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4  Ergebnisse

4.1  Identifizierung der IL‑4RαIT mRNA

Bei der Untersuchung der Expression der mRNA des Interleukin-4 Rezeptors mit RT-PCR an Knochenmark und Blut von Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie ließ sich bei elektrophoretischer Auftrennung der Produkte im Agarosegel zusätzlich zu dem erwarteten Produkt von 502 bp in wechselnder Intensität eine weitere kürzere Bande nachweisen (Abb. 11). Durch direkte Sequenzierung der Amplifikate beider Banden ließ sich zeigen, daß dem kürzeren Fragment bei ansonsten identischer Sequenz ein Stück von 50 Basenpaaren (bp) fehlte (Abb. 12 und Abb. 13). Diese Beobachtung legte nahe, daß es sich dabei um das Amplifikat eines alternativ gespleißten Transkriptes mit Fehlen eines einzelnen oder mehrerer Exons handelt.

Abb. 11: RT-PCR zur Amplifizierung von IL‑4Rα-cDNA. Dargestellt sind 6 Proben (PB oder KM) von Patienten mit ALL, bei denen sich zusätzlich zu der erwarteten Bande ein weiteres, 50 bp kürzeres Produkt in sehr unterschiedlicher Intensität nachweisen läßt. Auf die Entstehung der als Heteroduplexe bezeichneten Bande wird weiter unten eingegangen.


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Abb. 12: Elektropherogramm der Sequenzierungen der PCR-Fragmente von IL‑4Rα und IL‑4RαIT. Der Pfeil bezeichnet in der Splice-Variante IL‑4RαIT die Stelle, an welcher im Vergleich zur vollständigen IL‑4Rα-cDNA 50 bp fehlen.

Abb. 13: mRNA-Struktur von of IL‑4Rα and IL‑4RαIT: Durch Auslassen des Exon x kommt es zur Verschiebung des Leserasters und zur Entstehung eines in frame-Stop Codons. Die schwarzen Pfeile bezeichnen die IL‑4Rα-spezifischen Primer IL‑4R 617 up/IL‑4R 1118 down (Tab. 1); SP: Signalpeptid; EX: extrazelluläre Domäne; TM: trans­membranöse Domäne; CYTO: zytoplasmatische Domäne; STOP: Stop-Codon.

Um das zu belegen, war es nötig, die Exon-Grenzen dieses Bereiches zu identifizieren. Eine ausführliche Recherche der Literatur und der veröffentlichten Sequenzen in den Gen-Datenbanken erbrachte keine weiterführenden Informationen über die genomische Struktur der humanen IL‑4Rα-DNA. Für die eng verwandte mRNA des IL‑4Rα der Maus[125] sind diese Daten jedoch bereits veröffentlicht. Ein Sequenzvergleich von humaner und muriner IL‑4Rα-mRNA zeigte, daß die fehlenden Nukleotide der beobachteten IL‑4Rα-mRNA-[Seite 62↓]Variante mit einer Homologie von 74% mit dem Exon 11 der IL‑4Rα-mRNA der Maus übereinstimmte, und ließ vermuten, daß es sich bei diesem Segment ebenfalls um ein Exon handelt (Abb. 14). Um dies zu belegen, wurden mit einer Exon-übergreifenden PCR die diesem Segment benachbarten Bereiche der genomischen DNA amplifiziert, wobei jeweils ein Primer upstream bzw. downstream der beiden vermuteten Exon-Grenzen positioniert war (Abb. 15).

Abb. 14: Sequenzvergleich des alternativ gepleißten Exon x der humanen IL‑4Rα-mRNA mit dem korrespondierenden Exon 11 der Maus (Homologie 74%).

Abb. 15: Lokalisation der Primerpaare IL‑4R 950 up/IL‑4R 1074 down und IL‑4R 1030 up/IL‑4R 1118 down zur Amplifizierung der an das „Exon x“ angrenzenden Introns der IL‑4Rα-DNA.

Dies resultierte in Produkten von ca. 1500 bp für das Fragment upstream und ca. 1800 bp für das Fragment downstreamdieses Segmentes. Durch die Sequenzierung der 3‘- und 5‘ Enden dieser Produkte konnte das 50 bp-Fragment als vollständiges Exon identifiziert werden, da ihm auf genomischer Ebene tatsächlich Sequenzen benachbart sind, die den benachbarten Introns entsprechen und von den Konsensus-Sequenzen der donorund acceptor splice sites flankiert werden (Abb. 16). Dies zeigte, daß die kürzere Variante einem alternativ gespleißten Transkript entspricht, dem ein vollständiges Exon von 50 nt Länge fehlt.


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Abb. 16: Region des alternativ gespleißten Exon x der IL‑4Rα-mRNA (oben) und den angrenzenden Introns der genomischen DNA (unten). Die DNA-Sequenz der Exon-Intron-Grenzen ist unten aufgeführt. Exon-Sequenzen sind unterstrichen, die donor und acceptor splice sites sind fett gedruckt.

Dieses Exon, das im Folgenden als „Exon x“ bezeichnet wird, ist 82 nt downstreamdes Bereiches gelegen, der für die transmembranöse Domäne des IL‑4Rα kodiert (Abb. 13). Bei Translation dieser Variante käme es durch Verschiebung des Leserasters zu der Entstehung von 21 neuen Aminosäuren, gefolgt von einem Stop-Codon. Ein entstehendes Protein hätte daher eine stark verkürzte zytoplasmatische Domäne und besäße nur einen Teil der für die Signaltransduktion essentiellen Bereiche (Abb. 17). Gale et al.[112]hat eine Splice-Variante der gemeinsamen beta-Kette (common beta chain, βC) der Rezeptoren für GM-CSF, IL-3 und IL-5 beschrieben, deren mRNA einen sehr ähnlichen Aufbau wie die Splice-Variante des IL‑4R hat. Diese Rezeptor-Variante kodiert ebenfalls für einen Rezeptor mit stark verkürzter intrazellulärer Domäne und erhielt daher den Namen βIT(IT für intracytoplasmic truncated). In Anlehnung daran wurde die in dieser Arbeit identifizierte Splice-Variante der IL‑4Rα—Kette IL‑4RαIT genannt.


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Abb. 17: A: Potentielle Proteinstruktur von IL‑4RαIT (rechts) im Vergleich zum vollständigen IL‑4Rα (links). Die schwarze Box stellt die Homologie-Box 1 dar, die in IL‑4RαIT erhalten ist, die schraffierte Box entspricht dem durch die Verschiebung des Leserasters veränderten C-terminalen Ende von 21 Aminosäuren. EX: extrazelluläre; TM: transmembranöse; CYTO: cytoplasmatische Domäne. GLU: Glutaminsäurereiche Region. Die Abbildung zeigt, daß alle Tyrosinreste und die für die Proliferation essentielle glutaminreiche Region in IL‑4RαIT fehlen. B: Potentielle Aminosäuresequenzen von IL‑4RαIT und IL‑4Rα. Der Pfeil bezeichnet den Beginn der durch die Verschiebung des Leserasters geänderten Sequenz.

Bei weiter gelelektrophoretischer Auftrennung der Banden der PCR-Produkte von IL‑4Rα und IL‑4RαIT war regelmäßig zwischen den beiden Banden eine zusätzliche Bande abzugenzen (Abb. 11). Diese entsteht durch die Bildung von Heteroduplexen aus den Einzelsträngen der Amplifikate von IL‑4Rα und IL‑4RαIT. Ein Nachweis dessen gelang durch die Analyse der Amplifikate der Banden in einer SSCP (Abb. 18).


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Abb. 18: SSCP-Analyse der PCR-Produkte von IL‑4Rα und IL‑4RαIT zum Nachweis der Heteroduplex-Bande. Da die Heteroduplexe aus Einzelsträngen von IL‑4Rα und IL‑4RαIT bestehen, zeigt sich auch ein Bandenmuster, das sich aus den Banden von IL‑4Rα und IL‑4RαIT zusammensetzt.

4.2 Untersuchung der Expression der IL‑4RαIT mRNA an Patientenmaterial

Die IL‑4RαIT mRNA kodiert für ein Protein, dem bestimmte zytoplasmatische Domänen fehlen, denen wichtige Funktionen in der Signaltransduktion zukommen. Die Überlegung, daß ein aus dieser mRNA eventuell entstehendes Rezeptorprotein eine veränderte biologische Funktion haben könnte, und die Beobachtung, daß die mRNA dieser Variante bei verschiedenen untersuchten Proben sehr unterschiedlich stark exprimiert zu werden schien, ließ es sinnvoll erscheinen, eine größere Gruppe von pädiatrischen Patienten mit ALL/AHL und außerdem Zellen unterschiedlicher hämatopoietischer Zellinien auf die Expression der IL‑4RαIT-mRNA im Verhältnis zum IL‑4Rα zu untersuchen. Als dafür geeignete Methode wurde eine RT-PCR gewählt, die durch den Einsatz der in der Abb. 13 dargestellten Primer, die den alternativ gespleißten Bereich flankieren, eine simultane Amplifikation beider Produkte im Sinne einer kompetitiven PCR ermöglicht. Außerdem wurde als interne Kontrolle die konstitutiv exprimierte mRNA des β-Actin im selben Ansatz mitamplifiziert.

Nach Agarosegel-Elektrophorese wurden die Amplifikate mit Hilfe eines Gel-Dokumentationssystems quantitativ ausgewertet, und als Maß für die Expression der Splice-Variante im Verhältnis zum IL‑4Rα wurde eine standardisierte AUC (area under the curve, Fläche unter der Kurve) der IL‑4RαIT mRNA (sAUC(IL‑4RαIT)) errechnet (Abb. 19). Die sAUC(IL‑4RαIT) gibt den prozentualen Anteil der Expression der IL‑4RIT-mRNA an der Gesamt-Expression von IL‑4Rα- und IL‑4RαIT-mRNA wieder.


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Abb. 19: Profilanalyse zur Quantfizierung der Banden bei vier verschiedenen Patientenproben. Die grau getönten Flächen entsprechen den AUC’s für IL‑4Rα und IL‑4RαIT. Die Werte für die sAUC(IL‑4RαIT) machen die sehr unterschiedliche Expression der Splice-Variante bei verschiedenen Patientenproben deutlich. Bei der zusätzlichen Bande zwischen den Banden von IL‑4Rα und IL‑4RαIThandelt es sich um Heteroduplexe, die aufgrund der Ähnlichkeit der Amplifikate von IL‑4Rα und seiner Splice-Variante entstehen. Dies wurde durch eine SSCP(single stranded conformational polymorphism)-Analyse (siehe auch Abb. 18 und Abschnitt 4.1) nachgewiesen.

Hierbei fiel auf, daß die sAUC(IL‑4RαIT) mit Werten von 0-80% interindividuell sehr variierte, während sie bei unterschiedlichen Proben desselben Patienten aber annähernd konstant zu sein schien. Dies wurde auch bei der statistischen Auswertung deutlich: Beim Vergleich von KM mit Blut zum Zeitpunkt der Diagnose und von KM zum Zeitpunkt der Diagnose mit KM in Remission jeweils derselben Patienten zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den verglichenen Proben (Abb. 20). Auch im Hinblick auf den Immunphänotyp der Blasten war kein Zusammenhang mit der Expression der Splice-Variante erkennbar (Daten nicht dargestellt). Die sAUC(IL‑4RαIT) in den hämatopoetischen Zellinien Jurkat, MOLT4, Raji, KM-H2, 697 und REH betrug weniger als 10%.


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Abb. 20: Boxplots zum Vergleich unterschiedlicher Untersuchungsmaterialien jeweils derselben Patienten: Sowohl beim Vergleich von Blut mit KM zum Zeitpunkt der Diagnose (A) als auch von KM bei Diagnose mit Remissionsmark (B) zeigt die statistische Auswertung keinen signifikanten Unterschied.

Einen hoch signifikanten Unterschied zeigte jedoch der Vergleich von Patienten mit ALL-Ersterkrankung mit Patienten im ersten oder folgenden Rezidiv. In diese Auswertung wurden nur KM-Proben zum Zeitpunkt der Diagnose einbezogen (Abb. 21). Der Median für die Expression der Splice-Variante im Verhältnis zum IL‑4Rα war bei den untersuchten Patienten mit Ersterkrankung mit einem Wert von 10,25% (range 0‑60%) für die sAUC(IL‑4RαIT) weitaus geringer als bei den Rezidivpatienten (Median: 39,5%, range 0‑80%).

Abb. 21: Vergleich der Expression von IL‑4RαIT, ausgedrückt als sAUC(IL‑4RαIT), in Proben von Patienten mit Ersterkrankung mit einer Gruppe von Rezidivpatienten, dargestellt in Boxplots.

Im weiteren Verlauf der Arbeit mußte die Deutung dieses Ergebnisses wieder revidiert werden, da sich zeigte, daß der Unterschied der Werte für die sAUC(IL‑4RαIT) zwischen [Seite 68↓]diesen beiden Gruppen keinen Zusammenhang mit der Erkrankung an einer ersten oder rezidivierten Leukämie darstellt, sondern die im Folgenden erläuterten Gründe hat.

So betrug die sAUC(IL‑4RαIT) bei der Untersuchung von Blut einiger gesunder erwachsener Probanden ausnahmslos weniger als 20%. Dieses Untersuchungsmaterial stammte vorwiegend von Mitarbeitern unseres Labores und wurde direkt nach Abnahme aufgearbeitet. Um die Gruppe gesunder Kontrollpersonen zu vergrößern, wurde weiteren Probanden Blut abgenommen, das aber transportbedingt oft nicht am selben Tag weiterverarbeitet werden konnte. Bei diesem Material fiel eine um so stärkere Expression der Splice-Variante in Relation zur IL‑4Rα mRNA auf, je länger der Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung war. Diese Beobachtung wurde wiederholt experimentell bestätigt. Peripheres Blut gesunder Probanden wurde dazu in mehrere Portionen geteilt und zum Teil sofort nach Abnahme, zum Teil bis zu vier Tage später aufgearbeitet (Abb. 22). Hierbei spielte es keine Rolle, ob die Proben als Vollblut oder nach Isolierung der mononukleären Zellen in eigenem Plasma oder Zellmedium aufgehoben wurden. Bei Aufbewahrung der Zellen im Kühlschrank war der Effekt weniger stark ausgeprägt als bei Zimmertemperatur (Abb. 23).

Abb. 22: Expression von IL‑4RαIT mRNA im Verhältnis zu IL‑4Rα bei Aufarbeitung von mononukleären Zellen derselben Blutprobe direkt nach Abnahme oder 2 bzw. 4 Tage später: Der Anteil der Expression von IL‑4RαIT ist umso größer, je länger der Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung der Proben war.


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Abb. 23: Einfluß der Temperatur auf die Expression von IL‑4RαIT bei verzögerter Aufarbeitung. Bei Kühlung der Proben ist der Effekt der Zunahme der sAUC(IL‑4RαIT) weniger ausgeprägt.

Vor dem Hintergrund dieser Beobachtungen wurde die Expression der Splice-Variante im Verhältnis zum IL‑4Rα im untersuchten Patientenmaterial in Bezug auf die transport­bedingte Zeit zwischen Abnahme und Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials statistisch neu ausgewertet. Das Ergebnis ist in der Abb. 24 dargestellt. Ausgewertet wurden diesmal alle untersuchten Proben von Rezidivpatienten und Patienten mit Ersterkrankung unabhängig von der Art des Materials oder dem Immunphänotyp der Erkrankung (n=197) (Abb. 24A). Bei Untersuchungsmaterialien, die am selben Tag abgenommen wie aufgearbeitet wurden, zeigte die sAUC(IL‑4RαIT) signifikant geringere Werte (Median 10%, range 0-80%, n=79) als bei den Proben die einen Tag (Median 32,5%, range 0-65%n=79) oder 2-7 Tage (Median 51%, range 0-72%, n=39) unterwegs waren (p=<0,01, Kruskal-Wallis Test) (Abb. 24A). Auch bei Betrachtung ausschließlich der Rezidivpatienten gab es keine entscheidende Änderung dieses Ergebnisses (Tag 0: Median 14,5%, range 0-56%, n=15; 1. Tag: Median 33%, range 0‑65%, n=71; 2.-7. Tag: Median 53,75, range 0-72,5%, n=34; p<0,01, Kruskal-Wallis Test) (Abb. 24B). Bei der Auswertung ausschließlich der Patienten mit Ersterkrankung war aufgrund der kleinen Patientengruppe eine weitere Aufspaltung der Materialien, die einen Tag und länger unterwegs waren, nicht sinnvoll. Auch hier war der Unterschied zwischen den Gruppen, wenn auch etwas weniger ausgeprägt, signifikant (Tag 0: Median 10%, range 0-58%, n=64; 1.-2. Tag: Median 20%, range 0‑60%, n=13, p=0,016, Mann-Whitney-U Test) (Abb. 24C).


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Abb. 24: Vergleich unterschiedlich langer Transportzeiten des Untersuchungsmaterials. Deutlicher Anstieg der Expression der IL‑4RαIT bei längeren Transportzeiten. In A stammt das untersuchte Material (Blut oder KM) von Patienten mit Ersterkrankungen oder Rezidiven, in B wurden nur Rezidivpatienten, in C nur Patienten mit Ersterkrankung eine ALL ausgewertet.

4.3  Untersuchung der mRNA-Stabilität von IL‑4Rα und IL‑4RαIT

Ein möglicher Grund für das beobachtete Phänomen wäre ein auf ungleichen Stabilitäten beruhender unterschiedlicher Abbau der beiden mRNAs. Die Stabilität einer mRNA kann bestimmt werden, indem mit einem geeigneten Transkriptionshemmer die Transkription und damit der Nachschub neuer mRNA über einen bestimmten Zeitraum blockiert werden und anschließend die Veränderung der mRNA-Menge quantifiziert wird.

Für diesen Zweck wurde die RNA mononukleärer Zellen eines gesunden Probanden teils am Tag der Blutabnahme, teils 2 und 4 Tage später aufgearbeitet. Die Zellen wurden bis zur Aufarbeitung in Zellmedium mit bzw. ohne Zugabe von Actinomycin D bei Zimmertemperatur aufgehoben. Anschließend wurden diese Proben auf die Expression von IL‑4Rα und IL‑4RαIT mRNA untersucht.

Abb. 25: Stabilität der mRNA von IL‑4Rα und IL‑4RαIT. Bei Hemmung der Transkription mit Actinomycin D zur Beurteilung der Degradierung der beiden mRNA-Varianten zeigt sich bei verzögerter Aufarbeitung der Zellen ebenfalls eine Zunahme der sAUC(IL‑4RαIT).


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Wie in Abb. 25 zu sehen, nimmt auch bei Hemmung der Transkription mit Actinomycin D die sAUC(IL‑4RαIT) bei den nach 2 und 4 Tagen aufgearbeiteten Proben zu (11% → 34% → 36%), was für eine größere Stabilität der mRNA von IL‑4RαIT spricht. Betrachtet man im Vergleich dazu allerdings die Proben, die ohne Zugabe von Actinomycin D 2 bzw. 4 Tage gestanden haben (Abb. 26) ist dieser Effekt hier viel stärker ausgeprägt (11% → 55% → 66%). Unabhängig vom Abbau der mRNA scheint also auch eine Änderung der Expression von IL‑4RαIT eine Rolle zu spielen.

Abb. 26: Vergleich der Proben mit und ohne Hemmung der Transkription. Bei den Proben mit Actinomycin D zeigen sich nach verzögerter Aufarbeitung deutlich höhere Werte für die sAUC(IL‑4RαIT) (B+D) als bei den Proben ohne Transkriptionshemmung (C+E).

Dasselbe Phänomen, wenn auch in unterschiedlicher Ausprägung, war auch bei der Untersuchung einiger Splice-Varianten von anderen Zytokinen und Zytokin-Rezeptoren wie IL-7, IL-7R, IL-15, γC und βC zu beobachten (Abb. 27). Sowohl die Zunahme des Verhältnisses der Transkripte zugunsten der Splice-Variante, wie auch die geringere Ausprägung dessen unter Hemmung der Transkription war regelmäßig zu beobachten.


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Abb. 27: Expression von Splice-Varianten anderer Interleukine oder Interleukin-Rezeptoren in mononukleären Zellen eines gesunden Probanden, die mit oder ohne Hemmung der Transkription entweder direkt oder erst 2 bzw 4 Tage nach Abnahme aufgearbeitet wurden. Die Zunahme der sAUC der Splice-Varianten ist sehr unterschiedlich ausgeprägt. Regelmäßig ist die Zunahme unter Actinomycin D geringer oder gar nicht nachweisbar. Die in der Probe „Tag 4 ohne Actinomycin D“ nachweisbare zusätzliche Bande der γC ist in der veröffentlichten Literatur bisher nicht beschrieben. Vermutlich handelt es sich hier ebenfalls um das Amplifikat eines alternativ gespleißten Transkriptes mit zusätzlicher typischer Heteroduplex-Bande.


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4.4  Semiquantitative RT-PCR der mRNA von IL‑4Rα und IL‑4RαIT

Die Amplifizierung der beiden IL‑4Rα mRNA-Varianten mit der oben beschriebenen Methode der kompetitiven RT-PCR erlaubt ausschließlich Aussagen über das Verhältnis der beiden mRNAs zueinander, ausgedrückt als sAUC(IL‑4RαIT). Eine Aussage über die absolute Mengenänderung der Transkripte ist mit diesem Versuchsaufbau nicht möglich, so daß nicht zu ersehen ist, ob bei einem Anstieg der sAUC(IL‑4RαIT) bei verzögerter Aufarbeitung der Zellen die IL‑4RαIT-mRNA zunimmt, die IL‑4Rα-mRNA abnimmt oder ob beide Transkripte in unterschiedlichem Maße zu- bzw. abnehmen.

Um dies herauszufinden, wurden die einzelnen Transkripte mit jeweils spezifischen Primern in einer semiquantitativen RT-PCR amplifiziert (Abb. 28). Die mRNA der Glycerinaldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), die als housekeeping gene konstitutiv exprimiert wird, diente als interner Standard. Um eine gegenseitige Beeinflussung der Amplifizierung der Produkte durch Konkurrenzreaktionen um Substrate wie Enzym oder Nukleotide zu vermeiden und um unterschiedliche cDNA-Verdünnungen bei der Amplifikation der jeweiligen templates zu ermöglichen (siehe Abschnitt 5.1.1), wurden IL‑4Rα bzw. IL‑4RαIT und GAPDH in jeweils unterschiedlichen Ansätzen amplifiziert.

Abb. 28: Lokalisation der in der semiquantitativen RT-PCR eingesetzten, jeweils für IL‑4Rα und IL‑4RαIT spezifischen Primerpaare. IL‑4R 1030 up sitzt im „Exon x“, das in IL‑4RαIT fehlt, und kann daher nur IL‑4Rα-cDNA amplifizieren, IL‑4R 1089IT down überspannt die Grenze der beiden dem „Exon x“ benachbarten Exons und ist daher spezifisch für IL‑4RαIT-cDNA.

Die Banden dieses Versuches wurden über die Bestimmung ihrer optischen Dichte (optical densitiy, O.D.) mit einem Gel-Dokumentationssystem und einer geeigneten Software quantifiziert. In Analogie zur Berechung er sAUC(IL‑4RαIT) erfolgte die Bestimmung der relativen O.D. der Banden von IL‑4Rα bzw. IL‑4RαIT in Bezug auf GAPDH. Das Ergebnis ist in Abb. 29 graphisch dargestellt. Zum anschaulicheren Vergleich der Proben wurden die ermittelten Werte beider Transkripte am Tag 0 auf 100% gesetzt. Das Ergebnis der kompetitiven RT-PCR (Abb. 26) ließ sich hierbei gut nachvollziehen. In den Proben mit Actinomycin D nehmen wie erwartet beide Transkripte ab. In den Proben ohne Hemmung der Transkription wird nun deutlich, daß die Zunahme der sAUC(IL‑4RαIT) tatsächlich in einer [Seite 74↓]Hochregulation von IL‑4RαIT begründet ist, während die Expression von IL‑4Rα in diesen Proben abnimmt.

Abb. 29: Bestimmung der Expressionsunterschiede von IL‑4Rα und IL‑4RαIT bei verzögerter Aufarbeitung der Zellen mit und ohne Hemmung der Transkription. Dargestellt ist die Auswertung der semiquantitativen PCR mit jeweils für die beiden Transkripte spezifischen Primern zur Beurteilung der relativen Expressionsunterschiede von IL‑4Rα bzw. IL‑4RαIT zwischen den Proben. Während in den Proben mit Hemmung der Transkription beide Transkripte abnehmen, zeigt sich in den Proben ohne Actinomycin D eine Hochregulation von IL‑4RαIT. Die gemessenen O.D. der einzelnen Banden von IL‑4Rα bzw. IL‑4RαIT jeder Probe sind in Bezug zur O.D. der Bande für GAPDH derselben Probe gesetzt worden. Zum anschaulicheren Vergleich der Proben wurden die ermittelten Werte am Tag 0 auf 100% Prozent gesetzt.

4.5 Reversibilität der Zunahme der Expression von IL‑4RαIT

Nimmt man mononukleäre Zellen eines gesunden Probanden, die zwei Tage nach Entnahme der Probe bei Zimmertemperatur gestanden haben und daher die IL‑4RαIT mRNA recht stark exprimieren, wieder bei 37°C in Kultur, entweder in reinem Medium oder unter Stimulation mit Concanavalin A oder IL‑4, zeigt sich bei der Durchführung einer kompetitiven RT-PCR, daß sich die sAUC(IL‑4RαIT) nach kurzer Zeit wieder drastisch verringert (Abb. 30A). Werden die beiden Transkripte wieder einzeln semiquantitativ amplifiziert, wird in der Probe, die in reinem Medium kultiviert wurde, eine Abnahme der Expression von IL‑4RαIT deutlich. In den Proben, die zusätzlich mit Concanavalin A oder IL‑4 stimuliert wurden, wird im Vergleich zu der Probe ohne zusätzliche Stimulation die Expression beider Transkripte hochreguliert. Dennoch kommt es auch hier zu einer Abnahme der Expression der IL‑4RαIT mRNA (Abb. 30B).


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Abb. 30: Reversibilität der Zunahme der sAUC(IL‑4RαIT) nach Kultivierung der Zellen. Werden mononukleäre Zellen, die die IL‑4RαIT-mRNA nach einigen Tagen Stehen bei Zimmertemperatur relativ stark exprimieren, wieder in Kultur genommen, nimmt innerhalb weniger Stunden die sAUC(IL‑4RαIT) wieder deutlich ab (A). Die semiquantitative Bestimmung der Einzel­transkripte zeigt, daß die mRNA von IL‑4RαIT in diesen Zellen wieder herunterreguliert wird. Bei zusätzlicher Stimulation mit Concanavalin A oder IL‑4 werden im Vergleich zu den Zellen ohne zusätzliche Stimulation beide Transkripte stärker exprimiert (B).

4.6 Biologische Funktion von IL‑4RαIT

Die Zellen der IL-3-abhängige Maus pro-B-Zellinie Ba/F3 können bei Kultur in Wachstumsfaktor-freiem Medium nicht mehr proliferieren und unterziehen sich außerdem der Apoptose. Andere Wachstumsfaktoren, z.B. mIL‑4, können die Funktion von IL-3 bis zu einem gewissen Maße ersetzen. In vielen Studien konnte bereits gezeigt werden, daß bei Transfektion von Ba/F3-Zellen mit dem hIL‑4R auch durch hIL‑4 Proliferation vermittelt und die Auslösung von Apoptose verhindert werden kann. An diesem dafür geeigneten Zellmodell wurde untersucht, inwiefern der aus der IL‑4RαIT mRNA entstehende verkürzte Rezeptor bei Bindung von IL‑4 Signaltransduktion vermitteln kann. Ba/F3-Zellen wurden [Seite 76↓]dafür mit IL‑4Rα bzw. IL‑4RαIT transfiziert, die Zellen kloniert und mit den resultierenden Zellklonen unter Ersatz des mIL-3 durch humanes oder murines IL‑4 Zellproliferations-Assays und Untersuchungen zur Apoptose der Zellen durchgeführt.

4.6.1 Transfektion von Ba/F3 mit pCR3.1-Uni, pCR3.1/IL‑4Rα und pCR3.1/IL‑4RαIT

Die gesamten kodierenden Bereiche von IL‑4Rα und IL‑4RαIT wurden mittels PCR aus der cDNA eines gesunden Probanden amplifiziert und in den eukaryontischen Expressions­vektor pCR3.1TM-Uni einkloniert. Nach Sequenzierung der resultierenden Vektorkonstrukte pCR3.1/IL‑4Rα und pCR3.1/IL‑4RαIT wurden Zellen der Maus-pro-B-Zellinie Ba/F3 mit den aufgereinigten Vektoren korrekter Sequenz mittels Elektroporation transfiziert und die stabil transfizierten Zellen unter Zugabe des Antibiotikums G418 selektioniert.

Trotz Einsatzes einer DNA-Polymerase mit Proofreading-Aktivität wies der größte Teil der Inserts Polymerase-generierte Fehler in der Basen-Sequenz auf. Um einen Vektor mit fehlerfreiem Insert des vollständigen IL‑4Rα zu erhalten, wurden wie im Abschnitt 3.6.5 ausführlich beschrieben zwei Klone von pCR3.1TM-Uni-IL4Rα mit fehlerhaften Sequenzen jeweils in anderen Bereichen des Inserts mit bestimmten Restriktionsendonukleasen geschnitten und die fehlerfreien Abschnitte religert.

4.6.2 Nachweis der Expression von IL‑4Rα und IL‑4RαIT

Nach der Klonierung der Zellen wurden die Klone auf die Expression der gewünschten Rezeptoren überprüft. Die Integration der vollständigen Rezeptor-DNA und deren Expression auf mRNA-Ebene wurde durch Amplifizierung der gesamten kodierenden DNA bzw. cDNA nachgewiesen (Abb. 31). Um in den RNA-Präparationen Kontaminationen durch DNA auszuschließen und somit eine alleinige Amplifizierung von cDNA in der RT-PCR zu gewährleisten, wurde vor Durchführung der reversen Transkription ein DNase-Verdau der RNA durchgeführt. Der fehlende Nachweis eines Amplifikates bei direktem Einsatz der RNA in die PCR-Reaktion (Daten nicht dargestellt) sicherte den alleinigen Nachweis von cDNA bei der anschließend durchgeführten RT-PCR. Zusätzlich konnte mit Hilfe eines RNase Protection Assay die Expression der mRNA direkt nachgewiesen werden (Abb. 32).


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Abb. 31: Nachweis der Integration der gesamten kodierenden Sequenz der DNA (oben) bzw. Expression der mRNA (unten) von IL‑4Rα und IL‑4RαIT in den transfizierten Ba/F3-Zellen mittels PCR bzw. RT-PCR exemplarisch für einige Klone. Die in der PCR oben dargestellte zusätzliche kürzere Bande von ca. 340 bp ließ sich in der RT-PCR nicht beobachten, war aber auch in den untransfizierten Ba/F3-Zellen nachweisbar (nicht dargestellt) und stellt vermutlich ein unspezifisches Produkt aus dem Maus-eigenen Genom dar.

Abb. 32: RNase-Protection-Assay zum Nachweis der Expression der IL‑4Rα- und IL‑4RαIT-mRNA in den mit pCR3.1/IL‑4Rα und pCR3.1/IL‑4RαIT transfizierten Ba/F3-Zellen, exemplarisch dargestellt für je einen Zellklon.

Die Expression der Rezeptor-Proteine auf der Zelloberfläche wurde durchflußzytometrisch mit einem fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper nachgewiesen, der spezifisch an die humane IL‑4Rα-Kette bindet. Abb. 33 zeigt exemplarisch die Expression für je einen Klon der mit pCR3.1/IL‑4Rα bzw. pCR3.1/IL‑4RαIT transfizierten Zellen im Vergleich zu Zellen, die [Seite 78↓]mit dem leeren Vektor transfiziert wurden. Auf die Durchführung von IL‑4-Bindungsstudien wurde verzichtet, da in anderen Studien bereits mehrfach gezeigt wurde, daß eine drastische Verkürzung der intrazellulären Domäne des IL‑4R bei unverändertem extrazellulären Anteil die Affinität des Rezeptors zu seinem Liganden nicht beein­flußt[57, 58, 61, 114].

Abb. 33: Durchflußzytometrischer Nachweis der Expression von IL‑4Rα und IL‑4RαIT auf der Zelloberfläche der transfizierten Zellen exemplarisch für drei Klone. Der ausgefüllte Peak entspricht der Isotypkontrolle. Das Histogramm ganz rechts zeigt die fehlende Expression auf den mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen.

Von den Klonen, die die transfizierten Rezeptoren sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene exprimierten, wurden 21 mit pCR3.1/IL‑4Rα und 18 mit pCR3.1/IL‑4RαIT transfizierte Klone für die folgenden Proliferationsassays eingesetzt. Die mit dem leeren Vektor pCR3.1‑Uni transfizierten Zellen wurden ohne weitere Klonierung als Negativkontrolle verwendet.

4.6.3 Proliferationsassays

Um zu untersuchen, ob bei Bindung von humanem IL‑4 (hIL‑4) an IL‑4RαIT Proliferation vermittelt werden kann, wurden mit den transfizierten Zellen Proliferationsassays unter IL‑4 durchgeführt. Nach Kultur der Zellen für ca. 45 h in Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen an humanem bzw. murinem IL‑4 wurde mit dem MTS-Zell-Proliferationstest die Proliferation der Zellen gemessen. Dabei wurde das Proliferationsverhalten der mit IL‑4RαIT transfizierten Zellklone (Ba/F3-pCR3.1/IL‑4RαIT) unter hIL‑4 mit dem unter murinem IL‑4 (mIL‑4) bzw. in wachstumsfaktor­freiem Medium verglichen. Außerdem wurde die Proliferation dieser Zellen unter hIL‑4 mit der Proliferation der Zellklone verglichen, die mit dem vollständigen IL‑4-Rezeptor (Ba/F3- pCR3.1/IL‑4Rα) bzw. mit dem leeren Vektor (Ba/F3-pCR3.1) transfiziert wurden.


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Abb. 34: Proliferationsverhalten der mit der vollständigen IL‑4Rα-Kette (oben), mit der Splice-Variante IL‑4RαIT (Mitte) und der mit dem leeren Vektor pCR3.1-Uni (links) trans­fizierten Ba/F3-Zellen unter Stimulation mit hIL‑4 im Vergleich zu mIL‑4 (4 ng/ml) über 42-48 Stunden. Mit Ausnahme eines Klones (Pfeil) proliferierten unter hIL‑4 alle mit IL‑4Rα transfizierten Klone, großenteils stärker als unter mIL‑4, während die mit der Splice-Variante und erwartungsgemäß auch die mit dem leeren Vektor trans­fizierten Zellen unter hIL‑4 kein Wachstum zeigten.

In der Abb. 34 ist das Proliferationsverhalten der Zellen ohne Wachstumsfaktor bzw. unter 4 ng/ml murinem oder humanem IL‑4 nach Kultivierung über 42-48 h dargestellt. Im Vergleich zu den ohne Wachstumsfaktor kultivierten Zellen proliferierten unter der Stimulation mit mIL‑4 alle untersuchten Zellklone. Von den 21 untersuchten Klonen, die den transfizierten humanen IL‑4Rα voller Länge exprimierten, proliferierten 20 Klone unter der [Seite 80↓]Zugabe von hIL‑4, in den meisten Fällen stärker als unter mIL‑4, nur ein Klon zeigte kein Wachstum. Dagegen war bei keinem der 18 Zellklone, die mit der Splice-Variante transfiziert worden waren, eine eindeutige Proliferation unter hIL‑4 zu verzeichnen. Nur in wenigen Fällen schienen sie unter hIL‑4 eine geringfügiges Wachstum zu zeigen, dies war jedoch bei Wiederholung der Versuche nicht reproduzierbar (Abb. 34). Auch unter sehr hohen hIL‑4-Konzentrationen von 20 ng/ml zeigte sich keine Proliferation der mit der Splice-Variante transfizierten Zellen. Wie erwartet zeigten auch die mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen unter hIL‑4 keine Proliferation, während das Wachstum unter mIL‑4 unbeeinflußt war.

In der Abb. 35 ist exemplarisch für je einen mit IL‑4Rα, IL‑4RαIT und mit dem leeren Vektor transfizierten Zellklon die Abhängigkeit der Proliferation der Zellen von der IL‑4-Konzen­tration im Medium dargestellt.

Abb. 35: Messung der Proliferation der mit IL‑4Rα, IL‑4RαIT oder dem leeren Vektor transfizierten Ba/F3-Zellen unter Stimulation mit mIL‑4 und hIL‑4 in unterschiedlichen Konzentrationen exemplarisch für je einen Zellklon. Alle Klone proliferierten wie erwartet konzentrationsabhängig unter mIL‑4. Der mit dem vollständigen hIL‑4Rα transfizierte Klon zeigt unter hIL‑4 ebenfalls Wachstum, während der mit der Splice-Variante und der mit dem leeren Vektor transfizierte Zellklon unter hIL‑4 nicht proliferierten. Dargestellt sind jeweils die gemittelten Werte aus drei Messungen.

Die Spezifität der Wirkungen von humanem und murinem IL‑4 auf ihre jeweiligen Rezep­toren wurde durch Stimulations­versuche mit und ohne Zugabe eines spezifischen blockie­ren­den Antikörpers gegen den humanen IL‑4Rα bestätigt. Wie in der Abb. 36 dargestellt, wird die hIL‑4-vermittelte Proliferation der Zellen durch den Zusatz des Antikörpers verhindert, während das durch mIL‑4 vermittelte Wachstum durch die Zugabe des anti-hIL‑4Rα-Antikörper weitgehend unbeeinflußt bleibt.


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Abb. 36: Hemmung der hIL‑4-vermittelten Proliferation eines mit dem vollständigen hIL‑4Rα transfizierten Ba/F3-Zellklones durch einen für den hIL‑4Rα spezifischen monoklonalen Antikörper. Der Antikörper hemmt nicht die über den mIL‑4R vermittelte Proliferation durch mIL‑4.

4.6.4 Apoptose der transfizierten Zellen unter IL‑4-Stimulation

Mit der Kombination zweier sich ergänzender durchfluß­zyto­metrischer Methoden wurde untersucht, inwiefern in den transfizierten Zellen unter Stimulation mit hIL‑4 die IL‑4RαIT-Variante im Vergleich zum vollständigen IL‑4Rα und im Vergleich zur Stimulation mit mIL‑4 die Induktion von Apoptose verhindern kann.

Zellklone, die mit dem vollständigen IL‑4Rα, mit der Variante IL‑4RαIT oder mit dem leeren Vektor transfiziert worden waren, wurden zu diesem Zweck in Medium unter Zugabe von hIL‑4, mIL‑4 oder ohne Wachstumsfaktor für 24 h kultiviert. Der Anteil der apoptotischen Zellen wurde durch die Anfärbung mit Annexin V-FITC in Kombination mit Propidiumjodid durchflußzytometrisch bestimmt.

In der Darstellung im Histogramm mit Propidiumjodid als alleinigem Farbstoff können die Zellen in den sehr frühen Stadien der Apoptose, in denen die Zellmembran noch intakt ist und daher der DNA-Farbstoff nicht in die Zelle eindringen kann, nicht von den vitalen Zellen unterschieden werden. Wie die Abb. 37 zeigt, war der Anteil dieser Zellen jedoch in den durchgeführten Versuchen gering, so daß sich das Ergebnis der Auswertung der Versuche nicht entscheidend von der zweiparametrigen Darstellung im Dot Plot in der Färbung mit Annexin V-FITC und Propidiumjodid unterschied. Der Anteil der nekrotischen Zellen ließ sich in beiden Darstellungen von den apoptotischen Zellen abgrenzen und betrug in allen Versuchen ca. 3 bis 7%.


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Abb. 37: Messung der Apoptose der mit IL‑4Rα (A), IL‑4RαIT (B) bzw. dem leeren Vektor (C) transfizierten Zellklone nach Kultur in wachstumsfaktorfreiem Medium oder unter Stimulation mit humanem oder murinem IL‑4 über 24 h. Dargestellt sind jeweils die Färbung mit Propidiumjodid als Histogramme und die dazu­gehörige Zweiparameter-Darstellung der Markierung mit Annexin-V-FITC gegen die Propidium­jodid-Färbung.

Beide Darstellungen geben prinizipiell dieselbe Aussage wieder. Der Anteil der apo­ptotischen Zellen des mit IL‑4Rα tranfizierten Zellklones entspricht unter hIL‑4 etwa dem Anteil unter mIL‑4, während ohne Wachstumsfaktor zu dem Zeitpunkt ein sehr viel größerer Anteil der Zellen apoptotisch ist. Sowohl in den mit IL‑4RαIT als auch bei den mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen kann durch hIL‑4 die Auslösung der Apoptose in den Zellen nicht verhindert werden. Der Anteil der apoptotischen Zellen ist unter hIL‑4 deutlich größer als unter mIL‑4 und damit genauso hoch wie ohne Wachstumsfaktor.
Die jeweils etwas höheren Werte der Regionen R2 im Vergleich zu M2 der Histogramme und der Bereiche M1 der Histogramme im Vergleich zu den Regionen R1 in den Dot Plots ergeben sich durch die bereits durch Annexin-V-FITC markierten Zellen in sehr frühen Phasen der Apoptose, die sich mit Propidiumjodid noch nicht anfärben lassen und so in den Histogrammen zu den vitalen Zellen gezählt werden. Der Anteil dieser Zellen ist jdoch stets sehr gering und ändert nichts an der Gesamtaussage der Versuche.

Prinzipiell zeigen sowohl die einparametrige Histogrammdarstellung der Propidiumjodid-Färbung als auch die Zweiparameter-Darstellung im Dot-Plot mit der Annexin V-Färbung als zusätzlichem Parameter die gleichen Ergebnisse. Bei Stimulation eines Ba/F3-Zellklones, der mit dem vollständigen humanen IL‑4Rα transfiziert wurde, war der Anteil der apo­ptotischen Zellen unter hIL‑4 und mIL‑4 identisch, während bei Kultivierung in wachstums­faktorfreiem Medium der Anteil deutlich höher lag (Abb. 37A). Über die Rezeptor-Variante IL‑4RαIT dagegen konnte durch hIL‑4 kein Apoptose-Schutz vermittelt werden. Der Anteil der apoptotischen Zellen unter Stimulation eines mit der Splice-Variante transfizierten Zellklones mit mIL‑4 war deutlich geringer als der Anteil unter hIL‑4, der etwa dem ohne [Seite 84↓]Wachstumsfaktor entsprach (Abb. 37B). Dasselbe Ergebnis zeigte sich auch bei der Untersuchung der mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen (Abb. 37B). In der Abb. 38 sind diese Ergebnisse zusammenfassend in einem Diagramm dargestellt.

Abb. 38: Zusammenfassende graphische Darstellung der Untersuchung des Anteils apoptotischer Zellen unter Stimulation mit hIL‑4, mIL‑4 oder ohne Wachstumsfaktor. Zur Erläuterung siehe Abb. 37.


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04.01.2005