4. DISKUSSION

4.1  Daten zum Shuntmodell

↓46

Als Modell der Herzinsuffizienz durch chronische Volumenbelastung wurde der aortokavale Shunt bei der Ratte gewählt. Das Herz wurde zur Durchführung der Experimente entnommen und isoliert schlagend untersucht, wobei die Perfusion unter konstanten Druckbedingungen aufrecht erhalten wurde. Zur Diskussion der Versuche wurden dabei folgende Parameter herangezogen:

↓47

Im Folgenden wurden die variablen Werte wie ANP-Freisetzung, ANP-Konzentration im Perfusat sowie die Koronarperfusion der isoliert schlagenden Herzen unter Ruhebedingungen aufgezeichnet (das heißt bei retrograder Perfusion während der Baseline der durchgeführten Versuche) und zwischen Shunt- und Kontrollgruppe verglichen. Auf diesem Wege sollen die Veränderungen im Ruhezustand bei Herzinsuffizienz am Modell herausgearbeitet werden. Darauf basierend werden im Anschluss die Veränderungen der Parameter bei Vorhofdehnung im Versuch A sowie bei Stimulation der Proteinkinase C im Versuch B, diskutiert.

4.1.1 Herzgewicht

Das Herzgewicht zuvor shuntoperierter Tiere war mehr als doppelt so groß wie das der Kontrolltiere. Eine gravierende Zunahme des Herzgewichts wurde bei Patienten mit Herzinsuffizienz von A. Linzbach schon 1960216 beschrieben. Für diesen Prozess scheinen vor allem myozytäre Hypertrophie und ein robustes Wachstum interstitieller Matrix verantwortlich zu sein, aber auch von kardiomyozytärer Hyperplasie wurde durch einige Autoren berichtet (in Übersicht abgehandelt durch Francis 20013).

↓48

Durch die Shunt-Operation wurde eine Verbindung zwischen abdomineller Aorta und Vena cava inferior geschaffen. Dadurch floss ein Teil des Herzminutenvolumens unter Umgehung der Kreislaufperipherie direkt zurück in den venösen Schenkel und zum Herzen, wodurch es zu einer verstärkten kardialen Volumenbelastung kam. Es ist anzunehmen, dass die dadurch zunehmende diastolische Wandspannung durch Bildung neuer hintereinander liegender Sarkomere8 ,10 -13 eine exzentrische Hypertrophie hervorrief, widergespiegelt in der deutlichen Gewichtszunahme der Herzen in der Shuntgruppe.

In der Literatur und auch durch unsere Arbeitsgruppe wurden zahlreiche Abweichungen der Hämodynamik shuntoperierter Ratten beschrieben. So kam es zu einer Erhöhung des zentralen Venendrucks bzw. rechtsatrialen Drucks237-239 und des linksventrikulären enddiastolischen Drucks238 ,240 sowie zu einer Abnahme des arteriellen Drucks238-240. Diese Abweichungen sind typisch für das Vorliegen einer Herzinsuffizienz.1 Eine starke Zunahme des Herzgewichts durch Shuntinduktion wurde auch von anderen Autoren beschrieben.237-241

Zusammenfassend kann der aortokavale Shunt an der Ratte als etabliertes und valides Modell der volumeninduzierten Herzinsuffizienz gewertet werden. Das in den hier dargestellten Versuchsreihen ermittelte Herzgewicht entsprach dem anderer Versuchsserien in unserer Arbeitsgruppe, in denen eine detaillierte hämodynamische Charakterisierung durchgeführt wurde.237,240 Um durch Manipulation mit kardialen Kathetern nicht auf die ANP-Freisetzung einzuwirken, wurde in den vorliegenden Versuchen auf eine erneute hämodynamische Messung verzichtet und die Zunahme des Herzgewichts in der Shuntgruppe als Ausdruck kardialer Insuffizienz interpretiert.

4.1.2 ANP – Freisetzung

↓49

Die ANP-Menge, die unter Baselinebedingungen pro Minute von den Herzen shuntoperierter Tiere sezerniert wurde, überstieg das Dreifache der Freisetzung in der Kontrollgruppe. Auch je Gramm Herzgewicht war die ANP-Freisetzung der Herzen von Shunttieren signifikant höher als in der Kontrollgruppe.

Die beobachtete Steigerung der ANP-Basalfreisetzung könnte die deutlich erhöhten ANP-Plasmaspiegel bei Patienten mit kardialer Insuffizienz63-67 erklären. Am Shuntmodell237-239 sowie an diversen anderen Modellen der Herzinsuffizienz193 ,194,214konnte bisher einheitlich eine Erhöhung der ANP-Spiegel im Plasma in vivo gezeigt werden. Das Fortbestehen der veränderten ANP-Freisetzung in vitro spricht hierbei für eine andauernde Störung, die auch in Abwesenheit von hämodynamischer Überbelastung und ohne den Einfluss von zirkulierenden Hormonen weiterbesteht.

In der Literatur besteht weitgehende Einigkeit darüber, dass die Induktion der ANP-Synthese in den Herzkammern eine wesentliche Rolle bei der Steigerung der ANP-Freisetzung bei Herzinsuffizienz spielt. Diesbezüglich wurden beim aortokavalen Shunt an der Ratte237 ,240,241 und an anderen Tiermodellen der Herzinsuffizienz193,197,214 sowie bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie196,199,200 erhöhte Mengen an ANP-mRNA in den Herzkammern nachgewiesen. Die ventrikuläre ANP-Expression wird in Verbindung mit der Reinduktion fetaler Genprogramme28 ,198 im Zuge der Entwicklung kardialer Insuffizienz gesehen. Auch von vermehrtem Vorliegen synthetisierten Hormons im Ventrikelgewebe liegen zahlreiche Nachweise an unterschiedlichen experimentellen Insuffizienzmodellen193 ,194(u.a. beim aortokavalen Shunt an der Ratte237,238) sowie bei humaner Herzinsuffizienz200,217,218 vor. In Anbetracht dieser Daten ist im vorliegenden Versuch eine wesentliche Beteiligung der Herzkammern an der vermehrten Basalfreisetzung von ANP aus den Herzen von Shunttieren sehr wahrscheinlich.

↓50

Mit der Anreicherung von ANP-Molekülen im ventrikulären Herzgewebe kann ANP über Rezeptoren auf den Kardiomyozyten und kardialen Fibroblasten auto- und parakrine Wirkungen entfalten, welche einem maladaptiven kardialen Remodeling entgegenwirken.60-62,125,126 Da trotz der protektiven Eigenschaften des Hormons eine extreme Gewichtszunahme der Herzen von Shunttieren (als Zeichen kardialer Hypertrophie und Fibrosierung im Zuge maladaptiven Remodelings) zu beobachten war, scheinen prohypertrophe Einflüsse auch im vorliegenden Insuffizienzmodell zu überwiegen.

Ob das vermehrt freigesetzte ANP der Herzen shuntoperierter Tiere auch aus den Vorhöfen stammt, ist auf dem derzeitigen Stand der Forschung nicht eindeutig zu beantworten.

Die Datenlage zur ANP-Synthese in den Vorhöfen präsentiert sich als widersprüchlich. Beim aortokavalen Shunt an der Ratte fanden sich normale bis erhöhte mRNA-Werte.237,240,241 Das Infarktmodell an der Ratte zeigte eine gesteigerte ANP-Expression.214,215 Bei kardiomyopathischen Hamstern reichten die Ergebnisse in Bezug auf die ANP mRNA jedoch von erhöhten219 über unveränderte221 bis zu signifikant erniedrigten Werten197. Eine Studie an Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie200 zeigte eine Verdopplung der atrialen ANPmRNA bei erkrankten Individuen. Die Konzentration von synthetisiertem ANP in den Herzvorhöfen war bis auf wenige Ausnahmen200 ,237in den meisten Studien zur Herzinsuffizienz erniedrigt.194,214,238

↓51

Da es jedoch auch in den Vorhöfen zu einer hypertrophen Gewebevermehrung bei Herzinsuffizienz kommt, wichen die Ergebnisse zum ANP-Gehalt der gesamten Vorhöfe in manchen Fällen von denen zur Konzentration, die sich auf das Gewicht bezieht, ab. Am Shuntmodell zeigten sich dadurch normale bis erhöhte ANP-Mengen in den Vorhöfen.237 ,238 Studien an kardiomyopatischen Hamstern zeigten dagegen widersprüchliche Ergebnisse.194,195,219

Der Anteil der Vorhöfe an der Basalfreisetzung bei Herzinsuffizienz ist folglich aufgrund widersprüchlicher Ergebnisse zahlreicher Studien bislang nicht zu eruieren und geht aus der aktuell bestimmten ANP-Sekretion des gesamten Herzen nicht hervor. Mit Blick auf die dargelegte Datenlage stammt das in der Shuntgruppe des aktuellen Versuchs vermehrt freigesetzte ANP mit großer Wahrscheinlichkeit im Wesentlichen aus den Herzkammern.

Wodurch die Induktion und Mehrfreisetzung von ANP aus den Herzkammern hervorgerufen wird, ist bislang nicht geklärt. Bei Herzinsuffizienz aktivierte neuroendokrine Faktoren wie Angiotensin II178,179, Endothelin 1164-166, Noradrenalin157,174 und ADH160,175-177 steigern die ANP-Freisetzung und könnten bei der Zunahme der ANP-Basalfreisetzung durch Shuntinduktion eine Rolle gespielt haben. Eine aktuelle Studie von Tran et al.213 zeigt eine gesteigerte Expression des ProANP-spaltenden Enzyms Corin im linken Ventrikel am Infarktmodell der Ratte sowie in hypertrophen Kardiomyozytenkulturen. Diese Ergebnisse deuten auf eine regulative Komponente der verstärkten ANP-Freisetzung aus den Ventrikeln bei der Herzinsuffizienz hin.

↓52

Der im aktuellen Versuch beobachtete massive Freisetzungsanstieg von ANP in der Shuntgruppe ist ein ausdrücklicher Hinweis darauf, dass der Zustand der Herzinsuffizienz nicht mit einer Insuffizienz der basalen ANP-Freisetzung verbunden ist. Vielmehr scheint hier eine periphere Resistenz der Rezeptor-tragenden Organe vorzuliegen, die im Fall der Niere schon wenige Jahre nach der Entdeckung von ANP nachgewiesen wurde207 ,208. Auf Rezeptorebene kommen mehrere Mechanismen für eine derartige Wirkungsabschwächung in Frage, darunter hormonelle Rezeptordesensitivierung209 und -downregulation104 sowie die chloridabhängige Modulation der Rezeptoraffinität gegenüber ANP105. Sie wurden unter 1.2.1 näher beschrieben.

4.1.3 ANP – Konzentration

Bei den Herzen der shuntoperierten Tiere war die Konzentration von ANP in der perfundierenden Flüssigkeit unter Baselinebedingungen höher als in der Kontrollgruppe. Setzt man modellhaft die ANP-Konzentration im Perfusat der ANP-Plasmakonzentration im lebenden Organismus gleich, entspricht diese Konstellation den in diversen Studien63-67 als erhöht erwiesenen ANP-Plamaspiegeln bei Herzinsuffizienz. Da Unterschiede zwischen den durchgeführten Versuchen bestanden, und das Blut am isoliert schlagenden Modellherz nicht zirkuliert sondern stetig neues/hormon-, enzym- und rezeptorfreies Perfusat zugeleitet wird, soll in der folgenden Diskussion der Versuchsergebnisse weniger auf die Basalkonzentration selbst als vielmehr auf deren Änderungstendenz nach Manipulation eingegangen werden.

4.1.4 Koronarperfusion

Die pro Zeiteinheit durch die Koronararterien fließende Flüssigkeitsmenge war bei den Herzen von Shunttieren signifikant erhöht. Da maschinell bedingt konstante Druckverhältnisse vorlagen, muss also der Gesamtquerschnitt der das Herz versorgenden Blutgefäße unter Ruhebedingungen größer gewesen sein, als das in der Kontrollgruppe der Fall war. Dieser Umstand kann prinzipiell durch zwei Mechanismen hervorgerufen werden: die Vergrößerung der Gefäßlumina (Dilatation) und die Bildung neuer Gefäße (Angiogenese).

↓53

Eine Koronardilatation erscheint in diesem Zusammenhang unwahrscheinlich. Bei der Herzinsuffizienz wird sogar eine Vasokonstriktion diskutiert.41 Durch bisherige Studien42-44 zur koronaren Ruhedurchblutung bei Herzinsuffizienz konnten jedoch keine einheitlichen Ergebnisse erzielt werden, sodass ein Beweis dieser pathologischen Vorgänge bislang ausblieb. Von einer Dilatation der Koronargefäße in der Shuntgruppe kann in Anbetracht der Datenlage allerdings nicht ausgegangen werden.

Folglich ließe sich die Zunahme des koronaren Perfusionsvolumens durch Shuntanlage eher mit einer Induktion der Angiogenese erklären. Tomanek und Torry206 konnten bei volumeninduzierter kardialer Hypertrophie eine verstärkte Angiogenese nachweisen. Somit kommt die Neubildung von Blutgefäßen in den Herzen von Shunttieren zur Begründung der erhöhten Koronarperfusion im Ruhezustand in Frage.

Je Gramm Herzgewicht zeigten sich zwischen Kontroll- und Shuntgruppe keine Unterschiede in der Koronarperfusion. Man kann dementsprechend einen bedeutenden Einfluss der Koronarperfusion auf die ANP-Sekretion unter Baselinebedingungen ausschließen und davon ausgehen, dass die unterschiedliche basale ANP-Sekretion der beiden Versuchsgruppen durch andere Vorgänge ausgelöst wurde.

4.2  Versuch A: Analyse der dehnungsinduzierten ANP-Freisetzung

↓54

Der adäquate Reiz für volumeninduzierte ANP-Freisetzung ist die atriale Dehnung (Stretch).149,150 Ziel des vorliegenden Versuches war es, ein etwaiges Abweichen dieser Reizantwort bei Herzinsuffizienz (die zumindest in ihren schwereren Stadien in aller Regel mit einer Volumenüberlastung einhergeht) zu erörtern. Zu diesem Zweck wurde über den linken Herzvorhof unter definiertem Druck Perfusionsflüssigkeit zugeleitet, was konsekutiv eine Dehnung der linksatrialen Wand hervorrief.

4.2.1 ANP – Freisetzung

In der Kontrollgruppe bewirkte die Dehnung der Vorhofwand erwartungsgemäß einen starken Anstieg der ANP-Freisetzung auf mehr als das doppelte des Ruhezustandes. Die insuffizienten Herzen shunt-operierter Tiere zeigten unter linksatrialem Stretch hingegen nur eine nicht signifikante Tendenz zur Mehrfreisetzung. Im Gegensatz zur Basalfreisetzung ist die akute ANP-Sekretion der Herzen von Shunttieren in Reaktion auf den adäquaten Dehnungsreiz in vitro somit drastisch abgeschwächt.

In vivo war die ANP-Freisetzungsantwort insuffizienter Herzen bei atrialer Dehnung in mehreren Versuchsreihen abgeschwächt. Die Dehnung der Vorhofwand wurde unter anderem durch akute intravasale Volumenexpansion hervorgerufen und führte beim Shunt-Modell an der Ratte237 sowie bei der Schrittmacher-induzierten Herzinsuffizienz bei Hunden205 zu einer signifikant geringeren ANP-Freisetzung im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie und leicht symptomatischem Herzversagen zeigten eine abgeschwächte ANP-Freisetzung in Reaktion auf intravasale Volumenexpansion.210 ,211

↓55

Die Ergebnisse des vorliegenden Versuchs zeigen, dass die bei der Herzinsuffizienz in vivo beobachtete veränderte Regulation der ANP-Freisetzung in vitro fortbesteht. Dies spricht für eine andauernde Störung der ANP-Freisetzung, die auch in Abwesenheit von hämodynamischer Überbelastung und ohne den Einfluss von zirkulierenden Hormonen weiterbesteht.

Der pathophysiologische Entstehungsmechanismus dieser Sekretionsminderung ist noch nicht geklärt. Da beim Shuntmodell an der Ratte normale bis erhöhte Werte für den ANP-Gehalt im linken Vorhof gemessen wurden237 ,238, erscheint die früher angenommene Depletion der ANP-Vorräte236 in diesem Fall als Ursache unwahrscheinlich.

Mehrere Arbeiten deuten darauf hin, dass das bei Herzinsuffizienz aktivierte Angiotensin II eine Rolle spielen könnte. Sata et. al.212 untersuchten hierzu den Einfluss der Hemmung von angiotensinkonvertierendem Enzym (ACE) und von Angiotensin-Rezeptorantagonisten bei medikamentös induzierter Hypertonie an der Ratte. Dadurch wurde ein signifikanter Anstieg der ANP-Plasma-Konzentration sowie atrialer ANP-enthaltender Granula hervorgerufen.

↓56

Beim Shuntmodell an der Ratte konnte in vivo gezeigt werden, dass die abgeschwächte ANP-Freisetzung der Herzen operierter Tiere bei Volumenexpansion durch den ACE-Hemmer Ramipril wiederhergestellt wird.237 Auch die Herzen von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie setzten bei Volumenexpansion unter ACE-Hemmung deutlich mehr ANP frei als die nicht behandelte Versuchsgruppe.211 Angiotensin II scheint somit einen negativen Effekt auf die volumeninduzierte ANP-Freisetzung auszuüben.

Langenickel et al.204 zeigten kürzlich, dass die Expression von Corin, einem Enzym welches ProANP zu sezernierbarem ANP und einem Spaltprodukt umwandelt, in den Vorhöfen shunt-operierter Ratten vermindert ist. Dabei könnte es sich um einen regulativen Mechanismus handeln, der zur abgeschwächten ANP-Freisetzung bei Vorhofdehnung beiträgt. Corin scheint bei der Herzinsuffizienz also in den Herzkammern induziert213 und in den Vorhöfen vermindert exprimiert204 zu werden.

Bisher liegen noch keine Studien vor, die sich mit regulatorischen Einflussfaktoren auf Corin beschäftigen. Im 2003 veröffentlichten Review von Ruskoaho192 wurde allerdings eine differentielle Regulation der ANP-Genexpression in den Herzvorhöfen und den Herzkammern durch auto-, endo- und parakrine Faktoren angesprochen.

↓57

Mit Blick auf die möglicherweise ausschlaggebende Rolle von Corin bei der ANP-Freisetzung erscheint es sinnvoll, den Einfluss von derartigen Faktoren wie z.B. Angiotensin auf die Expression von Corin zu untersuchen. Er könnte die aktuell gezeigte Diskrepanz zwischen verstärkter ANP-Basalfreisetzung aus den Ventrikeln und abgeschwächter ANP-Freisetzungsantwort auf den Dehnungsreiz im linken Vorhof erklären.

4.2.2 Koronarperfusion

Die Koronarperfusionder Shunt- und Kontrollherzen nahm einen ganz ähnlichen Verlauf wie die ANP-Sekretion. Von erhöhtem Baselineniveau ausgehend, glich das koronare Perfusionsvolumen der Herzen shuntoperierter Tiere unter Vorhofdehnung dem der Kontrollherzen. Dabei hatte die Zuführung von Perfusat in den linken Vorhof neben atrialem Stretch auch den Effekt, dass das linke Herz nun aktiv Flüssigkeit förderte. Die bei Kontrollherzen beobachtete Zunahme der Koronarperfusion im Zeitraum der atrialen Dehnung ließe sich somit durch einen erhöhten Energie- und Sauerstoffverbrauch des kardialen Gewebes erklären, welcher auf bisher noch nicht vollständig geklärte Weise eine Dilatation der Koronararterien hervorrufen kann (eine Zusammenfassung der zur Diskussion stehenden Mediatoren wurde 2002 von Tune et al.222 veröffentlicht).

Bei den Herzen von Shunttieren fand sich im Gegensatz dazu kein signifikanter Anstieg der Koronarperfusion. Unter atrialem Stretch wurden sie von ebensoviel Flüssigkeit durchflossen wie die Herzen der Kontrollgruppe. Verschiedene andere Arbeitsgruppen45-47 haben bei insuffizienten Herzen ebenfalls einen abgeschwächten Anstieg der Koronarperfusion in Reaktion auf atriales Pacing und körperliches Training (als Zustände erhöhten metabolischen Bedarfs) beobachtet. Traverse et al.45 setzten dies in Zusammenhang mit ebenfalls abgeschwächter O2-Aufnahme in insuffizientem kardialen Gewebe, für deren Ursache allerdings noch kein Erklärungsansatz existiert.

4.2.3 ANP – Konzentration

↓58

Die relativen Veränderungen der ANP-Sekretion und der Koronarperfusion beider Versuchsgruppen unterlagen in diesem Versuch parallelen Schwankungen. Somit änderte sich die ANP-Konzentration im Perfusat bei Vorhofdehnung nicht.

Andere Arbeitsgruppen hatten durch Vorhofdehnung an isoliert perfundierten Rattenherzen normaler Herzfunktion eine Konzentrationserhöhung von ANP im Perfusat provoziert.231 Dort wurde mit konstantem Perfusionsvolumen gearbeitet. Kongruent zu den vorliegenden Versuchsergebnissen wurde durch die Dehnung des Vorhofs eine Zunahme der ANP-Freisetzung bei Herzen von Ratten mit normaler Herzfunktion bewirkt. Da dies unter der im aktuellen Versuch variablen Koronarperfusion nicht zu einer Konzentrationsänderung im Perfusat führte, scheinen die Koronarperfusion und die ANP-Plasmakonzentration bei der akuten ANP-Freisetzung durch Vorhofdehnung eine untergeordnete Rolle zu spielen.

4.3  Versuch B: Stimulation der Proteinkinase C

Bei der Herzinsuffizienz ist die basale ANP-Freisetzung erhöht, wodurch es zu einem Anstieg der Konzentrationen von biologisch aktivem ANP99-126 und dem N-terminalen Peptid (ANP1-98) im Plasma kommt.63-67 ,188-191 Wie diese verstärkte Freisetzung zu Stande kommt, ist noch nicht vollständig geklärt, die Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPgR) könnte dabei jedoch eine bedeutende Rolle spielen. Diese setzen (über die Aktivierung der PLCβ ♢ DAG, IP3♢ PKC ♢ MAP-Kinasen / noch unbekannte Effektoren mit konsekutiver Induktion von Hypertrophie-assoziierten Genprodukten) einen Transduktionsweg in Gang, der zur vermehrten Synthese von ANP beiträgt. Auch die ANP-Freisetzung aus den Kardiomyozyten scheint (via Prostaglandinwirkung?182 -184 ) von intakter PKC-Funktion abhängig zu sein. So wurde unter Stimulation der Proteinkinase C in kardiomyozytären Zellkulturen171 ,229 sowie am isoliert perfundierten Herzmodell230 eine Steigerung der ANP-Freisetzung beobachtet. Kongruent dazu wurde die Freisetzung von ANP in atrialen Myozyten durch PKC-Inhibition vermindert. 223 Die getriggerte ANP-Sekretion durch ET-1171, Ang II 235, ADH176>, α1-Rezeptor-Agonisten157, sowie Gewebedehnung159 fiel unter PKC-Inhibition geringer aus.

↓59

Da bei der Herzinsuffizienz eine Reihe von GPgR-bindenden Faktoren (wie ET-1, AngII, ADH und über α-Rezeptoren auch Noradrenalin) aktiviert sind, war es von Interesse, eventuelle Unterschiede in der Regulation dieser Signalkaskade bei Herzinsuffizienz herauszuarbeiten.

Zu diesem Zweck wurde im vorliegenden Versuch die Proteinkinase C kontinuierlich mit PMA stimuliert und die ANP-Freisetzung ins Perfusat analysiert.

4.3.1 ANP – Freisetzung

Durch die Stimulation der Proteinkinase C mit PMA zeigten sich deutliche Unterschiede in der ANP-Freisetzungsantwort zwischen den Versuchsgruppen. Bei den Herzen von Shunttieren kam es zu einem starken Abfall der Sekretion von ANP. Eine derartige Signalumkehrung wurde bislang nicht beschrieben. Eine PKC-Downregulation/Aktivitätsminderung durch protrahierte Einwirkung von PMA ist allerdings bekannt.224-227 Es wäre demzufolge denkbar, dass permanent erhöhte Plasmafaktoren wie ET-151-53, AngII54, ADH55 und Noradrenalin49,50 bei Herzinsuffizienz über eine protrahierte Stimulation der PKC zu deren Downregulation/Aktivitätsminderung beitragen und so zu einer Toleranzentwicklung gegenüber hormonellen Stimuli führen. Diese Annahme wird dadurch unterstützt, dass die Koronarperfusion der Herzen von Shunttieren nicht durch PKC-Stimulation beeinflusst wurde, die der Kontrollherzen dagegen deutlich. Auch das bei Herzinsuffizienz erhöhte ANP selbst kann NPR-A-vermittelt die PKC-Aktivität senken228 und somit zu dem beschriebenen Phänomen beitragen. Eine Signalumkehrung ließe sich auf diese Weise jedoch nicht erklären. An der Veränderung der basalen ANP-Freisetzung bei Herzinsuffizienz müssen also noch andere Mechanismen beteiligt sein.

↓60

Es wäre zum Beispiel möglich, dass verschiedene PKC-Isoformen einen unterschiedlichen, eventuell sogar gegensätzlichen Einfluss auf die ANP-Freisetzung ausüben. In humanem Myokard sind PKCα, β1/2, δ sowie ε nachgewiesen worden.35 Sie gehören zu den konventionellen (cPKC: α, β) und neuartigen (nPKC: δ und ε) Proteinkinasen vom C-Typ und sind daher mit Diacylglycerol aktivierbar.30 In dem aktuellen Versuch wurden durch DAG-Analogon PMA also alle dieser Unterformen stimuliert, wobei die Rolle hinsichtlich der ANP-Freisetzung nicht für jede einzelne geklärt ist. Kerkelä et al.36 wiesen für die PKC α kürzlich eine ausschlaggebende Funktion bei der ET-1 induzierten ANP- und BNP-Freisetzung nach. In den Prozess der Herzinsuffizienzentwicklung und -hypertrophie sind indes auch andere PKC-Isoformen involviert. So wurde in kardialen Myozyten bei humaner Herzinsuffizienz eine verstärkte Transkription des β-PKC-Gens gefunden.35 Auch am druckinduzierten Insuffizienzmodell der Ratte konnte eine gesteigerte Aktivität von PKCβ sowie ε gezeigt werden.37 Es ist also nicht auszuschließen, dass die verschiedene Reaktion der Herzen aus Kontroll- und Shuntgruppe auf PMA-Einwirkung durch ein ungleiches Regulationsmuster der PKC-Subklassen bei Herzinsuffizienz hervorgerufen wird. Dahingehend wäre eine Funktionsanalyse der β- und ε-PKC im Hinblick auf die ANP-Freisetzung aufschlussreich, denn ein negativer Einfluss ihrerseits könnte eine Erklärung für den Abfall der ANP-Sekretion der Herzen von Shunttieren unter PMA-Einwirkung darstellen.

Einen weiteren Ansatzpunkt bieten die unter 4.2 erwähnten Studien zur Rolle des Angiotensins bei der ANP-Freisetzung. Angiotensin aktiviert über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren die PKC31 und zeigte bei normaler Herzfunktion178,179 einen positiven Effekt auf die ANP-Freisetzung. Im Gegensatz dazu rief seine Wirkungsminderung durch ACE-Hemmer bzw. ATII-Rezeptorantagonisten bei medikamtentös induzierter Hypertonie212 eine Steigerung der basalen ANP-Plasmaspiegel und bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie211 sowie am Shuntmodell der Ratte237 eine Wiederherstellung der dehnungsinduzierten ANP-Freisetzung hervor. Diese gegensätzliche Wirkung von Angiotensin auf die ANP-Sekretion von gesunden bzw. insuffizienten Herzen könnte ein Ausdruck abweichend regulierter Proteinkinase C bei Herzinsuffizienz sein und die bei der Shuntgruppe beobachtete Signalumkehr bei PKC-Stimulation erklären.

Das exakte Zustandekommen der Unterschiede zwischen Shunt- und Kontrollgruppe lässt sich auf dem bisherigen Forschungsstand allerdings nicht klären. Die Ergebnisse des vorliegenden Versuches deuten jedoch daraufhin, dass für die gesteigerte ANP-Basalfreisetzung im herzinsuffizienten Zustand andere Einflüsse, als die reine Stimulation der PKC (als Bestandteil der PKC-beinhaltenden Signalkaskade G-Protein-gekoppelter Rezeptoren), eine bedeutendere Rolle spielen.

4.3.2 Integrative Diskussion der Parameter

↓61

In der Kontrollgruppe bewirkte die PKC-Stimulation keine signifikante Veränderung der ANP-Freisetzung im Vergleich zu den Vehikel-stimulierten Kontrollherzen. Isoliert betrachtet ist dies ein unerwartetes Ergebnis, denn sowohl in kardiomyozytären Zellkulturen171 ,229 als auch am isoliert perfundierten Herzmodell230 wurde in der Vergangenheit ein positiver Effekt von PMA auf die ANP-Freisetzung demonstriert. Zur Annäherung an diese Problematik erwies es sich als sinnvoll, die aktuellen Versuchsbedingungen zunächst mit denen von Ruskoaho et al.230 zu vergleichen, die mit einem analogen Herzmodell gearbeitet hatten. Die Gruppe stimulierte ebenfalls die Proteinkinase C mit PMA (Synonym: TPA) in isoliert perfundierten Rattenherzen und konnten einen Anstieg auf das circa Vierfache der Baseline durch PMA-Einwirkung nachweisen. Der Versuchsaufbau war prinzipiell ähnlich: die Proteinkinase C in retrograd perfundierten Rattenherzen wurde durch PMA-Beimengung zum Perfusat kontinuierlich stimuliert. Der einzige Unterschied zu den vorliegenden Versuchsbedingungen bestand in der Koronarperfusion unter konstanten Flussbedingungen, während die in unserem Labor verwendete Apparatur den Druck konstant hielt. Dies ist insofern von Bedeutung, als dass die PMA-sensible PKCε an Gefäßmuskelzellen eine Vasokonstriktion infolge GPgR-Stimulation vermittelt (ausführlich diskutiert von Walsh et al.38).

Dieser Umstand bewirkt bei der Durchströmung isolierter Herzen mit PMA-haltiger Flüssigkeit eine Gefäßverengung, wodurch es im aktuellen Versuch zu einer starken Abnahme des koronaren Perfusionsvolumens von Kontrollherzen kam. Auch die Koronarperfusion Vehikel-stimulierter Kontrollherzen nahm über den Zeitverlauf von 60 Minuten kontinuierlich ab, was damit zusammenhängen könnte, dass das zugeführte Perfusat komplett frei von Plasmafaktoren war, welche den Gefäßtonus in vivo modulieren. Die Veränderung der Koronarperfusion der Vehikel-Gruppe war jedoch weitaus weniger ausgeprägt, als das in der PMA-stimulierten Kontrollgruppe der Fall war. Die Abnahme des koronaren Perfusionsvolumens war bei Herzen von Shunttieren etwas stärker als bei den Vehikel-stimulierten Kontrollen und steht in Kongruenz mit der Annahme, dass die koronarkonstriktiven Mechanismen bei der Herzinsuffizienz stärker aktiviert sind, als im gesunden Zustand41. Ganz im Gegensatz zu den herzgesunden Kontrollen gab es in der Shuntgruppe allerdings keine signifikanten Unterschiede in der Koronarperfusion zwischen PMA- und Vehikel-stimulierter Versuchsgruppe. Dieses Ergebnis zeigt deutlich, dass die Regulation der Proteinkinase C in koronaren Gefäßmuskelzellen bei der Herzinsuffizienz verändert ist. Mit Bezug auf die Koronarperfusion kam es im vorliegenden Versuch somit zu ausgeprägten Abweichungen in der Hämodynamik der betrachteten Versuchsgruppen.

Auf die Experimente von Ruskoaho et al.230 zurückkommend, liegt in der Hämodynamik ein großer Unterschied zwischen den Versuchsbedingungen in dieser Arbeitsgruppe und denen des aktuellen Experiments. Auch in deren Versuchen kam es zu einer Gefäßverengung in normalen Herzen in Reaktion auf PMA. Da allerdings unter konstanten Flussbedingungen gearbeitet wurde, bewirkte dies keine Absenkung der Koronarperfusion, sondern es wurde durchgehend das gleiche Volumen gegen den infolge Vasokonstriktion ansteigenden Druck in die Aa. coronariae gepresst. Diesen Sachverhalt beschrieben Ruskoaho et al. auch in ihrem einige Jahre später veröffentlichten Artikel231, in dem über Experimente mit ähnlicher Versuchsanordnung berichtet wird. Unter derartig konstantem Perfusionsvolumen ist ein Anstieg der ANP-Konzentration im Perfusat auch als Anstieg der ANP-Freisetzung zu werten und wurde bisher ausschließlich unter diesem Aspekt diskutiert. Da die Koronarperfusion im gegenwärtigen Versuch variabel war, besteht bei dieser Versuchsanordnung nun die Möglichkeit, die gegenseitige Abhängigkeit von der ANP-Freisetzung und der ANP-Konzentration im Perfusat (als Modell für die ANP-Plasmaspiegel in vivo) zu untersuchen. Tatsächlich zeigte sich für die Kontrollgruppe des konkreten Versuchs ein starkes Ansteigen der ANP-Konzentration im Perfusat durch PMA-Stimulation. Quantitativ stieg sie in etwa auf das Vierfache der Baseline, was den Ergebnissen von Ruskoaho et al.230 entspricht. Dieser Sachverhalt impliziert, dass die basale ANP-Freisetzung möglicherweise in Abhängigkeit von der ANP-Plasmakonzentration über eine Modulation der PKC-Aktivität reguliert wird. Ein solcher Feed-Back-Mechanismus erfordert nunmehr ein Bindeglied zwischen zirkulierenden ANP-Molekülen und den sezernierenden Kardiomyozyten – z.B. in Form eines NP-Rezeptors. Für ANP beträfe dies den NPR-C und den NPR-A. Bei NPR-C knockout Mäusen konnte kein Unterschied der basalen ANP-Plasmaspiegel im Vergleich zum Wildtyp nachgewiesen werden.109 Das Interesse konzentriert sich somit auf den NPR-A, von dem Leskinen et al.232 in der Tat das Eingebundensein in einen negativen Feed-Back-Mechanismus von ANP auf seine eigene Freisetzung nachweisen konnten.

↓62

Interessanterweise wurden auch für die NO-Wirkung Unterschiede in Abhängigkeit von konstanten Druck- versus konstanten Flussbedingungen festgestellt.233 Da eine Stimulation der endothelialen NO-Synthase via NPR-A111, 234 sowie eine negative Modulation der ANP-Freisetzung durch NO185,186 bereits bekannt sind, könnte endothelial synthetisiertes Stickstoffmonoxid einen mutmaßlichen Mediator der Modulation der ANP-Freisetzung in Abhängigkeit von seiner Plasmakonzentration darstellen. Diese theoretischen Schlussfolgerungen bedürfen freilich weiterer experimenteller Bestätigung.

Die ANP-Konzentration im Perfusat änderte sich bei den insuffizienten Herzen von Shunttieren unter PKC-Stimulation nicht. Dies könnte dadurch hervorgerufen werden, dass die PKC-einschließende Signalkaskade durch das vermehrte vorliegen GPgR-Liganden im Plasma nicht weiter stimulierbar ist. Da die ANP-Freisetzung unter PMA-Einwirkung jedoch kontinuierlich abfiel, scheint bei der Herzinsuffizienz eine Änderung in der Regulation der PKC-beinhaltenden Signalkaskade vorzuliegen.

Demnach deuten die Ergebnisse des vorliegenden Versuchs daraufhin, dass die ANP-Freisetzung über die Proteinkinase C möglicherweise in Abhängigkeit von den ANP-Spiegeln im Plasma reguliert wird und dass dieser Regulationsmechanismus bei der Herzinsuffizienz verändert zu sein scheint. Es wurde demonstriert, dass erhöhte ANP-Plasmakonzentrationen bei Herzinsuffizienz z.T. durch die abweichende Regulation der Proteinkinase C erklärt werden können.

↓63

Die durchgeführten Versuche zeigen am Shuntmodell der Ratte, dass die basale ANP-Freisetzung bei Herzinsuffizienz erhöht ist. Bei Vorhofdehnung als adäquaten Sekretionsreiz wird sie jedoch nicht gesteigert. Die ANP-Sekretion am insuffizienten Herzen ist im Vergleich zur normalen Herzfunktion somit verändert. Als regulatorische Komponente kommt dabei die Proteinkinase C in Frage, da sekretionsfördernde Faktoren bei normaler Herzfunktion über die PKC zu einer ANP-Freisetzung führen. Die vorliegenden Versuche haben gezeigt, dass die PKC-Stimulation bei der Herzinsuffizienz zu einer Abnahme der basalen ANP-Freisetzung führt. Damit wurde der Verdacht erhärtet, dass die Proteinkinase C in die Regulation der ANP-Freisetzung bei der Herzinsuffizienz involviert ist.


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