Alternatives mRNA-Splicing ist ein häufig beobachtetes Phänomen, das es der Zelle ermöglicht, unterschiedliche Proteine aus einem Gen zu generieren. In den letzten Jahren wurden immer mehr alternativ gespleißte Transkripte entdeckt, und einigen der daraus resultierenden Protein-Isoformen konnten geänderte biologische Funktionen zugeordnet werden.
In dieser Arbeit ist erstmals ein alternativ gespleißtes Transkript der Interleukin-4 Rezeptor alpha (IL-4Rα) Kette beschrieben. Dieser mRNA Splice-Variante, genannt IL-4RαIT, fehlt im membranproximalen Bereich der zytoplasmatischen Domäne ein komplettes Exon. Dies führt zur Verschiebung des Leserasters und so zur Entstehung eines vorzeiten Stop-Codons. Der resultierenden Protein-Isoform fehlt der größte Teil der intrazellulären Kette mit den dort enthaltenen, für die Signaltransduktion essentiellen Domänen.
Die Untersuchung der biologischen Funktion der Rezeptor-Varianten in einem geeigneten Zellsystem der Maus zeigte, daß die Splice-Variante IL-4RαIT keine Proliferation der Zellen vermitteln und auch den Übergang der Zellen in die Apoptose nicht verhindern kann.
Bei der Quantifizierung der Expression von IL‑4RαIT-mRNA in Relation zum IL-4Rα voller Länge mit einer kompetitiven RT-PCR an Knochenmark und peripheren Blutlymphozyten von Kindern mit ALL zeigte sich zunächst ein irreführender Unterschied zwischen Proben von Kindern mit ALL-Ersterkrankung und Rezidiv. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, daß der Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials für diesen scheinbaren Zusammenhang verantwortlich war. Während direkt nach Abnahme aufgearbeitetes Untersuchungsmaterial eine nur niedrige relative Expression der Splice-Variante zeigte, nahm diese bei verzögerter Aufarbeitung drastisch zu. Diese Beobachtung wurde experimentell an Proben gesunder Probanden wiederholt bestätigt.
Interessanterweise konnte derselbe Effekt in unterschiedlicher Ausprägung auch bei Splice-Variante anderer Zytokine und –Rezeptoren wie IL‑7, IL‑7R und βC beobachtet werden. mRNA-Stabilitäts-Assays und die Bestimmung der einzelnen Transkripte mit einer semiquantitativen RT-PCR zeigten, daß es tatsächlich zu einer absoluten Hochregulation der IL-4RαIT-mRNA in den verzögerte aufgearbeiteten Proben kommt. Wurden die Zellen wieder in Kultur genommen, war dies innerhalb weniger Stunden reversibel. Desweiteren scheinen auch unterschiedlichen mRNA-Stabilitäten eine Rolle zu spielen.
Alternative pre-mRNA splicing is a widespread mechanism contributing to the diversity of gene expression. The number of newly detected alternatively spliced transcripts has continuously risen, and distinct biological functions have been attributed to some protein isoforms resulting from these mRNA variants.
We report on the detection of a novel alternatively spliced transcript of the human interleukin-4 receptor alpha (IL‑4Rα) chain, which has been called IL‑4RαIT mRNA. A premature stop codon due to omission of one exon in the membrane-proximal region of the cytoplasmic domain leads to an mRNA variant, which encodes an intracellular truncated receptor protein lacking domains which are essential for signal transduction.
The investigation of the biological function of the IL-4Rα splice variants in a suitable mouse cell system showed, that the truncated receptor variant is not able to mediate cell proliferation or prevention of apoptosis.
Bone marrow and peripheral blood samples from children with acute lymphoblastic leukemia were analyzed for the expression of IL‑4RαIT mRNA relative to the full-length receptor transcript by competitive RT-PCR. Initially, there was found a difference of IL‑4RαIT mRNA expression in patients with initial ALL versus relapsed ALL. However, this difference turned out to be due to the time interval between collection and preparation of samples. While freshly isolated material was associated with low levels of IL‑4RαIT mRNA, samples with a longer period until cell preparation exhibited a drastic increase of IL‑4RαIT mRNA levels. The same results were obtained for peripheral blood samples from healthy donors by imitating a prolonged time of transport until cell preparation. Interestingly, a similar effect could be demonstrated for splice variants of other cytokine receptors and cytokines (βC, IL‑7R, and IL‑7), although to different extents. mRNA stability assays and semiquantitative RT-PCR specific for IL‑4Rα or IL‑4RαIT, respectively, indicated that the expression of IL‑4RαIT mRNA increases absolutely in these samples, although mRNA degradation may be of importance as well.
Interleukin-4 (IL‑4) wurde im Jahre 1982 in seiner Eigenschaft identifiziert, die polyklonale Proliferation kostimulierter B-Zellen von Mäusen zu induzieren[1]. Nach der Klonierung von humaner IL‑4 cDNA[2] konnte gezeigt werden, daß es darüber hinaus über ein weites Spektrum biologischer Effekte auf hämatopoietische und nicht-hämatopoietische Zellen verfügt. So hat es wachstumsfördernde Wirkungen auf T‑Zellen[3], Endothelzellen[4] und Fibroblasten[5] und spielt eine kritische Rolle bei der Reifung von B-Zellen zu Immunglobulin-sezernierenden Plasmazellen durch die Induktion des Immunglobulinklassenwechsel von IgM zu IgG1 und IgE[6, 7, 8]. Desweiteren ist es wichtig für die Expression des niedrig-affinen IgE-Rezeptors CD23[9, 10], von MHC-Klasse II[11, 12] und von Oberflächen-IgM[13] auf B-Zellen. In seiner Eigenschaft als Faktor für die Differenzierung von T-Helfer-(Th-)0-Vorläuferzellen zu Th2-Zellen trägt es zur Entwicklung einer humoralen Immunantwort bei[14, 15, 16].
Durch Studien an CD4+ T-Helfer-Zellen von Mäusen konnte gezeigt werden, daß sich basierend auf deren Muster der Zytokin-Synthese zwei Zelltypen unterscheiden lassen: Th1-Zellen sezernieren IL-2 und IFN-γ, Th2-Zellen dagegen IL‑4, IL-5, IL-10[17]. Ähnlich polarisierte T-Zell Untergruppen lassen sich auch beim Menschen beobachten[18], obwohl hier die Grenzen zwischen Th1- und Th2-Zellen nicht immer leicht gezogen werden können. Inzwischen ist deutlich geworden, daß es viele Überlappungen zwischen den Subpopulationen gibt und Zytokin-Muster gesehen werden, die sich keinem bekannten Phänotyp eindeutig zuordnen lassen. Ob diese beobachtete Vielfalt unterschiedliche Stadien der Zellentwicklung oder transiente Antworten auf Immunstimuli widerspiegelt oder ob es sich um eine nicht zu überblickende Menge an definierten Phänotypen handelt, konnte bisher nicht in letzter Konsequenz geklärt werden. Dennoch läßt sich diversen Immunreaktionen eine definierte Th1- oder Th2-Zellantwort mit streng korrelierender Zytokin-Produktion zuordnen, was die Th1-Th2-Dichotomie auch weiterhin als eine sinnvolle funktionelle Einteilung erscheinen läßt[19].
Während die Th1-Zellen ihre Aufgaben vor allem in der zellvermittelten Immunität haben, sind die Th2-Zellen vornehmlich in die humorale Immunantwort involviert. Sie antworten auf Antigene, die von B-Zellen präsentiert werden, fördern die Sekretion von Antikörpern, insbesondere von IgE, und unterstützen Proliferation und Funktion von Mastzellen und Eosinophilen[19].
Mehrere Studien weisen darauf hin, daß IL‑4 einen direkten wachstumshemmenden Effekt auf leukämische Zellen haben kann[23] und daß ihm bei der immunologischen Abwehr maligner Zellen eine Bedeutung zukommt. So konnten Okabe et al.[24] zeigen, daß IL‑4 die DNA-Synthese Ph1-positiver ALL-Blasten vom B-Zell Phänotyp supprimiert. Außerdem hemmt es dosisabhängig das Wachstum von Ph1-positiven ALL-Zellinien. Dieser Effekt ist mit einer Hemmung der Tyrosinkinase-Aktivität assoziiert, so daß davon ausgegangen werden kann, daß es nach Bindung von IL‑4 an seinen spezifischen Rezeptor über einen bis jetzt noch unbekannten Mechanismus zu einem inhibitorischen Einfluß auf die bcr-abl-Tyrosinkinase kommt.
IL‑4 hemmt auch das Wachstum von Zellen der chronischen myelomonozytären Leukämie (CMMoL) durch Hemmung der „autokrinen“ Produktion von IL-6 oder GM-CSF[25]. Dieser Effekt ist jedoch nur in der chronischen Phase der Erkrankung wirksam, während in der akuten Phase ein direkter wachstumsstimulierender Einfluß von IL‑4 überwiegt[26]. Auch bei akuten myeloischen Leukämien mit myelomonozytärer Differenzierung (M4/M5-AML) konnte in den meisten Fällen eine proliferationshemmende Wirkung von IL‑4 in vitro beobachtet werden. Diese ändert sich allerdings nicht unter Zugabe von IL-6, so daß dieser Effekt nicht durch eine alleinige Hemmung der autokrinen IL-6-Produktion durch IL‑4 erklärt werden kann[27].
Eine indirekte Wirkung auf Tumorzellen ist über eine Einflußnahme von IL‑4 auf zytotoxische Zellen möglich. Bei der Aktivierung unspezifisch wirkender zytotoxischer Zellen scheint IL‑4 aber im Vergleich mit IL-2 eine eher untergeordnete Rolle zu spielen. So zeigte sich in in vitro-Versuchen, daß CD3- NK-Zellen, vorausgesetzt ein mitogener Stimulus ist beigegeben, in Antwort auf IL‑4 zwar proliferieren[28], andererseits aber die IL-2-abhängige Bildung von LAK-Zellen durch IL‑4 verhindert wird[29, 30]. Die IL‑4-induzierte Suppression von IL-2-vermittelter unspezifischer Zytotoxizität ist allerdings nicht wirksam bei mit IL-2 präaktivierten Zellen, die durch IL‑4 sogar in ihren Funktionen verstärkt werden können. Diese scheinbar widersprüchliche Wirkung von IL‑4 ist möglicherweise durch eine IL‑4-vermittelte Herunterregulierung des IL-2R auf ruhenden LAK-Vorläuferzellen bedingt, so daß ihre Proliferation und Differenzierung in Effektorzellen verhindert wird[31].
IL‑4 vermittelt seine biologischen Effekte durch Bindung an einen Rezeptor-Komplex, der sich aus der spezifischen IL‑4 Rezeptor alpha-(IL‑4Rα-)Kette und einem oder eventuell auch mehreren weiteren assoziierten Proteinen zusammensetzt. Bisher bekannte Rezeptorketten, die mit IL‑4Rα einen funktionellen Rezeptor-Komplex bilden können, sind die gemeinsame Gamma-Kette (common gamma chain, γC)[37, 38], die als Rezeptorkette von verschiedenen Zytokin-Rezeptoren geteilt wird, und die kürzlich klonierten IL-13 Rezeptor-Ketten IL‑13Rα1[39, 40] und IL-13Rα2[41].
IL‑4Rα ist als reife Rezeptorkette ein ~140 kDa schweres, 800 Aminosäuren (AS) langes transmembranes Glykoprotein, das IL‑4 mit hoher Affinität bindet[42]. Bestimmte strukturelle Eigenschaften in der extrazellulären Domäne des Rezeptors lassen ihn der Familie der Klasse I-Zytokin-Rezeptoren zuordnen. Diese charakteristischen Strukturen sind vier in ihrer
Die extrazelluläre Domäne ist über eine einzelne kurze Transmembranregion mit der langen zytoplasmatischen Domäne verbunden, deren Sequenz weniger konserviert ist als die der Extrazellulärregion. Einige Motive haben jedoch durch ihre Homologie mit funktionell bedeutsamen Domänen anderer Rezeptoren besondere Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Dazu gehört die sogenannte Homologie-Box 1, ein kurzes Prolin-reiches Motiv, das membranproximal innerhalb der ersten 20 Aminosäuren (AS) gelegen ist. Ungefähr 100 AS weiter carboxy-terminal findet sich eine Sequenz, die durch ihren Reichtum an Glutaminsäure-Resten auffällt. Eine weitere Struktur ist das sogenannte I4R-(Insulin Rezeptor/IL‑4R-)Motiv, das enge Homologie mit einem Motiv der Rezeptoren für Insulin und IGF (Insulin-like growth factor) 1 zeigt. Es enthält einen einzelnen Tyrosinrest an Position 497. Drei weitere Tyrosinreste lassen sich in der distalen Region der Rezeptorkette an den Positionen 575, 603 und 631 finden.
Diese und wahrscheinlich noch weitere bisher nicht identifizierte Domänen tragen zu dem Prozeß der Signalübermittlung durch den IL‑4R bei. Zur Charakterisierung der Bedeutung dieser Motive und zur Identifizierung weiterer funktionell wichtiger Domänen wurden Deletions- und Mutationskonstrukte des Rezeptors auf ihre Fähigkeit analysiert, verschiedene Bereiche der Signaltransduktion wie Proliferation, Inhibition von Apoptose oder Differenzierung vermitteln zu können. Der Vorgang der Signaltransduktion und die Beteiligung dieser Domänen daran soll im Folgenden vereinfacht und auf die wesentlichen bekannten Mechanismen beschränkt dargestellt werden.
Ein wichtiges Merkmal aller Klasse-I-Zytokin-Rezeptoren ist das Fehlen einer intrinsischen Tyrosinkinase-Aktivität der Rezeptor-Ketten. Trotzdem werden der Rezeptor und diverse zytoplasmatische Proteine nach Bindung von IL‑4 an den Rezeptor-Komplex phosphoryliert. Vermittelt wird dies über Tyrosinkinasen, die mit den Rezeptorketten assoziiert sind. Im Falle eines aus IL‑4Rα und γC bestehenden IL‑4R-Komplexes sind das die Januskinasen JAK1
Zwei Wege der dadurch in Gang gesetzten Signaltransduktionskaskade sind in den Abbildungen 2 und 3 schematisch dargestellt. Wird der einzelne Tyrosinrest Y497 im schon erwähnten I4R-Motiv phosphoryliert, können hier IRS1 (Insulin-Rezeptor-Substrat-1) bzw. sein Homolog 4PS/IRS2 ankoppeln und ihrerseits durch die Januskinasen phosphoryliert werden[48, 49, 50, 51]. Phosphoryliertes 4PS/IRS2 kann verschiedene SH2-Domänen enthaltende Signalmoleküle binden, was zu einer Aktivierung von Genen führt, die für die Proliferation der Zelle verantwortlich sind (Abb. 2)[49]. Der Transkriptionsfaktor STAT6 (Signal Transducer and Activator of Transcription) bindet in der Region der schon beschriebenen C-terminal gelegenen Tyrosinreste Y575, Y603 und Y631. Zwei STAT6-Moleküle können nach ihrer Phosphorylierung dimerisieren, translozieren in den Zellkern und binden dort an Promotorregionen von Genen, deren Expression durch IL‑4 hochreguliert wird (Abb. 3 )[52, 53, 54, 55, 56, 57].
Die beiden hier dargestellten Wege der Signaltransduktion, die entweder über die Aktivierung von 4PS/IRS2 zur Proliferation der Zelle oder über die Aktivierung von STAT6 zur Expression von bestimmten Faktoren und damit zur Differenzierung der Zelle führen, geben sicherlich nur einen kleinen Teil der ablaufenden Mechanismen wieder. Die zum Teil sehr widersprüchlichen Ergebnisse der Untersuchungen mit IL‑4Rα-Deletionsmutanten machen deutlich, daß die eigentlichen Vorgänge sehr viel komplexer sind und daß sich weder die Signalmoleküle noch die beiden Effekte Proliferation und Differenzierung streng bestimmten funktionellen Domänen zuordnen lassen.
So zeigen einige Untersuchungen, daß das schon oben erwähnte I4R-Motiv mit seinem Tyrosin-Rest an Position 497 (Y497) essentiell für die proliferativen Eigenschaften des IL‑4Rα ist. Rezeptormutanten, in denen dieses Motiv deletiert ist oder Y497 gegen Phenylalanin ausgetauscht ist, können in diesen Studien kein Proliferationssignal mehr vermitteln[48, 58, 59, 60]. In anderen Untersuchungen jedoch konnte über Rezeptormutanten, deren zytoplasmatische Domäne ebenfalls proximal des I4R-Motives trunkiert ist, Proliferation vermittelt werden [61, 62, 63]. Ebenso widersprüchliche Ergebnisse gibt es bei der Zuordnung der differenzierenden Signale zu bestimmten funktionellen Domänen. Ryan et al. zeigten, daß mindestens einer der drei Tyrosinreste Y575, Y603 und Y631 für die Aktivierung von STAT6 bzw. für die Expression von CD23, MHCII oder Iε notwendig ist[57], und andere Autoren zeigten die Fähigkeit der Peptidsequenzen, die die Tyrosinreste Y603 und Y631 flankieren, an STAT6 zu binden[52, 64]. Dennoch konnten in anderen Studien Rezeptormutanten ohne diese Region und sogar ohne einen einzigen Tyrosinrest, der als Bindungsstelle für die SH2-Domäne von STAT6 dienen könnte, die Aktivierung von STAT6 induzieren[63, 65].
Für diese widersprüchlichen Ergebnisse sind bisher noch keine zufriedenstellenden Erklärungen gefunden worden. Es läßt sich nicht ausschließen, daß diese Ungereimtheiten teilweise auf methodischen Problemen beruhen. Beispielsweise machen die Nutzung unterschiedlicher Zellsysteme und die damit verbundene unterschiedliche Expression von Signalmolekülen die Ergebnisse in den verschiedenen Arbeiten nur eingeschränkt vergleichbar. Entscheidend ist sicherlich auch, daß die Vielschichtigkeit der an der Signaltransduktion beteiligten Elemente bisher noch nicht zu überblicken ist. Das bedeutet, daß durch den Einfluß von bisher noch nicht identifizierten Domänen und/oder Signalmolekülen, insbesondere auch von negativ regulierenden Zell-Phosphatasen die Interpretation der Ergebnisse erschwert wird. Hinzu kommen nicht vorhersehbare Veränderungen der dreidimensionalen Molekülstruktur der Deletions-/Mutationskonstrukte, wodurch Bindungsstellen für Signalmoleküle eventuell unbrauchbar werden.
Vergleicht man die Nukleotidsequenz einer reifen mRNA mit der ihres zugrundeliegenden Genes, findet man die für die mRNA kodierende Region der DNA durch lange Segmente unterbrochen, die in der reifen mRNA fehlen. Diese nicht kodierenden Regionen der DNA werden als Intron-Sequenzen bezeichnet, während die Bereiche, aus denen sich die reife mRNA zusammensetzt und die auch die für das Protein kodierenden Sequenzen enthalten, Exons genannt werden. Das primäre RNA-Transkript ist eine exakte Kopie des Genes und enthält daher sowohl die Intron- als auch die Exon-Sequenzen. Bei der folgenden Umwandlung dieser unreifen Vorläufer-mRNA (precursor mRNA, pre-mRNA) in ein reifes mRNA-Molekül, das direkt für ein Protein kodieren kann, werden über einen komplexen enzymatischen Vorgang die Introns herausgeschnitten und die Exon-Sequenzen miteinander verbunden. Diese Reaktion wird als RNA Splicing bezeichnet.
Damit beim Splice-Vorgang das Herausschneiden der Introns und das Zusammenfügen der Exons präzise ablaufen kann, ist eine korrekte Erkennung der Exon-Intron-Grenzen, der sog. splice sites, erforderlich. Eine wichtige Rolle als Erkennungssequenzen spielen dabei die konservierten Intron-flankierenden Nukleotide an der 5’-splice site (acceptor site)bzw. der 3’-splice site (donor site). Die Stärke/Zuverlässigkeit einer splice site ist dabei durch ihre Übereinstimmung mit diesen Konsensus-Sequenzen definiert (Abb. 4). Weitere für den Splice-Vorgang wichtige Intron-Motive sind ein an die 3‘-splice site angrenzender Polypyrimidin-Trakt und etwas weiter upstream ein einzelnes A-Nukleotid innerhalb der sog.
Die eigentliche chemische Reaktion des Splicing, das Herausschneiden der Intron-Sequenzen und Zusammenfügen der Exons, beinhaltet zwei transesterifizierende Reaktionen. Bei der ersten wird die 5‘-splice site durch nukleophilen Angriff der 2‘-OH-Gruppe des branch site-A-Nukleotid gespalten. Das nun freie 5‘-Ende des Introns verbindet sich kovalent über eine 5‘-2‘-Phosphodiester-Bindung mit dem branch site–A-Nukleotid, wobei sich ein Ring (engl. lariat: Lasso) formt. In der zweiten Reaktion spaltet das entstandene freie 3‘-Ende des 5‘-Exons die RNA an der 3‘-splice site, und die Phosphodiesterbindung der 3‘-splice site wird auf das freie 3‘-Ende des 5‘-Exons übertragen. Das auf diese Weise herausgeschnittene Intron wird wieder linearisiert und rasch degradiert.
Diese chemischen Reaktionen werden durch die Komponenten des Splice-Apparates katalysiert, die als Splicing-Faktoren bezeichnet werden und im Zellkern die sog. Spliceosomen bilden. Spliceosome sind große Komplexe, die sich aus Ribonukleoproteinen zusammensetzen. Sie enthalten ca. 40 unterschiedliche Proteine und kleine nukleäre RNA-Moleküle (small nuclear RNAs,snRNAs), die in kleinen Komplexen als Ribonukleoprotein-Partikel (snRNP) existieren und nach der enthaltenen snRNA als U1, U2, U4/6 und U5 snRNP benannt werden. Eine große Anzahl der im Spliceosom enthaltenen Proteine sind nicht Teil der snRNPs. Zu diesen non-snRNP-Splicing-Faktoren gehören unter anderen der U2 snRNP Auxiliary Factor (U2AF) mit seinen beiden Untereinheiten U2AF65 und U2AF35 und die Familie der SR-Proteine[67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74].
Bei vielen Faktoren, RNAs und Proteinen, die in den Splice-Vorgang verwickelt sind, sind bereits Domänen beschrieben, mit denen die Faktoren untereinander oder an die pre-mRNA binden können. So besitzt die U1 snRNA an ihrem 5‘-Ende eine einzelsträngige Sequenz,
Im frühesten funktionellen Splicing-Komplex (E-(early-)Komplex)[78] bindet das U1 snRNP an die 5’-splice site und U2AF mit seiner Untereinheit U2AF65 an den Polypyrimidin-Trakt der pre-mRNA. Diese Bindungen werden durch SR-Proteine gefördert, die wahrscheinlich direkt mit dem U1-70K Protein[79] und der U2AF35 Untereinheit[80, 81] interagieren. Mit der Formation dieses E-Komplexes hat bereits die Spezifizierung der splice sites stattgefunden.
Mit der Bindung des U2 snRNP an die pre-mRNA bildet sich der A-Komplex. U2AF65 erleichtert mit seiner RS-Domäne durch Neutralisierung der negativ geladenen Phosphate der pre-mRNA die Basen-Paarung der U2 snRNA an diebranch site[75]. Außerdem wird durch die Bindung verschiedener U2 snRNP Untereinheiten an eine Region von 20 Nukleotiden upstream der branch site, die sog. anchoring site, der Komplex stabilisiert[82, 83].
Bei der Bildung des B-Komplexes löst sich U1 snRNP von der 5‘ splice site, und stattdessen assoziiert das präformierte U4/U6-U5 tri-snRNP mit der pre-mRNA, wobei U5 snRNA mit Exon-Sequenzen[77] und U6 snRNA mit Intron-Sequenzen an der 5‘-splice site interagiert. Das nun reife Spliceosom enthält jetzt alle für die katalytischen Reaktionen benötigten Komponenten.
Im C-Komplex wird durch die Dissoziation der U4 snRNA von dem U4/U6 Komplex die erste Transesterifizierungsreaktion getriggert. U6 snRNA nimmt nach Abdissoziation von U4 snRNA eine neue Konformation an, durch die eine Basenpaarung mit U2 snRNA möglich wird. Dadurch werden die 5‘-splice site und das branchpoint A-Nukleotid für den ersten Transesterifizierungsschritt zueinander gebracht[84]. U5 ist möglicherweise an der zweiten Transesterifizierung maßgeblich beteiligt. Durch zusätzliche Bindung an der 3‘-splice site des downstream Exons bringt es das freie 3‘-Ende an die 3‘-splice siteheran und spielt somit gemeinsam mit assoziierten Proteinen zumindest eine stabilisierende Rolle bei dem zweiten katalytischen Schritt[77].
SR-Proteine (SRp) sind einerseits essentielle Splicing-Faktoren[73], die schon früh in der Bildung der Spliceosomen wirken. Andererseits stellen sie wichtige Regulatoren des alternativen Splicing dar[86, 87]. Als gemeinsame Strukturen besitzen die Mitglieder der
In in-vitro-Splicing Experimenten mit sogenannten S100-Zellextrakten, die alle für den Splice-Vorgang notwendigen Komponenten mit Ausnahme der SR-Proteine enthalten, konnte gezeigt werden, daß SR-Proteine für den Splice-Vorgang essentiell sind und sie sich bis zu einem gewissen Grade gegenseitig ersetzen können. Diese Redundanz zeigt sich besonders in einfachen in vitro-Splicing-Systemen, während bei zunehmender Komplexizität der Systeme die Spezifität der unterschiedlichen SR-Proteine offensichtlich wird.
SR-Proteine sind bereits für die Bildung des E-Komplexes essentielle Faktoren. Sie ermöglichen und stabilisieren Bindungen der snRNPs untereinander und an die pre-mRNA, wobei die zugrundeliegenden Mechanismen (in Abhängigkeit von der pre-mRNA) wahrscheinlich sehr vielfältig sind. Es besteht die Vorstellung von einem sehr komplexen Netzwerk der SR-Proteine im Spliceosom. Hierbei agieren sie beispielsweise direkt mit Elementen der pre-mRNA und vermitteln so Interaktionen zwischen der pre-mRNA und den snRNP. Sie können aber auch Bindungen zwischen den snRNAs bzw. deren assoziierten Proteinen untereinander herstellen. Dies kann zur Bildung einer Brücke aus einem oder mehreren SR-Proteinen führen, die ein Intron oder auch ein Exon überspannen und so passende splice sites zueinander bringen können.
Durch die Bindung der SR-Proteine an sogenannte Exon-Enhancer wird ein solcher Komplex zusätzlich stabilisiert. Exon-Enhancer sind purinreiche Exon-Sequenzen und können das Splicing eines angrenzenden Introns fördern[89]. Sie finden sich bevorzugt assoziiert mit schwachen splice sites, die häufig variabel gespleißt werden. Bindet ein SR-Protein[78, 90, 91, 92, 93] an die Enhancer-Sequenz, kann es so durch die schon eben beschriebene Brückenbildung über das Exon hinweg die Bindung von U2AF an den Polypyrimidin-Trakt im
Phosphorylierung und Dephosphorylierung der SR-Proteine und möglicherweise auch anderer Splicing-Faktoren wie U1-70K[94] spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulation von Splicing-Prozessen[95]. Die Behandlung von Splicing-Extrakten mit Phosphatasen zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Splice-Vorganges zeigte, daß die Phosphorylierung von SR-Proteinen und eventuell auch weiteren Faktoren für die Bildung des frühen Pre-Spliceosoms, des E-Komplexes essentiell ist, die Dephosphorylierung der Faktoren nach der Formation eines funktionsfähigen Spliceosoms den Ablauf des Splicing jedoch nicht mehr verhindert[95]. Andererseits blockiert die Behandlung mit einem Phosphatase-Inhibitor die beiden katalytischen Reaktionen des Splicing, verhindert aber nicht die Bildung eines vollständigen, wenn auch inaktiven Spliceosoms[96]. Passend zu diesen Beobachtungen konnten bisher drei Kinasen identifiziert werden, die RS-Domänen phosphorylieren, nämlich die SR-Protein spezifischen Kinasen SRPK 1[97, 98] und 2[99] und außerdem Clk/Sty[100, 101], die auch über eine RS-Domäne verfügt, über die sie mit anderen RS-Domänen besitzenden Proteinen agiert.
Durch Selektion unterschiedlich miteinander kombinierter splice sites kommt es zur Entstehung verschiedener reifer mRNAs aus einer gemeinsamen pre-mRNA. Hierbei können ganze Exons oder Introns ein- oder ausgeschlossen bzw. alternativ genutzt werden, oder die Variationen können nur Teile von Exons oder Introns betreffen. Beispiele für die Entstehung unterschiedlicher mRNAs durch alternatives Splicing sind in Abb. 5 dargestellt.
Zusätzlich zu ihrer Funktion als konstitutive Splicing-Faktoren können SR-Proteine die Wahl von 5‘- und 3‘-splice sites beeinflussen. Die absoluten und relativen Mengen der SR‑Proteine in einer Zelle und deren Aktivierungszustand durch Phosphorylierung beeinflussen im kompliziertem Zusammenspiel mit cis acting-Elementen der pre-mRNA, wie z.B. Exon-Enhancern, und negativen Regulatoren das Schicksal eines primären Transkriptes.
Für das SR-Protein ASF/SF2 konnte gezeigt werden, daß es wahrscheinlich unselektiv über eine Interaktion mit U1-70K die Besetzung möglicher 5‘-splice sites durch U1 snRNP fördert[79, 102]. Sind zwei miteinander konkurrierende 5‘-splice sites gleichermaßen mit U1 snRNP besetzt, wird diejenige 5‘-splice site gewählt, die sich proximal zur 3‘-splice site befindet[102]. Ein Anstieg der Konzentration von ASF/SF2 führt also zu einer Bevorzugung der proximalen 5‘-splice site. Der zugrundeliegende Mechanismus ist bisher noch nicht vollständig verstanden.
Die Untersuchung des Einflusses der SR-Proteine SRp30b/SC35, SRp40, SRp55 und SRp75 auf die Wahl alternativer 5‘-splice sites zweier unterschiedlicher pre-mRNA-Konstrukte mit je einem einzelnen Intron demonstrierte sowohl unterschiedliche Effekte verschiedener SR-Proteine auf dieselbe pre-mRNA als auch umgekehrt unterschiedliche Wirkungen desselben SR-Proteins auf die beiden prinzipiell gleich aufgebauten pre-mRNA-Konstrukte[103]. So fördert beispielsweise SRp30b in einem pre-mRNA-Konstrukt des Simian Virus 40 (SV40) das Splicing mit der proximalen 5‘-splice site, während unter SRp40, SRp55 und SRp75 bevorzugt die distale 5‘-splice sitegenutzt wird. Bei einem Transkript des E1a-Genes kam es dagegen bei diesen drei SR-Proteinen konzentrationsabhängig zu einer Bevorzugung der proximalen 5‘-splice site. Weiterführende Experimente zeigten, daß SRp40 übereinstimmend mit diesen Beobachtungendie Interaktion von U1 snRNP mit der distalen 5‘-splice site der SV40 pre-mRNA fördert, während SRp30b die Bindung von U1 snRNP an beide 5‘-splice sites gleichermaßen begünstigt, was, wie oben bereits erwähnt, zur Nutzung der proximalen 5‘-splice site führt[104]. Diese Beobachtung läßt sich aber, zumindest in diesem Fall, nicht mit einer Präferenz der SR-Proteine für bestimmte Sequenzen in der Region der alternativen 5‘-splice sites erklären, da der Austausch der die beiden 5‘-splice sites umgebenden Sequenzen die Splicing-Muster nicht veränderte. Dies legt nahe, daß sich die entscheidenden Bindungselemente außerhalb dieser Regionen befinden.
Der antagonistisch wirkende Splicing-Faktor hnRNP/PTB konkurriert mit U2AF um die Bindung am Polypyrimidin-Trakt und behindert so das Splicing der betroffenen 3‘-splice site[105].
Über die Expression verschiedener Splice-Varianten hat die Zelle die Möglichkeit, posttranskriptionell die Expression bestimmter Proteine zu regulieren. Welche Stimuli bei der differentiellen Expression der Splice-Varianten eine Rolle spielen, ist weitgehend noch nicht geklärt. Die entscheidende Funktion der Splicing-Faktoren legt nahe, daß die Expression und Aktivierung dieser Faktoren in diesem Zusammenhang bedeutsam sind. Es gibt einige
Auch in der Familie der Zytokin-Rezeptoren ist alternatives Splicing ein häufig beobachtetes Phänomen, das es der Zelle ermöglicht, unterschiedliche Proteine aus einem Gen zu generieren. Einige der bekannten Mechanismen, die so zur Entstehung unterschiedlicher Proteinstrukturen führen, sollen folgend kurz aufgeführt werden.
In Abhängigkeit von der Anzahl der Nukleotide, die die durch alternatives Splicing entstandene mRNA-Variante von der „Original“-mRNA unterscheiden, bleibt das Leseraster der mRNA entweder erhalten („in frame“), so daß in dem resultierenden Protein lediglich Aminosäuren fehlen oder hinzukommen, oder es kommt zur Verschiebung des Leserasters („out of frame“), was zu einer kompletten Änderung der Aminosäuresequenz distal der alternativ gespleißten Region führt. In vielen Fällen hat die Verschiebung des Leserasters die Neuentstehung eines in frame-Stop-Codons zu Folge. Die Translation bricht dann an dieser Stelle ab, so daß in Abhängigkeit von der Lokalisation des Stop-Codons mehr oder weniger stark verkürzte Rezeptorketten entstehen.
Kodiert zum Beispiel das in einer alternativ gespleißten mRNA fehlende Exon für die Transmembranregion, entsteht ein lösliches Rezeptorprotein (Abb. 6B). Beispiele hierfür sind die löslichen Varianten der GM-CSF Rezeptor α-Kette[108], des IL‑7R[109] und des IL-6R[110]. Ist das Stop-Codon hinter der Transmembranregion gelegen, bleibt der Rezeptor membrangebunden, erhält aber eine verkürzte zytoplasmatische Domäne (Abb. 6C). Dies ist der Fall bei einer Variante des growth hormone receptor (GHR)[111] und bei der gemeinsamen β-Kette (commonβ chain, βc)[112], die von den Rezeptoren für IL-3, IL-5 und GM-CSF genutzt wird.
Ein weiteres interessantes Beispiel stellt c-kit, der Rezeptor des stem cell factor (SCF) dar[116, 117]. Hier kodiert in einer Splice-Variante eine kurze, vor der Transmembranregion gelegene Insertion für eine Protease-sensitive Region. Das daraus entstehende Protein wird an dieser Stelle bevorzugt proteolytisch gespalten, so daß ein löslicher Rezeptor entsteht (Abb. 6F).
Aus den geänderten Strukturen der resultierenden Proteine der Splice-Varianten ergeben sich häufig auch geänderte Eigenschaften. Für die löslichen Rezeptoren stehen unterschiedliche biologische Effekte zur Diskussion. Sie können die Wirkung ihrer Zytokine
Es gibt Hinweise dafür, daß in verschiedenen Differenzierungsstadien hämatopoietischer Zellen unterschiedliche Splice-Varianten von Zytokin-Rezeptoren exprimiert werden. So wurde gezeigt, daß es bei der Differenzierung der myeloischen Zellinie HL60 durch Dimethylsulfoxid zu Neutrophilen zu einer Herunterregulation einer weiteren Splice-Variante von GMRα, die für einen löslichen Rezeptor kodiert, und einer Hochregulation des membrangebundenen Rezeptors kommt[121]. Ein weiteres Beispiel stellt die oben bereits erwähnte verkürzte Splice-Variante des EpoR dar. Diese dominiert im frühen Stadium der erythroiden Entwicklung, während die Expression des EpoR voller Länge mit weiterer Differenzierung der Zellen zunimmt[115, 119]. Gale et al. beobachteten, daß in Stimulationsversuchen mit GM-CSF die Expression der Splice-Variante βIT in myeloischen Blasten parallel zur Differenzierung der Zellen deutlich zurückging[112]. Dies ließ die Autoren folgern, daß hier ebenfalls einen Zusammenhang zwischen der Expression von βIT und der Differenzierung myeloischer Zellen besteht.
IL‑4 bzw. dessen Rezeptor sind an der Proliferation, Differenzierung und Aktivierung verschiedener immunologischer Effektorzellen beteiligt, so daß ihnen somit potentiell eine Rolle bei der Entstehung und Abwehr von Leukämien zukommt. Aber auch der direkte Einfluß von IL‑4 auf die Rezeptor-tragende Leukämiezelle könnte in der Leukämogenese möglicherweise eine Rolle spielen. Bei einigen Interleukin-Rezeptoren sind alternativ gespleißte mRNAs identifiziert worden, die für funktionell geänderte Proteinisoformen kodieren und deren Expression die Wirkung des jeweiligen Interleukins auf die Zelle beeinflußt. Über die Expression solcher alternativ gespleißten Transkripte ist eine Regulation der Proteinexpression auf posttranskriptioneller Ebene möglich. Zusammenhänge mit der Differenzierung, unterschiedlichen Aktivierungszuständen der Zelle oder der Zellart werden vermutet, in vielen Fällen ist jedoch noch nicht geklärt, welche Bedeutung diesen Splice-Varianten in vivo zukommt.
In der vorliegenden Arbeit wurde eine bisher unbekannte alternativ gespleißte mRNA der IL‑4Rα-Kette identifiziert, die für ein Rezeptorprotein mit geänderter Struktur der zytoplasmatischen Domäne kodiert.
Zur weiteren Untersuchung dieser Splice-Variante wurde für die vorliegende Promotionsarbeit zunächst folgende Fragestellung formuliert:
Welche Funktion der IL‑4Rα Splice-Variante wäre ausgehend von ihrer Proteinstruktur zu erwarten?
Wird sie nach Transfektion eines geeigneten Zellsystems auf der Zelloberfläche exprimiert?
Hat sie die Fähigkeit, Signaltransduktion zu vermitteln und somit Proliferation zu induzieren und die Auslösung von Apoptose zu verhindern?
Gibt es bei pädiatrischen Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) interindividuelle Unterschiede in der Expression der Splice-Variante von IL‑4Rα-mRNA in Relation zum IL‑4Rα voller Länge?
Gibt es einen Unterschied in der Expression der IL‑4Rα-mRNA Splice-Variante zwischen Patienten mit ALL und gesunden Probanden?
Korreliert die Expression der Splice-Variante der IL‑4Rα-mRNA mit bestimmten Immunphänotypen der ALL-Blasten oder mit der Prognose der Erkrankung?
Die
Ist das an den Patientenproben beobachtete Phänomen der experimentell nachvollziehbar?
Ist die Veränderung der Expression von Splice-Varianten bei verzögerter Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials auch bei anderen Interleukinen/Interleukin-Rezeptoren zu beobachten?
Beruht die veränderte Expression der IL‑4Rα-Splice-Variante bei verzögerter Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials auf unterschiedlichen mRNA-Stabilitäten der beiden Splice-Varianten oder handelt es sich um eine Änderung der Expression der mRNAs?
Knochenmark-(KM-)Aspirate (n=155) oder peripheres Blut (n=42) von 131 pädiatrischen Patienten mit Erkrankung an einer akuten lymphoblastischen Leukämie (ALL) (7 prä-prä-B, 70 common, 24 prä-B, 2 B, 2 prä-T, 15 T, 11 My+) wurden auf die Expression der mRNA von IL‑4R und IL‑4RαIT untersucht. 49 Patienten hatten eine ALL-Ersterkrankung, 82 ein erstes oder folgendes ALL-Rezidiv. Von 32 der Patienten wurden KM und PB zum Zeitpunkt der Diagnose, von 10 Patienten ausschließlich Blut zum Zeitpunkt der Diagnose, von 30 Patienten KM-Proben zum Zeitpunkt der Diagnose und in Remission nach chemotherapeutischer Behandlung und von 12 Patienten KM ausschließlich in Remission analysiert. Die Patienten mit ALL-Rezidiv wurden an unterschiedlichen Kliniken in Deutschland, Österreich und der Schweiz im Rahmen der ALL-REZ BFM 87-96 Studien therapiert. Das Untersuchungsmaterial für die molekularbiologischen Untersuchungen dieser Patienten wird regelmäßig an die Studienzentrale in Berlin geschickt. Die Patienten mit ALL-Ersterkrankung wurden im Rahmen der ALL-BFM 90-95 Studien an unserer Klinik behandelt.
Die Expression der IL‑4Rα- und IL‑4RαIT-mRNA wurde in den in der folgenden Tabelle dargestellten humanen Zellinien untersucht, die Funktionsstudien von IL‑4RαIT wurden mit der Maus-Zellinie Ba/F3 durchgeführt.
Actinomycin D, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, D.
Acrylamid-/Bisacrylamid-Stammlösungen:
Agarose:
Ammonium Persulfate, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, D.
Borsäure, Merck, Darmstadt, D.
Bromphenolblau, Merck, Darmstadt, D
Chloroform, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, D.
Concanavalin A, Boehriger Mannheim GmbH, Mannheim, D.
Dithiothreitol (DTT), Ultra pure, GIBCO BRL, Life Technologies, GmbH, Eggenstein, D.
Essigsäure 100%, Merck, Darmstadt, D.
Ethanol 100% unvergällt, Merck, Darmstadt, D.
Ethidiumbromid, reinst, Serva, Feinbiochemika GmbH, Heidelberg, D.
Ethylenediaminetetraacetic-Acid (EDTA), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, D.
Ficoll separating solution, Density 1.077, Seromed® Biochrom KG, Berlin, D.
Formamid, Merck, Darmstadt, D.
Gel-Mix® Running Mate, TBE Buffer, GIBCO BRL, Life Technologis, GmbH, Eggenstein, D.
Harnstoff kristallin, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, D.
MDE, Gel Solution, FMC BioProducts, Rockland, ME, USA.
Natriumhydroxid, Merck, Darmstadt, D.
Natriumthiosulfat, Merck, Darmstadt, D.
Phenol, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, D.
Propidiumjodid, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, D.
Sephadex® G-50 Fine, DNA Grade, Pharmacia Biotech, Freiburg, D.
Silbernitrat 0,1%, Merck, Darmstadt, D.
TEMED, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, D.
Trizma-Base, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, D.
Xylencyanol, Merck, Darmstadt, D.
1x TBE, pH 8,0:
1x TAE, pH 8,0:
1x Gelladepuffer (Agarose-Gelelektrophorese):
SSCP-Ladepuffer:
Lösungen für die Silberfärbung:
Fixierlösung:
Aqua dest. ad 500 ml
Entwicklerlösung:
Stoplösung:
Sequenzierung
RNase-Protection-Assay
Denaturierendes Top-Gel:
2,5 ml Formamid
2,5 ml 2x MDE
0,5 ml 5x TBE
100 µll APS 10%
20 µl TEMED
PBS-Dulbecco, Seromed® Biochrom KG, Berlin, D.
RPMI 1640 mit L-Glutamin, PAA Laboratories GmbH, Linz, Österreich.
Foetal Calf Serum, PAA Laboratories GmbH, Linz, Österreich.
Penicillin (10.000 U/ml)/Streptomycin (10.000 µg/ml), Seromed® Biochrom KG, Berlin, D.
LB (Luria-Bertani) Medium, pH 7,0:
Luria Agar (Miller’s LB-Agar), GIBCO BRL, Life Technologies, GmbH, Eggenstein, D.
SOC-Medium:
1Kb-DNA Ladder, GIBCO BRL, Life Technologis, GmbH, Eggenstein, D.
Deoxynucleoside Triphosphate Set, GIBCO BRL, Life Technologis, GmbH, Eggenstein, D.
Fluorescein RNA Labeling Mix, Boehringer-Mannheim, Mannheim, D.
Hexanukleotidgemisch, 10x konz., Boehringer-Mannheim, Mannheim, D.
Oligonukleotid-Primer, TIB MOLBIOL, Berlin, D.
Original TA-Cloning® Kit, Invitrogen, Groningen, Niederlande.
Eukaryotic TA Cloning® Kit – Unidirectional, Invitrogen, Groningen, Niederlande.
AmpliTaq® DNA-Polymerase, Perkin-Elmer, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, D.
TaKaRa LA Taq DNA-Polymerase, TaKaRa Shuzo Co., LTD, Shiga, Japan.
Expand™ HF PCR System enzyme mix, Boehriger Mannheim GmbH, Mannheim, D.
SuperScript IITM H- Reverse Transkriptase, GIBCO BRL, Life Technologis, GmbH, Eggenstein, D.
RNase T1, Boehriger Mannheim GmbH, Mannheim, D.
Anti human IL‑4Rα-Antikörper (anti CD124), Klon S456C9, PE-konj., Coulter-Immunotech Diagnostics, Hamburg, D.
Maus-IgG1-PE, B&D, Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, San José, CA, USA.
Anti-human IL‑4R polyclonal antibody, R&D Systems GmbH, Wiesbaden, D.
Annexin V/FITC Kit, Bender MedSystems, Wien, Österreich.
ThermoSequenaseTM dye terminator cycle sequencing pre-mix kit, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, D.
RiboQuantTM, RPA-Kit, PharMingen GmbH, Hamburg, D
CellTiter 96™ AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, USA
ABI PRISM™ DNA Sequencing Analysis Software, PerkinE, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, D.
GeneScan Analysis-Software Version 1.2.2-1, Perkin-Elmer, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, D.
WinMDI Version 2.8, Flow Cytometry Application, Joseph Trotter.
CellQuest Version 3.1f, Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, San José, CA, USA.
Molecular Analyst® /PC, UV Gel Documentation, Bio-Rad Laboratories, Hercules, Ca, USA.
SPSS for Windows, Release 7.0.
Microsoft® Word 97
Microsoft® Excel 97
Brutschränke:
Heraeus Instruments, Berlin, D.
FACScan™ Flowzytometer, B&D, Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, San José, CA, USA.
Elektrophoresekammern:
Wide Mini Sub® Cell, Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D.
Elektroporator:
Gene Pulser, Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D.
Gel-Dokumentationssystem:
Gel Doc 1000TM, Bio-Rad Laboratories GmbH, München, D.
Kamera:
Polaroid CU-5 Nahaufnahme-Kamera, Polaroid, Offenbach/Main, D.
Mikroskope:
Carl Zeiss, Jena, D.
Plattenphotometer:
Dynatech MR5000 Microplate Reader, MTX Lab Systems Inc., Vienna, VA, USA.
Power Supply:
Power Pack P25, Biometra, Göttingen, D.
Schüttelinkubator:
Certomat® R/Certomat® H, B. Braun Biotech International, Melsungen, D.
Sequenzierer:
ABI PrismTM 373 und 377 Automatic Sequencer, Perkin-Elmer, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, D.
Sterilbank:
LaminAir® HBB 2436, Heraeus Instruments, Berlin, D.
Thermo-Cycler:
DNA-Engine, Peltier Thermal Cycler, Model PTC-200, MJ Research Inc., Watertown, MA, USA.
GeneAmp® PCR System 2400, Perkin-Elmer, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, D.
Filme:
Land Pack Filme Typ 667 (36 DIN), Polaroid Co., Cambridge, Mass., USA.
UV-Transilluminator:
TFX-20M, Fröbel Labor Technik GmbH, Berlin, D.
Zentrifugen:
Labofuge 400R, Heraeus Instruments, Berlin, D.
Megafuge 1.0, Heraeus Instruments, Berlin, D.
Die graphische Darstellung der Werte für sAUC (IL-4RαIT) der Patientengruppen erfolgte in Boxplots. In einem Boxplot sind die Werte einer Gruppe basierend auf der Darstellung von Median, Quartilen und Extremwerten zusammengefaßt. Die Box stellt den interquartilen Bereich dar, der 50% aller Werte enthält, die Linie durch die Box bezeichnet den Median. Die „Antennen“ umfassen den Bereich vom Rand der Box bis zum höchsten bzw. niedrigsten Wert, abgesehen von „Ausreißern“ und „Extremen“. „Ausreißer“ sind als Kreise dargestellt und bezeichnen Werte, deren Abstand vom oberen bzw. unteren Rand der Box 1,5 bis 3 Box-Längen beträgt. „Extreme“ sind mehr als 3 Box-Längen entfernt, und werden als Sternchen dargestellt.
Als statistische Tests wurden der Mann-Whitney-U Test, der Kruskal-Wallis Test und der Wilcoxon-rank Test eingesetzt. Die Berechnungen erfolgten mit der Software SPSS for Windows, Release 7.0. Statistische Auswertungen mit p<0,05 wurde als signifikant gewertet.
Alle Zellinien wurden in RPMI 1640 mit Glutamin (PAA Laboratories GmbH) unter Zusatz von 10% fetalem Kälberserum (PAA Laboratories GmbH) 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin (Seromed, Biochrom KG) bei 37°C in wassergesättigter Atmosphäre mit 5% CO2 kultiviert.
Das Medium für die Kultivierung der Zellinie Ba/F3 enthielt zusätzlich 5 ng/ml mIL-3 (TEBU).
Durch Zentrifugation über einen Ficoll-Dichte-Gradienten (Seromed, Biochrom KG, Dichte 1.077 g/ml) wurden die mononukleären Zellen der Knochenmark- und Blut-Proben von Patienten und gesunden Probanden angereichert.
Gesamt-RNA und DNA der Proben wurden mit dem RNeasy Total RNA KitTM bzw. dem QIAamp Blood Kit™ (beide von Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers isoliert.
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR) ist eine Technik zur zyklischen Amplifizierung bestimmter DNA-Bereiche. Nach Denaturierung der DNA und damit Trennung der gebildeten Doppelstränge lagert sich bei geeigneten Temperaturen ein Paar spezifischer Oligodesoxynukleotide (Primer), das die nachzuweisenden DNA-Region flankiert, der DNA an (annealing) und initiiert die Synthese des jeweils komplementären DNA-Stranges durch eine thermostabile DNA-Polymerase (Elongation). Weitere Zyklen mit den jeweiligen Schritten Denaturierung, Primer-annealing und Elongation schließen sich an. Da sich idealerweise die synthetisierten DNA-Fragmente mit jedem Zyklus verdoppeln, resultiert eine exponentielle Vermehrung des PCR-Produktes. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung stellen sich die PCR-Fragmente als Bande dar. Durch Färbung des Geles mit Ethidiumbromid, einem Farbstoff, der mit DNA interkaliert und bei Licht einer Wellenlänge von 256 nm fluoresziert, können die Banden im UV-Licht sichtbar gemacht werden.
Die Umschreibung von RNA in komplementäre DNA (cDNA) gibt die Möglichkeit, durch Amplifizierung von cDNA-Fragmenten mit der Methode der PCR indirekt auch RNA-Bereiche nachzuweisen.
Die Reaktionsansätze und -bedingungen der in dieser Arbeit durchgeführten PCR’s und RT‑PCR’s sind im speziellen Methodenteil ab Abschnitt 3.5 beschrieben. Die in den unterschiedlichen PCR-Ansätzen verwendeten Primer (TIB MOLBIOL, Berlin) und ihre Sequenzen sind in der Tabelle 1 aufgeführt.
Die Reaktion der reversen Transkription zur Generierung von komplementärer DNA (cDNA) wurde bei 37°C für 45 min und anschließender Hitzeinaktivierung der Reversen Transkriptase bei 94°C für 5 min in folgendem Ansatz durchgeführt:
10 µl-Aliquots eines jeden PCR-Produktes wurden nach elektrophoretischer Auftrennung in mit Ethidiumbromid (200 µg/l) gefärbten 0,6-3%igen Agarose-Gelen (NuSieve GTG:SeaKem GTG (2:1) für 3%ige Gele, SeaKem LE für 0,6-2%ige Gele, Biozym Diagnostics GmbH) analysiert.
Aufreinigungen von PCR-Produkten wurden mit dem PCR Purification Kit (Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Amplifikate der aus Agarose-Gelen herausgeschnittenen Banden wurden mit dem Gel Extraction Kit (Qiagen) aufgereinigt.
Die PCR-Produkte bzw. Plasmide wurden mit dem „ThermoSequenaseTM dye terminator cycle sequencing pre-mix kit“ (Amersham) sequenziert. Die Methode des Cycle Sequencing basiert auf dem Prinzip der PCR, wobei allerdings im Unterschied zur PCR nur ein Primer eingesetzt wird. Durch den Einsatz einer hitzestabilen DNA-Polymerase können durch wiederholte Zyklen von Hitzedenaturierung des Templates, Primer-Anlagerung und Elongation größere Mengen von Produkt erzielt werden als bei Sequenzierungen mit hitzeempfindlichen Polymerasen wie z. B. der T7 Sequenase, die nur einen einzigen Polymerisierungsschritt erlauben.
Der Einbau eines Didesoxynukleotids (ddNTP) in den DNA-Strang verhindert eine weitere Polymerisierung, so daß es an dieser Stelle zum Kettenabbruch kommt. Die vier verschiedenen ddNTPs sind jeweils mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung, die die Fragmente nach ihrer Größe separiert,
Cycle-Sequencing-Ansatz
Plasmid-Sequenzierung:
Direkte Sequenzierung eines PCR-Produktes:
Reaktionsbedingungen
Die Cycle-Sequencing-Reaktionen wurden im Thermocycler GeneAmp® PCR System 2400 (PE, Applied Biosystems) durchgeführt. Durch Zentrifugation über Sephadex-Säulen (Sephadex G50, Pharmacia Biotech ) wurden die Produkte von den überschüssigen Primer- und Nukleotid-Resten abgetrennt und in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Die Pellets wurden in 4 µl Ladepuffer gelöst und nach Denaturierung für 2 min bei 94°C auf Eis gestellt. 2 µl der Probe wurden für die weitere Analyse auf das Gel geladen.
Die Produkte wurden in einem Polyacrylamid-Gel (5% Acrylamid:Bisacrylamid (29:1), 7 M Harnstoff) im ABI PrismTM 377 aufgetrennt und analysiert.
Verdaue mit Restriktionsendonukleasen wurden unter den entsprechenden Pufferbedingungen mit je ca. 1‑2 U Enzym pro µg DNA bei 37°C für 1‑4 Stunden durchgeführt.
Die SSCP-Analyse beruht auf dem Prinzip, daß einzelsträngige DNA-Fragmente in einem nicht-denaturierenden Milieu entsprechend ihrer Primärstruktur sekundäre Konformationen annehmen, die das Laufverhalten in einem hochauflösenden Polyacrylamid-Gel beeinflussen, so daß mit dieser Methode bei geeigneten Versuchsbedingungen Punktmutationen detektiert werden können. Durch eine initiale Hitze-Denaturierung in Formamid werden die Doppelstränge eines PCR-Produktes in Einzelstränge getrennt. Diese bilden dann bei Auftrennung im nicht-denaturierenden Gel entsprechend ihren Laufeigenschaften ein spezifisches Bandenmuster, das mittels einer hochsensitiven Silberfärbung sichtbar gemacht werden kann.
Die Methode der SSCP wurde in der vorliegenden Arbeit angewandt, um die bei der kompetitiven PCR von IL‑4Rα/IL‑4RαIT (siehe Abschnitt 3.5.1 und Abb. 11) auftretende zusätzlichen Bande als Heteroduplexe zu identifizieren (siehe auch Abschnitt 3.5.3 und Abb. 18).
Zur Durchführung der SSCP wurden 5 µl der aus dem Gel extrahierten Amplifikate mit 15 µl SSCP-Ladepuffer gemischt, nach Denaturierung über 10 Minuten sofort auf Eis gestellt und auf ein 0,7x MDE-Gel geladen. Die Elektrophorese erfolgte in 0,5x TBE als Laufpuffer bei einer elektrischen Leistung von 4 Watt während der ersten 15 Minuten, anschließend über einen Zeitraum von 15-18 Stunden bei 2 Watt. Um die Banden nach Abschluß der Elektrophorese durch eine Silberfärbung sichtbar zu machen, wurde das Gel zunächst fixiert, anschließend in 0,1% Silbernitrat 10 Minuten inkubiert, gewaschen und in der Entwicklerlösung geschwenkt bis die Banden sichtbar wurden. Die Entwicklung wurde in 10% Essigsäure gestoppt.
Die Durchflußzytometrie ist ein Meßverfahren zur Untersuchung von Partikeln wie z.B. Zellen in wässriger Suspension. Die Zellen werden im Durchflußzytometer in einem Flüssigkeitsstrom wie in einer Perlenkette aufgereiht durch eine Meßkammer geleitet und dort dem Meßpunkt, dem Kreuzungspunkt mit einem Laserstrahl zugeführt. Das an der Zelle entstehende Streulicht wird in verschiedenen Winkeln ausgewertet. Das im Engwinkel gemessene Streulicht (forward scatter) ist ein Maß für die Größe der Zellen, während das seitwärts im rechten Winkel gemessene Streulicht die Zellgranularität bestimmt. Zusätzlich kann die Fluoreszenz der Zellen gemessen werden. Dazu werden die Zellen entweder direkt mit Fluorochromen angefärbt (z.B. Propidiumjodid als Kernfarbstoff) oder sie werden mit Fluoreszenz-markierten Antikörpern beladen. Die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe
Die in dieser Arbeit durchgeführten durchflußzytometrischen Messungen wurden mit dem FacScan der Firma Becton-Dickinson durchgeführt.
Das Prinzip des TA-Cloning (Original TA-Cloning®, Eukaryotic TA Cloning® Kit - Unidirectional, Invitrogen) beruht auf der Eigenschaft der Taq-Polymerase, an das 3‘-Ende jedes bei der PCR-Amplifikation entstehenden Stranges ein einzelnes A-Nukleotid anzufügen. Der Vektor ist bereits linearisiert und mit jeweils einem T-Nukleotid-Überhang an seinen 3‘-Enden versehen. Dadurch werden „sticky ends“ passend zu den 3‘A-Überhängen der PCR-Produkte geschaffen und die Selbstligation des Vektors verhindert.
Der TA-Cloning-Vektor pCR3.1™-Uni (Eukaryotic TA Cloning® Kit - Unidirectional, Invitrogen) ist ein eukaryontischen Expressionsvektor, der zusätzlich die gerichtete Klonierung von PCR-Produkten ermöglicht. Für diesen Zweck trägt das eine 5‘-Ende des Vektors keine Phosphatgruppe, was eine Ligation mit einem Ende eines DNA-Stranges, der ebenfalls keine 5‘-Phosphatgruppe trägt, verhindert. Durch vorhergehende Phosphorylierung eines der beiden Primer, die bei der PCR zur Herstellung des Inserts eingesetzt werden, kann das Insert jedoch in der gewünschten Orientierung in den Vektor eingebaut werden (Abb. 7).
Die Phosphorylierung eines Primers und die anschließende Ligation der Inserts mit dem Vektor erfolgten nach den Anweisungen des Herstellers der eingesetzten TA-Cloning®-Kits.
Der Ansatz wurde für 40 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Kinase für 5 min bei 94°C inaktiviert, der Ansatz auf Eis gestellt und sofort in der PCR weiterverwendet.
Kompetente Zellen des E. coli-Stammes TOP10F‘ (One ShotTM, Invitrogen) wurden mit den fertigen Ligationsansätzen transformiert.
Die Zellen wurden auf Eis aufgetaut und mit 2 µl β-Mercaptoethanol und 1-2 µl des Ligationsansatzes gemischt. Nach Inkubation für 30 min auf Eis wurden die Zellen für 30 sec einem Hitzeschock bei 42°C ausgesetzt, kurz auf Eis abgekühlt und dann für 60 min in 250 µl SOC-Medium bei 37°C und 225 UpM auf einem Rotations-Schüttler geschüttelt. Anschließend wurden je 50 µl und 250 µl des Ansatzes auf Luria-Agar-Platten mit Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Für die Plasmid-Minipräparationen wurde je eine Kolonie einer Übernachtplatte gepickt und in 2 ml Ampicillin-LB-Medium für ca. 16 h bei 37°C geschüttelt. Die Isolierung der Plasmide wurde mit dem QIAprep Plasmid Mini Kit (Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Bakterien werden nach alkalischer Lyse über Säulen mit einer DNA-bindenden Silica-Matrix aufgereinigt.
Plasmidpräparationen mit ausreichender Reinheit und Menge für die nachfolgenden Transfektionen wurden mit dem QIAfilter Plasmid Maxi Kit (Qiagen) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.
Für die Identifizierung und die folgende Sequenzierung der IL‑4RαIT wurde eine PCR mit dem Primerpaar IL‑4R 617 up/IL‑4R 1118 down (Tab. 1) durchgeführt.
Reaktionsansatz
Reaktionsbedingungen
Bei der Untersuchung der Patientenproben wurden die gleichen Reaktionsbedingungen verwendet. Der Reaktionsansatz enthielt aber zusätzlich 0,15 µl je β-Actin-spezifischem Primer als interne Kontrolle.
Nach Agarose-Gelelektrophorese wurden die Banden für den IL‑4Rα und die IL‑4RαIT aus dem Gel herausgeschnitten, die Amplifikate aufgereinigt und nach der in Abschnitt 3.4.5 beschriebene Methode direkt sequenziert.
Zur Identifizierung der Heteroduplexe wurden die Banden von IL‑4R und IL‑4RIT und die Heteroduplex-Bande nach elektrophoretischer Auftrennung in einem Agarose-Gel einzeln aus dem Gel herausgeschnitten, aufgereinigt und in einer SSCP-Analyse das Laufverhalten der Einzelstränge ermittelt.
Mit Hilfe eines Gel-Dokumentationssystems (Gel Doc 1000TM) und der Molecular Analyst® Software (beide von Bio-Rad Laboratories) konnte die Intensität der Banden dokumentiert und analysiert werden. Für jede Probe wurde ein Profil erstellt, bei dem die Fläche unter der Kurve (AUC) eines jeden Peaks der Intensität der dazugehörigen Bande entspricht ( Abb. 19 ). Die AUC’s der Peaks von IL‑4Rα und IL‑4RαIT wurden bestimmt, und als Maß für die Expression der Splice-Variante im Verhältnis zum IL‑4Rα wurde eine standardisierte AUC für die Splice-Variante (sAUC(IL‑4RαIT)) nach der Formel
sAUC(IL‑4RαIT) =
Zur Identifizierung der Grenzen des alternativ gespleißten Exons wurde eine Intron-überspannende PCR mit DNA aus mononukleären Zellen peripheren Blutes eines gesunden Probanden durchgeführt. Die verwendeten Primerpaare waren IL‑4R 950 up/IL‑4R 1074 down für das Intron upstream des alternativ gespleißten Exons und IL‑4R 1030 up/IL‑4R 1118 down (Tab. 1)für das Intron downstream davon. Es gelang, die gesamten Introns unter den folgenden PCR-Bedingungen zu amplifizieren.
Reaktionsansatz
Reaktionsbedingungen
Die Länge der PCR-Produkte betrug ca. 1500 bp für das Intron oberhalb und ca. 1800 bp für das Intron unterhalb des alternativ gespleißten Exons.
Die Produkte wurden wie oben beschrieben aufgereinigt und je etwa 400 bp der 5’- und der 3’-Enden der Amplifikate wurden direkt sequenziert.
Zur Bestimmung der mRNA-Stabilitäten von IL‑4R und IL‑4RIT wurden mononukleäre Zellen peripheren Blutes eines gesunden Probanden in 5 Portionen (Nr. 1-5) zu je 1x107 Zellen geteilt. Aus Portion Nr. 1 wurde sofort RNA gewonnen, Nr. 2 und 3 wurden am zweiten Tag und Nr. 4 und 5 am vierten Tag nach Abnahme aufgearbeitet. Die Zellen aus den Portionen 2-5 wurden bis zur Aufarbeitung in 4 ml RPMI-Medium bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Die Portionen 2 und 4 enthielten zusätzlich 10 µg/ml Actinomycin D (Sigma-Aldrich) zur Hemmung der Transkription.
Um das Verhältnis der Expression von IL‑4Rα- zu IL‑4RαIT-mRNA zu bestimmen, wurde eine kompetitive RT-PCR wie im Abschnitt 3.5.1 beschrieben durchgeführt.
Die Expression der einzelnen Transkripte von IL‑4Rα und IL‑4RαIT wurde mit semiquantitativen RT-PCRs mit jeweils für die einzelnen Transkripte spezifischen Primern in folgenden Ansätzen durchgeführt.
Reaktionsansatz für IL‑4R α IT
Reaktionsansatz für GAPDH
Reaktionsbedingungen für IL‑4R α , IL‑4R α IT und GAPDH
Die gesamten kodierenden Bereiche des IL‑4Rα und der IL‑4RαIT wurden mit einer sogenannten nested PCR amplifiziert. Hierbei wird ein PCR-Produkt als template in einem weiteren PCR-Ansatz eingesetzt und mit intern (nested) gelegenen Primern amplifiziert. Dadurch werden die Ausbeute erhöht und gleichzeitig im externen PCR-Ansatz entstandene unspezifische Produkte durch den Einsatz der nested gelegenen Primer im internen Ansatz nicht weiter amplifiziert.
Die externe PCR wurde mit dem Primerpaar IL‑4R 16 up/IL‑4R 3065 down (Tab. 1)durchgeführt.
Reaktionsansatz
Reaktionsbedingungen
Für die interne PCR wurde das Produkt der externen PCR 1:104 verdünnt und mit dem Primerpaar IL‑4R 125 up/IL‑4R 2793 down (Tab. 1) amplifiziert. Um eine anschließende gerichtete Klonierung in den Vektor pCR3.1TM-Uni zu ermöglichen, wurde der Sense-Primer IL‑4R 125 up zuvor phosphoryliert (siehe 3.4.10.1.)
Reaktionsansatz
Reaktionsbedingungen
Die Amplifikationsprodukte der internen PCR wurden in dem eukaryontischen Expressionsvektor pCR3.1™-Uni kloniert.
Zur Klonierung wurden die Amplifikationsprodukte der IL‑4Rα- und IL‑4RαIT-cDNA zunächst mit dem Vektor pCR3.1™-Uni ligiert. Gewöhnlich wird in der Ligation ein molares Verhältnis von Vektor zu Insert von 1:1 bis 1:2 empfohlen. Für eine größere Effizienz der Ligation kann laut Hersteller bei langen Inserts der Einsatz einer größeren Menge PCR-Produkt in Relation zum Vektor nötig sein. Da trotz der nested-PCR die Ausbeute an PCR-Produkt relativ gering war, wurden zur Anreicherung die gewünschten Produkte mehrerer Ansätze aufgereinigt und in einem kleineren Volumen H2O aufgenommen. Dieses Produkt wurde nach Zugabe von PCR-Puffer, dNTPs und Taq-Polymerase nochmals für 15 min bei 72°C inkubiert, um einen ausreichenden 3‘-A-Überhang der Produkte und damit eine hohe Ligationseffizienz zu gewährleisten.
Die Ligation fand bei 14°C über Nacht statt.
Kompetente E. coli-Bakterien wurden wie im Abschnitt 3.4.10.3 beschrieben mit den Ligationsansätzen transformiert. Die Kolonien der Übernachtplatten wurden in je 2 ml LB‑Ampicillin-Medium für ca. 16 h weiter kultiviert. Je 1 µl dieser Zellsuspensionen wurde mit 100 µl H2O verdünnt und 1 µl davon als template in eine PCR eingesetzt, um zu kontrollieren, ob ein Insert und ob die IL‑4Rα- oder IL‑4RαIT‑cDNA in die Klone integriert wurde. Die PCR wurde mit dem Primerpaar IL‑4R 617 up/IL‑4R 1118 down (Tab. 1) unter den im Abschnitt 3.5.1 beschriebenen Konditionen durchgeführt. Aus den Kulturen, deren Klone das gewünschte Insert integriert hatten, wurden die Plasmide wie in Abschnitt 3.4.10.4 beschrieben extrahiert.
Zur Kontrolle der korrekten Sequenz wurden die Inserts der Vektoren nach der im Abschnitt 3.4.5 beschriebenen Methode mit den in der Tabelle 1 aufgelisteten IL‑4Rα-Primern sequenziert.
Da trotz Einsatzes einer DNA-Polymerase mit proofreading-Aktivität kein Klon von pCR3.1/IL‑4Rα mit fehlerfreiem Insert erhalten werden konnte, wurden die korrekten Bereiche zweier Vektoren mit Fehlern an jeweils unterschiedlichen Positionen des Inserts miteinander ligiert: Der Klon Nr. 24 hatte Fehler in seiner Basensequenz an den Positionen 487 und 887, der Klon Nr. 17 an Position 2001. Die Restriktionsendonuklease SspBI schneidet im Insert an Position 1785, AccI an Position 2185. Beide Enzyme schneiden an keinen weiteren Stellen im Vektor. Durch Verdau beider Klone mit beiden Restriktionsenzymen konnte der Bereich im Klon 17, der den Fehler an Position 2001 enthielt, herausgeschnitten und durch Ligation mit dem homologen, fehlerlosen Abschnitt aus Klon 24 ausgetauscht werden.
Die Produkte des Restriktionsverdaus wurden auf einem 1%igen Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Das kurze Fragment (=400 bp) aus Klon Nr. 24 und das lange Fragment (≈7270 bp) aus Klon Nr. 17 wurden aus dem Gel herausgeschnitten, mit dem QiAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) aufgereinigt und religiert. Die erneute Sequenzierung dieses Vektors zeigte dann eine korrekte Basensequenz, so daß er in die folgenden Versuche eingesetzt wurde.
Von den Klonen mit den korrekten IL‑4Rα- bzw. IL‑4RαIT-Inserts wurden wie in Abschnitt 3.4.10.4 beschrieben Maxipräparationen des Vektors hergestellt.
Zellen der pro-B-Zellinie Ba/F3 der Maus wurden mit PBS gewaschen und anschließend zu einer Konzentration von 1x107 vitalen Zellen in RPMI resuspendiert. Je 0,8 ml Zellsuspension wurden mit ca. 50 µg mit PvuI linearisiertem Vektor (pCR3.1/IL‑4R, pCR3.1/IL‑4RIT, pCR3.1) nach 5-minütiger Inkubation auf Eis bei 300 V und 950 µF in einem Elektroporator (Gene Pulser, Bio-Rad Laboratories) elektroporiert. Die Zellen wurden in je 20 ml Ba/F3-Medium (s.o.) für 48 h kultiviert und anschließend die stabil transfizierten Zellen unter Zugabe von Geneticin® (G418) (Invitrogen) in einer Konzentration von 800 µg/ml in 24-Loch-Platten für ca. 2-3 Wochen selektioniert. Um homogene, rezeptortragende Klone der mit pCR3.1™-Uni-IL‑4R bzw. pCR3.1™-Uni-IL‑4RIT transfizierten Zellen zu erhalten, wurden die stabil transfizierten Zellen auf eine Konzentration von ca. 10 Zellen/ml eingestellt und in 96-Loch-Platten mit je 100 µl Zellsuspension pro well kultivert. Die aus einer Einzelzelle entstandenen Klone wurden weiter expandiert und auf die Expression des IL‑4Rα/IL‑4RαIT bzw. deren mRNA mit Durchflußzytometrie, RT-PCR und RNase-Protection-Assay überprüft. 21 mit pCR3.1™-Uni-IL‑4R und 18 mit pCR3.1™-Uni-IL4RIT transfizierte Klone, die durchflußzytometrisch den Rezeptor auf der Zelloberfläche und in der RT-PCR den gesamten kodierenden Bereich der IL‑4R- bzw. IL‑4RIT-mRNA exprimierten, wurden in den folgenden Experimenten weiter untersucht. Die mit dem leeren Vektor pCR3.1™-Uni stabil transfizierten Zellen wurden ohne weitere Klonierung als negative Kontrolle eingesetzt.
Je 5x105Zellen wurden in 100 µl PBS mit 20 µg Maus IgG (Sigma) zur Blockade unspezifischer Bindungen für 20 min und anschließend nach Zugabe von 20 µl PE-konjugiertem monoklonalem anti-human IL‑4Rα-Antikörper (anti CD124, Immunotech) bzw. 5 µl der passenden PE-konjugierten Isotyp-Kontrolle (Becton-Dickinson) für weitere 20 min bei 4°C inkubiert. Nach Waschen der Zellen in PBS wurden die Proben im Durchflußzytometer (FACScan, Becton-Dickinson) gemessen und die Ergebnisse mit der CellQuest-Software (Becton-Dickinson) und zur weiteren Bearbeitung unter Windows mit dem dem Programm WinMDI Version 2.8 ausgewertet.
Das Tetrazoliumsalz MTS (Owen’s Reagenz) wird bei Zugabe von PMS (Phenazin-Methosulfat) als Elektronendonator durch die mitochondrialen Dehydrogenasen lebender Zellen zu einem wasserlöslichen Formazan reduziert, dessen Entstehung sich colorimetrisch durch sein Absorptionsmaximum bei 490 nm bestimmen läßt und zu der Zahl der lebenden Zellen in der Kultur proportional ist. Mit dem MTS Zell-Proliferations-Test (CellTiter 96™ AQueousNon-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega, Madison, USA) wurde in der vorliegenden Arbeit die Fähigkeit der mit IL‑4Rα bzw. IL‑4RαIT transfizierten Zellen gemessen, unter Stimulation mit humanem und murinem IL‑4 zu proliferieren.
Je 2 x 104 Zellen/well wurden in 100 µl Medium ohne bzw. nach Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen von humanem oder murinem IL‑4 in 96-well‑Platten bei 37°C inkubiert. Nach 42 bis 48 h wurden den Zellen pro well 20 µl einer Lösung aus 2 mg/ml MTS und 0,92 mg/ml PMS zugesetzt, und nach weiterer Inkubation der Platten für ca. 4-6 h bei 37°C die Entstehung des Formazans in einem Plattenphotometer mit einem Meßfilter von 490 nm und einem Referenzfilter von 720 nm gemessen. Die gemessenen Absorptionen (optische Dichte, O.D.) von jeweils 3 wells desselben Ansatzes wurden gemittelt und durch Subtraktion der gemittelten Absorption von wells mit Medium und MTS/PMS aber ohne Zellen korrigiert.
Je 2 x 104 Zellen/well wurden in 100 µl Medium ohne und mit 0,5 µg/ml polyklonalem Antikörper gegen humanen IL‑4R (R&D Systems) für 1 h bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach 42 h Wachstum dieser Zellen bei 37°C unter unterschiedlichen Konzentrationen von humanem oder murinem IL‑4 wurde wie oben beschrieben die Proliferation gemessen.
Während früher Stadien der Apoptose erscheint Phosphatidylserin (PS) auf der Außenseite der Zellmembran. Durch den Einsatz fluoreszenzmarkierter PS-bindende Proteine wie z.B. Annexin V-FITC können Zellen in diesem Stadium durchflußzytometrisch detektiert werden. Außerdem verliert die Zelle während der Apoptose zunehmend die Barrierefunktion ihrer Zellmembran, so daß der DNA-Farbstoff Propidiumjodid von der Zelle aufgenommen wird.
Zur Bestimmung des Anteils apoptotischer Zellen nach Stimulation der mit IL‑4Rα, IL‑4RαIT oder dem leeren Vektor transfizierten Zellklone mit IL‑4 wurden 1 x 106 Zellen/well in 1 ml Medium in 24-well-Platten je unter Zusatz von 4 ng/ml hIL‑4 oder mIL‑4 bzw. ohne Interleukin für 42 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen, je 1,5 x 105 Zellen in 100 µl Calcium-Puffer resuspendiert und nach Zugabe von Annexin V‑FITC (Bender MedSystems) für 20 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden nochmals gewaschen, Propidiumjodid hinzugefügt und sofort im Durchflußzytometer gemessen.
Der RNase-Protection-Assay (RPA) basiert auf dem Prinzip, daß einzelsträngige RNA von RNasen verdaut wird, während doppelsträngige RNA-RNA-Hybride vor dem Verdau durch bestimmte RNasen geschützt sind. Durch Hybridisierung der RNA mit RNA-Sonden, die Sequenzen enthalten, die zu der nachzuweisenden RNA komplementär sind, wird bei dem nachfolgenden RNase-Verdau der hybridisierte Bereich der Sonden vor dem Angriff der RNasen bewahrt, und kann anschließend gelelektrophoretisch aufgetrennt und detektiert werden. Da die Sonden auch Sequenzen enthalten, die zu der nachzuweisenden RNA nicht komplementär sind und daher während der RNase-Behandlung verdaut werden, sind die unverdaute Sonde und der beim RNase-Verdau „geschützte“ Bereich in ihrer Länge voneinander zu unterscheiden. Unter Einsatz Fluorescein-markierter RNA-Sonden wurde ein nicht radioaktiver RPA etabliert, bei dem ohne weitere Hybridisierungsschritte nach Gelelektrophorese die Sonden direkt detektiert werden konnten (Abb. 8 und Abb. 9).
Die im RPA eingesetzte Sonde ist einem Bereich der IL‑4R-mRNA komplementär, der das alternativ gespleißte Exon enthält. Damit ist mit derselben Sonde ein Nachweis und die Unterscheidung der IL‑4R- und der IL4RIT-mRNA möglich. Zur Herstellung der Sonde wurde ausgehend von dem Plasmid pCR3.1TM-Uni-IL‑4R als template das geeignete Fragment mit dem Primerpaar IL4R 950 up/IL4R 1384 down amplifiziert. Um eine gerichtete Ligation in
Reaktionsansatz
Reaktionsbedingungen
Dieses Fragment wurde in den Vektor pCR3.1TM-Uni so gerichtet einkloniert, daß bei vom T7-Promoter des Vektors ausgehender Transkription eine zur IL‑4Rα-mRNA komplementäre Sequenz entsteht. Anschließend wurde der Vektor mit der Restriktionsendonuklease EcoRI linearisiert und nach Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanol-Fällung in die in-vitro-Transkriptioneingesetzt.
In der in-vitro-Transkription wird das in den Reaktionsansatz gegebene Fluorescein-12-dUTP von der RNA-Polymerase in das Transkript eingebaut.
Reaktionsansatz in-vitro-Transkription
Der Ansatz wurde für 2 h bei 37°C inkubiert.
Zur Entfernung der template-DNA wurde der Ansatz nach Zugabe von 2 µl DNase I, RNase-frei (10 U/µl) (Boehringer-Mannheim) für weitere 15 min bei 37°C inkubiert und anschließend die Reaktion mit 2 µl 0,2 M EDTA, pH 8,0 auf Eis gestoppt.
Die nicht eingebauten Nukleotide wurden durch Zentrifugation über eine Sephadex G50-Säule (Pharmacia Biotech) abgetrennt und das aufgereinigte Transkript 1:100 in RPA-Hybridisierungspuffer (PharMingen) verdünnt.
Ca. 70 µg RNA wurden in einer Vakuum-Zentrifuge getrocknet, in 9 µl RPA-Hybridisierungspuffer gelöst und zusammen mit 1 µl der verdünnten Fluorescein-markierten IL‑4R-Sonde nach kurzer Denaturierung bei 90°C für 12-16 h bei 50°C inkubiert.
Je Probe wurden 100 µl RNase-Reaktionsgemisch (RNase-Puffer, 125 U RNase T1 und 8 ng RNase A) dazugegeben und bei 30°C für 45 min inkubiert. Mit einem anschließenden Verdau der RNase mit Proteinase K (12 µg in 18 µl Proteinase K-Puffer) für 15 min bei 37°C wurde die Reaktion gestoppt.
Nach Fällung der Proben in Ethanol wurden die Pellets in Formamid-Ladepuffer gelöst, nach kurzer Denaturierung auf Eis gestellt und anschließend zur Analyse auf ein denaturierendes 6%iges Polyacrylamid-Gel (7,5 ml Acrylamid/Bisacrylamid (19:1, 40%), 5 ml 10x TBE, 24 g Harnstoff, H2O ad 50 ml, 300 µl Ammoniumpersulfat (10%), 40 µl TEMED) aufgetragen.
Als Größenmarker wurden die unverdaute IL‑4Rα-Sonde von 481 nt und ein weiteres in vitro-Transkript von 193 nt, hergestellt nach Linearisierung des pCR3.1/IL‑4Rα-Vektors mit BalI, eingesetzt (Abb. 10).
Die Proben wurden in der Gelelektrophorese-Kammer eines ABI PrismTM 373 Automatic Sequencer(PE, Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und mit der GeneScan Analysis-Software Version 1.2.2-1 (PE, Applied Biosystems) ausgewertet.
Bei der Untersuchung der Expression der mRNA des Interleukin-4 Rezeptors mit RT-PCR an Knochenmark und Blut von Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie ließ sich bei elektrophoretischer Auftrennung der Produkte im Agarosegel zusätzlich zu dem erwarteten Produkt von 502 bp in wechselnder Intensität eine weitere kürzere Bande nachweisen (Abb. 11). Durch direkte Sequenzierung der Amplifikate beider Banden ließ sich zeigen, daß dem kürzeren Fragment bei ansonsten identischer Sequenz ein Stück von 50 Basenpaaren (bp) fehlte (Abb. 12 und Abb. 13). Diese Beobachtung legte nahe, daß es sich dabei um das Amplifikat eines alternativ gespleißten Transkriptes mit Fehlen eines einzelnen oder mehrerer Exons handelt.
Um das zu belegen, war es nötig, die Exon-Grenzen dieses Bereiches zu identifizieren. Eine ausführliche Recherche der Literatur und der veröffentlichten Sequenzen in den Gen-Datenbanken erbrachte keine weiterführenden Informationen über die genomische Struktur der humanen IL‑4Rα-DNA. Für die eng verwandte mRNA des IL‑4Rα der Maus[125] sind diese Daten jedoch bereits veröffentlicht. Ein Sequenzvergleich von humaner und muriner IL‑4Rα-mRNA zeigte, daß die fehlenden Nukleotide der beobachteten IL‑4Rα-mRNA-
Dies resultierte in Produkten von ca. 1500 bp für das Fragment upstream und ca. 1800 bp für das Fragment downstreamdieses Segmentes. Durch die Sequenzierung der 3‘- und 5‘ Enden dieser Produkte konnte das 50 bp-Fragment als vollständiges Exon identifiziert werden, da ihm auf genomischer Ebene tatsächlich Sequenzen benachbart sind, die den benachbarten Introns entsprechen und von den Konsensus-Sequenzen der donorund acceptor splice sites flankiert werden (Abb. 16). Dies zeigte, daß die kürzere Variante einem alternativ gespleißten Transkript entspricht, dem ein vollständiges Exon von 50 nt Länge fehlt.
Dieses Exon, das im Folgenden als „Exon x“ bezeichnet wird, ist 82 nt downstreamdes Bereiches gelegen, der für die transmembranöse Domäne des IL‑4Rα kodiert (Abb. 13). Bei Translation dieser Variante käme es durch Verschiebung des Leserasters zu der Entstehung von 21 neuen Aminosäuren, gefolgt von einem Stop-Codon. Ein entstehendes Protein hätte daher eine stark verkürzte zytoplasmatische Domäne und besäße nur einen Teil der für die Signaltransduktion essentiellen Bereiche (Abb. 17). Gale et al.[112]hat eine Splice-Variante der gemeinsamen beta-Kette (common beta chain, βC) der Rezeptoren für GM-CSF, IL-3 und IL-5 beschrieben, deren mRNA einen sehr ähnlichen Aufbau wie die Splice-Variante des IL‑4R hat. Diese Rezeptor-Variante kodiert ebenfalls für einen Rezeptor mit stark verkürzter intrazellulärer Domäne und erhielt daher den Namen βIT(IT für intracytoplasmic truncated). In Anlehnung daran wurde die in dieser Arbeit identifizierte Splice-Variante der IL‑4Rα—Kette IL‑4RαIT genannt.
Bei weiter gelelektrophoretischer Auftrennung der Banden der PCR-Produkte von IL‑4Rα und IL‑4RαIT war regelmäßig zwischen den beiden Banden eine zusätzliche Bande abzugenzen (Abb. 11). Diese entsteht durch die Bildung von Heteroduplexen aus den Einzelsträngen der Amplifikate von IL‑4Rα und IL‑4RαIT. Ein Nachweis dessen gelang durch die Analyse der Amplifikate der Banden in einer SSCP (Abb. 18).
Die IL‑4RαIT mRNA kodiert für ein Protein, dem bestimmte zytoplasmatische Domänen fehlen, denen wichtige Funktionen in der Signaltransduktion zukommen. Die Überlegung, daß ein aus dieser mRNA eventuell entstehendes Rezeptorprotein eine veränderte biologische Funktion haben könnte, und die Beobachtung, daß die mRNA dieser Variante bei verschiedenen untersuchten Proben sehr unterschiedlich stark exprimiert zu werden schien, ließ es sinnvoll erscheinen, eine größere Gruppe von pädiatrischen Patienten mit ALL/AHL und außerdem Zellen unterschiedlicher hämatopoietischer Zellinien auf die Expression der IL‑4RαIT-mRNA im Verhältnis zum IL‑4Rα zu untersuchen. Als dafür geeignete Methode wurde eine RT-PCR gewählt, die durch den Einsatz der in der Abb. 13 dargestellten Primer, die den alternativ gespleißten Bereich flankieren, eine simultane Amplifikation beider Produkte im Sinne einer kompetitiven PCR ermöglicht. Außerdem wurde als interne Kontrolle die konstitutiv exprimierte mRNA des β-Actin im selben Ansatz mitamplifiziert.
Nach Agarosegel-Elektrophorese wurden die Amplifikate mit Hilfe eines Gel-Dokumentationssystems quantitativ ausgewertet, und als Maß für die Expression der Splice-Variante im Verhältnis zum IL‑4Rα wurde eine standardisierte AUC (area under the curve, Fläche unter der Kurve) der IL‑4RαIT mRNA (sAUC(IL‑4RαIT)) errechnet (Abb. 19). Die sAUC(IL‑4RαIT) gibt den prozentualen Anteil der Expression der IL‑4RIT-mRNA an der Gesamt-Expression von IL‑4Rα- und IL‑4RαIT-mRNA wieder.
Hierbei fiel auf, daß die sAUC(IL‑4RαIT) mit Werten von 0-80% interindividuell sehr variierte, während sie bei unterschiedlichen Proben desselben Patienten aber annähernd konstant zu sein schien. Dies wurde auch bei der statistischen Auswertung deutlich: Beim Vergleich von KM mit Blut zum Zeitpunkt der Diagnose und von KM zum Zeitpunkt der Diagnose mit KM in Remission jeweils derselben Patienten zeigte sich kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den verglichenen Proben (Abb. 20). Auch im Hinblick auf den Immunphänotyp der Blasten war kein Zusammenhang mit der Expression der Splice-Variante erkennbar (Daten nicht dargestellt). Die sAUC(IL‑4RαIT) in den hämatopoetischen Zellinien Jurkat, MOLT4, Raji, KM-H2, 697 und REH betrug weniger als 10%.
Einen hoch signifikanten Unterschied zeigte jedoch der Vergleich von Patienten mit ALL-Ersterkrankung mit Patienten im ersten oder folgenden Rezidiv. In diese Auswertung wurden nur KM-Proben zum Zeitpunkt der Diagnose einbezogen (Abb. 21). Der Median für die Expression der Splice-Variante im Verhältnis zum IL‑4Rα war bei den untersuchten Patienten mit Ersterkrankung mit einem Wert von 10,25% (range 0‑60%) für die sAUC(IL‑4RαIT) weitaus geringer als bei den Rezidivpatienten (Median: 39,5%, range 0‑80%).
Im weiteren Verlauf der Arbeit mußte die Deutung dieses Ergebnisses wieder revidiert werden, da sich zeigte, daß der Unterschied der Werte für die sAUC(IL‑4RαIT) zwischen
So betrug die sAUC(IL‑4RαIT) bei der Untersuchung von Blut einiger gesunder erwachsener Probanden ausnahmslos weniger als 20%. Dieses Untersuchungsmaterial stammte vorwiegend von Mitarbeitern unseres Labores und wurde direkt nach Abnahme aufgearbeitet. Um die Gruppe gesunder Kontrollpersonen zu vergrößern, wurde weiteren Probanden Blut abgenommen, das aber transportbedingt oft nicht am selben Tag weiterverarbeitet werden konnte. Bei diesem Material fiel eine um so stärkere Expression der Splice-Variante in Relation zur IL‑4Rα mRNA auf, je länger der Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung war. Diese Beobachtung wurde wiederholt experimentell bestätigt. Peripheres Blut gesunder Probanden wurde dazu in mehrere Portionen geteilt und zum Teil sofort nach Abnahme, zum Teil bis zu vier Tage später aufgearbeitet (Abb. 22). Hierbei spielte es keine Rolle, ob die Proben als Vollblut oder nach Isolierung der mononukleären Zellen in eigenem Plasma oder Zellmedium aufgehoben wurden. Bei Aufbewahrung der Zellen im Kühlschrank war der Effekt weniger stark ausgeprägt als bei Zimmertemperatur (Abb. 23).
Vor dem Hintergrund dieser Beobachtungen wurde die Expression der Splice-Variante im Verhältnis zum IL‑4Rα im untersuchten Patientenmaterial in Bezug auf die transportbedingte Zeit zwischen Abnahme und Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials statistisch neu ausgewertet. Das Ergebnis ist in der Abb. 24 dargestellt. Ausgewertet wurden diesmal alle untersuchten Proben von Rezidivpatienten und Patienten mit Ersterkrankung unabhängig von der Art des Materials oder dem Immunphänotyp der Erkrankung (n=197) (Abb. 24A). Bei Untersuchungsmaterialien, die am selben Tag abgenommen wie aufgearbeitet wurden, zeigte die sAUC(IL‑4RαIT) signifikant geringere Werte (Median 10%, range 0-80%, n=79) als bei den Proben die einen Tag (Median 32,5%, range 0-65%n=79) oder 2-7 Tage (Median 51%, range 0-72%, n=39) unterwegs waren (p=<0,01, Kruskal-Wallis Test) (Abb. 24A). Auch bei Betrachtung ausschließlich der Rezidivpatienten gab es keine entscheidende Änderung dieses Ergebnisses (Tag 0: Median 14,5%, range 0-56%, n=15; 1. Tag: Median 33%, range 0‑65%, n=71; 2.-7. Tag: Median 53,75, range 0-72,5%, n=34; p<0,01, Kruskal-Wallis Test) (Abb. 24B). Bei der Auswertung ausschließlich der Patienten mit Ersterkrankung war aufgrund der kleinen Patientengruppe eine weitere Aufspaltung der Materialien, die einen Tag und länger unterwegs waren, nicht sinnvoll. Auch hier war der Unterschied zwischen den Gruppen, wenn auch etwas weniger ausgeprägt, signifikant (Tag 0: Median 10%, range 0-58%, n=64; 1.-2. Tag: Median 20%, range 0‑60%, n=13, p=0,016, Mann-Whitney-U Test) (Abb. 24C).
Ein möglicher Grund für das beobachtete Phänomen wäre ein auf ungleichen Stabilitäten beruhender unterschiedlicher Abbau der beiden mRNAs. Die Stabilität einer mRNA kann bestimmt werden, indem mit einem geeigneten Transkriptionshemmer die Transkription und damit der Nachschub neuer mRNA über einen bestimmten Zeitraum blockiert werden und anschließend die Veränderung der mRNA-Menge quantifiziert wird.
Für diesen Zweck wurde die RNA mononukleärer Zellen eines gesunden Probanden teils am Tag der Blutabnahme, teils 2 und 4 Tage später aufgearbeitet. Die Zellen wurden bis zur Aufarbeitung in Zellmedium mit bzw. ohne Zugabe von Actinomycin D bei Zimmertemperatur aufgehoben. Anschließend wurden diese Proben auf die Expression von IL‑4Rα und IL‑4RαIT mRNA untersucht.
Dasselbe Phänomen, wenn auch in unterschiedlicher Ausprägung, war auch bei der Untersuchung einiger Splice-Varianten von anderen Zytokinen und Zytokin-Rezeptoren wie IL-7, IL-7R, IL-15, γC und βC zu beobachten (Abb. 27). Sowohl die Zunahme des Verhältnisses der Transkripte zugunsten der Splice-Variante, wie auch die geringere Ausprägung dessen unter Hemmung der Transkription war regelmäßig zu beobachten.
Die Amplifizierung der beiden IL‑4Rα mRNA-Varianten mit der oben beschriebenen Methode der kompetitiven RT-PCR erlaubt ausschließlich Aussagen über das Verhältnis der beiden mRNAs zueinander, ausgedrückt als sAUC(IL‑4RαIT). Eine Aussage über die absolute Mengenänderung der Transkripte ist mit diesem Versuchsaufbau nicht möglich, so daß nicht zu ersehen ist, ob bei einem Anstieg der sAUC(IL‑4RαIT) bei verzögerter Aufarbeitung der Zellen die IL‑4RαIT-mRNA zunimmt, die IL‑4Rα-mRNA abnimmt oder ob beide Transkripte in unterschiedlichem Maße zu- bzw. abnehmen.
Um dies herauszufinden, wurden die einzelnen Transkripte mit jeweils spezifischen Primern in einer semiquantitativen RT-PCR amplifiziert (Abb. 28). Die mRNA der Glycerinaldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), die als housekeeping gene konstitutiv exprimiert wird, diente als interner Standard. Um eine gegenseitige Beeinflussung der Amplifizierung der Produkte durch Konkurrenzreaktionen um Substrate wie Enzym oder Nukleotide zu vermeiden und um unterschiedliche cDNA-Verdünnungen bei der Amplifikation der jeweiligen templates zu ermöglichen (siehe Abschnitt 5.1.1), wurden IL‑4Rα bzw. IL‑4RαIT und GAPDH in jeweils unterschiedlichen Ansätzen amplifiziert.
Die Banden dieses Versuches wurden über die Bestimmung ihrer optischen Dichte (optical densitiy, O.D.) mit einem Gel-Dokumentationssystem und einer geeigneten Software quantifiziert. In Analogie zur Berechung er sAUC(IL‑4RαIT) erfolgte die Bestimmung der relativen O.D. der Banden von IL‑4Rα bzw. IL‑4RαIT in Bezug auf GAPDH. Das Ergebnis ist in Abb. 29 graphisch dargestellt. Zum anschaulicheren Vergleich der Proben wurden die ermittelten Werte beider Transkripte am Tag 0 auf 100% gesetzt. Das Ergebnis der kompetitiven RT-PCR (Abb. 26) ließ sich hierbei gut nachvollziehen. In den Proben mit Actinomycin D nehmen wie erwartet beide Transkripte ab. In den Proben ohne Hemmung der Transkription wird nun deutlich, daß die Zunahme der sAUC(IL‑4RαIT) tatsächlich in einer
Nimmt man mononukleäre Zellen eines gesunden Probanden, die zwei Tage nach Entnahme der Probe bei Zimmertemperatur gestanden haben und daher die IL‑4RαIT mRNA recht stark exprimieren, wieder bei 37°C in Kultur, entweder in reinem Medium oder unter Stimulation mit Concanavalin A oder IL‑4, zeigt sich bei der Durchführung einer kompetitiven RT-PCR, daß sich die sAUC(IL‑4RαIT) nach kurzer Zeit wieder drastisch verringert (Abb. 30A). Werden die beiden Transkripte wieder einzeln semiquantitativ amplifiziert, wird in der Probe, die in reinem Medium kultiviert wurde, eine Abnahme der Expression von IL‑4RαIT deutlich. In den Proben, die zusätzlich mit Concanavalin A oder IL‑4 stimuliert wurden, wird im Vergleich zu der Probe ohne zusätzliche Stimulation die Expression beider Transkripte hochreguliert. Dennoch kommt es auch hier zu einer Abnahme der Expression der IL‑4RαIT mRNA (Abb. 30B).
Die Zellen der IL-3-abhängige Maus pro-B-Zellinie Ba/F3 können bei Kultur in Wachstumsfaktor-freiem Medium nicht mehr proliferieren und unterziehen sich außerdem der Apoptose. Andere Wachstumsfaktoren, z.B. mIL‑4, können die Funktion von IL-3 bis zu einem gewissen Maße ersetzen. In vielen Studien konnte bereits gezeigt werden, daß bei Transfektion von Ba/F3-Zellen mit dem hIL‑4R auch durch hIL‑4 Proliferation vermittelt und die Auslösung von Apoptose verhindert werden kann. An diesem dafür geeigneten Zellmodell wurde untersucht, inwiefern der aus der IL‑4RαIT mRNA entstehende verkürzte Rezeptor bei Bindung von IL‑4 Signaltransduktion vermitteln kann. Ba/F3-Zellen wurden
Die gesamten kodierenden Bereiche von IL‑4Rα und IL‑4RαIT wurden mittels PCR aus der cDNA eines gesunden Probanden amplifiziert und in den eukaryontischen Expressionsvektor pCR3.1TM-Uni einkloniert. Nach Sequenzierung der resultierenden Vektorkonstrukte pCR3.1/IL‑4Rα und pCR3.1/IL‑4RαIT wurden Zellen der Maus-pro-B-Zellinie Ba/F3 mit den aufgereinigten Vektoren korrekter Sequenz mittels Elektroporation transfiziert und die stabil transfizierten Zellen unter Zugabe des Antibiotikums G418 selektioniert.
Trotz Einsatzes einer DNA-Polymerase mit Proofreading-Aktivität wies der größte Teil der Inserts Polymerase-generierte Fehler in der Basen-Sequenz auf. Um einen Vektor mit fehlerfreiem Insert des vollständigen IL‑4Rα zu erhalten, wurden wie im Abschnitt 3.6.5 ausführlich beschrieben zwei Klone von pCR3.1TM-Uni-IL4Rα mit fehlerhaften Sequenzen jeweils in anderen Bereichen des Inserts mit bestimmten Restriktionsendonukleasen geschnitten und die fehlerfreien Abschnitte religert.
Nach der Klonierung der Zellen wurden die Klone auf die Expression der gewünschten Rezeptoren überprüft. Die Integration der vollständigen Rezeptor-DNA und deren Expression auf mRNA-Ebene wurde durch Amplifizierung der gesamten kodierenden DNA bzw. cDNA nachgewiesen (Abb. 31). Um in den RNA-Präparationen Kontaminationen durch DNA auszuschließen und somit eine alleinige Amplifizierung von cDNA in der RT-PCR zu gewährleisten, wurde vor Durchführung der reversen Transkription ein DNase-Verdau der RNA durchgeführt. Der fehlende Nachweis eines Amplifikates bei direktem Einsatz der RNA in die PCR-Reaktion (Daten nicht dargestellt) sicherte den alleinigen Nachweis von cDNA bei der anschließend durchgeführten RT-PCR. Zusätzlich konnte mit Hilfe eines RNase Protection Assay die Expression der mRNA direkt nachgewiesen werden (Abb. 32).
Die Expression der Rezeptor-Proteine auf der Zelloberfläche wurde durchflußzytometrisch mit einem fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörper nachgewiesen, der spezifisch an die humane IL‑4Rα-Kette bindet. Abb. 33 zeigt exemplarisch die Expression für je einen Klon der mit pCR3.1/IL‑4Rα bzw. pCR3.1/IL‑4RαIT transfizierten Zellen im Vergleich zu Zellen, die
Von den Klonen, die die transfizierten Rezeptoren sowohl auf mRNA- als auch auf Protein-Ebene exprimierten, wurden 21 mit pCR3.1/IL‑4Rα und 18 mit pCR3.1/IL‑4RαIT transfizierte Klone für die folgenden Proliferationsassays eingesetzt. Die mit dem leeren Vektor pCR3.1‑Uni transfizierten Zellen wurden ohne weitere Klonierung als Negativkontrolle verwendet.
Um zu untersuchen, ob bei Bindung von humanem IL‑4 (hIL‑4) an IL‑4RαIT Proliferation vermittelt werden kann, wurden mit den transfizierten Zellen Proliferationsassays unter IL‑4 durchgeführt. Nach Kultur der Zellen für ca. 45 h in Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen an humanem bzw. murinem IL‑4 wurde mit dem MTS-Zell-Proliferationstest die Proliferation der Zellen gemessen. Dabei wurde das Proliferationsverhalten der mit IL‑4RαIT transfizierten Zellklone (Ba/F3-pCR3.1/IL‑4RαIT) unter hIL‑4 mit dem unter murinem IL‑4 (mIL‑4) bzw. in wachstumsfaktorfreiem Medium verglichen. Außerdem wurde die Proliferation dieser Zellen unter hIL‑4 mit der Proliferation der Zellklone verglichen, die mit dem vollständigen IL‑4-Rezeptor (Ba/F3- pCR3.1/IL‑4Rα) bzw. mit dem leeren Vektor (Ba/F3-pCR3.1) transfiziert wurden.
In der Abb. 34 ist das Proliferationsverhalten der Zellen ohne Wachstumsfaktor bzw. unter 4 ng/ml murinem oder humanem IL‑4 nach Kultivierung über 42-48 h dargestellt. Im Vergleich zu den ohne Wachstumsfaktor kultivierten Zellen proliferierten unter der Stimulation mit mIL‑4 alle untersuchten Zellklone. Von den 21 untersuchten Klonen, die den transfizierten humanen IL‑4Rα voller Länge exprimierten, proliferierten 20 Klone unter der
In der Abb. 35 ist exemplarisch für je einen mit IL‑4Rα, IL‑4RαIT und mit dem leeren Vektor transfizierten Zellklon die Abhängigkeit der Proliferation der Zellen von der IL‑4-Konzentration im Medium dargestellt.
Die Spezifität der Wirkungen von humanem und murinem IL‑4 auf ihre jeweiligen Rezeptoren wurde durch Stimulationsversuche mit und ohne Zugabe eines spezifischen blockierenden Antikörpers gegen den humanen IL‑4Rα bestätigt. Wie in der Abb. 36 dargestellt, wird die hIL‑4-vermittelte Proliferation der Zellen durch den Zusatz des Antikörpers verhindert, während das durch mIL‑4 vermittelte Wachstum durch die Zugabe des anti-hIL‑4Rα-Antikörper weitgehend unbeeinflußt bleibt.
Mit der Kombination zweier sich ergänzender durchflußzytometrischer Methoden wurde untersucht, inwiefern in den transfizierten Zellen unter Stimulation mit hIL‑4 die IL‑4RαIT-Variante im Vergleich zum vollständigen IL‑4Rα und im Vergleich zur Stimulation mit mIL‑4 die Induktion von Apoptose verhindern kann.
Zellklone, die mit dem vollständigen IL‑4Rα, mit der Variante IL‑4RαIT oder mit dem leeren Vektor transfiziert worden waren, wurden zu diesem Zweck in Medium unter Zugabe von hIL‑4, mIL‑4 oder ohne Wachstumsfaktor für 24 h kultiviert. Der Anteil der apoptotischen Zellen wurde durch die Anfärbung mit Annexin V-FITC in Kombination mit Propidiumjodid durchflußzytometrisch bestimmt.
In der Darstellung im Histogramm mit Propidiumjodid als alleinigem Farbstoff können die Zellen in den sehr frühen Stadien der Apoptose, in denen die Zellmembran noch intakt ist und daher der DNA-Farbstoff nicht in die Zelle eindringen kann, nicht von den vitalen Zellen unterschieden werden. Wie die Abb. 37 zeigt, war der Anteil dieser Zellen jedoch in den durchgeführten Versuchen gering, so daß sich das Ergebnis der Auswertung der Versuche nicht entscheidend von der zweiparametrigen Darstellung im Dot Plot in der Färbung mit Annexin V-FITC und Propidiumjodid unterschied. Der Anteil der nekrotischen Zellen ließ sich in beiden Darstellungen von den apoptotischen Zellen abgrenzen und betrug in allen Versuchen ca. 3 bis 7%.
Prinzipiell zeigen sowohl die einparametrige Histogrammdarstellung der Propidiumjodid-Färbung als auch die Zweiparameter-Darstellung im Dot-Plot mit der Annexin V-Färbung als zusätzlichem Parameter die gleichen Ergebnisse. Bei Stimulation eines Ba/F3-Zellklones, der mit dem vollständigen humanen IL‑4Rα transfiziert wurde, war der Anteil der apoptotischen Zellen unter hIL‑4 und mIL‑4 identisch, während bei Kultivierung in wachstumsfaktorfreiem Medium der Anteil deutlich höher lag (Abb. 37A). Über die Rezeptor-Variante IL‑4RαIT dagegen konnte durch hIL‑4 kein Apoptose-Schutz vermittelt werden. Der Anteil der apoptotischen Zellen unter Stimulation eines mit der Splice-Variante transfizierten Zellklones mit mIL‑4 war deutlich geringer als der Anteil unter hIL‑4, der etwa dem ohne
Bei dem Versuch, mRNA zu quantifizieren, tauchen sehr schnell Probleme auf, die Zweifel an der Validität der Methoden aufkommen lassen. Die Problematik beginnt damit, daß eine Probe präparierter RNA in Abhängigkeit von der Menge der eingesetzten Zellen, der Methode der Aufarbeitung und aufgrund von Degradierungsprozessen auch abhängig von Alter und Lagerung der Probe sehr unterschiedliche RNA-Konzentrationen enthalten kann. Auch die Reaktion der reversen Transkription kann eine sehr variable Effektivität haben, die vor allem in der Empfindlichkeit der Reversen Transkriptase gegenüber in der RNA-Präparation verbliebenen Salzen, Alkohol oder Phenol begründet liegt. Die Quantifizierung einer bestimmten mRNA kann also nur gelingen, wenn eine Bezugsgröße bekannt ist, die die Menge an eingesetzter Gesamt-mRNA bzw. -cDNA widerspiegelt
Eine solche Bezugsgröße könnte die Expression einer anderen mRNA darstellen. Von dieser mRNA, die damit als ein interner Standard eingesetzt wird, wird gefordert, daß sie in den untersuchten Zellen konstant exprimiert wird. Diese Bedingungen werden von verschiedenen konstitutv exprimierten Genen, den sogenannten „housekeeping“-Genen, wie z.B. β-Actin oder GAPDH, erfüllt. Mit Hilfe einer derartigen mRNA als internem Standard ist es möglich, die unterschiedliche Expression einer anderen mRNA in verschiedenen Proben in Relation zueinander zu quantifizieren. Da jedoch der interne Standard keine absolute Bezugsgröße darstellt, muß eine solche Quantifizierung immer als semiquantitativ angesehen werden.
Beim Vergleich von RT-PCR-Produkten unterschiedlicher mRNAs ist in die Interpretation der Ergebnisse miteinzubeziehen, daß unterschiedliche cDNAs in einer PCR nicht unbedingt in gleichem Maße amplifiziert werden. Diese Unterschiede sind vor allem durch die Verwendung spezifischer und damit unterschiedlicher Primer für die verschiedenen templates begründet. Erscheint beim Einsatz unterschiedlicher Primerpaare nach Amplifizierung eine Bande stärker als eine andere, muß die dazugehörige mRNA also nicht notwendigerweise stärker exprimiert werden. Ein direkter Vergleich unterschiedlicher mRNAs miteinander ist daher nicht möglich.
Anders ist die Situation allerdings in einer kompetitiven PCR, in welcher unterschiedliche cDNAs mit demselben Primerpaar amplifiziert werden, wie bei der Amplifizierung der cDNAs von IL‑4Rα und IL‑4RαIT in dieser Arbeit. Hier konkurrieren beide templates unter denselben
Erscheinen also nach Amplifizierung durch eine kompetitive RT-PCR zwei Banden gleich stark, kann damit auf eine identische Menge der beiden amplifizierten cDNAs bzw. zugrundeliegenden mRNAs in der untersuchten Probe rückgeschlossen werden. Bei unterschiedlichen Mengen der templates verhalten sich die Produktmengen und damit die optische Dichte der resultierenden Banden nach Amplifizierung jedoch nicht proportional zu den zugrundeliegenden mRNA-Mengen, da durch die Konkurrenzreaktionen der beiden templates um die Substrate in der PCR das in größerer Menge vorliegende template einen überproportionalen Vorteil gewinnt.
Dasselbe Phänomen zeigt sich auch bei der Amplifizierung von zwei oder mehr cDNAs mit unterschiedlichen Primerpaaren in einem Ansatz im Sinne einer Duplex- oder Multiplex-PCR. Hier konkurrieren die templates zwar nicht um dieselben Primer, aber dennoch um andere Substrate wie Enzym und Nukleotide. Dies fällt insbesondere dann ins Gewicht, wenn die beiden templates in sehr unterschiedlichen Konzentrationen in der Probe vorliegen. Die Vermeidung dieser gegenseitigen Beeinflussung war einer der Gründe, weshalb in dieser Arbeit bei der Quantifizierung mit einem internen Standard die zu quantifizierende cDNA und der interne Standard GAPDH in unterschiedlichen Ansätzen amplifiziert wurden.
Die Aussagen, die bei der Anwendung der beiden oben erwähnten Möglichkeiten der Quantifizierungen mittels PCR gemacht werden können, sind sehr unterschiedlich. Bei der kompetitiven RT-PCR ist es zwar möglich, die amplifizierten templates direkt miteinander zu vergleichen und somit unter Berücksichtigung der oben erwähnten Einschränkungen auch bis zu einem gewissen Grade etwas über das Mengenverhältnis der beiden zugrundeliegenden mRNAs auszusagen. Vergleicht man aber mehrere Proben mit unterschiedlichem Verhältnis der beiden kompetitiv amplifizierten templates untereinander, läßt sich mit diesem Ansatz nicht entscheiden, welche Expressionsunterschiede der mRNAs zwischen den Proben dafür verantwortlich sind. Angaben darüber sind jedoch möglich, wenn die Expression der zu quantifizierenden mRNAs in Bezug zu einem internen Standard gesetzt wird.
In diesem Fall wird gefordert, daß dieser interne Standard in den Zellen konstant exprimiert wird bzw. den allgemeinen Aktivitätsstatus der Zellen widerspiegelt. Die sich daraus ergebenden Probleme sind offensichtlich. Sicherlich wird sich in einem dynamischen System wie dem einer Zelle keine mRNA finden lassen, die unabhängig von äußeren Einflüssen
Besonders problematisch gestaltete sich in der vorliegenden Arbeit aus den genannten Gründen die Quantifizierung der beiden IL‑4Rα-Splice-Varianten in den Versuchen zu den mRNA-Stabilitäten unter Transkriptionshemmung mit Actinomycin D. Die mRNA des gewählten internen Standards GAPDH wird in diesen Versuchen selbstverständlich auch degradiert. In eigenen Versuchen zur mRNA-Stabilität, in denen Proben identischer Zellzahl nach Zugabe von Actinomycin D bei 37°C über unterschiedliche Zeiträume inkubiert wurden, zeigte sich allerdings, daß die GAPDH-mRNA insbesondere im Verhältnis zu den mRNAs von IL‑4Rα und IL‑4RαIT über den untersuchten Zeitraum hinweg sehr stabil zu sein schien. Aufgrund der Notwendigkeit, daß eine interne Bezugsgröße gebraucht wird, wurde daher auch in diesen Versuchen GAPDH als interner Standard benutzt.
Desweiteren stellt sich die Frage, inwiefern sich die Expression der GAPDH-mRNA bei den verzögert aufgearbeiteten Proben verändert. Idealerweise ist deren Expression in den Proben konstant. Aber auch in diesem Fall ist aus den oben erläuterten Gründen die Interpretation dieser Quantifizierung kritisch zu betrachten und die in diesen Versuchen beobachteten Veränderungen der Expression von IL‑4Rα und IL‑4RαIT im Verhältnis zur Expression von GAPDH zu sehen.
Bei der Untersuchung von Patientenmaterial wurde in den Ansätzen β-Actin mitamplifiziert, da ursprünglich geplant war, zusätzlich zur Quantifizierung der beiden IL‑4Rα-Splice-Varianten in Relation zueinander die Expressionsunterschiede der Varianten zwischen den Proben semiquantitativ mit β-Actin als internem Standard zu bestimmen. Dabei zeigte sich, daß die Produkte nur gut miteinander verglichen werden können, solange sie aus einem gemeinsamen master mix entstanden sind, der alle Substrate außer der cDNA enthält. Reaktionsansätze aus unterschiedlichen master mixes zeigten jedoch ausgeprägte Schwankungen im Mengenverhältnis der Produkte von β-Actin zu den IL‑4Rα-Varianten. Die Ursache hierfür ist die starke Expression der housekeeping-Gene, die in einem solchen Duplex- bzw. Multiplex-RT-PCR-Ansatz nur durch den Einsatz sehr geringer Primer-Mengen ausgeglichen werden kann. Daraus resultiert, daß sehr geringe Schwankungen dieser Primer-Mengen im PCR-Ansatz deutliche Unterschiede in den resultierenden Produktmengen ergeben. Aus diesem Grunde wurde in den untersuchten Patientenproben ausschließlich das Verhältnis der Produkte von IL‑4Rα und IL‑4RαIT zueinander ausgewertet. Diese Ergebnisse waren auch bei mehrfacher Wiederholung der Versuche gut reproduzierbar.
In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, eine nicht radioaktive Anwendung des RNase Protection Assay zu etablieren. Die Sonden wurden dafür mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert und die Produkte nach gelelektrophoretischer Auftrennung im ABI PrismTM 373 (PE, Applied Biosystems, Weiterstadt) detektiert und mit der GeneScan Analysis Software (Version 1.2.2-1) ausgewertet.
Etabliert wurde die Methode anin vitro-transkribierten RNA-Fragmenten, was zu zufriedenstellenden Ergebnissen führte. Bei der Anwendung zum Nachweis der IL‑4Rα und IL‑4RαITmRNA in Zellen zeigte sich jedoch, daß die Sensitivität der Methode trotz Einsatzes großer RNA Mengen von bis zu 100 µg nur für den Nachweis stark exprimierter mRNAs ausreichte.
Ursächlich dafür ist wahrscheinlich, daß die Fluorescein-12-UTP modifizierten Nukleotide die RNA-RNA Duplexe, bestehend aus RNA-Sonden und komplementärem mRNA-Bereich, destabilisieren, so daß schon bei Anwendung nur geringer Mengen RNase nicht nur die einzelsträngigen Sonden-Bereiche sondern auch die Sonden innerhalb der hybridisierten Region verdaut werden. Dieses Problem konnte bis zu einem bestimmten Punkt durch den Einsatz geringerer Mengen an RNase A und dafür mehr RNase T1 ausgeglichen werden. Dennoch reichte die Sensitivität dieser Methode nicht aus, um die natürlicherweise in den Zellen exprimierte IL‑4Rα bzw. IL‑4RαIT-mRNA nachzuweisen. In den mit IL‑4Rα bzw. IL‑4RαITtransfizierten Zellen wurden die transfizierten Gene jedoch ausreichend exprimiert, so daß hier die Detektion der jeweiligen mRNA mit dieser Methode gelang.
In der Familie der Zytokin-Rezeptoren sind in den letzten Jahren diverse alternativ gespleißte mRNAs neu entdeckt worden. Häufig ist die Struktur des resultierenden Rezeptors durch Verlust essentieller Domänen entscheidend verändert und läßt auf eine geänderte Funktion dieser Rezeptor-Variante schließen. In manchen Fällen liegen die Konsequenzen, die die Veränderungen der Struktur nach sich ziehen, auf der Hand. Als Beispiel sei der Verlust der transmembranösen Domäne genannt, der durch fehlende Verankerung in der Zellmembran zu einem löslichen Rezeptor-Protein führt. Aber sogar in diesem Fall können den löslichen Rezeptoren unterschiedliche Funktionen zugeordnet werden[118]. So können sie z.B. als Bindungsproteine dienen, die ihren Liganden extrazellulär stabilisieren, oder sie antagonisieren die Rezeptor-vermittelte Wirkung durch Konkurrenz mit den membranständigen Rezeptoren um die Bindung des Liganden. Eine weitere Funktion eines löslichen Rezeptors kann darin bestehen, durch Bindung seines spezifischen Liganden in Assoziation mit einer membranständigen Rezeptorkette die Übermittlung von Signalen in Zellen zu ermöglichen, die den membrangebundenen Liganden-spezifischen Rezeptor nicht exprimieren. Ein Beispiel hierfür ist der lösliche IL-6R, der im Komplex mit IL-6 und der membranständigen Rezeptorkette gp130, die alleine IL-6 nicht binden kann, auch in Zellen, die die IL-6R-Kette nicht exprimieren, Signaltransduktion vermitteln kann.
Noch schwerer ist die Funktion der durch alternatives Splicing resultierenden Rezeptor-Proteine vorherzusagen, wenn bestimmte Regionen der intrazellulären Kette strukturell verändert sind. Vielen intrazellulären Domänen konnten bereits Aufgaben bei der Signaltransduktion zugeschrieben werden, so daß bei Strukturänderungen in diesen Regionen Vermutungen über die Auswirkungen gemacht werden können. Dennoch ist die Funktion einer großen Anzahl von Domänen noch nicht definiert, was eine Einschätzung der Konsequenz einer Strukturänderung erschwert. Desweiteren kann es bei Änderung der Primärstruktur eines Proteins zu unvorhersehbaren Änderungen der dreidimensionalen Struktur kommen, die die Funktion von erhaltenen funktionellen Domänen verändern. Nicht zuletzt darf nicht vernachlässigt werden, daß die Möglichkeit besteht, daß durch Verschiebung des Leserasters neu entstandene Peptidstrukturen die Funktion des Rezeptors entscheidend verändern können.
Der in dieser Arbeit identifizierten alternativ gespleißten mRNA des IL‑4Rα fehlt ein komplettes Exon von 50 bp, das innerhalb der zytoplasmatischen Domäne 82 bp downstream des Bereiches gelegen ist, der für die Transmembranregion kodiert. Dies führt zu einer Verschiebung des Leserasters und dadurch nach weiteren 64 bp zur Entstehung eines in frame-Stop-Codons (Abb. 17). Das bei Translation dieser mRNA resultierende Protein ist ein stark verkürzter membranständiger Rezeptor, dem der größte Teil der
In der veröffentlichten Literatur ist eine solche Variante des humanen IL‑4Rα bisher weder als mRNA noch als Protein beschrieben. Bei der Maus ist ein alternativ gespleißtes Transkript des IL‑4Rα bekannt, das allerdings durch Einführen eines Stop-Codons vor die Transmembranregion für ein lösliches Rezeptor-Protein kodiert[125]. Desweiteren ist ein humanes lösliches IL‑4Rα-Protein beschrieben worden. Ob dieses Protein durch Proteolyse oder ebenfalls durch alternatives Splicing entsteht, ist unklar. Eine korrespondierende mRNA konnte bisher jedenfalls noch nicht identifiziert werden[126].
Bei Betrachtung der potentiellen Proteinstruktur von IL‑4RαIT, stellen sich die Fragen, ob ein solcher Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimiert werden und IL‑4 binden kann und inwieweit er bei Bindung von IL‑4 zur Signaltransduktion beitragen kann. Verschiedene Transfektionsstudien mit IL‑4Rα-Mutanten zeigten, daß Rezeptor-Isoformen mit Deletionen innerhalb der intrazellulären Domäne, selbst wenn die gesamte intrazelluläre Region fehlte, ausnahmslos an der Zelloberfläche exprimiert werden und IL‑4 binden konnten[48, 61, 65], so daß von vornherein davon auszugehen war, daß auch eine Expression von IL‑4RαIT an der Zelloberfläche möglich ist.
Weniger klar sind die Schlußfolgerungen, die aus den theoretischen Überlegungen dazu gezogen werden können, ob IL‑4RαIT fähig ist, Signaltransduktion zu vermitteln. Wie bereits im Kapitel „Funktionelle Domänen des IL-4R“ (Abschnitt 1.2.3) erläutert, ergeben die Studien mit Mutationskonstrukten des IL‑4Rα zur Identifizierung funktioneller Domänen uneinheitliche Ergebnisse, die somit nicht zulassen, eindeutige Parallelen zu der Struktur und einer sich daraus ergebenden Funktion von IL‑4RαIT zu ziehen.
IL‑4RαIT besitzt, wie oben erwähnt, in seiner kurzen zytoplasmatischen Domäne als einzige der bisher charakterisierten funktionellen Domänen die Prolin-reiche Homologie-Box 1, die als Bindungsstelle für JAK1 dient. In allen veröffentlichten Studien, die sich mit der Funktion dieser Domäne beschäftigen, zeigte sich übereinstimmend, daß diese Struktur für die Proliferation der Zelle und die differenzierenden Signale, gemessen an der STAT6-Aktivierung, essentiell ist[58, 63, 65]. Die Deletion dieses Motives oder die Mutation der in ihr enthaltenen Prolin-Reste führte ausnahmslos zu einem Verlust dieser Eigenschaften. Auch eine JAK-Aktivierung konnte in den Studien nicht beobachtet werden[63, 65, 127].
Galeet al. hat ein Splice-Variante der common beta chain (βC), der gemeinsamen Rezeptorkette der Rezeptoren für GM-CSF, IL-3 und IL-5, beschrieben[112], deren Struktur analog zu der des IL‑4RαIT aufgebaut ist. Die resultierende Proteinisoform, βIT genannt, hat ebenso wie IL‑4RαIT ein kurzes membranproximal gelegenes Stück der zytoplasmatischen Domäne von 23 Aminosäuren mit βC gemeinsam, dann schließen sich, bedingt durch eine Verschiebung des Leserasters, 23 neue Aminosäuren an. Die verbliebene zytoplasmatische Domäne enthält das Box 1-Motiv als einzige definierte funktionelle Domäne. Transfektionsstudien mit dieser Variante zeigten, daß JAK2 zwar an den verbleibenden zytoplasmatischen Rest binden und auch phophoryliert werden, ein mitogenes Signal durch βIT jedoch nicht vermittelt werden kann.
Wendet man die Erkenntnisse aus diesen Untersuchungen an, um damit auf die Funktion des IL‑4RαITzu schließen, legen sie nahe, daß diese Rezeptor-Variante vermutlich nicht fähig ist, Proliferation zu vermitteln. Mit vollständiger Sicherheit ließ sich das jedoch aus den oben erläuterten Gründen nicht vorhersagen. Ferner kam hinzu, daß eine eventuelle Funktion der neuen N-terminalen Domäne nicht abzuschätzen ist.
Als geeignetes Zellsystem für die funktionellen Untersuchungen von IL‑4RαIT wurde die pro‑B Zellinie Ba/F3 der Maus gewählt und mit der cDNA des humanen IL‑4Rα und seiner Splice-Variante IL‑4RαIT transfiziert. Der IL‑4R der Maus setzt sich wie der des Menschen aus der IL‑4Rα-Kette und der γC-Kette zusammen. Humanes IL‑4 besitzt eine Spezifität für den humanen IL‑4Rα und kann nicht an die Mäuse-IL‑4Rα-Kette binden. Die humane IL‑4Rα Kette kann jedoch mit der γC der Maus einen funktionellen Rezeptorkomplex eingehen und bei Bindung von humanem IL‑4 an diesen Rezeptorkomplex Signaltransduktion vermitteln. Dies beinhaltet, daß auch die involvierten Signalmoleküle der Maus an die hIL‑4Rα-Kette binden können. Mit diesem System ist es möglich, bei Stimulation der transfizierten Zellen mit hIL‑4 die Wirkung über den transfizierten (humanen) Rezeptor allein zu betrachten. Durch
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Proliferationsstudien bestätigten die theoretischen Überlegungen zur Struktur und potentiellen Funktion von IL‑4RαIT. Die getesteten Zellklone, die mit der vollständigen IL‑4Rα-Kette transfiziert wurden, zeigten eine deutliche Proliferation, die das Wachstum unter mIL‑4 in den meisten Fällen übertraf. Eine Proliferation der mit IL‑4RαIT transfizierten Zellen war dagegen in keinem der untersuchten Klone unter hIL‑4 zu beobachten, während das Wachstum unter mIL‑4 unbeeinträchtigt war. Bezieht man die oben gemachten Überlegungen über die Grenzen eines Mäuse-Zellsystems mit ein, ist nicht mit Sicherheit zu sagen, daß diese Untersuchungen die Vorgänge widerspiegeln, die in einem humanen Zellsystem ablaufen würden. Denoch ist die Wahrscheinlichkeit groß, daß keine wesentliche Unterschiede bestehen.
In einer Untersuchung von Deutsch et al. mit Mutationskonstrukten des IL‑4Rα, die eine Punktmutation in der Homologie-Box 1 (P267S) aufwiesen, konnte gezeigt werden, daß gewisse Rezeptor-Mutanten zwar keine Proliferation der Zellen vermitteln, die Apoptose von Zellen dennoch verhindern können[58]. Dies bedeutet, daß die Proliferation der Zellen und der Schutz vor dem Zelltod durch Apoptose nicht miteinander gleichzusetzen sind und durch unterschiedliche Motive des IL‑4Rα vermittelt werden. Die von Deutsch et al. untersuchten Rezeptorkonstrukte, vermittelten aber allesamt keinen Schutz vor Apoptose, sofern ihnen die Glutaminsäure-reiche Region fehlte. Die mit IL‑4RαIT durchgeführten Funktionsstudien zeigten, daß IL‑4RαIT passend zum Fehlen der Glutaminsäure-reichen Region in der Rezeptor-Variante keinen Schutz vor Apoptose vermitteln kann, und bestätigten so die von Deutsch et al. gemachte Beobachtung.
Bei der Untersuchung der Expression der Splice-Variante in zunächst nur einigen Proben von Patienten mit Erkrankung an einer ALL zeigten sich große quantitative Unterschiede der Expression von IL‑4RαIT in Relation zum vollständigen IL‑4Rα. Die Expression in den Proben variierte zwischen fehlendem Nachweis der Splice-Variante und Werten für die sAUC(IL‑4RαIT) von 80%. Da in verschiedenen Studien gezeigt wurde, daß IL‑4 und damit auch die Expression des IL‑4R eine Rolle bei Wachstum und immunologischer Abwehr von leukämischen Zellen spielen könnte, und da die zu diesem Zeitpunkt gemachten theoretischen Überlegungen auf eine geänderte Funktion des IL‑4RαIT hinwiesen, wurde eine
In der Auswertung zeigte sich, daß beim Vergleich der Proben von Patienten zur Zeit einer ALL-Ersterkankung mit Proben von Rezidivpatienten in der Gruppe der Rezidivpatienten IL‑4RαIT in Relation zum IL‑4Rα, ausgedrückt als sAUC(IL‑4RαIT), signifikant stärker exprimiert wurde als in der Gruppe mit Ersterkrankungen (Abb. 21). Zwischen unterschiedlichen Materialien (Blut, KM) jeweils derselben Patienten und zwischen Proben von Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose oder in Remission gab es keinen Unterschied (Abb. 20), so daß der Anteil an leukämischen Blasten in den Proben keinen Zusammenhang mit der Expression der Splice-Variante zu haben schien. Dies führte zunächst zu der Hypothese, daß es eine individuelle Disposition gäbe, einen bestimmten Anteil des IL‑4RαIT zu exprimieren. Daraus mußte dann gefolgert werden, daß die Patienten, die IL‑4RαIT im Rezidiv stark exprimierten, eine ähnlich starke Expression auch schon zum Zeitpunkt ihrer ALL-Ersterkrankung gezeigt haben müssen. Proben jeweils derselben Patienten zum Zeitpunkt der Ersterkrankung und des Rezidives zur Überprüfung dieser Annahme standen nicht zur Verfügung. Der sehr viel größere Anteil der Proben mit starker Expression von IL‑4RαIT in der Gruppe mit Rezidivpatienten sprach außerdem für eine Selektion dieser Patienten im Rezidiv, was den Schluß nahelegte, daß die Patienten, die IL‑4RαIT stark exprimierten, eine größeres Risiko haben, ein Rezidiv zu erleiden.
Hinzu kam zu diesem Zeitpunkt die Beobachtung, daß in den untersuchten Proben einer derzeit kleinen Gruppe von gesunden Probanden die sAUC(IL‑4RαIT) durchgehend niedrig war. Diese Gruppe von Probanden bestand ausschließlich aus Mitarbeitern unseres Labores, so daß das Material direkt nach der Abnahme aufgearbeitet wurde. Bei der Untersuchung weiterer gesunder Kontrollpersonen fiel eine stärkere Expression von IL‑4RαIT in den Fällen auf, in denen das abgenommene Blut aus organisatorischen Gründen nicht am selben Tag aufgearbeitet werden konnte. Versuche, in denen dies nachgestellt wurde, indem Blut eines Probanden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Abnahme aufgearbeitet wurde, bestätigten diese Beobachtung. Eine erneute Auswertung der Ergebnisse, zeigte die Abhängigkeit der IL‑4RαIT-Expression vom meist transportbedingten Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung der Proben (Abb. 24).
Der hoch signifikante Unterschied der sAUC(IL‑4RαIT) zwischen Ersterkrankungen und Rezidiven, der zu der anfänglichen Fehlinterpretation der Ergebnisse geführt hatte, ließ sich nun dadurch erklären, daß die Patienten mit Ersterkrankung hauptsächlich an unserer Abteilung behandelt werden, während uns das Untersuchungsmaterial der Rezidivpatienten aus ganz Deutschland zukommt, was häufig längere Transportzeiten mit sich bringt. Diese
Die Faktoren, die die mRNA-Menge in einer Zelle beeinflussen können, sind zum einen die Generierung der mRNA durch Transkription und nachfolgendes Splicing der gemeinsamen pre-mRNA zu den reifen mRNA-Varianten und ihre Abbaurate. Hieraus ergeben sich auch die Mechanismen, die das Mengenverhältnis der beiden mRNA-Splice-Varianten bei verzögerter Probenaufarbeitung verändern könnten. Entweder durch die unterschiedliche Synthese der beiden mRNAs auf der Ebene des Splicing oder die unterschiedliche Degradation infolge ungleicher Stabilitäten.
Unter Hemmung der Transkription mit einem geeigneten Zytostatikum ist es möglich, den Abbau der mRNA isoliert zu betrachten. Actinomycin D verhindert durch Interkalieren mit der DNA die Transkription und wird daher für solche mRNA-Stabilitäts-Tests häufig verwendet. Neuere Untersuchungen haben jedoch gezeigt, daß Actinomycin D einen direkten stabilisierenden Effekt auf die mRNA hat, wobei die zugrundeliegenden Mechanismen noch
Auch unter Hemmung der Transkription kam es in den Proben, die verzögert nach Abnahme aufgearbeitet worden waren, zu einer Zunahme der sAUC(IL‑4RαIT). Unter der Voraussetzung, daß Actinomycin D, wie oben erwähnt, die mRNA zwar stabilisiert, die Relation der Halbwertzeiten unterschiedlicher mRNAs aber nicht beeinflußt, spricht dies für eine größere Stabilität der IL‑4RαIT-mRNA. Eine Mitbeteiligung von Abbauvorgängen an dem beobachten Phänomen kann also nicht ausgeschlossen werden.
Obwohl sich die beiden mRNAs für IL‑4Rα und IL‑4RαIT bei einer Gesamtlänge von ca. 3500 nt innerhalb der kodierenden Sequenz nur um 50 nt voneinander unterscheiden, wäre ein Einfluß dieser geänderten Struktur auf die mRNA-Stabilität durchaus denkbar. Die Degradierung einer mRNA wird durch RNasen, Endo- sowie Exonukleasen, vermittelt. Bestimmte Sequenzen in der 3‘‑untranslatierten Region, der Poly-A-Trakt und sogenannte AU-reiche Elemente, aber auch Elemente innerhalb der kodierenden Sequenz beeinflussen die Stabilität einer mRNA. Durch Bindung an diese Sequenzen schützen mRNA-bindende Proteine die mRNA vor dem Angriff durch Endonukleasen. Dies beinhaltet, daß Veränderungen der primären Sequenz und/oder nachfolgende Änderungen der Sekundärstruktur den Abbau einer mRNA entscheidend beeinflussen können[132].
Die Zunahme der sAUC(IL‑4RαIT) bei verzögerter Probenaufarbeitung war in den Proben ohne Hemmung der Transkription jedoch deutlich stärker ausgeprägt als mit Transkriptionshemmung. Dies spricht dafür, daß ein zusätzlicher aktiver Prozeß im Sinne einer Verschiebung des Verhältnisses von IL‑4Rα und IL‑4RαIT in Richtung der Splice-Variante bei der Generierung der beiden mRNAs aus einer gemeinsamen pre-mRNA beteiligt ist. Ein weiteres Argument ist auch, daß sich der gleiche Effekt in unterschiedlich starker Ausprägung auch bei der Untersuchung der Expression der mRNAs von Splice-Varianten anderer Zytokine und Zytokin-Rezeptoren beobachten ließ, wie bei den Varianten von IL-7, IL-15, IL-7R, γC und βC, so daß ein Zusammenhang mit dem eigentlichen Prozeß des alternativen Splicing wahrscheinlich ist.
An dieser Stelle soll noch einmal betont werden, daß in der Versuchsanordnung der kompetitven RT-PCR nur das Mengenverhältnis der untersuchten mRNAs quantifiziert
Die Untersuchung der einzelnen Transkripte mit jeweils spezifischen Primer-Paaren in einer semiquantitativen RT-PCR erlaubte eine Beurteilung des Expressionsunterschiedes der einzelnen Transkripte zwischen den Proben. Hierbei zeigte sich, daß die Zunahme der sAUC(IL‑4RαIT) in den verzögert aufgearbeiteten Proben durch eine Hochregulation von IL‑4RαIT und eine Herunterregulation von IL‑4Rα bedingt ist. Wurden die Zellen, die sich in einem solchen Zustand befanden, wieder in Kultur genommen, war diese Situation innerhalb der kurzen Zeit von ca. 6 h wieder vollständig reversibel, die Expression von IL‑4RαIT nahm wieder ab, die Expression von IL‑4Rα dagegen wieder zu. Dieser Umstand deutet ebenfalls auf ein aktives Geschehen hin.
Gale et al. haben in ihrer Publikation über die Splice-Variante von βC, genannt βIT, ähnliche Beobachtungen gemacht[112], sie aber anders gedeutet. In deren Arbeit zeigte sich eine eher niedrige Expression von βIT in den hämatopoietischen Zellinien TF-1, HL60 und U937, ebenso in CD34-positiven Zellen und in Knochenmark und Granulozyten von gesunden Probanden. In Blasten von Patienten mit akuten Leukämien (ALL und AML) waren bei großer Variationsbreite allerdings Werte für den relativen Anteil der βIT-mRNA bis >90% zu beobachten. Um zu untersuchen, ob ein Zusammenhang zwischen dem Differenzierungsgrad der Blasten und der Expression von βIT besteht, wurden Blasten von Patienten mit AML in Kultur unter Stimulation mit IL‑3, G-CSF und GM-CSF zur Differenzierung gebracht und morphologisch der Anteil differenzierter Zellen bestimmt. Die Beoachtung, daß die Expression von βIT bei Kultivierung dieser Zellen abnahm und gleichzeitig der Anteil der differenzierten Zellen deutlich zunahm, veranlaßte die Autoren zu der Spekulation, daß ein Zusammenhang zwischen der Expression von βIT und dem Differenzierungsgrad der Blasten bestünde. Eine Korrelation mit dem immunologisch erfaßbaren Differenzierungsgrad der AML-Blasten nach der FAB-Klassifikation konnte aber nicht beobachtet werden.
Es ist durchaus möglich, daß den in der oben zitierten Arbeit gemachten Beobachtungen dieselben Mechanismen zugrunde liegen, wie sie in der hier vorgestellten Arbeit beobachtet wurden, und so ebenfalls zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse geführt haben. Über den Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung der Proben sind in dieser Publikation keine
Was für die Zunahme der Splice-Varianten von IL‑4RαIT, aber auch der Varianten von IL-7, IL-7R, IL-15, βIT und γC verantwortlich ist, ist im Moment nicht zu klären. Wichtig dafür wäre zu wissen, welche Mechanismen in den Zellen in der Zeit zwischen Abnahme und Aufarbeitung ablaufen. Wahrscheinlich erfahren die Zellen in gewisser Weise eine Schädigung, die vielleicht in der ungenügenden Nährstoffzufuhr, dem Entzug beeinflussender Wachstumsfaktoren und/oder dem Anfall von Stoffwechselendprodukten und damit verbundenen Milieuänderungen begründet ist. Sicherlich würde ein Beibehalten dieses Zustandes zum Tod der Zellen, möglicherweise durch Apoptose, führen. Fest steht, daß, zumindest zu einem großen Anteil, ein aktiver Prozeß der Veränderung des Verhältnisses der Splice-Varianten zugrundeliegt. Anders ließe sich die Hochregulation von IL‑4RαIT nicht erklären.
Eine interessante Erklärung würde die Hoch- oder Herunterregulierung der Menge bzw. der Aktivität von Splicing-Faktoren darstellen. Es ist bekannt, daß während der Apoptose, im Rahmen von proteolytischen Prozessen, Splicing-Faktoren gespalten werden[133, 134]. Bisher ist nicht geklärt, ob dies auch Auswirkungen auf die Expression von Splice-Varianten in dieser Phase hat. Desweiteren stellt sich die Frage, ob in diesem Fall die Kaskade der proteolytischen Prozesse der Apoptose so weit fortgeschritten ist, daß sie irreversibel zum Tod der Zelle führt. Spekuliert man, daß solche Vorgänge ursächlich für die beobachteten Veränderungen sind, würde sich dies jedoch nicht mit der von uns gemachten Beobachtung vereinbaren lassen, daß IL‑4RαITbei erneuter Kultivierung, also wahrscheinlich bei Wegfallen der Noxe, wieder herunterreguliert wird, in den Zellen also eine „Erholung“ stattfindet, die zeigt, daß es sich um ein zumindest bis zu einem bestimmten Punkt reversibles Geschehen handelt.
Der Apoptose-protektive Faktor Bcl-xL ist in zytoplasmatischen und nukleären Membranen lokalisiert und kann durch Erhalt der Homöostase der mitochondrialen Membran Apoptose verhindern. In mit Bcl-xL transfizierten Zellen konnte nach Behandlung mit anti-Fas-
Diese Untersuchungen zeigen, daß nach Einwirken eines Apoptose-induzierenden Stimulus auch nach Auslösung der proteolytischen Kaskade die Vorgänge unter bestimmten Voraussetzungen vollständig reversibel sein können. Es stellt sich allerdings die Frage, ob vergleichbare Voraussetzungen auch in vivo denkbar wären und eine relevante Rolle spielen. Sicherlich kann nicht jeder die Zelle schädigende oder potentiell Apoptose auslösende Stimulus als Trigger eines „alles oder nichts“-Ereignisses angesehen werden, sondern es gibt vermutlich auch verschiedene langsam letale oder subletale Stimuli, aus denen die Zelle unbeschadet wieder hervorgehen kann. Es ist durchaus möglich, daß dabei zum Teil bzw. bis zu einem gewissen Punkt dieselben Mechanismen ablaufen wie bei der Apoptose.
Utz et al.[106] beschreiben, daß sich nach Auslösung von Apoptose über verschiedene Stimuli durch U1-snRNP-erkennende Antiseren vier Phosphoproteine präzipitieren lassen, die wahrscheinlich phosphorylierten SR-Proteinen entsprechen. Ob diese Proteine nach Auslösung der Apoptose phosphoryliert werden oder ob bereits phosphorylierte Proteine zum U1-snRNP-Komplex rekrutiert werden, läßt sich nicht mit Sicherheit beurteilen. Interessant ist jedoch, daß in einer weiteren Arbeit der Autoren in Lysaten apoptotischer Zellen eine phosphorylierte Serin/Threonin-Kinase gefunden wurde, die sich in nicht-apoptotischen Zellen nicht präzipitieren ließ[136]. Diese Beobachtungen suggerieren, daß regulatorische Mechanismen der Apoptose bzw. prä-apoptotischer Zustände unter anderem auf der Ebene des mRNA-Splicing stattfinden könnten. Experimentell konnte gezeigt werden, daß es von verschiedenen Apoptose-agonistischen Faktoren alternativ gespleißte Transkripte gibt, die Apoptose-protektiv wirken können. So werden Zellen, die die zur Familie der Bcl-2-Proteine gehörende größere Splice-Variante des bcl-x-Genes (Bcl-xL) exprimieren, wie oben bereits erwähnt wurde, vor Apoptose geschützt, während die kleinere Splice-Variante Bcl-xS die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber apoptotischen Stimuli steigert[137]. Ähnliche Mechanismen sind für den death domain-Rezeptor LARD[138], das Genprodukt von ced-4, ein für
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigen, daß die verzögerte Aufarbeitung von Untersuchungsmaterial zu signifikanten Veränderungen der relativen mRNA-Mengen dieser Proben geführt hat. Nachgewiesen wurde dies für die mRNA einiger Splice-Varianten von Zytokinen und Zytokinrezeptoren, es ist jedoch nicht ausgeschlossen, daß diverse andere mRNAs ebenfalls davon betroffen sind. In dieser Arbeit führte dies zu einem scheinbaren Zusammenhang mit Patienten-Kollektiven und so zunächst zu einer Fehlinterpretation der Ergebnisse. Der weitaus größte Teil der Untersuchungsmaterialien, die verspätet aufgearbeitet wurden, war aus anderen Kliniken zu uns gesandt worden, aus der eigenen Klinik konnten nur einzelne Proben aus organisatorischen Gründen nicht am selben Tag aufgearbeitet werden. Dies zeigt, daß das Problem vor allem in der Organisation des Transportes der Untersuchungsmaterialien liegt.
Es stellt sich die Frage, inwiefern bei großen multizentrischen Studien solche Verzögerungen infolge der weiten Transportwege zu vermeiden sind. Eine Kühlung der Proben während des Transportes würde die Situation vielleicht verbessern, stellt aber sicherlich trotzdem keine ideale Lösung dar. Das bestmögliche Vorgehen wäre zweifellos die Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials vor Ort direkt nach Abnahme; dies ist aber schwerlich in die Praxis umzusetzen. Bis zu einer Lösung dieses Problemes muß sicherlich sehr genau überlegt werden, inwieweit mRNA-Quantifizierungen im Rahmen von solchen multizentrischen Studien überhaupt sinnvoll sind, wenn nicht ein Einfluß einer verzögerten Materialaufarbeitung auf die Expression der zu quantifizierenden mRNAs von vornherein ausgeschlossen worden ist .
Die Untersuchung der Expression der mRNA der IL‑4R alpha-Kette in Knochenmark und Blut von pädiatrischen Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie mittels RT-PCR zeigte in unterschiedlichem Maße die zusätzliche Expression einer bislang noch nicht beschriebenen Splice-Variante der IL‑4Rα-mRNA, genannt IL‑4RαIT. Diese Variante unterscheidet sich durch das Fehlen eines einzelnen vollständigen Exons von 50 nt Länge, das 82 nt downstream des Bereiches gelegen ist, der für die Transmembranregion kodiert. Die Struktur eines aus dieser mRNA-Variante möglicherweise entstehenden Proteines entspricht einem membranständigen Rezeptor, dem im Vergleich zur vollständigen IL‑4Rα-Kette der größte Teil der zytoplasmatischen Region einschließlich der dort lokalisierten essentiellen signaltransduktorischen Domänen fehlt.
Zur Untersuchung der biologischen Funktion der Splice-Variante wurden Zellen der pro-B Zellinie Ba/F3 der Maus mit IL‑4RαIT-cDNA transfiziert. Es zeigte sich, daß die Rezeptorvariante auf der Zelloberfläche exprimiert wird, bei Stimulation mit hIL‑4 konnte jedoch keine Proliferation induziert und der Übergang der Zellen in die Apoptose nicht verhindert werden. Diese Beobachtungen stimmten mit den anhand der Struktur der Rezeptor-Variante gemachten theoretischen Überlegungen zur potentiellen Funktion überein.
Bei der Quantifizierung der Expression von IL‑4RαIT in Relation zum IL-4Rα voller Länge mit einer kompetitiven RT-PCR an mononukleären Zellen einer größeren Gruppe von Kindern mit ALL zeigte sich zunächst ein irreführender Unterschied zwischen Proben von Kindern mit ALL-Ersterkrankung und Rezidiv, wobei die Splice-Variante in den Proben der Patienten mit ALL-Rezidiv signifikant stärker exprimiert wurde. Weitere Untersuchungen ergaben jedoch, daß der Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials für diesen scheinbaren Zusammenhang verantwortlich war. Waren die Proben nicht direkt nach Abnahme, sondern verspätet aufgearbeitet worden, zeigten sie eine deutliche Verschiebung des Mengenverhältnisses der beiden mRNAs zugunsten der von IL‑4RαIT. Diese Beobachtung wurde experimentell an Proben gesunder Probanden wiederholt bestätigt. Die Untersuchung der mRNA-Stabilitäten unter Hemmung der Transkription mit Actinomycin D ließ einen Einfluß durch unterschiedliche Degradation der IL‑4Rα- und IL‑4RαIT-mRNAs zwar nicht ausschließen, dennoch ergaben die Versuche, daß zu einem großen Anteil aktive Expressionsänderungen der beiden Splice-Varianten im Sinne einer Regulation auf der Ebene des Splicing dafür verantwortlich zu sein scheinen. So zeigte sich das beobachtete Phänomen in unterschiedlicher Ausprägung auch bei der Untersuchung anderer Zytokine und Zytokin-Rezeptoren. Ferner war in den verzögert aufgearbeiteten Proben nicht nur eine Zunahme der Relation der IL‑4RαIT- zur IL‑4Rα-mRNA zu beobachten, sondern es zeigte
Während der größte Teil der in dieser Arbeit untersuchten Patienten mit ALL-Ersterkrankung in Berlin behandelt wurde, kam uns das Untersuchungsmaterial der Rezidivpatienten im Rahmen der ALL-REZ BFM-Studie aus ganz Deutschland zu. Dies war für den Unterschied der Transportzeiten zwischen den beiden Gruppen verantwortlich und führte zu der anfänglichen Fehlinterpretation der Ergebnisse.
mRNA- und Protein-Sequenz von IL‑4R α /IL‑4R α IT
mRNA-Sequenz der IL-4Rα-Kette nach Idzerda et al. [122].Die Sequenzen der in der Arbeit verwendeten Primer sind unterstrichen, weitere wichtige Motive sind gekennzeichnet.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Karl Seeger für die großartige Betreuung. Mit Engagement, fundierter Sachkenntnis und stetiger Bereitschaft zur Diskussion hat er sich stets meiner fachlichen Probleme angenommen und mir über alle Phasen des Zweifels hinweggeholfen.
Herrn Prof. Dr. G. Henze danke ich für die Überlassung des Themas und sein Interesse am Fortgang dieser Arbeit.
Ich bedanke mich bei meinen Eltern, die mir das Studium ermöglichten und mir mit ihrer aufmunternden Unterstützung in allen schwierigen Phasen dieser Arbeit beistanden.
Ich danke der Kind-Philipp-Stiftung für Leukämieforschung e.V. für die finanzielle Unterstützung durch ein Promotionsstipendium.
Außerdem bedanke ich mich bei den Mitarbeitern unseres Labores, ohne deren Mithilfe diese Arbeit nicht hätte entstehen können:
Unseren MTAs Claudia Hanel, Lucia Badiali, Gabriele Körner und Gisela Götze für die Aufarbeitung der Patientenmaterialien und ihre bereitwillige Unterstützung bei allen praktischen Fragen.
Gabriele Körner und Christian Kebelmann-Betzing, denen die zusätzliche Bande in der PCR des IL-4Rα bei eigenen Arbeiten erstmals aufgefallen ist und die mir außerdem die Primer für die PCRs von IL-15 und γC zur Verfügung stellten.
Lucia Badiali, die eine unersetzliche Hilfe bei allen Problemen der Durchflußzytometrie und Zellkultivierung war.
Serge Dragon, der mich in die Methodik des Sequenzierens einwies.
Tobias Reindl, der mit mir die SSCP zum Nachweis der Heteroduplexe durchführte.
Oliver Fahron für seine Hilfe insbesondere bei Computerproblemen und statistischen Fragestellungen.
Margaritta Petterson, die mir ihre reichhaltige Erfahrung vor allem bei den Zellproliferationsassays und der Durchflußzytometrie zur Verfügung stellte.
Birgit Beyermann für ihre Hilfe bei methodischen Problemen.
Tillmann Taube und Alexander Korte für die Überlassung der Primer für die PCRs von βC, IL-7 und IL-7R.
Allen oben erwähnten und außerdem meinen weiteren Mitdoktoranden Anita Peter, Dirk Buchwald, Clemens Tillmann, Hagen v. Einsiedel und Michael Pogodda, die mir stets mit Rat und Tat zur Seite standen.
Hiermit erkläre ich, daß die Dissertation von mir selbst ohne die unzulässige Hilfe Dritter verfaßt wurde, auch in Teilen keine Kopie anderer Arbeiten darstellt und die benutzten Hilfsmittel sowie die Literaur vollständig angegeben sind.
Anja Möricke