für das Unvermögen des Herzens verantwortlich ist, das Blut dem Bedarf der metabolisierenden Gewebe entsprechend auszuwerfen, und/oder dies nur durch ein erhöhtes diastolisches Volumen möglich ist.1

Zusammen mit kardiovaskulären Erkrankungen wie der chronisch ischämischen Herzkrankheit und dem akuten Myokardinfarkt stellte sie im Jahr 2001 rund 26% der Gesamtmortalität in Deutschland2 und ist damit eine der schwerwiegendsten medizinischen sowie ökonomischen Herausforderungen an das Gesundheitssystem. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, fokussierend auf das atriale natriuretische Peptid, zur weiteren Erforschung der pathophysiologischen Vorgänge bei der Herzinsuffizienz beizutragen.

1.1  Pathophysiologie der Herzinsuffizienz

Die Vorstellung von den krankheitsprozessfördernden Vorgängen bei der Entwicklung einer Herzinsuffizienz unterlag in der Vergangenheit gravierenden Veränderungen3 und ist weiterhin Gegenstand intensiver Forschung. Derzeit wird entsprechend der neurohormonalen Hypothese davon ausgegangen, dass als Antwort auf ein primär schädigendes Ereignis (index event) endogene Neurohormone und Zytokine in ihrer Freisetzung variiert werden und somit strukturelle und funktionelle Veränderungen am Herzen (kardiales Remodeling) hervorrufen. Diese können über einen gewissen Zeitraum zur Ausbildung klinischer Symptome der Herzinsuffizienz führen.3 Verschiedenste Formen von Herzkrankheit wie Myokardinfarkt, Klappendefekte und Myokarditiden oder auch Zustände, die zu einer Überwässerung des Körpers führen wie z.B. bei Niereninsuffizienz, können ein derartiges index event darstellen. Am häufigsten scheint das Herzversagen mit Berufung auf die Framingham-Studie aus koronarer Herzerkrankung und arterieller Hypertonie zu resultieren.4 ,5

↓2

Bei akuter Belastung des Herzens (Minuten bis Stunden) stehen zur Aufrechterhaltung der Pumpfunktion vor allem der Frank-Starling-Mechanismus und die Aktivierung noradrenerger kardialer Nerven als Adaptationsmechanismen zur Verfügung.6 Der Frank-Starling-Mechanismus besagt, dass es durch Erhöhung des enddiastolischen Volumens mit konsekutiver

Dehnung der Ventrikelwand zu einer Längenzunahme intramyozytär gelegener Sarkomere kommt. Die dadurch gesteigerte Kalzium-Sensitivität kontraktiler Filamente bewirkt am gesunden Herzen eine Erhöhung der myokardialen Kontraktilität. Im herzinsuffizienten Zustand ist dieser Effekt abgeschwächt.7 Die Freisetzung von Noradrenalin an kardialen sympathischen Nervenendigungen bewirkt ebenfalls eine Kontraktilitätsteigerung des Myokards und verstärkt das bei Herzinsuffizienz aktivierte Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS), wodurch der arterielle Blutdruck und die Perfusion lebenswichtiger Organe aufrechterhalten werden können.6

Bei chronischem Missverhältnis zwischen der Belastung des Herzens und seiner Pumpfunktion kommt es stro m aufwärts, das heißt hinter dem initial betroffenen Ventrikel, zu einem Rückstau des Blutes (Rückwärtsversagen). Mit ansteigender Druckdifferenz zwischen intravasalem und extravasalem Raum tritt dann intravasale Flüssigkeit ins Interstitium über und es kommt zur klinischen Manife s tation von Ödemen in den vorgeschalteten Körperpartien. Chronische Salz- und Wasserretention wird auch durch eine Minderperfusion der Nieren (Vorwärtsversagen) sowie durch die RAAS-Aktivierung hervorgerufen. Klinisch führt die Überwässerung des Körpers zu dem Hauptb e schwerdebild der chronischen Herzinsuffizienz – der Atemnot. Durch Flüssigkeit s einlagerung in das Lungengewebe kommt es zu einem erschwerten Gasaustausch und folglich zum Auftreten von Dyspnoe vor allem bei Belastung und in liegender Position. 1 Je nach Schweregrad der Erkrankung stellt die hierdurch bedingte Einschränkung der körpe r lichen Belastba r keit bis hin zur Erstickungsangst eine enorme Minderung der Lebensqualität dar. Körpereigene Substanzen wie die natriuretischen Peptide wirken einer Salz- und Wasserretention entgegen und besitzen d a durch therapeutisches Potential. Eine pharmakologische Ausnutzung ihrer Kapazität war bisher nur eingeschränkt möglich, sodass auf diesem Gebiet weiterer Forschungsbedarf besteht. Das derzeitige Behandlungskonzept der Wassereinl a gerung stützt sich vor allem auf eine Trinkmengenbeschränkung, die Gabe von Diuretika und teilweise auf die A n tagonisierung des RAAS. In der Regel führt dies zu einer Besserung der Symptomatik. Trotzdem kommt es in den meisten Fällen fortgeschrittener Erkrankung zur wiederholten Dekompensation mit Flüssigkeitsretention und weite r führend zur chronischen Belastung des Herzens.

1.1.1 Kardiales Remodeling

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Chronisch starke Überbeanspruchung des Herzens führt zu einer Vielzahl struktureller Veränderungen des Herzgewebes. Dazu gehören unter anderem kardiozytäre Apoptose und die Aktivierung spezifischer myokardialer Matrix-Metallo-Proteinasen, die am Abbau des kollagenen Netzwerkes beteiligt sind. Dieses unterstützt im gesunden Zustand die dreidimensionale Anordnung der Kardiomyozyten. Unter mechanischem Stress kann es dann zu einem Auseinanderdriften der Kardiomyozyten („myocyte slippage“) kommen, welches zur pathologischen Ventrikeldilatation beiträgt.

Seit langem bekannt ist auch die Zunahme des Herzgewichts bei Patienten mit Herzinsuffizienz. Dafür scheinen ein robustes Wachstum interstitieller Matrix und myozytäre Hypertrophie verantwortlich zu sein, aber auch kardiomyozytäre Hyperplasie wurde von einigen Autoren beschrieben.3

Über die Hypertrophie als Reaktion der Herzmuskelzellen auf mechanischen Stress liegen bisher die ausführlichsten Informationen vor. Resultiert diese aus einer verstärkten Druckbelastung (Afterload) mit Zunahme der systolischen Wandspannung, entsteht infolge paralleler Neubildung von Myofibrillen eine konzentrische Hypertrophie.8,9 Ein vermehrtes Volumenangebot (Preload) mit Zunahme der Wandspannung während der Diastole bedingt durch Bildung neuer hintereinander liegender Sarkomere eine exzentrische Hypertrophie.8,10-13 Bei dem in der vorliegenden Arbeit angewandten Modell des aortokavalen Shunts führt dieser Mechanismus zur Entwicklung der kardialen Hypertrophie und Insuffizienz.

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Zur Erforschung der Pathophysiologie der Herzinsuffizienz dienen außerdem noch andere Modelle, wobei zur Induktion der Herzinsuffizienz mit den verschiedensten primär schädigenden Ereignissen gearbeitet wird. Zur Diskussion der vorliegenden Versuche wurden beispielsweise Daten herangezogen, die an Infarktmodellen, genetisch bedingter Kardiomyopathie, experimentell induzierter Klappeninsuffizienz, medikamentöser Hypertonie und anderen Modellen der Herzinsuffizienz im Tierversuch gewonnen wurden.

Unabhängig von der auslösenden Ursache steigert kardiale Hypertrophie das Risiko eines plötzlichen Herztodes bzw. der fortschreitenden Entwicklung zur Herzinsuffizienz deutlich.14-16

Mechanische Belastung führt dabei über eine komplexe Interaktion von extra- und intrazellulärer Matrix zur Aktivierung diverser, teilweise untereinander vernetzter Signalkaskaden, welche auf Transkriptionsebene zum Teil konvergieren und letztendlich zu den hypertrophietypischen morphologischen Veränderungen führen. Die Wahrnehmung von mechanischem Stress scheint in diesem Kontext über verschiedene zelluläre Proteine realisiert zu werden, u.a. Titin und Integrine. Die Expression von Integrinen ist im herzinsuffizienten Zustand erhöht. Kardiale Fibroblasten besitzen außerdem die Fähigkeit, auf mechanische Stimulation hin auto- und parakrine Faktoren wie Endothelin 1 (ET-1) und Angiotensin II (Ang II) freizusetzen. Diese und weitere Faktoren, wie der VEGF (vascular endothelial growth factor) und TGFβ (transforming growth factor-β), amplifizieren einen durch mechanische Dehnung getriggerten Wachstumsstimulus und wirken derart förderlich auf die Entwicklung einer Herzhypertrophie.17 Auch α1-adrenerge Agonisten18,19 und Wachstumsfaktoren wie fibroblast growth factors (FGFs)20,21 und insuline like growth factor 1 (IGF1)22-24 wirken hypertroph auf kardiale Myozyten. Durch die Aktivierung verschiedener Signalkaskaden kommt es infolgedessen zu einem globalen Ansteigen der Proteinsyntheserate, der transienten Induktion von sogenannten „early genes“ (c-jun, c-fos, Egr-1) und chronisch zur Rekapitulation fetaler Genprogramme.25-28 Letzteres umfasst die Reinduktion der fetalen Formen kontraktiler Proteine, das Absinken der Ca2+-ATPase am sarkoplasmatischen Retikulum sowie die Hochregulation ventrikulärer natriuretischer Peptidexpression.28,29 Bei den kontraktilen Proteinen und der Ca2+-ATPase wurden Unterschiede zwischen druck- und volumeninduzierter Hypertrophie festgestellt, wogegen ANP (das atriale natriuretische Peptid) bei beiden Hypertrophieformen verstärkt in den Ventrikeln gebildet wird.29

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In die intrazelluläre Vermittlung dieser modifizierten Genexpression sind mehrere Transduktionswege involviert (in Übersicht beschrieben von Frey und Olson30). An der Zellmembran betrifft dies mehrere Ionenkanäle, neurohormonelle Rezeptoren und rezeptorassoziierte G-Proteine. Diese bewirken Veränderungen im zytosolischen Ca2+-Haushalt und führen zur Modulation der Aktivität komplex interagierender intrazellulärer Proteine. Dazu gehören z.B. Ca2+-Calmodulin, die Proteinkinase C, Phosphoinositid 3-Kinasen und die Proteinkinase A, welche über angeschlossene Signalkaskaden letztendlich mit regulativen Einheiten hypertrophieassoziierter Gene kommunizieren und so zur einer Abwandlung deren Expressionsmuster führen.

Da der Proteinkinase C eine ausschlaggebende Rolle bei der Expression und Freisetzung atrialer natriuretischer Peptide zugeschrieben wird, soll auf ihre Struktur und Wirkungsweise im Folgenden ausführlicher eingegangen werden.

1.1.2 Die Proteinkinase C

Die ubiquitär exprimierte Proteinkinase C (PKC) ist ein Schlüsselenzym, das in die Regulation diverser zellulärer Prozesse, wie Wachstum, Differenzierung, Metabolismus, Sekretion und glatte Gefäßmuskelkontraktion eingebunden ist. Sie stellt ein Bindeglied zwischen hypertrophen sowie antihypertrophen Stimuli und vielfältigen Effektorproteinen sowie Genregulatoren dar und spielt somit eine zentrale Rolle bei der Entstehung einer Herzinsuffizienz. Ihre Stimulation führte in kardiomyozytären Zellkulturen171 ,229 sowie am isoliert perfundierten Herzmodell230 zu einer Steigerung der ANP-Freisetzung. Kongruent dazu wurde ANP von atrialen Myozyten durch PKC-Inhibition vermindert freigesetzt. 223Zahlreiche Faktoren, die eine ANP-Freisetzung fördern, vermitteln ihre Wirkung über die Proteinkinase C.31

↓6

Es sind 11 Isoformen der PKC bekannt, die je nach Aktivierungsmodus in 3 verschiedene Subklassen unterteilt werden:

  1. die konventionellen (cPKC: α, β1/2, γ; aktiviert durch Ca2+ und Diacylglycerol (DAG)),
  2. die neuartigen (nPKC: δ, ε, η, θ; aktiviert durch DAG) und
  3. die atypischen Proteinkinasen vom C-Typ (aPKC: ζ, λ; aktiviert durch Phospholipide).31-33

Die Zuteilung der PKCμ ist in der Literatur unklar definiert und ihr Aktivierungsgang erscheint komplexer als jener der anderen PKC-Subtypen.

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Da für die verschiedenen Isoformen immunhistochemisch unterschiedliche intrazelluläre Lokalisationen nachgewiesen wurden34, ist zu vermuten, dass sich auch ihre zellulären Funktionen unterscheiden. In humanem Myokard demonstrierten Bowling et al.35 das Vorhandensein von konventionellen und neuartigen PKC-Typen in Form von PKCα, β, δ und ε. Kerkelä et al.36 zeigten eine Beteilung der PKCα an der Regulation hypertropher Genexpression und der Freisetzung natriuretischer Peptide. Auch für die Isoformen β und ε existieren deutliche Hinweise auf ein Eingebundensein in die Vermittlung hypertropher Stimuli.35 ,37

Für die PKC-Aktivierung wurden mehrere Möglichkeiten vorgeschlagen.38 Der etablierteste und in den Prozess kardialer Hypertrophieentwicklung involvierte Aktivierungsmodus wird durch Ligand-Rezeptor-Interaktionen an G-Proteingekoppelten Rezeptoren (GPgRs) ausgelöst.31 Die α-Untereinheit der G-Proteine ist im Stande die Phospholipase β (PLC β) zu aktivieren, welche membrangebundenes Phosphatidylinositolbisphosphat (PIP2) zu Diacylglycerol (DAG) und Insoitoltrisphosphat (IP3 ) spaltet, die mit oben beschriebener Affinität die unterschiedlichen Subklassen der PKC aktivieren. Die Aktivierung durch DAG erfolgt nach dessen Bindung an einer zysteinreichen Struktur (zinc butterfly) in der N-terminalen regulatorischen Domäne der PKC.38 Dieser Prozess kann durch DAG-Analoga wie PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Azetat) nachgeahmt und für experimentelle Zwecke genutzt werden.39 Auch bei den vorliegenden Versuchen wurde mit PMA gearbeitet.

Durch Aktivierung translozieren die PKC-Subtypen dann in isoformspezifische Zellregionen und modulieren dort verschiedene Ionenkanäle und -transporter sowie kontraktile Proteine.38 ,40 Die in „1.1.1 kardiales Remodeling“ angesprochene Regulation der Genexpression scheint über die Aktivierung spezieller mitogenaktivierter Proteinkinasen (MAPKKK ♢ MAPKK ♢ MAPK) vermittelt zu werden. Sie können Transkriptionsfaktoren wie c-jun und c-fos stimulieren und so die Expression hypertrophieassoziierter Gene modulieren.31

1.1.3 Das kardiale Gefäßsystem

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Auch in der glatten Muskulatur der Blutgefäße vermittelt die PKC zelluläre Funktionen. Die Aktivierung ihrer ε-Isoform bewirkt dort eine Vasokonstriktion.38 Bei der Herzinsuffizienz wird eine gesteigerte Vasokonstriktion als verstärkender Pathomechanismus diskutiert.41 Studien zur koronaren Ruhedurchblutung bei Herzinsuffizienz lieferten jedoch widersprüchliche Ergebnisse.42-44 In Zuständen erhöhten metabolischen Bedarfs konnte dagegen ein abgeschwächter Anstieg der Koronarperfusion an Tiermodellen der Herzinsuffizienz gezeigt werden.45-47

Im Herzen sind etwa dreimal mehr Endothelzellen zu finden als Herzmuskelzellen, obwohl sie aufgrund ihrer deutlich geringeren Größe nur einige Hundertstel des kardiomyozytären Volumens ausmachen.48 Organisiert in myokardialen Kapillaren befinden sie sich in unmittelbarer Nähe der Kardiomyozyten, was eine intensive Kommunikation zwischen Herzmuskel und dem Gefäßsystem ermöglicht. So geben sie eine Reihe von Faktoren (wie Endotheline, Angiotensin II, Stickstoffmonoxid und andere) an das Interstitium ab, welche im Stande sind, zu den Herzmuskelzellen zu diffundieren und dort deren Funktion zu modulieren.41

1.1.4  Neuroendokrine Aktivierung

Im Plasma herzinsuffizienter Individuen liegen zahlreiche, die kardiovaskuläre Funktion beinflussende Faktoren in erhöhtem Maße vor, welche sich gegenseitig in ihrer Synthese, Freisetzung und Wirkung in komplexer Weise beeinflussen. Dazu gehören Noradrenalin49 ,50, Endothelin 1 (ET-1)51-53, Renin und Angiotensin II (Ang II)54, sowie das antidiuretische Hormon (ADH)55. Sie haben vasokonstriktive, antidiuretische sowie prohypertrophe Eigenschaften und fördern so im Falle abgeschwächter Pumpfunktion des Herzens die Aufrechterhaltung des Blutdrucks und damit die adäquate Perfusion lebenswichtiger Organe. Ihr chronischer Einfluss bewirkt allerdings eine kardiale Mehrbelastung, die im Sinne eines Circulus vitiosus wiederum zur Minderung der Herzfunktion beiträgt.56 Auch die Plasmaspiegel von Entzündungsmediatoren wie dem Tumornekrosefaktor α (TNFα) und Interleukinen (IL) sind bei Herzinsuffizienz erhöht. Es wurde gezeigt, dass sowohl TNFα als auch IL-1β kardiale Hypertrophie und die Induktion fetalen Genprogrammes stimulieren können.6

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Biologische Gegenspieler dieses Systems sind die natriuretischen Peptide57-67, Stickstoffmonoxid68, Adrenomedullin69-71, Bradykinine72 und Prostaglandine73. Sie wirken durch natriuretische, diuretische sowie antihypertrophe Effekte kardioprotektiv und sind beim Vorliegen einer Herzinsuffizienz ebenfalls aktiviert. Mit der Entwicklung einer Herzinsuffizienz kommt es jedoch zum Überwiegen der chronisch herzschädigenden Einflüsse kardiostimulatorischer Faktoren und zur Progredienz der Erkrankung bis hin zum Tod.

Warum kardioprotektive Substanzen diesen Prozess nicht aufhalten können, ist unbekannt. Die Interaktion zwischen den einzelnen Faktoren erscheint komplex und ist mit dem jetzigen Stand der Forschung nur in Ansätzen aufgeklärt. Vor diesem Hintergrund stellen die folgenden Abschnitte das bisherige Wissen über die natriuretischen Peptide und ihre Interaktion mit anderen neurohumoralen Systemen bei der Herzinsuffizienz zusammenfassend dar.

1.2  Die natriuretischen Peptide

Schon 1956 konnten Kirsch et al.74 in atrialen Zellen elektronenmikroskopisch Granula nachweisen, die denen endokriner Drüsen ähnelten. 1981 führten de Bold et al.75 dann ein bahnbrechendes Experiment durch, welches zeigte, dass intravenös injizierter Extrakt atrialen Myokardiums eine schnelle und potente natriuretische Antwort bei Ratten hervorrief. Purifikation und Charakterisierung der für diesen Effekt verantwortlichen Substanz führten kurze Zeit später zu der Entdeckung des atrialen natriuretischen Peptids (ANP).76,77 1988 wurde ein weiteres natriuretisches Peptid aus Schweinehirn isoliert und entsprechend seines Ursprungsorgans „brain natriuretic peptide“ (BNP) genannt.78 Spätere Studien zeigten jedoch, dass auch BNP vorwiegend im Herzen synthetisiert wird.79 Ebenfalls 1988 wurde Urodilatin aus humanem Urin isoliert, analysiert und als Mitglied der natriuretischen Peptidfamilie identifiziert.80 Urodilatin wird in der Niere freigesetzt und scheint vor allem lokal renale Wirkungen zu vermitteln.81,82 Zwei Jahre später isolierten Sudoh et al.83 CNP (C-type natriuretic peptide) aus Schweinehirnzellen. Es wird überwiegend im Gehirn und vaskulären Endothelzellen synthetisiert84-86 und scheint bei sehr geringen Plasmaspiegeln vornehmlich parakrin zu wirken87. Das zuletzt entdeckte natriuretische Peptid ist das DNP (Dendroaspis natriuretic peptide). Es wurde 1992 im Gift der namensgebenden Schlangenart Dendroaspis angusticeps gefunden und später auch in humanem Gewebe nachgewiesen.88 ,89 Über seine physiologische Bedeutung ist jedoch noch wenig bekannt.

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Zusammenfassend besteht die Familie der natriuretischen Peptide (NP) nach dem derzeitigen Forschungsstand aus fünf Peptidhormonen (ANP, BNP, CNP, DNP und Urodilatin), welche ausgeprägte strukturelle Gemeinsamkeiten aufweisen (Abb.1; DNP ist nicht abgebildet).

Abbildung 1: molekulare Struktur der natriuretischen Peptide (Abbildung zum Teil aus Forssmann et. al 1998 242)

Charakteristischerweise bilden sie aufgrund einer intramolekularen Disulfidbrücke eine 17 Aminosäuren umfassende Ringsstruktur aus, die für die Rezeptorbindung und damit die biologische Wirkung der NPs essentiell zu sein scheint.90

1.2.1  Rezeptoren

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NP-Rezeptoren (NPR) befinden sich in einer Vielzahl von Organen, unter anderem: Niere, Gefäßsystem, Herz, Lunge, Nebennieren, Gehirn, Fettgewebe, Auge, Gastrointestinaltrakt, Knochen, schwangerer Uterus und Plazenta.65 ,91,92,94 -100

Vier Rezeptorsubtypen sind bisher beschrieben worden, namentlich NPR-A, -B, -C und -D.

Der NPR-A ist ein Transmembranprotein, das in seiner Struktur den Rezeptoren von Wachstumshormonen und Zytokinen ähnelt. Er besteht aus einer extrazellulären Hormonbindungsdomäne (Affinität für ANP > BNP >> CNP101), einer Transmembrandomäne und einem intrazellulären Proteinanteil, der Guanylatzyklaseaktivität besitzt.102 Der NPR-B ist dem NPR-A in Aufbau und Funktionsweise sehr ähnlich, bindet jedoch bevorzugt CNP.103 In Abwesenheit eines Ligands liegen die Rezeptoren als Homodimere oder Homotetramere in stark phosphorylierter Form mit geringer Guanylatzyklaseaktivität vor. Die Bindung von ANP bewirkt eine Konformationsänderung des Rezeptorproteins sowie die Aktivierung der Guanylatzyklase (GC) und somit die Bildung des second messengers cGMP (zyklisches Guanosinmonophosphat). Die Aktivierung der Rezeptoren führt im Folgenden zu ihrer Dephosphorylierung. Sie werden auf diesem Wege gegenüber natriuretischen Peptiden desensitiviert womit die Lösung der Ligand-Rezeptor-Bindung erleichtert wird. Nicht nur der adäquate Ligand ANP selbst, sondern auch andere, in den Krankheitsprozess der Herzinsuffizienz involvierte Substanzen wie ADH, AngII und ET-1 sind im Stande eine Dephosphorylierung des Rezeptormoleküls und damit eine Wirkungsabschwächung natriuretischer Peptide hervorzurufen.102 Dies erfolgt an anderer Stelle über die Stimulation der Proteinkinase C und bewirkt eine verringerte Bildung von cGMP nach Rezeptoraktivierung durch natriuretische Peptide. Ein weiterer Mechanismus, der die Minderung der ANP-Wirkung bei Herzinsuffizienz erklären könnte, ist die Rezeptordownregulation Auch hierbei konnte ein Zusammenhang mit insuffizienzkorrelierten Vasokonstriktoren (ADH und AngII) hergestellt werden.104 Im insuffizienten Herzen wurden erniedrigte Werte für NPR-C-mRNA gemessen, die Transkripte von NPR-A und NPR-B waren dagegen erhöht. In Gefäßmuskelzellen wiesen mehrere Arbeitsgruppen eine Herabregulierung von NP-Rezeptoren in vitro nach. Zur Downregulation renaler NP-Rezeptoren liegen widersprüchliche Daten vor und adrenale Rezeptoren sowie solche in der subfornikalen Region und Area postrema scheinen bei Herzinsuffizienz nicht downreguliert zu werden.102 Die pathophysiologische Bedeutung dieser Daten ist noch zu evaluieren.

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Die Bindung von ANP an NPR-A und -B ist chloridabhängig, wobei eine niedrige Chloridko n zentrationdie ANP-Bindung blockiert.105 Dies könnte einen weiteren feed back Mechanismus zur Modulation der ANP-Wirkung darstellen, da hierbei durch eine eingetretene ANP-Wirkung (Kochsalzausscheidung mit entsprechendem Absinken der Chloridkonzentration) die fortlaufende Signalübermittlung vermindert wird.

In den meisten Geweben ist die Dichte des NPR-C höher als die von NPR-A und -B; in Endothelzellen z.B. gehören 94% der Rezeptoren zum Typ C.106 Seine kurze intrazelluläre Domäne besitzt keine Guanylatzyklasefunktion. An den NPR-C binden alle natriuretischen Peptide.107 Nach der Bindung wird der Ligand-Rezeptor-Komplex internalisiert und das natriuretische Peptid lysosomal hydrolysiert. Der Rezeptor hingegen wird erneut auf der Zelloberfläche exprimiert.108 Auf diese Weise fungiert der NPR-C als Clearance-Rezeptor für natriuretische Peptide. Zu erwähnen bleibt hierbei, dass es bei NPR-C knockout Mäusen zwar zu einer verlängerten Halbwertszeit von ANP kam, die basalen Plasmaspiegel des Hormons unterschieden sich jedoch nicht von den Wildtyp-Kontrollen.109 Bei der Regulation der NP-Plasmakonzentration scheinen daher andere Mechanismen eine Rolle zu spielen.

Die Aktivierung des NPR-C führt über inhibitorische G-Proteine auch zu einer Hemmung der Adenylatzyklase mit konsekutiver Senkung der intrazellulären cAMP-Konzentration (zyklisches Adenosinmonophospat). Auch eine Aktivierung des Phosphoinositol-Weges wurde beobachtet, könnte jedoch auch sekundär zur Wirkung auf die Adenylatzyklase auftreten.106

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Auch der NPR-C wird in seiner Funktion von Faktoren beeinflusst, welche im Zustand der Herzinsuffizienz in veränderter Konzentration im Plasma vorliegen. Beispielsweise unterdrückt AngII über eine PKC-Aktivierung die NPR-C vermittelte Adenylatzyklasehemmung. Noradrenalin sowie cAMP führen zu einer Rezeptordownregulation.106

Der vierte Rezeptor der natriuretischen Peptide, der NPR-D, wurde bisher nur in Gehirnzellen des Aals nachgewiesen und ist nicht an eine Guanylatzyklase gekoppelt.110 Seine biologische Funktion ist nicht bekannt.

1.2.2  Wirkungen

Wie die Vielfalt NP-Rezeptor-ausgestatteter Organe schon erahnen lässt, existiert ein weitgefächertes Wirkspektrum der natriuretischen Peptide, wobei ANP und das (infolge ähnlicher Rezeptorpräferenz vergleichbar agierende) BNP im Mittelpunkt der folgenden Abhandlung stehen sollen. Ihre am längsten bekannten Effekte sind Natriurese und Diurese 57 ,58 Die Steigerung der glomerulären Filtrationsrate (durch Dilatation der afferenten und Konstriktion der efferenten Arteriole)112 sowie die direkte Hemmung des Na+-Transports in proximalem Tubulus und Sammelrohr113,114 spielen bei der Vermittlung dieser Wirkungen eine Rolle. Ein indirekter Beitrag wird auch dank Antagonisierung der antidiuretischen Wirkung von ADH115 und des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems geleistet, letzteres mittels Hemmung der Aldosteronfreisetzung sowie der Reninsekretion.116-118 Diese Antagonisierung der darüber hinaus vasokonstriktorisch wirkenden Substanzen AngII und ADH (und ebenso von ET-1 und Katecholaminen119) steuert außerdem einem weiteren wichtigen Aspekt der NP-Wirkung bei: der Senkung des arterie l len Blutdrucks. Mäuse, die nicht über ein ANP-Gen verfügen, entwickelten demgemäss eine chronische Hypertonie.59 Durch Herabsetzung der Katecholaminsynthese und -freisetzung in den Nervenendigungen des Sympathikus beeinflusst ANP direkt die sympathische Modulation des Gefäßtonus. Ferner bewirkt die Aktivierung guanylatzyklasegekoppelter Rezeptoren eine Relaxation von Gefäßmuskelzellen, wobei in diesem Zusammenhang auch CNP eine Rolle spielen könnte. Zu einer Vasodilatation führt außerdem die Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) in Endothelzellen (mit anschließender Diffusion zur Gefäßmuskulatur und dortiger Wirkungsentfaltung), hervorgerufen durch die ANP-vermittelte Aktivierung der endothelialen NO-Synthase (eNOS). ANP hemmt auch die Synthese und Freisetzung von TNFα in Makrophagen und dämmt damit seine potentiell fördernde Wirkung auf die Entwicklung einer Herzinsuffizienz. Calderone bringt dies in seinem kürzlich veröffentlichten Review120 mit der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) in Verbindung, die einen Teil dieser krankheitsfördernden Wirkungen von TNFα vermitteln soll.

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Ein weiterer Angriffspunkt zur Regulation des Blutdrucks ist die Gefäßpermeabilität. ANP-Infusionen erhöhen diese und bewirken so eine Volumenumverteilung von intravasal nach interstitiell, welche wiederum einen hypotensiven Effekt darstellt. 121

Im Gefäßsystem provoziert ANP außerdem antiproliferative Reaktionen. Sie wurden sowohl in Endothelzellen122 als auch in den glatten Gefäßmuskelzellen122-124 nachgewiesen; in der Gefäßmuskulatur unterdrückt es ferner die Produktion extrazellulärer Matrix.

Der Hauptsyntheseort von ANP und BNP, das Herz, exprimiert selbst auch NP-Rezeptoren. In beiden Vorhöfen und im linken Ventrikel wurde mRNA der Rezeptortypen A, B und C gefunden. Auf Kardiomyozyten findet sich vor allem der NPR-A, wogegen auf kardialen Fibroblasten der NPR-C prädominant zu sein scheint.120 NP-vermittelte Wirkungen am Herzen umfassen die Hemmung der Proliferation kardialer Fibroblasten125 sowie die Suppression deren Kollagensynthese126. Auf Herzmuskelzellen wirkt ANP antihypertroph.60-62 Diese Effekte sprechen für ein umfangreiches protektives Potential der natriuretischen Peptide im Bezug auf die maladaptive Umstrukturierung kardialen Gewebes bei der Ausbildung einer Herzinsuffizienz.

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Wieso es trotzdem zu einem Überwiegen schädigender Einflüsse und der Progredienz der Erkrankung kommt ist bisher nicht ausreichend geklärt. Veränderungen an den Rezeptoren können zur Wirkungsabschwächung natriuretischer Peptide im Sinne einer Hormonresistenz führen und wurden (wie unter 1.2.1 beschrieben) detailliert untersucht. Demgegenüber scheint es auch zur Modulation der ANP-Freisetzung bei Herzinsuffizienz zu kommen. Die vorliegende Arbeit soll einen Beitrag zum Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen dieser Variation leisten.

1.2.3  Kinetik

1.2.3.1  Synthese

Das ANP-Gen befindet sich auf Chromosom 1 und kodiert mit 3 Exons das Vorläuferprotein PräProANP134-138 (Abb.2). Durch Abspaltung des sogenannten Signalpeptids wird der Transport über die Membran des endoplasmatischen Retikulums ermöglicht und es entsteht ProANP, die Hauptspeicherform von ANP in kardialen Myozyten.139-141 Dies liegt dort in Zellmembran-benachbarten Granula vor und wird in Reaktion auf adäquate Sekretionsreize via Exozytose freigesetzt.142,143 Im Zuge der Freisetzung erfolgt durch die Serinprotease Corin144 die Spaltung des 126 Aminosäuren umfassenden ProANP in das C-terminale und biologisch aktive ANP99-126 und das N-terminale Peptid (ANP1-98). In einigen Publikationen wurden auch für das C-terminale Peptid und seine Spaltprodukte spezifische Wirkungen beschrieben.145-147

Abbildung 2: schematische Darstellung der ANP-Synthese (Abbildung aus Ruskoaho 1992236)

1.2.3.2  Freisetzung

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Bei normaler Herzfunktion wird ANP vor allem in den Vorhöfen synthetisiert und freigesetzt.148 Für die Freisetzung des Hormons sind verschiedene Stimuli nachgewiesen worden. Der am längsten bekannte und äußerst potente Sekretionsreiz ist die mechanische Dehnung kardialer Myozyten.149,150 Sein exakter Transduktionsmechanismus ist nicht bekannt, es sind jedoch eine Vielzahl von Einflussfaktoren beschrieben worden, wie z.B. die zelluläre Ca 2+ -Homöostase. So wurde die ANP-Freisetzungsreaktion durch Dehnung kardialen Gewebes unter der Blockade dehnungsaktivierter Ionenkanäle151 und Hemmung der Ca2+ -Abgabe aus dem sarkoplasmatischen Retikulum 152-154vermindert. Auch die Inhibition von Ca2+ -Calmodulin 153 ,155,156 und der Proteinkinase C 158,159 führte zu einer Abschwächung der dehnungsinduzierten ANP-Sekretion. ET 1 dagegen steigert die Freisetzung bei Vorhofdehnung 160 ,161 , wobei dieser Effekt durch die Einwirkung von NO negativ beeinflusst wird 162 . Ang II hat wie ET-1 auch eine verstärkende Wirkung auf die ANP-Sekretion, jedoch geringer ausgeprägt. 163

Nicht nur die dehnungsinduzierte sondern auch die Freisetzung von ANP wird durch verschiedenste Plasmafaktoren beeinflusst.Sie wird durch ET-1 via Bindung an den G-Protein-gekoppelten ETA-Rezeptor erhöht. 164-166 Dieser bringt eine Signalkaskade in Gang, die zu einer intrazellulären Ca2+ -Mobilisation und Aktivierung der Proteinkinase C führt (siehe 1.1.2). Dass diese intrazellulären Vorgänge in die Vermittlung der ANP-Sekretionssteigerung eingebunden sind, wird dadurch unterstrichen, dass Ca2+-Kanal-Antagonisten 167-170 und die Inhibition von Calmodulin 171 ,172 sowie der Proteinkinase C 171,173 zu einer Herabsetzung der ET-1-induzierten ANP-Freisetzung führen. Auch Noradrenalin bewirkt durch die Bindung an ebenfalls G-Protein-gekoppelte α-Rezeptoren und die konsekutive Aktivierung der Proteinkinase C157 sowie die zytosolische Erhöhung der Ca2+-Konzentration157,174 eine Freisetzung von ANP aus Kardiomyozyten. Weiterhin binden ADH160 ,175 -177 und Ang II 178,179 an GPgRs und haben eine ANP-Sekretionssteigerung zu Folge.

Die PKC-Downstream-Transduktion birgt indes noch viele Rätsel. Bekannt ist eine ANP-Geninduktion durch die Stimulation der MAP-Kinase-Kaskade.180,181 Die Freisetzung von ANP durch ADH182, α-Rezeptor-Agonist Isoproterenol183, PKC-Stimulator PMA184 sowie durch Ca2+-Kanalöffner177 wird unter der Einwirkung von Cyclooxigenase-Hemmstoffen abgeschwächt, sodass auch Prostaglandine in den Prozess der ANP-Sekretion involviert zu sein scheinen.

↓17

Gehemmt wird die ANP-Basalfreisetzung ebenfalls durch NO185,186 und Adrenomedullin187.

Im Zustand der Herzinsuffizienz sind die basalen Plasmaspiegel von biologisch aktivem ANP63-67 und dem N-terminalen Peptid188-191 erhöht. In vivo Experimente zeigten bei Vorhofdehnung jedoch eine abgeschwächte ANP-Freisetzung bei Herzinsuffizienz.205,210,211,237

Die Plasmaspiegel korrelieren mit dem Schweregrad der Erkrankung93 und lassen sich aus diesem Grund diagnostisch einsetzen. In diesem Zusammenhang scheint allerdings die Messung von BNP dem ANP als prognostischem Marker bei der Herzinsuffizienz überlegen zu sein.192 Wie es zu der Spiegelerhöhung bei Herzinsuffizienz kommt, ist nicht vollständig geklärt. Über eine Induktion am eigentlichen Syntheseort, den Herzvorhöfen, bestehen divergente Ansichten. So liegen widersprüchliche Daten zur ANP-mRNA-Menge in den Vorhöfen insuffizienter Herzen vor.197,200,214Auch in Bezug auf die Konzentration synthetisierten ANPs in atrialem Gewebe194,200,214 und den Gesamthormongehalt der hypertrophierten Vorhöfe194,214,219 gehen die Angaben auseinander.Das für die vorliegenden Versuche angewendete Shuntmodell an der Ratte ergab in früheren Studien normale bis erhöhte mRNA-Mengen237,240,241 und eine erhöhte oder erniedrigte Konzentration von ANP237,238 in den Herzvorhöfen. Der atriale Gesamthormongehalt war beim Shunt normal bis erhöht.237,238

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Wahrscheinlich kommen die erhöhten ANP-Plasmaspiegel bei der Herzinsuffizienz vor allem durch eine vermehrte Freisetzung aus den Herzkammern zustande. Diesbezüglich wurden beim aortokavalen Shunt an der Ratte237,240,241 und an anderen Tiermodellen der Herzinsuffizienz193,197,214 sowie bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie196,199,200 erhöhte Mengen an ANP-mRNA in den Herzkammern nachgewiesen. Die ventrikuläre ANP-Expression wird in Verbindung mit der Reinduktion fetaler Genprogramme28,198 im Zuge der Entwicklung kardialer Insuffizienz gesehen. Auch von vermehrtem Vorliegen synthetisierten Hormons im Ventrikelgewebe liegen zahlreiche Nachweise an unterschiedlichen experimentellen Insuffizienzmodellen193,194(u.a. beim aortokavalen Shunt an der Ratte237,238) sowie bei humaner Herzinsuffizienz200,217,218 vor. Ungeklärt bleibt jedoch vorerst, wodurch die vermehrte ANP-Synthese und -Freisetzung hervorgerufen wird. Bei der Herzinsuffizienz ist eine erhebliche Anzahl an Faktoren aktiviert (Noradrenalin49,50, ET-151-53, Ang II54, ADH55,NO68, Adrenomedullin69-71, Prostaglandine73), die in oben beschriebener Weise die Freisetzung von ANP beeinflussen können. Zusätzlich ist es nicht auszuschließen, dass sich ihr Wirkmechanismus bei der Entwicklung einer Herzinsuffizienz verändert. So wurde beispielsweise für AngII ein förderlicher Effekt auf die ANP-Freisetzung aus atrialem Gewebe der Ratte festgestellt.178,179 Verschiedene Studien an Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie211 bzw. an Tiermodellen der Herzinsuffizienz212,237 deuten allerdings darauf hin, dass eine Wirkungsminderung von Ang II (via ACE-Hemmer bzw. ATII-Rezeptor-Blockade) bei der Herzinsuffizienz die ANP-Plasmaspiegel anheben kann. Da Ang II ebenso wie mehrere andere bei Herzinsuffizienz aktivierte Plasmafaktoren die Aktivität der Proteinkinase C beeinflusst, ist es von Interesse die Rolle der PKC bei der Regulation der ANP-Freisetzung näher zu erforschen. Die der vorliegenden Arbeit zugrundeliegenden Versuche sollen zur Klärung dieser Problematik einen Beitrag leisten.

1.2.3.3  Abbau

Nach der Freisetzung aus den Kardiomyozyten, verweilt ANP durchschnittlich nur 4,5 Minuten im Plasma.201 Es wird vor allem durch die Bindung an den NP-Rezeptor C und enzymatische Degradation via neutrale Endopeptidase 24.11 abgebaut.202

1.3  Fragestellungen

Im Vorangegangenen wurde die Entstehung der Herzinsuffizienz basierend auf der neurohormonalen Hypothese beschrieben. In diesem Kontext fokussiert die vorliegende Arbeit auf das kar-dioprotektiv wirkende atriale natriuretische Peptid. Es liegt bei der Herzinsuffizienz in erhöhtem Maße im Plasma vor63-67 und wurde mit Blick auf seine kardiale Freisetzung in vitro untersucht. Zwei Aspekte standen diesbezüglich im Vordergrund: die stimulierte ANP-Freisetzung durch Vorhofdehnung und die basale ANP-Freisetzung unter Ruhebedingungen.

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Folgenden Fragestellungen wurden dazu bearbeitet:

  1. Wie ist die basale ANP-Freisetzung bei Herzinsuffizienz in vitro verändert?
  2. Weicht die dehnungsinduzierte ANP-Sekretion bei der Herzinsuffizienz auch in vitro vom Zustand normaler Herzfunktion ab?
  3. Welche Funktion hat die Proteinkinase C bei der Regulation der ANP-Freisetzung bei der Herzinsuffizienz?
  4. Stehen die ANP-Plasmakonzentration und hämodynamische Parameter wie die Koronarperfusion in Zusammenhang mit der Freisetzung von ANP?

Zu diesem Zweck wurde die ANP-Freisetzung an einem Modell der Herzinsuffizienz (aortokavaler Shunt an der Ratte) unter Ruhebedingungen, bei Vorhofdehnung sowie unter Stimulation der Proteinkinase C untersucht und mit gesunden Kontrollgruppen verglichen.


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26.10.2005