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1  Einleitung

1.1 Interleukin-4

Interleukin-4 (IL‑4) wurde im Jahre 1982 in seiner Eigenschaft identifiziert, die polyklonale Proliferation kostimulierter B-Zellen von Mäusen zu induzieren[1]. Nach der Klonierung von humaner IL‑4 cDNA[2] konnte gezeigt werden, daß es darüber hinaus über ein weites Spektrum biologischer Effekte auf hämatopoietische und nicht-hämatopoietische Zellen verfügt. So hat es wachstumsfördernde Wirkungen auf T‑Zellen[3], Endothelzellen[4] und Fibroblasten[5] und spielt eine kritische Rolle bei der Reifung von B-Zellen zu Immunglobulin-sezernierenden Plasmazellen durch die Induktion des Immunglobulin­klassenwechsel von IgM zu IgG1 und IgE[6, 7, 8]. Desweiteren ist es wichtig für die Expression des niedrig-affinen IgE-Rezeptors CD23[9, 10], von MHC-Klasse II[11, 12] und von Oberflächen-IgM[13] auf B-Zellen. In seiner Eigenschaft als Faktor für die Differenzierung von T-Helfer-(Th-)0-Vorläuferzellen zu Th2-Zellen trägt es zur Entwicklung einer humoralen Immunantwort bei[14, 15, 16].

Durch Studien an CD4+ T-Helfer-Zellen von Mäusen konnte gezeigt werden, daß sich basierend auf deren Muster der Zytokin-Synthese zwei Zelltypen unterscheiden lassen: Th1-Zellen sezernieren IL-2 und IFN-γ, Th2-Zellen dagegen IL‑4, IL-5, IL-10[17]. Ähnlich polarisierte T-Zell Untergruppen lassen sich auch beim Menschen beobachten[18], obwohl hier die Grenzen zwischen Th1- und Th2-Zellen nicht immer leicht gezogen werden können. Inzwischen ist deutlich geworden, daß es viele Überlappungen zwischen den Subpopulationen gibt und Zytokin-Muster gesehen werden, die sich keinem bekannten Phänotyp eindeutig zuordnen lassen. Ob diese beobachtete Vielfalt unterschiedliche Stadien der Zellentwicklung oder transiente Antworten auf Immunstimuli widerspiegelt oder ob es sich um eine nicht zu überblickende Menge an definierten Phänotypen handelt, konnte bisher nicht in letzter Konsequenz geklärt werden. Dennoch läßt sich diversen Immunreaktionen eine definierte Th1- oder Th2-Zellantwort mit streng korrelierender Zytokin-Produktion zuordnen, was die Th1-Th2-Dichotomie auch weiterhin als eine sinnvolle funktionelle Einteilung erscheinen läßt[19].

Während die Th1-Zellen ihre Aufgaben vor allem in der zellvermittelten Immunität haben, sind die Th2-Zellen vornehmlich in die humorale Immunantwort involviert. Sie antworten auf Antigene, die von B-Zellen präsentiert werden, fördern die Sekretion von Antikörpern, insbesondere von IgE, und unterstützen Proliferation und Funktion von Mastzellen und Eosinophilen[19].


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Viele der Th2-assoziierten Eigenschaften werden durch die oben dargestellten biologischen Funktionen von IL‑4 vermittelt. So spielt IL‑4 auch in der Pathogenese verschiedener Erkrankungen ein wichtige Rolle. Als Beispiel sei der Zusammenhang von inadäquater IL‑4-Produktion bzw. dessen Wirkung über den IL‑4R mit atopischen Erkrankungen genannt. Einer der bekannten Polymorphismen im Promoter des IL‑4-Genes führt zu hoher Transkriptionsaktivität und Überexpression von IL‑4[20]. Für den IL‑4R sind bisher zwei Polymorphismen bekannt, deren Auftreten mit erhöhter IgE-Produktion und atopischen Erkrankungen korreliert[21, 22].

Mehrere Studien weisen darauf hin, daß IL‑4 einen direkten wachstumshemmenden Effekt auf leukämische Zellen haben kann[23] und daß ihm bei der immunologischen Abwehr maligner Zellen eine Bedeutung zukommt. So konnten Okabe et al.[24] zeigen, daß IL‑4 die DNA-Synthese Ph1-positiver ALL-Blasten vom B-Zell Phänotyp supprimiert. Außerdem hemmt es dosisabhängig das Wachstum von Ph1-positiven ALL-Zellinien. Dieser Effekt ist mit einer Hemmung der Tyrosinkinase-Aktivität assoziiert, so daß davon ausgegangen werden kann, daß es nach Bindung von IL‑4 an seinen spezifischen Rezeptor über einen bis jetzt noch unbekannten Mechanismus zu einem inhibitorischen Einfluß auf die bcr-abl-Tyrosinkinase kommt.

IL‑4 hemmt auch das Wachstum von Zellen der chronischen myelomonozytären Leukämie (CMMoL) durch Hemmung der „autokrinen“ Produktion von IL-6 oder GM-CSF[25]. Dieser Effekt ist jedoch nur in der chronischen Phase der Erkrankung wirksam, während in der akuten Phase ein direkter wachstumsstimulierender Einfluß von IL‑4 überwiegt[26]. Auch bei akuten myeloischen Leukämien mit myelomonozytärer Differenzierung (M4/M5-AML) konnte in den meisten Fällen eine proliferationshemmende Wirkung von IL‑4 in vitro beobachtet werden. Diese ändert sich allerdings nicht unter Zugabe von IL-6, so daß dieser Effekt nicht durch eine alleinige Hemmung der autokrinen IL-6-Produktion durch IL‑4 erklärt werden kann[27].

Eine indirekte Wirkung auf Tumorzellen ist über eine Einflußnahme von IL‑4 auf zytotoxische Zellen möglich. Bei der Aktivierung unspezifisch wirkender zytotoxischer Zellen scheint IL‑4 aber im Vergleich mit IL-2 eine eher untergeordnete Rolle zu spielen. So zeigte sich in in vitro-Versuchen, daß CD3- NK-Zellen, vorausgesetzt ein mitogener Stimulus ist beigegeben, in Antwort auf IL‑4 zwar proliferieren[28], andererseits aber die IL-2-abhängige Bildung von LAK-Zellen durch IL‑4 verhindert wird[29, 30]. Die IL‑4-induzierte Suppression von IL-2-vermittelter unspezifischer Zytotoxizität ist allerdings nicht wirksam bei mit IL-2 präaktivierten Zellen, die durch IL‑4 sogar in ihren Funktionen verstärkt werden können. Diese scheinbar widersprüchliche Wirkung von IL‑4 ist möglicherweise durch eine IL‑4-vermittelte Herunterregulierung des IL-2R auf ruhenden LAK-Vorläuferzellen bedingt, so daß ihre Proliferation und Differenzierung in Effektorzellen verhindert wird[31].


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Im Gegensatz dazu weisen verschiedene Studien darauf hin, daß IL‑4 in der Entwicklung antigenspezifischer zytotoxischer T-Lymphozyten eine wichtige Rolle spielt: So kommt es in gemischten Leukozytenkulturen unter IL‑4 zu einer deutlichen Zunahme der antigen­spezifischen zytotoxischen Aktivität gegenüber allogenen Stimulator-Zellen[26, 32]. Unter einer Kombination von IL-2 und IL‑4 gelang es Kawakami et al.[33], aus Tumor-infiltrierenden Lymphozyten zytotoxische T-Zellinien zu züchten. Fanslow et al.[34] zeigten, daß durch die Behandlung von Mäusen mit löslichem IL‑4R Abstoßungsreaktionen gegenüber allogenen Transplantaten verhindert und so die Lebenszeit transplantierter Herzen verlängert werden kann. In einer von Golumbek et al.[35] mit Mäusen durchgeführten Studie wurden mit IL‑4 transfizierte Zellen spontan entstandener Nierenzelltumoren vorwiegend T-Zell-unabhängig abgestoßen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, daß die Tiere, welche die IL‑4-transfizierten Tumoren abstießen, eine T-Zell-abhängige, systemische Immunität gegen den Primärtumor entwickelten. Diese systemische Immunität war tumorspezifisch und hauptsächlich durch CD8+ T-Zellen vermittelt. Grusby et al.[36] fanden heraus, daß T-Zell-Klone, die in Anwesen­heit von IL‑4 kultiviert wurden, eine höhere zytolytische Aktivität zeigten als Zellen, die nur in IL-2 kultiviert wurden. Diese in IL‑4, aber nicht die in IL-2 gewachsenen Zellen, exprimierten eine Lipase, die an dem zytolytischen Prozeß beteiligt zu sein scheint.

1.2 Interleukin-4 Rezeptor

1.2.1 Aufbau des Interleukin-4 Rezeptors

IL‑4 vermittelt seine biologischen Effekte durch Bindung an einen Rezeptor-Komplex, der sich aus der spezifischen IL‑4 Rezeptor alpha-(IL‑4Rα-)Kette und einem oder eventuell auch mehreren weiteren assoziierten Proteinen zusammensetzt. Bisher bekannte Rezeptorketten, die mit IL‑4Rα einen funktionellen Rezeptor-Komplex bilden können, sind die gemeinsame Gamma-Kette (common gamma chain, γC)[37, 38], die als Rezeptorkette von verschiedenen Zytokin-Rezeptoren geteilt wird, und die kürzlich klonierten IL-13 Rezeptor-Ketten IL‑13Rα1[39, 40] und IL-13Rα2[41].

IL‑4Rα ist als reife Rezeptorkette ein ~140 kDa schweres, 800 Aminosäuren (AS) langes transmembranes Glykoprotein, das IL‑4 mit hoher Affinität bindet[42]. Bestimmte strukturelle Eigenschaften in der extrazellulären Domäne des Rezeptors lassen ihn der Familie der Klasse I-Zytokin-Rezeptoren zuordnen. Diese charakteristischen Strukturen sind vier in ihrer[Seite 16↓] Position konservierte, aminoterminal gelegene Cystein-Reste, die über Disulfid-Bindungen zur räumlichen Struktur des Rezeptors beitragen, zwei kanonisch angeordnete Fibronectin Typ III (Fn-III) Motive und membranproximal das sogenannte WSXWS-Motiv (“Tryptophan - Serin - beliebige Aminosäure - Tryptophan - Serin”)[43]. In der dreidimensionalen Struktur bildet die Region des WSXWS-Motiv eine Art Scharnier zwischen den Fn-III-Motiven und ist entscheidend für die Bindung des Liganden an den Rezeptor. In Untersuchungen des ebenso aufgebauten IL‑2Rβ konnte durch Mutationen einzelner Aminosäuren in dieser Region die Bindung des Liganden an den Rezeptor reduziert oder sogar aufgehoben werden[44].

Die extrazelluläre Domäne ist über eine einzelne kurze Transmembranregion mit der langen zytoplasmatischen Domäne verbunden, deren Sequenz weniger konserviert ist als die der Extrazellulärregion. Einige Motive haben jedoch durch ihre Homologie mit funktionell bedeutsamen Domänen anderer Rezeptoren besondere Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Dazu gehört die sogenannte Homologie-Box 1, ein kurzes Prolin-reiches Motiv, das membranproximal innerhalb der ersten 20 Aminosäuren (AS) gelegen ist. Ungefähr 100 AS weiter carboxy-terminal findet sich eine Sequenz, die durch ihren Reichtum an Glutaminsäure-Resten auffällt. Eine weitere Struktur ist das sogenannte I4R-(Insulin Rezeptor/IL‑4R-)Motiv, das enge Homologie mit einem Motiv der Rezeptoren für Insulin und IGF (Insulin-like growth factor) 1 zeigt. Es enthält einen einzelnen Tyrosinrest an Position 497. Drei weitere Tyrosinreste lassen sich in der distalen Region der Rezeptorkette an den Positionen 575, 603 und 631 finden.

Diese und wahrscheinlich noch weitere bisher nicht identifizierte Domänen tragen zu dem Prozeß der Signalübermittlung durch den IL‑4R bei. Zur Charakterisierung der Bedeutung dieser Motive und zur Identifizierung weiterer funktionell wichtiger Domänen wurden Deletions- und Mutationskonstrukte des Rezeptors auf ihre Fähigkeit analysiert, verschiedene Bereiche der Signaltransduktion wie Proliferation, Inhibition von Apoptose oder Differenzierung vermitteln zu können. Der Vorgang der Signaltransduktion und die Beteiligung dieser Domänen daran soll im Folgenden vereinfacht und auf die wesentlichen bekannten Mechanismen beschränkt dargestellt werden.

1.2.2 Prinzipien der Signaltransduktion über den IL‑4R

Ein wichtiges Merkmal aller Klasse-I-Zytokin-Rezeptoren ist das Fehlen einer intrinsischen Tyrosinkinase-Aktivität der Rezeptor-Ketten. Trotzdem werden der Rezeptor und diverse zytoplasmatische Proteine nach Bindung von IL‑4 an den Rezeptor-Komplex phosphoryliert. Vermittelt wird dies über Tyrosinkinasen, die mit den Rezeptorketten assoziiert sind. Im Falle eines aus IL‑4Rα und γC bestehenden IL‑4R-Komplexes sind das die Januskinasen JAK1 [Seite 17↓]und JAK3[45, 46], die konstitutiv an die Homologie Box 1 in der membranproximalen Region der beiden Rezeptorketten gebunden sind[47]. Die Bindung von IL‑4 führt zur Heterodimerisierung der Rezeptorketten und triggert so die Autophosphorylierung und Aktivierung der Januskinasen (Abb. 1). Diese wiederum können jetzt Tyrosinreste der intrazellulären Domäne der IL‑4Rα-Kette phosphorylieren, wodurch Bindungsstellen für verschiedene zytoplasmatische Signalproteine entstehen, die dann ihrerseits durch die JAK’s phosphoryliert werden.

Abb. 1: Signaltransduktion über den IL‑4R (1): Durch Heterodimerisierung der Rezeptoruntereinheiten nach Bindung von IL‑4 kommt es zur Autophosphorylierung und Aktivierung der Januskinasen.

Zwei Wege der dadurch in Gang gesetzten Signaltransduktionskaskade sind in den Abbildungen 2 und 3 schematisch dargestellt. Wird der einzelne Tyrosinrest Y497 im schon erwähnten I4R-Motiv phosphoryliert, können hier IRS1 (Insulin-Rezeptor-Substrat-1) bzw. sein Homolog 4PS/IRS2 ankoppeln und ihrerseits durch die Januskinasen phosphoryliert werden[48, 49, 50, 51]. Phosphoryliertes 4PS/IRS2 kann verschiedene SH2-Domänen enthaltende Signal­moleküle binden, was zu einer Aktivierung von Genen führt, die für die Proliferation der Zelle verantwortlich sind (Abb. 2)[49]. Der Transkriptionsfaktor STAT6 (Signal Transducer and Activator of Transcription) bindet in der Region der schon beschriebenen C-terminal gelegenen Tyrosinreste Y575, Y603 und Y631. Zwei STAT6-Moleküle können nach ihrer Phosphorylierung dimerisieren, translozieren in den Zellkern und binden dort an Promotor­regionen von Genen, deren Expression durch IL‑4 hochreguliert wird (Abb. 3 )[52, 53, 54, 55, 56, 57].


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Abb. 2: Signaltransduktion über den IL‑4R (2): Wahrscheinlich sind die Januskinasen auch für die Phosphory­lierung des I4R-Motivs verantwortlich. Hier kann dann 4PS/IRS2 koppeln, das dann nach Phos­phorylie­rung durch die Januskinasen diverse andere Signalmoleküle bindet. Dieser Weg führt über weitere, noch weitgehend ungeklärte Mechanismen zur Proliferation der Zelle.

Abb. 3: Signaltransduktion über den IL‑4R (3): Die aktivierten Januskinasen phosphorylieren zwei Tyrosinreste im C-terminalen Bereich des Rezeptors. Dadurch entsteht eine Bindungsstelle für STAT6. STAT6 wird seinerseits durch die Januskinasen phosphoryliert und transloziert als Homodimer in den Zellkern, wo es an die Promotoren der dargestellten Gene bindet.


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1.2.3  Funktionelle Domänen des IL‑4R

Die beiden hier dargestellten Wege der Signaltransduktion, die entweder über die Aktivierung von 4PS/IRS2 zur Proliferation der Zelle oder über die Aktivierung von STAT6 zur Expression von bestimmten Faktoren und damit zur Differenzierung der Zelle führen, geben sicherlich nur einen kleinen Teil der ablaufenden Mechanismen wieder. Die zum Teil sehr widersprüchlichen Ergebnisse der Untersuchungen mit IL‑4Rα-Deletionsmutanten machen deutlich, daß die eigentlichen Vorgänge sehr viel komplexer sind und daß sich weder die Signalmoleküle noch die beiden Effekte Proliferation und Differenzierung streng bestimmten funktionellen Domänen zuordnen lassen.

So zeigen einige Untersuchungen, daß das schon oben erwähnte I4R-Motiv mit seinem Tyrosin-Rest an Position 497 (Y497) essentiell für die proliferativen Eigenschaften des IL‑4Rα ist. Rezeptormutanten, in denen dieses Motiv deletiert ist oder Y497 gegen Phenylalanin ausgetauscht ist, können in diesen Studien kein Proliferationssignal mehr vermitteln[48, 58, 59, 60]. In anderen Untersuchungen jedoch konnte über Rezeptor­mutanten, deren zytoplasmatische Domäne ebenfalls proximal des I4R-Motives trunkiert ist, Proliferation vermittelt werden [61, 62, 63]. Ebenso widersprüchliche Ergebnisse gibt es bei der Zuordnung der differenzierenden Signale zu bestimmten funktionellen Domänen. Ryan et al. zeigten, daß mindestens einer der drei Tyrosinreste Y575, Y603 und Y631 für die Aktivierung von STAT6 bzw. für die Expression von CD23, MHCII oder Iε notwendig ist[57], und andere Autoren zeigten die Fähigkeit der Peptidsequenzen, die die Tyrosinreste Y603 und Y631 flankieren, an STAT6 zu binden[52, 64]. Dennoch konnten in anderen Studien Rezeptormutanten ohne diese Region und sogar ohne einen einzigen Tyrosinrest, der als Bindungsstelle für die SH2-Domäne von STAT6 dienen könnte, die Aktivierung von STAT6 induzieren[63, 65].

Für diese widersprüchlichen Ergebnisse sind bisher noch keine zufriedenstellenden Erklärungen gefunden worden. Es läßt sich nicht ausschließen, daß diese Ungereimtheiten teilweise auf methodischen Problemen beruhen. Beispielsweise machen die Nutzung unterschiedlicher Zellsysteme und die damit verbundene unterschiedliche Expression von Signalmolekülen die Ergebnisse in den verschiedenen Arbeiten nur eingeschränkt vergleichbar. Entscheidend ist sicherlich auch, daß die Vielschichtigkeit der an der Signaltransduktion beteiligten Elemente bisher noch nicht zu überblicken ist. Das bedeutet, daß durch den Einfluß von bisher noch nicht identifizierten Domänen und/oder Signalmolekülen, insbesondere auch von negativ regulierenden Zell-Phosphatasen die Interpretation der Ergebnisse erschwert wird. Hinzu kommen nicht vorhersehbare Verän­derungen der dreidimensionalen Molekülstruktur der Deletions-/Mutationskonstrukte, wodurch Bindungsstellen für Signalmoleküle eventuell unbrauchbar werden.


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Dennoch gibt es einige Domänen in der zytoplasmatischen Region des IL‑4R, die übereinstimmend in mehreren Untersuchungen als essentiell für bestimmte Bereiche der Signaltransduktion identifiziert wurden. In der Region der membranproximal gelegenen Homologie-Box 1, einer innerhalb der Zytokin-Rezeptoren konservierten Prolin-reichen Sequenz, bindet die Januskinase JAK1. Die Deletion dieser Domäne oder die Mutation ihrer Prolinreste führt in den veröffentlichten Studien regelmäßig zum Verlust der Fähigkeit, proliferative oder differenzierende Signale zu vermitteln[58, 63, 65]. Eine andere Domäne in der Region zwischen AS 355 und 390 ist ebenfalls ausnahmslos in den veröffentlichten Arbeiten sowohl für die Proliferation wie für die Differenzierung der Zelle als Antwort auf IL‑4 essentiell[58, 62, 63]. Zwei in dieser Region auffällige Strukturen sind eine Glutaminsäure-reiche und eine Serin-reiche Sequenz. Der Austausch sämtlicher Glutamat- oder Serin-Reste führte jedoch nicht zum Verlust der Funktion dieser Domäne[62].

1.3 RNA Splicing

1.3.1 Konstitutives Splicing

Vergleicht man die Nukleotidsequenz einer reifen mRNA mit der ihres zugrundeliegenden Genes, findet man die für die mRNA kodierende Region der DNA durch lange Segmente unterbrochen, die in der reifen mRNA fehlen. Diese nicht kodierenden Regionen der DNA werden als Intron-Sequenzen bezeichnet, während die Bereiche, aus denen sich die reife mRNA zusammensetzt und die auch die für das Protein kodierenden Sequenzen enthalten, Exons genannt werden. Das primäre RNA-Transkript ist eine exakte Kopie des Genes und enthält daher sowohl die Intron- als auch die Exon-Sequenzen. Bei der folgenden Umwandlung dieser unreifen Vorläufer-mRNA (precursor mRNA, pre-mRNA) in ein reifes mRNA-Molekül, das direkt für ein Protein kodieren kann, werden über einen komplexen enzymatischen Vorgang die Introns herausgeschnitten und die Exon-Sequenzen miteinander verbunden. Diese Reaktion wird als RNA Splicing bezeichnet.

1.3.1.1 Intron-Konsensus-Sequenzen, Splicing Elemente im Intron[66]

Damit beim Splice-Vorgang das Herausschneiden der Introns und das Zusammenfügen der Exons präzise ablaufen kann, ist eine korrekte Erkennung der Exon-Intron-Grenzen, der sog. splice sites, erforderlich. Eine wichtige Rolle als Erkennungssequenzen spielen dabei die konservierten Intron-flankierenden Nukleotide an der 5’-splice site (acceptor site)bzw. der 3’-splice site (donor site). Die Stärke/Zuverlässigkeit einer splice site ist dabei durch ihre Übereinstimmung mit diesen Konsensus-Sequenzen definiert (Abb. 4). Weitere für den Splice-Vorgang wichtige Intron-Motive sind ein an die 3‘-splice site angrenzender Polypyrimidin-Trakt und etwas weiter upstream ein einzelnes A-Nukleotid innerhalb der sog. [Seite 21↓] branch site (Abb. 4). Das branch site-A-Nukleotid ist in Hefen Teil einer hoch konservierten Sequenz, deren Mutation den Splice-Vorgang verhindert. In höheren Eukarionten ist dieser Bereich weit weniger konserviert und zeigt nur Bevorzugungen für Purine oder Pyrimidine an bestimmten Positionen. Bei Mutationen oder Deletionen der branch site können in vielen Fällen andere benachbarte Sequenzen deren Funktion ersetzen, so daß es zu keiner Veränderung des Splice-Produktes kommen muß.

Abb. 4: Konsensus-Sequenzen der 5‘- und 3‘-splice site des Introns.

1.3.1.2 Mechanismus des RNA Splicing[66]

Die eigentliche chemische Reaktion des Splicing, das Herausschneiden der Intron-Sequenzen und Zusammenfügen der Exons, beinhaltet zwei transesterifizierende Reaktionen. Bei der ersten wird die 5‘-splice site durch nukleophilen Angriff der 2‘-OH-Gruppe des branch site-A-Nukleotid gespalten. Das nun freie 5‘-Ende des Introns verbindet sich kovalent über eine 5‘-2‘-Phosphodiester-Bindung mit dem branch site–A-Nukleotid, wobei sich ein Ring (engl. lariat: Lasso) formt. In der zweiten Reaktion spaltet das entstandene freie 3‘-Ende des 5‘-Exons die RNA an der 3‘-splice site, und die Phosphodiesterbindung der 3‘-splice site wird auf das freie 3‘-Ende des 5‘-Exons übertragen. Das auf diese Weise herausgeschnittene Intron wird wieder linearisiert und rasch degradiert.

Diese chemischen Reaktionen werden durch die Komponenten des Splice-Apparates katalysiert, die als Splicing-Faktoren bezeichnet werden und im Zellkern die sog. Spliceosomen bilden. Spliceosome sind große Komplexe, die sich aus Ribonukleoproteinen zusammensetzen. Sie enthalten ca. 40 unterschiedliche Proteine und kleine nukleäre RNA-Moleküle (small nuclear RNAs,snRNAs), die in kleinen Komplexen als Ribonukleoprotein-Partikel (snRNP) existieren und nach der enthaltenen snRNA als U1, U2, U4/6 und U5 snRNP benannt werden. Eine große Anzahl der im Spliceosom enthaltenen Proteine sind nicht Teil der snRNPs. Zu diesen non-snRNP-Splicing-Faktoren gehören unter anderen der U2 snRNP Auxiliary Factor (U2AF) mit seinen beiden Untereinheiten U2AF65 und U2AF35 und die Familie der SR-Proteine[67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74].

Bei vielen Faktoren, RNAs und Proteinen, die in den Splice-Vorgang verwickelt sind, sind bereits Domänen beschrieben, mit denen die Faktoren untereinander oder an die pre-mRNA binden können. So besitzt die U1 snRNA an ihrem 5‘-Ende eine einzelsträngige Sequenz, [Seite 22↓]die komplementär zur Konsensus-Sequenz der 5‘-splice site ist. U2 snRNA enthält Sequenzen, die komplementär zur branch site sind[75], U2AF65 bindet an den Polypyrimidin-Trakt[76], U6 snRNA bindet an die 5‘-Konsensus-Sequenz der pre-mRNA und kann Basenpaarungen mit U2 snRNA ausbilden, und U5 snRNA assoziiert mit Exon-Sequenzen im Bereich der 5‘- und der 3‘-splice sites[77]. Alle diese Bindungen werden durch weitere Splicing-Faktoren, vornehmlich die SR-Proteine, stabilisiert bzw. ermöglicht.

Im frühesten funktionellen Splicing-Komplex (E-(early-)Komplex)[78] bindet das U1 snRNP an die 5’-splice site und U2AF mit seiner Untereinheit U2AF65 an den Polypyrimidin-Trakt der pre-mRNA. Diese Bindungen werden durch SR-Proteine gefördert, die wahrscheinlich direkt mit dem U1-70K Protein[79] und der U2AF35 Untereinheit[80, 81] interagieren. Mit der Formation dieses E-Komplexes hat bereits die Spezifizierung der splice sites stattgefunden.

Mit der Bindung des U2 snRNP an die pre-mRNA bildet sich der A-Komplex. U2AF65 erleichtert mit seiner RS-Domäne durch Neutralisierung der negativ geladenen Phosphate der pre-mRNA die Basen-Paarung der U2 snRNA an diebranch site[75]. Außerdem wird durch die Bindung verschiedener U2 snRNP Untereinheiten an eine Region von 20 Nukleotiden upstream der branch site, die sog. anchoring site, der Komplex stabilisiert[82, 83].

Bei der Bildung des B-Komplexes löst sich U1 snRNP von der 5‘ splice site, und stattdessen assoziiert das präformierte U4/U6-U5 tri-snRNP mit der pre-mRNA, wobei U5 snRNA mit Exon-Sequenzen[77] und U6 snRNA mit Intron-Sequenzen an der 5‘-splice site interagiert. Das nun reife Spliceosom enthält jetzt alle für die katalytischen Reaktionen benötigten Komponenten.

Im C-Komplex wird durch die Dissoziation der U4 snRNA von dem U4/U6 Komplex die erste Transesterifizierungsreaktion getriggert. U6 snRNA nimmt nach Abdissoziation von U4 snRNA eine neue Konformation an, durch die eine Basenpaarung mit U2 snRNA möglich wird. Dadurch werden die 5‘-splice site und das branchpoint A-Nukleotid für den ersten Transesterifizierungsschritt zueinander gebracht[84]. U5 ist möglicher­weise an der zweiten Transesterifizierung maßgeblich beteiligt. Durch zusätzliche Bindung an der 3‘-splice site des downstream Exons bringt es das freie 3‘-Ende an die 3‘-splice siteheran und spielt somit gemeinsam mit assoziierten Proteinen zumindest eine stabilisierende Rolle bei dem zweiten katalytischen Schritt[77].

1.3.1.3 SR-Proteine[74, 85]

SR-Proteine (SRp) sind einerseits essentielle Splicing-Faktoren[73], die schon früh in der Bildung der Spliceosomen wirken. Andererseits stellen sie wichtige Regulatoren des alternativen Splicing dar[86, 87]. Als gemeinsame Strukturen besitzen die Mitglieder der [Seite 23↓]SR‑Protein-Familie eine aminoterminal gelegene RNA-bindende Domäne (RBD) und carboxyterminal die sog. RS-Domäne, die zahlreiche sich wiederholende Arginin-(R‑)Serin-(S‑)Dipeptide enthält und der eine wichtige Funktion bei Protein-Protein-Interaktionen im Spliceosom zukommt. Eine zweite Gruppe essentieller Splicing-Faktoren und Splicing-Regulatoren, die ebenfalls RS-Domänen enthalten, werden als SR-Protein-verwandte Polypeptide (SR protein related polypeptides, SRrp)zusammengefaßt. Dazu gehören unter anderem die 70K-Untereinheit von U1 snRNP und die beiden Unterheiten des U2AF. Eine weitere Gruppe von Splicing-Faktoren besitzen zwar keine RS-Domänen, sollen aber wegen ihrer regulatorischen Funktionen an dieser Stelle erwähnt werden. Im Gegensatz zu den positiv regulatorischen SR-Proteinen besitzen diese Faktoren negativ regulatorische Eigenschaften und antagonisieren die Aktivität der SR-Proteine. Zu ihnen gehören unter anderem die sogenannten heterogenen nukleären Ribonukleoproteine hnRNP A, hnRNP B und hnRNP I/PTB.

In in-vitro-Splicing Experimenten mit sogenannten S100-Zellextrakten, die alle für den Splice-Vorgang notwendigen Komponenten mit Ausnahme der SR-Proteine enthalten, konnte gezeigt werden, daß SR-Proteine für den Splice-Vorgang essentiell sind und sie sich bis zu einem gewissen Grade gegenseitig ersetzen können. Diese Redundanz zeigt sich besonders in einfachen in vitro-Splicing-Systemen, während bei zunehmender Komplexi­zität der Systeme die Spezifität der unterschiedlichen SR-Proteine offensichtlich wird.

1.3.1.4 Interaktionen der SR-Proteine im Spliceosom[74, 85, 88]

SR-Proteine sind bereits für die Bildung des E-Komplexes essentielle Faktoren. Sie ermöglichen und stabilisieren Bindungen der snRNPs untereinander und an die pre-mRNA, wobei die zugrundeliegenden Mechanismen (in Abhängigkeit von der pre-mRNA) wahrscheinlich sehr vielfältig sind. Es besteht die Vorstellung von einem sehr komplexen Netzwerk der SR-Proteine im Spliceosom. Hierbei agieren sie beispielsweise direkt mit Elementen der pre-mRNA und vermitteln so Interaktionen zwischen der pre-mRNA und den snRNP. Sie können aber auch Bindungen zwischen den snRNAs bzw. deren assoziierten Proteinen untereinander herstellen. Dies kann zur Bildung einer Brücke aus einem oder mehreren SR-Proteinen führen, die ein Intron oder auch ein Exon überspannen und so passende splice sites zueinander bringen können.

Durch die Bindung der SR-Proteine an sogenannte Exon-Enhancer wird ein solcher Komplex zusätzlich stabilisiert. Exon-Enhancer sind purinreiche Exon-Sequenzen und können das Splicing eines angrenzenden Introns fördern[89]. Sie finden sich bevorzugt assoziiert mit schwachen splice sites, die häufig variabel gespleißt werden. Bindet ein SR-Protein[78, 90, 91, 92, 93] an die Enhancer-Sequenz, kann es so durch die schon eben beschriebene Brückenbildung über das Exon hinweg die Bindung von U2AF an den Polypyrimidin-Trakt im [Seite 24↓]upstream gelegenen Intron und/oder von U1 snRNP im Intron downstream erleichtern bzw. stabilisieren und so das Splicing schwacher splice sites fördern[90, 91].

1.3.1.5 Regulation von SR-Proteinen

Phosphorylierung und Dephosphorylierung der SR-Proteine und möglicherweise auch anderer Splicing-Faktoren wie U1-70K[94] spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Splicing-Prozessen[95]. Die Behandlung von Splicing-Extrakten mit Phosphatasen zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Splice-Vorganges zeigte, daß die Phosphorylierung von SR-Proteinen und eventuell auch weiteren Faktoren für die Bildung des frühen Pre-Spliceosoms, des E-Komplexes essentiell ist, die Dephosphorylierung der Faktoren nach der Formation eines funktionsfähigen Spliceosoms den Ablauf des Splicing jedoch nicht mehr verhindert[95]. Andererseits blockiert die Behandlung mit einem Phosphatase-Inhibitor die beiden katalytischen Reaktionen des Splicing, verhindert aber nicht die Bildung eines vollständigen, wenn auch inaktiven Spliceosoms[96]. Passend zu diesen Beobachtungen konnten bisher drei Kinasen identifiziert werden, die RS-Domänen phosphorylieren, nämlich die SR-Protein spezifischen Kinasen SRPK 1[97, 98] und 2[99] und außerdem Clk/Sty[100, 101], die auch über eine RS-Domäne verfügt, über die sie mit anderen RS-Domänen besitzenden Proteinen agiert.

1.3.2 Alternatives Splicing

Durch Selektion unterschiedlich miteinander kombinierter splice sites kommt es zur Entstehung verschiedener reifer mRNAs aus einer gemeinsamen pre-mRNA. Hierbei können ganze Exons oder Introns ein- oder ausgeschlossen bzw. alternativ genutzt werden, oder die Variationen können nur Teile von Exons oder Introns betreffen. Beispiele für die Entstehung unterschiedlicher mRNAs durch alternatives Splicing sind in Abb. 5 dargestellt.


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Abb. 5: Schematische Darstellung der Entstehung unterschiedlicher reifer mRNAs aus einer gemeinsamen precursor-mRNA. In A ist der „normale“ Splicing-Vorgang dargestellt, in B ist ein vollständiges Exon ausgelassen worden („exon skipping“), in C verbleibt in der mRNA ein vollständiges Intron, in D und E werden alternative splice sites innerhalb des Exons genutzt, so daß Teile des Exons ausgelassen werden, und in F kommte es zur alternativen Nutzung zweier unterschiedlicher Exons.

1.3.2.1 Regulation von alternativem Splicing, Rolle der SR-Proteine

Zusätzlich zu ihrer Funktion als konstitutive Splicing-Faktoren können SR-Proteine die Wahl von 5‘- und 3‘-splice sites beeinflussen. Die absoluten und relativen Mengen der SR‑Proteine in einer Zelle und deren Aktivierungszustand durch Phosphorylierung beeinflussen im kompliziertem Zusammenspiel mit cis acting-Elementen der pre-mRNA, wie z.B. Exon-Enhancern, und negativen Regulatoren das Schicksal eines primären Transkriptes.


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Um die Komplexizität dieser Vorgänge deutlich zu machen, sollen im folgenden einige Beispiele für die Wirkung von Regulator-Proteinen auf den Splice-Vorgang dargestellt werden.

Für das SR-Protein ASF/SF2 konnte gezeigt werden, daß es wahrscheinlich unselektiv über eine Interaktion mit U1-70K die Besetzung möglicher 5‘-splice sites durch U1 snRNP fördert[79, 102]. Sind zwei miteinander konkurrierende 5‘-splice sites gleichermaßen mit U1 snRNP besetzt, wird diejenige 5‘-splice site gewählt, die sich proximal zur 3‘-splice site befindet[102]. Ein Anstieg der Konzentration von ASF/SF2 führt also zu einer Bevorzugung der proximalen 5‘-splice site. Der zugrundeliegende Mechanismus ist bisher noch nicht vollständig verstanden.

Die Untersuchung des Einflusses der SR-Proteine SRp30b/SC35, SRp40, SRp55 und SRp75 auf die Wahl alternativer 5‘-splice sites zweier unterschiedlicher pre-mRNA-Konstrukte mit je einem einzelnen Intron demonstrierte sowohl unterschiedliche Effekte verschiedener SR-Proteine auf dieselbe pre-mRNA als auch umgekehrt unterschiedliche Wirkungen desselben SR-Proteins auf die beiden prinzipiell gleich aufgebauten pre-mRNA-Konstrukte[103]. So fördert beispielsweise SRp30b in einem pre-mRNA-Konstrukt des Simian Virus 40 (SV40) das Splicing mit der proximalen 5‘-splice site, während unter SRp40, SRp55 und SRp75 bevorzugt die distale 5‘-splice sitegenutzt wird. Bei einem Transkript des E1a-Genes kam es dagegen bei diesen drei SR-Proteinen konzentrations­abhängig zu einer Bevorzugung der proximalen 5‘-splice site. Weiterführende Experimente zeigten, daß SRp40 übereinstimmend mit diesen Beob­achtungendie Interaktion von U1 snRNP mit der distalen 5‘-splice site der SV40 pre-mRNA fördert, während SRp30b die Bindung von U1 snRNP an beide 5‘-splice sites gleichermaßen begünstigt, was, wie oben bereits erwähnt, zur Nutzung der proximalen 5‘-splice site führt[104]. Diese Beobachtung läßt sich aber, zumindest in diesem Fall, nicht mit einer Präferenz der SR-Proteine für bestimmte Sequenzen in der Region der alternativen 5‘-splice sites erklären, da der Austausch der die beiden 5‘-splice sites umgebenden Sequenzen die Splicing-Muster nicht veränderte. Dies legt nahe, daß sich die entscheidenden Bindungs­elemente außerhalb dieser Regionen befinden.

Der antagonistisch wirkende Splicing-Faktor hnRNP/PTB konkurriert mit U2AF um die Bindung am Polypyrimidin-Trakt und behindert so das Splicing der betroffenen 3‘-splice site[105].

Über die Expression verschiedener Splice-Varianten hat die Zelle die Möglichkeit, post­transkriptionell die Expression bestimmter Proteine zu regulieren. Welche Stimuli bei der differentiellen Expression der Splice-Varianten eine Rolle spielen, ist weitgehend noch nicht geklärt. Die entscheidende Funktion der Splicing-Faktoren legt nahe, daß die Expression und Aktivierung dieser Faktoren in diesem Zusammenhang bedeutsam sind. Es gibt einige [Seite 27↓]Untersuchungen, die einen möglichen Einfluß unterschiedlicher Funktionszustände einer Zelle auf die Aktivierung von SR-Proteinen zeigen. So ließ sich nachweisen, daß die Phosphorylierung der SR-Proteine entsprechend der Aktivität der spezifischen Kinase SRPK 1 zellzyklus­abhängig reguliert wird[97]. Während apoptotischer Prozesse konnte eine Assoziation phosphorylierter SR-Proteine mit dem U1 snRNP-Komplex nachgewiesen werden[106]. Eine direkte Auswirkung solcher Aktivierungsänderungen von SR-Proteinen auf daraus resultierende veränderte Splicing-Muster bestimmter alternativ gespleißter Produkte ist zwar naheliegend, Untersuchungen dazu ließen sich jedoch in der bisher veröffentlichten Literatur nicht finden. Die Untersuchung der Expression von SR-Proteinen in verschiedenen Gewebetypen zeigte reproduzierbar spezifische Expressions­muster mit unterschiedlichen absoluten und relativen Mengen der SR-Proteine[103]. Ein Zusammenhang mit gewebe­abhängigen Splicing-Mustern bestimmter mRNAs erscheint auch hier wahrscheinlich[107].

1.3.2.2 Alternatives Splicing bei Zytokin-Rezeptoren

Auch in der Familie der Zytokin-Rezeptoren ist alternatives Splicing ein häufig beobachtetes Phänomen, das es der Zelle ermöglicht, unterschiedliche Proteine aus einem Gen zu generieren. Einige der bekannten Mechanismen, die so zur Entstehung unter­schiedlicher Proteinstrukturen führen, sollen folgend kurz aufgeführt werden.

In Abhängigkeit von der Anzahl der Nukleotide, die die durch alternatives Splicing entstandene mRNA-Variante von der „Original“-mRNA unterscheiden, bleibt das Leseraster der mRNA entweder erhalten („in frame“), so daß in dem resultierenden Protein lediglich Amino­säuren fehlen oder hinzukommen, oder es kommt zur Verschiebung des Leserasters („out of frame“), was zu einer kompletten Änderung der Aminosäuresequenz distal der alternativ gespleißten Region führt. In vielen Fällen hat die Verschiebung des Leserasters die Neuentstehung eines in frame-Stop-Codons zu Folge. Die Translation bricht dann an dieser Stelle ab, so daß in Abhängigkeit von der Lokalisation des Stop-Codons mehr oder weniger stark verkürzte Rezeptorketten entstehen.

Kodiert zum Beispiel das in einer alternativ gespleißten mRNA fehlende Exon für die Transmembranregion, entsteht ein lösliches Rezeptorprotein (Abb. 6B). Beispiele hierfür sind die löslichen Varianten der GM-CSF Rezeptor α-Kette[108], des IL‑7R[109] und des IL-6R[110]. Ist das Stop-Codon hinter der Transmembranregion gelegen, bleibt der Rezeptor membran­gebunden, erhält aber eine verkürzte zytoplasmatische Domäne (Abb. 6C). Dies ist der Fall bei einer Variante des growth hormone receptor (GHR)[111] und bei der gemeinsamen β-Kette (commonβ chain, βc)[112], die von den Rezeptoren für IL-3, IL-5 und GM-CSF genutzt wird.


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Zusätzliche Exons (die Frage, welche der Varianten in diesem Fall durch ein ”normales” Splicing-Ereignis entsteht, soll hier offenbleiben) enthalten häufig ein Stop-Codon. Befindet sich dieses vor der Transmembranregion, resultiert wieder ein lösliches Protein (Abb. 6D), wie zum Beispiel für den IL-5R[113] und den IL‑4R der Maus[114] beschrieben. Beim Erythropoietin-Rezeptor (EpoR) ist eine membrangebundene Variante mit stark verkürzter zytoplasmatischer Domäne bekannt[115]. Hier liegt das zusätzliche Exon downstream des für die Transmembranregion kodierenden Bereiches (Abb. 6E).

Ein weiteres interessantes Beispiel stellt c-kit, der Rezeptor des stem cell factor (SCF) dar[116, 117]. Hier kodiert in einer Splice-Variante eine kurze, vor der Transmembranregion gelegene Insertion für eine Protease-sensitive Region. Das daraus entstehende Protein wird an dieser Stelle bevorzugt proteolytisch gespalten, so daß ein löslicher Rezeptor entsteht (Abb. 6F).

Abb. 6: Beispiele für Strukturen unterschiedlicher mRNA Splice-Varianten. Bei den Varianten B und C kommt es durch eine Verschiebung des Leserasters zur Entstehung eines vorzeitigen in frame-Stop-Codons, bei den Varianten D und E enthält ein zusätzliches Exon ein Stop-Codon. Die Variante F enthält zusätzliche Nukleotide, die für eine Protease-sensitive Region kodieren. Die mRNA in A kodiert für den Rezeptor voller Länge, aus den Varianten B, E und F resultieren lösliche Rezeptoren und aus den Varianten C und D membranständige Rezeptoren mit mehr oder weniger verkürzten intrazellulären Domänen.

Aus den geänderten Strukturen der resultierenden Proteine der Splice-Varianten ergeben sich häufig auch geänderte Eigenschaften. Für die löslichen Rezeptoren stehen unter­schiedliche biologische Effekte zur Diskussion. Sie können die Wirkung ihrer Zytokine [Seite 29↓]antagonisieren, aber diesen auch als Träger- und Transportproteine dienen[118]. Für einige Rezeptor-Varianten mit verkürzter zytoplasmatischer Domäne konnte durch Transfektion von Zellen und funktionelle Tests gezeigt werden, daß sich diese in ihren biologischen Eigenschaften von den Rezeptoren voller Länge unterscheiden. Zu erwähnen ist hierbei nochmals die Variante des EpoR. Hier fehlen der verkürzten Rezeptorkette wesentliche zytoplasmatische Domänen, so daß kein Proliferations­signal vermittelt werden kann[115, 119]. Ein anderes Beispiel ist die schon oben erwähnte verkürzte Splice-Variante der βc-Kette (βIT). Wird diese zusammen mit der GM-CSF Rezeptor α-Kette (GMRα) in geeigneten Zellen koexprimiert, zeigt sich auch hier, daß ein solcher Rezeptor-Komplex keine GM-CSF induzierte Proliferation vermitteln kann[112]. Im Gegensatz dazu zeigte sich in Transfektions­studien mit zwei alternativ gespleißten Isoformen der GM-CSF-Rezeptor α-Kette, die sich in ihrem C-terminalen Ende der zytoplasmatischen Domäne durch Benutzung zweier alternativer Exons voneinander unterscheiden, funktionell hinsichtlich Induktion von Proliferation oder Differenzierung kein signifikanter Unterschied zwischen den Varianten[120].

Es gibt Hinweise dafür, daß in verschiedenen Differenzierungs­stadien hämatopoietischer Zellen unterschiedliche Splice-Varianten von Zytokin-Rezeptoren exprimiert werden. So wurde gezeigt, daß es bei der Differenzierung der myeloischen Zellinie HL60 durch Dimethylsulfoxid zu Neutrophilen zu einer Herunterregulation einer weiteren Splice-Variante von GMRα, die für einen löslichen Rezeptor kodiert, und einer Hochregulation des membrangebundenen Rezeptors kommt[121]. Ein weiteres Beispiel stellt die oben bereits erwähnte verkürzte Splice-Variante des EpoR dar. Diese dominiert im frühen Stadium der erythroiden Entwicklung, während die Expression des EpoR voller Länge mit weiterer Differenzierung der Zellen zunimmt[115, 119]. Gale et al. beobachteten, daß in Stimulations­versuchen mit GM-CSF die Expression der Splice-Variante βIT in myeloischen Blasten parallel zur Differenzierung der Zellen deutlich zurückging[112]. Dies ließ die Autoren folgern, daß hier ebenfalls einen Zusammenhang zwischen der Expression von βIT und der Differenzierung myeloischer Zellen besteht.


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04.01.2005