2. MATERIAL UND METHODEN

2.1  Tierhaltung

↓20

Für die Versuche sind ausschließlich männliche Wistar-Ratten (Moellegaard-Tierfarm, Schönwalde) verwendet worden. Sie wurden in einem 12-h-Tag-Nacht-Rhythmus gehalten, erhielten handelsübliches Futter und hatten freien Zugang zum Trinkwasser.

2.2  Aortokavaler Shunt

Die Methode wurde erstmalig von Garcia und Diebold 1990203 angewendet und mit modifizierter Technik wie folgt durchgeführt:

Bei 240–260g schweren Ratten wurde unter Äthernarkose (Diethyläther, Hedinger Chemikalien, Stuttgart) nach Rasur des Fells und Desinfektion der Bauchhaut die Abdominalhöhle eröffnet sowie die Vena cava inferior und Aorta abdominalis stumpf präpariert (Abb. 3a). Es folgte ein kurzzeitiges Abklemmen der Aorta unterhalb der Abgänge der Aa. renales zwecks Unterbrechung des arteriellen Blutflusses. Ein mit leichtem Druck auf den distalen Abschnitt der V. cava inferior aufgesetzter Tupfer verhinderte den venösen Rückstrom in das Operationsareal. In diesem Areal ließ sich dann die V. cava inferior mit einer Strauß-Kanüle (1,8mm; Braun, Melsungen) rechtsseitig punktieren und nach weiterem Vorschieben mit Perforation der aneinandergrenzenden Wände von Aorta und Vena cava eine Verbindung zwischen diesen beiden Gefäßen schaffen (Abb. 3b.). Die Kanüle wurde anschließend zügig zurückgezogen, die Einstichstelle mit Zyanoacrylatkleber (Instant Krazy Glue, Bordon Company, Willowdale, Ontario, Kanada) verschlossen und die Blutzirkulation wieder hergestellt.

↓21

Bei Gelingen der Shuntoperation war kranial der geschaffenen Fistel ein deutliches Anschwellen der unteren Hohlvene mit Annehmen der helleren Rotfarbe arteriovenösen Mischblutes zu beobachten (Abb. 3c). Abschließend wurde die abdominale Muskelschicht und die Haut via Knopfnahttechnik verschlossen.

Die Kontrolltiere erfuhren bis auf die Gefäßpunktion eine identische Behandlung.

Abbildung 3: Durchführung der Shunt-Operation.

2.3  Organentnahme

↓22

Vier Wochen nach Shunt-OP wurde unter Anästhesie mit Chloralhydrat (Merck, Darmstadt) der Thorax eröffnet, das schlagende Herz mit Gefäßstiel entnommen und in eiskalter KREBS-Lösung (Zusammensetzung siehe 2.4.2. Technische Umsetzung) von eventuell mitentfernten Gewebsresten befreit.

Nach Darstellung des ca. 3 mm langen Aortenstumpfes wurde das Herz umgehend an das Langendorff-Perfusionssystem angeschlossen und für den darauffolgenden Versuch präpariert.

2.4  Arbeit am isoliert schlagenden Herzen

2.4.1 Perfusionsprinzip

Mit der verwendeten Apparatur (Isoliertes Herz Typ 830 Gr.3, Hugo Sachs Elektronik, March-Hugstetten) war es möglich, das in vitro spontan schlagende Herz mit Hilfe zweier unterschiedlicher Perfusionsmodi zu untersuchen.

↓23

Zunächst wurde das Herz mit dem Aortenstumpf frei hängend an der Aortenkanüle (Abb. 4) angebracht. Die über die Aortenkanüle zugeführte, blutersetzende Perfusionslösung strömte mit einem Druck von 65 mmHg retrograd (entgegengesetzt der physiologischen Flussrichtung) in die Aorta und gelangte bei intakter Aortenklappe nicht in den linken Ventrikel, sondern floss über die Koronararterien und den Sinus coronarius in den rechten Vorhof. Von dort aus lief es zu einem Teil durch die Hohlvenenstümpfe und zum anderen Teil durch die Trikuspidalklappe, den rechten Ventrikel und schließlich den verbliebenen proximalen Teil der A. pulmonalis ab und konnte über eine Öffnung im unteren Bereich des Sammelgefäßes aufgefangen werden.

Dieser retrograde Perfusionsmodus wird im Folgenden als Langendorff-Modus (LD) bezeichnet. Durch Umstellen des Haupthahns war es binnen weniger Sekunden möglich, zum antegrad verlaufenden Perfusionsmodus zu wechseln. Bei diesem sogenannten Working-Heart-Modus (WH) wurde das Perfusat mit einem Druck von 10 mmHg über eine abflussdicht im linken Atrium platzierte Kanüle zugeführt. Dies hatte zum einen den Effekt der Vorhofdehnung, zum anderen förderte das spontan schlagende Herz die Perfusionslösung aktiv in den linken Ventrikel und gegen einen einstellbaren Widerstand von in diesem Fall 50 mmHg (Simulation der Nachlast) in die Aorta. Das linke Herz leistete somit Druck-Volumen-Arbeit. Das in die Aorta gepumpte Perfusat floss anschließend in die Koronararterien und nahm im weiteren den oben beschriebenen Verlauf. Überschritt das Herzminutenvolumen den koronaren Fluss, so strömte das zusätzliche Volumen über den Nachlastschlauch direkt in das Sammelgefäß und konnte zusammen mit dem übrigen Perfusat für weitere Messungen aufgefangen werden.

Um ein Entweichen von Flüssigkeit aus dem linken Vorhof zu verhindern, sind die Venae pulmonales vor Versuchsbeginn mit Perma-Hand Seide (3-0, Ethicon, Norderstedt) ligiert worden.

↓24

Abbildung 4: Versuchsaufbau zur Arbeit mit isolierten Herzen. In der rechten Position des Haupthahns wurde das Herz im Langendorff-Modus retrograd perfundiert. Durch Umschalten nach links in den Working-Heart-Modus wechselte die Flussrichtung des Perfusats nach antegrad. (Abbildung zum Teil aus der Bedienungsanleitung zur Apparatur isoliertes Herz Größe 3, Typ 830; Version 1.0 243 )

2.4.2 Technische Umsetzung

Als Perfusat wurde eine Variation der KREBS-HENSELEIT-Lösung mit folgender Zusammensetzung in mmol/l verwendet: NaCl 118; KCl; 4,70; CaCl2 1,50; MgSO4 2,10; NaHCO3 24,7; KH2PO4 0,23; Glukose 11,1; EDTA 0,06. Eine Schlauchpumpe beförderte die Lösung in den temperierbaren (37°C) Oxygenator, an dessen zur Oberflächenvergrößerung kugelig ausgebuchteter Innenwand sie als dünner Flüssigkeitsfilm entlang lief und durch das eingeleitete Carbogen (5Vol.% CO2, 95 Vol.% O2, Fa. Linde) oxygeniert und auf einen pH-Wert von 7,4 gebracht wurde.

Ein manuell in den linken Ventrikel eingeführter Mikro-Tip-Katheter-Druckaufnehmer (Millar Instruments, Houston) und zwei dünne Schlauchkatheter im Aortenwindkessel/Blasenfang und Vorhofkanüliersystem mit angeschlossenem Druckwandler (P23XL, Statham) und Verstärker (TA 11, Gould Electronics, Dietzenbach) ermöglichten die Messung der Druckbedingungen in der Aorta, dem linkem Vorhof und dem linken Ventrikel.

2.4.3 Versuchsdurchführung

↓25

Um die ANP-Freisetzung am Herzen zuvor shuntoperierter Tiere vergleichend mit der an Kontrolltierherzen zu untersuchen, wurden zwei Versuchsreihen (A & B) durchgeführt. Vor Beginn jedes einzelnen Experiments erfolgte, nach Einbringen des zu untersuchenden Herzens in das Perfusionssystem und dessen Präparation unter Perfusion im Langendorff-Modus (LD), eine 30minütige Äquilibrationsphase, in der keine Manipulationen stattfanden.

Zu Versuch A: Es wurde auf eine etwaige Abweichung der ANP-Freisetzung auf den adäquaten Reiz (Vorhofdehunung) bei Herzinsuffizienz untersucht. Dazu wurde die dehnungsinduzierte ANP-Sekretion vergleichend zwischen Kontrolle (n=13) und Shunt (n=14) analysiert. Im Anschluss an die Äquilibrationsphase umfasste dieser Versuch einen Zeitraum von 40 Minuten und bestand aus drei zeitlich aufeinanderfolgenden Abschnitten (Abb. 5):

(1) Baseline (0.-17.min): Unter Perfusion im LD-Modus wurden zu den Zeitpunkten 0.•2•.4.•6.•8.•10.•11.•13.•15. Minute über je 60s Perfusat aufgefangen und gewogen. Anschließend wurden davon ca. 1-2ml umfassende Proben entnommen und sofort eiskalt gekühlt.

↓26

(2) Stretch (17.-23.min): Mit Beginn der 17. Minute wurde auf den WH-Modus umgestellt. Dadurch kam es in oben beschriebener Weise zu einer Dehnung der Wand des linken Atriums. Die Probenentnahme erfolgte nach dem Schema: 17.•17,5.•18.•18,5.•20.•22. Minute. Die Entnahmezeiträume 17, 17,5 und 18 betrugen dabei je 30s, die folgenden jeweils 60s. Wieder wurde das aufgefangene Perfusat gewogen (wenn nötig auf 60s normiert) und die entnommenen Proben sofort in Eis gekühlt.

(3) retrograde Perfusion (23.-40.min): Die Rückstellung auf den LD-Modus fand zu Beginn der 23.Versuchsminute statt. Während der 25., 30., 35. und 40. Minute wurde die Perfusionslösung über jeweils 60s aufgefangen und anschließend wie in den Schritten eins und zwei verfahren.

Abbildung 5: Versuchsablauf A; LD = (retrograder) Langendorff-Modus; WH = (antegrader) Working-Heart-Modus.

↓27

Die eisgekühlten Proben wurden nach Versuchsende umgehend bei -80°C eingefroren und bis zur Bestimmung der enthaltenden ANP-Konzentration mittels Radioimmunoassays gelagert.

Zu Versuch B: Hierbei wurde die ANP-Sekretion unter Einwirkung eines Proteinkinase-C-Aktivators (Phorbol-12-Myristat-13-Azetat, PMA) im retrograden LD-Perfusionsmodus untersucht.

In einer Zeit von 60 min wurde das Perfusat kontinuierlich aufgefangen und das entsprechende Gefäß zur Probenentnahme und Registrierung des Perfusionsvolumens alle 2 min gewechselt. Die ca. 1-2ml umfassenden Proben wurden sofort eiskalt gekühlt und nach Beendigung des Experiments bei –80°C gelagert.

↓28

Die ersten 12 min des Versuchs verliefen ohne Zugabe von PKC-stimulierenden Substanzen. Ab Beginn der 13.Minute bis Ende des Experiments wurde dann mit PMA – enthaltendem Perfusat (50nM) oder mit Vehikel stimuliert (Abb. 6).

Abbildung 6: Ablauf des Versuchs B; Langendorff-Modus entspricht retrograder Perfusion.

Diese Versuchsreihe wurde mit insgesamt 25 entnommenen Herzen durchgeführt, wobei die Zuteilung zu den verschiedenen Versuchsgruppen in Tabelle 1 zu sehen ist.

↓29

Tabelle 1 : Tieranzahl in den Versuchsgruppen.

Stimulation mit ♢

Vehikel

50 nM PMA

Kontrolle

5

5

Shunt

8

7

2.5  Bestimmung der diskutierten Parameter

2.5.1 Koronarperfusion

Um das Flüssigkeitsvolumen zu bestimmen, welches das zu untersuchende Herz in oben beschriebener Weise (2.4.1 Perfusionsprinzip) pro Minute passierte, wurde das Perfusat durch eine Öffnung im unteren Bereich der temperierten Herzkammer über einen Zeitraum von 0,5-2 Minuten aufgefangen und anschließend gewogen. Das gemessene Gewicht in Gramm ergab das geförderte Volumen in Milliliter und wurde durch die Anzahl der Minuten, in denen die Flüssigkeit gesammelt wurde, geteilt und ergab so das Perfusionsvolumen (VPerfusion) in ml/min.

2.5.2 ANP-Konzentration

Die ANP-Konzentration in den Perfusatproben wurde mittels eines spezifischen Radioimmuno-assays (RIA) unter der Verwendung eines ANP-Antikörpers (J. Gutkowska, Montreal, Kanada) von einer Mitarbeiterin des Labors bestimmt.

2.5.3 ANP-Sekretion

↓30

Anhand des Perfusionsvolumens (VPerfusion) und der gemessenen ANP-Konzentration im Perfusat (cANP) konnte die im Verlauf von einer Minute in die Perfusionsflüssigkeit sezernierte ANP-Menge (nANP) berechnet werden.

2.6  Statistische Auswertung

Bei den variablen Parametern (ANP-Freisetzung, ANP-Konzentration und Koronarperfusion) wurde zunächst die Fläche unter der Kurve berechntet, die durch die jeweiligen Werte des Parameters (Y-Achse) über den Zeitverlauf einer bestimmten Versuchsphase (X-Achse) entsteht.

↓31

Die Daten der Versuchsgruppen wurden mit dem Statistikprogramm SPSS®11.0 für Windows 2000 auf Normalverteilung getestet. Da diese nicht vorlag, wurden die Ergebnisse nichtparametrisch getestet. Bei zwei unabhängigen Stichproben wurde der Mann-Whitney-U-Test, bei mehreren unabhängigen Stichproben der Kruskal-Wallis-Test verwendet, um auf signifikante Unterschiede in den Versuchsgruppen zu prüfen. Abhängige Stichproben wurden mittels Wilcoxon-Test auf Signifikanz geprüft. Zur Analyse longitudinaler Daten kam die parameterfreie Varianzanalyse nach Brunner zum Einsatz (SAS®V8.2). Die Signifikanzgrenze wurde mit p<0,05 festgelegt.

Alle gruppenspezifischen Werte wurden in Form des Medians der betreffenden Versuchsgruppe angegeben. Zur Darlegung der Streuung der Werte, wurde der zugehörige Interquartilsbereich (75-25) in eckigen Klammern hinter dem Median aufgeführt.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.
DiML DTD Version 4.0Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML-Version erstellt am:
26.10.2005