Aus der Klinik für Pädiatrie m.S. Onkologie/Hämatologie
Otto-Heubner-Centrum für Kinder- und Jugendmedizin
(Direktor: Prof. Dr. med. G. Henze)
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Identifizierung und Charakterisierung einer alternativ gespleißten mRNA der Interleukin-4 Rezeptor alpha-Kette und Untersuchung der biologischen Funktion der verkürzten Rezeptorvariante

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von
Anja Möricke
aus Berlin

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h. c. R. Felix

Gutachter:
1. Prof Dr. med. Dr. h. c. G. Henze
2. Prof. Dr. med. K. Welte
3. PD Dr. med. Chr. Schmidt

Datum der Promotion: 25.01.2002

ZUSAMMENFASSUNG

Alternatives mRNA-Splicing ist ein häufig beobachtetes Phänomen, das es der Zelle ermöglicht, unterschiedliche Proteine aus einem Gen zu generieren. In den letzten Jahren wurden immer mehr alternativ gespleißte Transkripte entdeckt, und einigen der daraus resultierenden Protein-Isoformen konnten geänderte biologische Funktionen zugeordnet werden.

In dieser Arbeit ist erstmals ein alternativ gespleißtes Transkript der Interleukin-4 Rezeptor alpha (IL-4Rα) Kette beschrieben. Dieser mRNA Splice-Variante, genannt IL-4RαIT, fehlt im membranproximalen Bereich der zytoplasmatischen Domäne ein komplettes Exon. Dies führt zur Verschiebung des Leserasters und so zur Entstehung eines vorzeiten Stop-Codons. Der resultierenden Protein-Isoform fehlt der größte Teil der intrazellulären Kette mit den dort enthaltenen, für die Signaltransduktion essentiellen Domänen.

Die Untersuchung der biologischen Funktion der Rezeptor-Varianten in einem geeigneten Zellsystem der Maus zeigte, daß die Splice-Variante IL-4RαIT keine Proliferation der Zellen vermitteln und auch den Übergang der Zellen in die Apoptose nicht verhindern kann.

Bei der Quantifizierung der Expression von IL‑4RαIT-mRNA in Relation zum IL-4Rα voller Länge mit einer kompetitiven RT-PCR an Knochenmark und peripheren Blutlymphozyten von Kindern mit ALL zeigte sich zunächst ein irreführender Unterschied zwischen Proben von Kindern mit ALL-Ersterkrankung und Rezidiv. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, daß der Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials für diesen scheinbaren Zusammenhang verantwortlich war. Während direkt nach Abnahme aufgearbeitetes Untersuchungsmaterial eine nur niedrige relative Expression der Splice-Variante zeigte, nahm diese bei verzögerter Aufarbeitung drastisch zu. Diese Beobachtung wurde experimentell an Proben gesunder Probanden wiederholt bestätigt.

Interessanterweise konnte derselbe Effekt in unterschiedlicher Ausprägung auch bei Splice-Variante anderer Zytokine und –Rezeptoren wie IL‑7, IL‑7R und βC beobachtet werden. mRNA-Stabilitäts-Assays und die Bestimmung der einzelnen Transkripte mit einer semiquantitativen RT-PCR zeigten, daß es tatsächlich zu einer absoluten Hochregulation der IL-4RαIT-mRNA in den verzögerte aufgearbeiteten Proben kommt. Wurden die Zellen wieder in Kultur genommen, war dies innerhalb weniger Stunden reversibel. Desweiteren scheinen auch unterschiedlichen mRNA-Stabilitäten eine Rolle zu spielen.

Eigene Schlagworte: Interleukin-4 Rezeptor, alternatives Splicing, mRNA-Stabilität, akute lymphoblastische Laukämie

ABSTRACT

Alternative pre-mRNA splicing is a widespread mechanism contributing to the diversity of gene expression. The number of newly detected alternatively spliced transcripts has continuously risen, and distinct biological functions have been attributed to some protein isoforms resulting from these mRNA variants.

We report on the detection of a novel alternatively spliced transcript of the human interleukin-4 receptor alpha (IL‑4Rα) chain, which has been called IL‑4RαIT mRNA. A premature stop codon due to omission of one exon in the membrane-proximal region of the cytoplasmic domain leads to an mRNA variant, which encodes an intracellular truncated receptor protein lacking domains which are essential for signal transduction.

The investigation of the biological function of the IL-4Rα splice variants in a suitable mouse cell system showed, that the truncated receptor variant is not able to mediate cell proliferation or prevention of apoptosis.

Bone marrow and peripheral blood samples from children with acute lymphoblastic leukemia were analyzed for the expression of IL‑4RαIT mRNA relative to the full-length receptor transcript by competitive RT-PCR. Initially, there was found a difference of IL‑4RαIT mRNA expression in patients with initial ALL versus relapsed ALL. However, this difference turned out to be due to the time interval between collection and preparation of samples. While freshly isolated material was associated with low levels of IL‑4RαIT mRNA, samples with a longer period until cell preparation exhibited a drastic increase of IL‑4RαIT mRNA levels. The same results were obtained for peripheral blood samples from healthy donors by imitating a prolonged time of transport until cell preparation. Interestingly, a similar effect could be demonstrated for splice variants of other cytokine receptors and cytokines (βC, IL‑7R, and IL‑7), although to different extents. mRNA stability assays and semiquantitative RT-PCR specific for IL‑4Rα or IL‑4RαIT, respectively, indicated that the expression of IL‑4RαIT mRNA increases absolutely in these samples, although mRNA degradation may be of importance as well.

Keywords: Interleukin-4 receptor, alternative splicing, mRNA stability, akute lymphoblastic leukemia

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04.01.2005