Diskussion

Probleme der Methoden Kompetitive und semiquantitative RT-PCR

Bei dem Versuch, mRNA zu quantifizieren, tauchen sehr schnell Probleme auf, die Zweifel an der Validität der Methoden aufkommen lassen. Die Problematik beginnt damit, daß eine Probe präparierter RNA in Abhängigkeit von der Menge der eingesetzten Zellen, der Methode der Aufarbeitung und aufgrund von Degradierungsprozessen auch abhängig von Alter und Lagerung der Probe sehr unterschiedliche RNA-Konzentrationen enthalten kann. Auch die Reaktion der reversen Transkription kann eine sehr variable Effektivität haben, die vor allem in der Empfindlichkeit der Reversen Transkriptase gegenüber in der RNA-Präparation verbliebenen Salzen, Alkohol oder Phenol begründet liegt. Die Quantifizierung einer bestimmten mRNA kann also nur gelingen, wenn eine Bezugsgröße bekannt ist, die die Menge an eingesetzter Gesamt-mRNA bzw. -cDNA widerspiegelt

Eine solche Bezugsgröße könnte die Expression einer anderen mRNA darstellen. Von dieser mRNA, die damit als ein interner Standard eingesetzt wird, wird gefordert, daß sie in den untersuchten Zellen konstant exprimiert wird. Diese Bedingungen werden von verschiedenen konstitutv exprimierten Genen, den sogenannten „housekeeping“-Genen, wie z.B. β-Actin oder GAPDH, erfüllt. Mit Hilfe einer derartigen mRNA als internem Standard ist es möglich, die unterschiedliche Expression einer anderen mRNA in verschiedenen Proben in Relation zueinander zu quantifizieren. Da jedoch der interne Standard keine absolute Bezugsgröße darstellt, muß eine solche Quantifizierung immer als semiquantitativ angesehen werden.

Beim Vergleich von RT-PCR-Produkten unterschiedlicher mRNAs ist in die Interpretation der Ergebnisse miteinzubeziehen, daß unterschiedliche cDNAs in einer PCR nicht unbedingt in gleichem Maße amplifiziert werden. Diese Unterschiede sind vor allem durch die Verwendung spezifischer und damit unterschiedlicher Primer für die verschiedenen templates begründet. Erscheint beim Einsatz unterschiedlicher Primerpaare nach Amplifizierung eine Bande stärker als eine andere, muß die dazugehörige mRNA also nicht notwendigerweise stärker exprimiert werden. Ein direkter Vergleich unterschiedlicher mRNAs miteinander ist daher nicht möglich.

Anders ist die Situation allerdings in einer kompetitiven PCR, in welcher unterschiedliche cDNAs mit demselben Primerpaar amplifiziert werden, wie bei der Amplifizierung der cDNAs von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT in dieser Arbeit. Hier konkurrieren beide templates unter denselben PCR-Bedingungen um dasselbe Primerpaar, und die PCR-Produkte unterscheiden sich einzig in ihrer Länge voneinander. Es ist vorstellbar, daß dem kürzeren Fragment dadurch während der Elongation ein Vorteil zukommt. Dies ist jedoch bei ausreichend lang gewählten Elongationszeiten und einer nur geringen Längendifferenz der beiden Fragmente vernachlässigbar.

Erscheinen also nach Amplifizierung durch eine kompetitive RT-PCR zwei Banden gleich stark, kann damit auf eine identische Menge der beiden amplifizierten cDNAs bzw. zugrundeliegenden mRNAs in der untersuchten Probe rückgeschlossen werden. Bei unterschiedlichen Mengen der templates verhalten sich die Produktmengen und damit die optische Dichte der resultierenden Banden nach Amplifizierung jedoch nicht proportional zu den zugrundeliegenden mRNA-Mengen, da durch die Konkurrenzreaktionen der beiden templates um die Substrate in der PCR das in größerer Menge vorliegende template einen überproportionalen Vorteil gewinnt.

Dasselbe Phänomen zeigt sich auch bei der Amplifizierung von zwei oder mehr cDNAs mit unterschiedlichen Primerpaaren in einem Ansatz im Sinne einer Duplex- oder Multiplex-PCR. Hier konkurrieren die templates zwar nicht um dieselben Primer, aber dennoch um andere Substrate wie Enzym und Nukleotide. Dies fällt insbesondere dann ins Gewicht, wenn die beiden templates in sehr unterschiedlichen Konzentrationen in der Probe vorliegen. Die Vermeidung dieser gegenseitigen Beeinflussung war einer der Gründe, weshalb in dieser Arbeit bei der Quantifizierung mit einem internen Standard die zu quantifizierende cDNA und der interne Standard GAPDH in unterschiedlichen Ansätzen amplifiziert wurden.

Die Aussagen, die bei der Anwendung der beiden oben erwähnten Möglichkeiten der Quantifizierungen mittels PCR gemacht werden können, sind sehr unterschiedlich. Bei der kompetitiven RT-PCR ist es zwar möglich, die amplifizierten templates direkt miteinander zu vergleichen und somit unter Berücksichtigung der oben erwähnten Einschränkungen auch bis zu einem gewissen Grade etwas über das Mengenverhältnis der beiden zugrundeliegenden mRNAs auszusagen. Vergleicht man aber mehrere Proben mit unterschiedlichem Verhältnis der beiden kompetitiv amplifizierten templates untereinander, läßt sich mit diesem Ansatz nicht entscheiden, welche Expressionsunterschiede der mRNAs zwischen den Proben dafür verantwortlich sind. Angaben darüber sind jedoch möglich, wenn die Expression der zu quantifizierenden mRNAs in Bezug zu einem internen Standard gesetzt wird.

In diesem Fall wird gefordert, daß dieser interne Standard in den Zellen konstant exprimiert wird bzw. den allgemeinen Aktivitätsstatus der Zellen widerspiegelt. Die sich daraus ergebenden Probleme sind offensichtlich. Sicherlich wird sich in einem dynamischen System wie dem einer Zelle keine mRNA finden lassen, die unabhängig von äußeren Einflüssen exprimiert wird, so daß diesbezüglich immer Kompromisse eingegangen werden müssen und eine solche Quantifizierung damit immer in Relation zu dem gewählten internen Standard gesehen werden muß.

Besonders problematisch gestaltete sich in der vorliegenden Arbeit aus den genannten Gründen die Quantifizierung der beiden IL‑4Rα-Splice-Varianten in den Versuchen zu den mRNA-Stabilitäten unter Transkriptionshemmung mit Actinomycin D. Die mRNA des gewählten internen Standards GAPDH wird in diesen Versuchen selbstverständlich auch degradiert. In eigenen Versuchen zur mRNA-Stabilität, in denen Proben identischer Zellzahl nach Zugabe von Actinomycin D bei 37°C über unterschiedliche Zeiträume inkubiert wurden, zeigte sich allerdings, daß die GAPDH-mRNA insbesondere im Verhältnis zu den mRNAs von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT über den untersuchten Zeitraum hinweg sehr stabil zu sein schien. Aufgrund der Notwendigkeit, daß eine interne Bezugsgröße gebraucht wird, wurde daher auch in diesen Versuchen GAPDH als interner Standard benutzt.

Desweiteren stellt sich die Frage, inwiefern sich die Expression der GAPDH-mRNA bei den verzögert aufgearbeiteten Proben verändert. Idealerweise ist deren Expression in den Proben konstant. Aber auch in diesem Fall ist aus den oben erläuterten Gründen die Interpretation dieser Quantifizierung kritisch zu betrachten und die in diesen Versuchen beobachteten Veränderungen der Expression von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT im Verhältnis zur Expression von GAPDH zu sehen.

Bei der Untersuchung von Patientenmaterial wurde in den Ansätzen β-Actin mitamplifiziert, da ursprünglich geplant war, zusätzlich zur Quantifizierung der beiden IL‑4Rα-Splice-Varianten in Relation zueinander die Expressionsunterschiede der Varianten zwischen den Proben semiquantitativ mit β-Actin als internem Standard zu bestimmen. Dabei zeigte sich, daß die Produkte nur gut miteinander verglichen werden können, solange sie aus einem gemeinsamen master mix entstanden sind, der alle Substrate außer der cDNA enthält. Reaktionsansätze aus unterschiedlichen master mixes zeigten jedoch ausgeprägte Schwankungen im Mengenverhältnis der Produkte von β-Actin zu den IL‑4Rα-Varianten. Die Ursache hierfür ist die starke Expression der housekeeping-Gene, die in einem solchen Duplex- bzw. Multiplex-RT-PCR-Ansatz nur durch den Einsatz sehr geringer Primer-Mengen ausgeglichen werden kann. Daraus resultiert, daß sehr geringe Schwankungen dieser Primer-Mengen im PCR-Ansatz deutliche Unterschiede in den resultierenden Produktmengen ergeben. Aus diesem Grunde wurde in den untersuchten Patientenproben ausschließlich das Verhältnis der Produkte von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT zueinander ausgewertet. Diese Ergebnisse waren auch bei mehrfacher Wiederholung der Versuche gut reproduzierbar.

Die housekeeping-Gene werden in den Zellen so stark exprimiert, daß auch beim Einsatz sehr geringer Primermengen nach Amplifizierung der Sättigungsbereich erreicht und daher keine quantitative Differenzierung zwischen den Proben mehr möglich ist. Dieses Problem läßt sich lösen, indem die cDNA verdünnt eingesetzt wird. Bei der Durchführung einer Duplex-PCR reichte die Konzentration der zu quantifizierenden cDNA von IL‑4Rα und insbesondere von IL‑4 Rα_IT in vielen Fällen nach der Verdünnung der cDNA nicht aus, um eine auswertbare Bande zu ergeben. Dies war ein weiteres Argument dafür, in der semiquantitativen RT-PCR internen Standard und zu quantifizierende cDNA in unterschiedlichen Ansätzen zu amplifizieren, da somit die Möglichkeit besteht, für internen Standard und zu quantifizierende cDNA unterschiedliche Verdünnungen zu wählen. Voraussetzung dabei ist natürlich, daß der Verdünnungsfaktor der zu vergleichenden Proben jeweils derselbe ist.

RNase Protection Assay

In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, eine nicht radioaktive Anwendung des RNase Protection Assay zu etablieren. Die Sonden wurden dafür mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert und die Produkte nach gelelektrophoretischer Auftrennung im ABI Prism^TM 373 (PE, Applied Biosystems, Weiterstadt) detektiert und mit der GeneScan Analysis Software (Version 1.2.2-1) ausgewertet.

Etabliert wurde die Methode anin vitro-transkribierten RNA-Fragmenten, was zu zufriedenstellenden Ergebnissen führte. Bei der Anwendung zum Nachweis der IL‑4Rα und IL‑4Rα_ITmRNA in Zellen zeigte sich jedoch, daß die Sensitivität der Methode trotz Einsatzes großer RNA Mengen von bis zu 100 µg nur für den Nachweis stark exprimierter mRNAs ausreichte.

Ursächlich dafür ist wahrscheinlich, daß die Fluorescein-12-UTP modifizierten Nukleotide die RNA-RNA Duplexe, bestehend aus RNA-Sonden und komplementärem mRNA-Bereich, destabilisieren, so daß schon bei Anwendung nur geringer Mengen RNase nicht nur die einzelsträngigen Sonden-Bereiche sondern auch die Sonden innerhalb der hybridisierten Region verdaut werden. Dieses Problem konnte bis zu einem bestimmten Punkt durch den Einsatz geringerer Mengen an RNase A und dafür mehr RNase T1 ausgeglichen werden. Dennoch reichte die Sensitivität dieser Methode nicht aus, um die natürlicherweise in den Zellen exprimierte IL‑4Rα bzw. IL‑4Rα_IT-mRNA nachzuweisen. In den mit IL‑4Rα bzw. IL‑4Rα_ITtransfizierten Zellen wurden die transfizierten Gene jedoch ausreichend exprimiert, so daß hier die Detektion der jeweiligen mRNA mit dieser Methode gelang.

Charakterisierung der Splice-Variante IL‑4Rα_IT

In der Familie der Zytokin-Rezeptoren sind in den letzten Jahren diverse alternativ gespleißte mRNAs neu entdeckt worden. Häufig ist die Struktur des resultierenden Rezeptors durch Verlust essentieller Domänen entscheidend verändert und läßt auf eine geänderte Funktion dieser Rezeptor-Variante schließen. In manchen Fällen liegen die Konsequenzen, die die Veränderungen der Struktur nach sich ziehen, auf der Hand. Als Beispiel sei der Verlust der transmembranösen Domäne genannt, der durch fehlende Verankerung in der Zellmembran zu einem löslichen Rezeptor-Protein führt. Aber sogar in diesem Fall können den löslichen Rezeptoren unterschiedliche Funktionen zugeordnet werden[118]. So können sie z.B. als Bindungsproteine dienen, die ihren Liganden extrazellulär stabilisieren, oder sie antagonisieren die Rezeptor-vermittelte Wirkung durch Konkurrenz mit den membranständigen Rezeptoren um die Bindung des Liganden. Eine weitere Funktion eines löslichen Rezeptors kann darin bestehen, durch Bindung seines spezifischen Liganden in Assoziation mit einer membranständigen Rezeptorkette die Übermittlung von Signalen in Zellen zu ermöglichen, die den membrangebundenen Liganden-spezifischen Rezeptor nicht exprimieren. Ein Beispiel hierfür ist der lösliche IL-6R, der im Komplex mit IL-6 und der membranständigen Rezeptorkette gp130, die alleine IL-6 nicht binden kann, auch in Zellen, die die IL-6R-Kette nicht exprimieren, Signaltransduktion vermitteln kann.

Noch schwerer ist die Funktion der durch alternatives Splicing resultierenden Rezeptor-Proteine vorherzusagen, wenn bestimmte Regionen der intrazellulären Kette strukturell verändert sind. Vielen intrazellulären Domänen konnten bereits Aufgaben bei der Signaltransduktion zugeschrieben werden, so daß bei Strukturänderungen in diesen Regionen Vermutungen über die Auswirkungen gemacht werden können. Dennoch ist die Funktion einer großen Anzahl von Domänen noch nicht definiert, was eine Einschätzung der Konsequenz einer Strukturänderung erschwert. Desweiteren kann es bei Änderung der Primärstruktur eines Proteins zu unvorhersehbaren Änderungen der dreidimensionalen Struktur kommen, die die Funktion von erhaltenen funktionellen Domänen verändern. Nicht zuletzt darf nicht vernachlässigt werden, daß die Möglichkeit besteht, daß durch Verschiebung des Leserasters neu entstandene Peptidstrukturen die Funktion des Rezeptors entscheidend verändern können.

Der in dieser Arbeit identifizierten alternativ gespleißten mRNA des IL‑4Rα fehlt ein komplettes Exon von 50 bp, das innerhalb der zytoplasmatischen Domäne 82 bp downstream des Bereiches gelegen ist, der für die Transmembranregion kodiert. Dies führt zu einer Verschiebung des Leserasters und dadurch nach weiteren 64 bp zur Entstehung eines in frame-Stop-Codons (Abb. 17). Das bei Translation dieser mRNA resultierende Protein ist ein stark verkürzter membranständiger Rezeptor, dem der größte Teil der zytoplasmatischen Domäne fehlt. Die extrazelluläre Region, die Transmembranregion und die ersten 27 Aminosäuren der zytoplasmatischen Domäne sind unverändert, daran schließt sich, bedingt durch die Leseraster-Verschiebung, ein kurzes Stück von 21 neuen Aminosäuren an, dem dann ein Kettenabbruch folgt. Die verbleibende intrazelluläre Sequenz enthält die Homologie-Box 1, weitere Domänen, die bisher als für die Signaltransduktion wichtig charakterisiert wurden, fehlen (Abb. 17).

In der veröffentlichten Literatur ist eine solche Variante des humanen IL‑4Rα bisher weder als mRNA noch als Protein beschrieben. Bei der Maus ist ein alternativ gespleißtes Transkript des IL‑4Rα bekannt, das allerdings durch Einführen eines Stop-Codons vor die Transmembranregion für ein lösliches Rezeptor-Protein kodiert[125]. Desweiteren ist ein humanes lösliches IL‑4Rα-Protein beschrieben worden. Ob dieses Protein durch Proteolyse oder ebenfalls durch alternatives Splicing entsteht, ist unklar. Eine korrespondierende mRNA konnte bisher jedenfalls noch nicht identifiziert werden[126].

Bei Betrachtung der potentiellen Proteinstruktur von IL‑4Rα_IT, stellen sich die Fragen, ob ein solcher Rezeptor auf der Zelloberfläche exprimiert werden und IL‑4 binden kann und inwieweit er bei Bindung von IL‑4 zur Signaltransduktion beitragen kann. Verschiedene Transfektionsstudien mit IL‑4Rα-Mutanten zeigten, daß Rezeptor-Isoformen mit Deletionen innerhalb der intrazellulären Domäne, selbst wenn die gesamte intrazelluläre Region fehlte, ausnahmslos an der Zelloberfläche exprimiert werden und IL‑4 binden konnten[48, 61, 65], so daß von vornherein davon auszugehen war, daß auch eine Expression von IL‑4Rα_IT an der Zelloberfläche möglich ist.

Weniger klar sind die Schlußfolgerungen, die aus den theoretischen Überlegungen dazu gezogen werden können, ob IL‑4Rα_IT fähig ist, Signaltransduktion zu vermitteln. Wie bereits im Kapitel „Funktionelle Domänen des IL-4R“ (Abschnitt 1.2.3) erläutert, ergeben die Studien mit Mutationskonstrukten des IL‑4Rα zur Identifizierung funktioneller Domänen uneinheitliche Ergebnisse, die somit nicht zulassen, eindeutige Parallelen zu der Struktur und einer sich daraus ergebenden Funktion von IL‑4Rα_IT zu ziehen.

IL‑4Rα_IT besitzt, wie oben erwähnt, in seiner kurzen zytoplasmatischen Domäne als einzige der bisher charakterisierten funktionellen Domänen die Prolin-reiche Homologie-Box 1, die als Bindungsstelle für JAK1 dient. In allen veröffentlichten Studien, die sich mit der Funktion dieser Domäne beschäftigen, zeigte sich übereinstimmend, daß diese Struktur für die Proliferation der Zelle und die differenzierenden Signale, gemessen an der STAT6-Aktivierung, essentiell ist[58, 63, 65]. Die Deletion dieses Motives oder die Mutation der in ihr enthaltenen Prolin-Reste führte ausnahmslos zu einem Verlust dieser Eigenschaften. Auch eine JAK-Aktivierung konnte in den Studien nicht beobachtet werden[63, 65, 127].

Die weiteren als funktionelle Domänen identifizierten Regionen, insbesondere die weiter C-terminal gelegene Glutaminsäure-reiche Sequenz (ca. AS 360-390), fehlen der IL‑4Rα Splice-Variante. Auch die Deletion dieser Region führte regelmäßig zu einem Verlust der proliferierenden Eigenschaften, wobei die Ergebnisse im Hinblick auf eine Aktivierung der Januskinasen uneinheitlich sind[58, 61, 62, 63]. Für die Aktivierung von STAT6 scheint dieses Motiv ebenfalls essentiell zu sein, auch wenn sich die Studien dahingehend widersprechen, ob es für die STAT6-Aktivierung zusammen mit der Box 1 ausreichend ist[57, 59, 63, 65].

Galeet al. hat ein Splice-Variante der common beta chain (β_C), der gemeinsamen Rezeptorkette der Rezeptoren für GM-CSF, IL-3 und IL-5, beschrieben[112], deren Struktur analog zu der des IL‑4Rα_IT aufgebaut ist. Die resultierende Proteinisoform, β_IT genannt, hat ebenso wie IL‑4Rα_IT ein kurzes membranproximal gelegenes Stück der zytoplasmatischen Domäne von 23 Aminosäuren mit β_C gemeinsam, dann schließen sich, bedingt durch eine Verschiebung des Leserasters, 23 neue Aminosäuren an. Die verbliebene zytoplasmatische Domäne enthält das Box 1-Motiv als einzige definierte funktionelle Domäne. Transfektionsstudien mit dieser Variante zeigten, daß JAK2 zwar an den verbleibenden zytoplasmatischen Rest binden und auch phophoryliert werden, ein mitogenes Signal durch β_IT jedoch nicht vermittelt werden kann.

Wendet man die Erkenntnisse aus diesen Untersuchungen an, um damit auf die Funktion des IL‑4Rα_ITzu schließen, legen sie nahe, daß diese Rezeptor-Variante vermutlich nicht fähig ist, Proliferation zu vermitteln. Mit vollständiger Sicherheit ließ sich das jedoch aus den oben erläuterten Gründen nicht vorhersagen. Ferner kam hinzu, daß eine eventuelle Funktion der neuen N-terminalen Domäne nicht abzuschätzen ist.

Funktion von IL‑4Rα_IT

Als geeignetes Zellsystem für die funktionellen Untersuchungen von IL‑4Rα_IT wurde die pro‑B Zellinie Ba/F3 der Maus gewählt und mit der cDNA des humanen IL‑4Rα und seiner Splice-Variante IL‑4Rα_IT transfiziert. Der IL‑4R der Maus setzt sich wie der des Menschen aus der IL‑4Rα-Kette und der γ_C-Kette zusammen. Humanes IL‑4 besitzt eine Spezifität für den humanen IL‑4Rα und kann nicht an die Mäuse-IL‑4Rα-Kette binden. Die humane IL‑4Rα Kette kann jedoch mit der γ_Cder Maus einen funktionellen Rezeptorkomplex eingehen und bei Bindung von humanem IL‑4 an diesen Rezeptorkomplex Signaltransduktion vermitteln. Dies beinhaltet, daß auch die involvierten Signalmoleküle der Maus an die hIL‑4Rα-Kette binden können. Mit diesem System ist es möglich, bei Stimulation der transfizierten Zellen mit hIL‑4 die Wirkung über den transfizierten (humanen) Rezeptor allein zu betrachten. Durch IL‑4 vermittelte Effekte wie Proliferation, Schutz vor Apoptose und Differenzierung konnten in einem solchen System zwar nachgewiesen werden, es muß jedoch offenbleiben, ob alle signaltransduktorischen Mechanismen des hIL‑4Rα ebenso genutzt werden können wie in einem vergleichbaren humanen Zellsystem.

Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Proliferationsstudien bestätigten die theoretischen Überlegungen zur Struktur und potentiellen Funktion von IL‑4Rα_IT. Die getesteten Zellklone, die mit der vollständigen IL‑4Rα-Kette transfiziert wurden, zeigten eine deutliche Proliferation, die das Wachstum unter mIL‑4 in den meisten Fällen übertraf. Eine Proliferation der mit IL‑4Rα_IT transfizierten Zellen war dagegen in keinem der untersuchten Klone unter hIL‑4 zu beobachten, während das Wachstum unter mIL‑4 unbeeinträchtigt war. Bezieht man die oben gemachten Überlegungen über die Grenzen eines Mäuse-Zellsystems mit ein, ist nicht mit Sicherheit zu sagen, daß diese Untersuchungen die Vorgänge widerspiegeln, die in einem humanen Zellsystem ablaufen würden. Denoch ist die Wahrscheinlichkeit groß, daß keine wesentliche Unterschiede bestehen.

In einer Untersuchung von Deutsch et al. mit Mutationskonstrukten des IL‑4Rα, die eine Punktmutation in der Homologie-Box 1 (P267S) aufwiesen, konnte gezeigt werden, daß gewisse Rezeptor-Mutanten zwar keine Proliferation der Zellen vermitteln, die Apoptose von Zellen dennoch verhindern können[58]. Dies bedeutet, daß die Proliferation der Zellen und der Schutz vor dem Zelltod durch Apoptose nicht miteinander gleichzusetzen sind und durch unterschiedliche Motive des IL‑4Rα vermittelt werden. Die von Deutsch et al. untersuchten Rezeptorkonstrukte, vermittelten aber allesamt keinen Schutz vor Apoptose, sofern ihnen die Glutaminsäure-reiche Region fehlte. Die mit IL‑4Rα_IT durchgeführten Funktionsstudien zeigten, daß IL‑4Rα_IT passend zum Fehlen der Glutaminsäure-reichen Region in der Rezeptor-Variante keinen Schutz vor Apoptose vermitteln kann, und bestätigten so die von Deutsch et al. gemachte Beobachtung.

Expression von IL‑4Rα_IT in Material von Patienten mit ALL

Bei der Untersuchung der Expression der Splice-Variante in zunächst nur einigen Proben von Patienten mit Erkrankung an einer ALL zeigten sich große quantitative Unterschiede der Expression von IL‑4Rα_IT in Relation zum vollständigen IL‑4Rα. Die Expression in den Proben variierte zwischen fehlendem Nachweis der Splice-Variante und Werten für die sAUC(IL‑4Rα_IT) von 80%. Da in verschiedenen Studien gezeigt wurde, daß IL‑4 und damit auch die Expression des IL‑4R eine Rolle bei Wachstum und immunologischer Abwehr von leukämischen Zellen spielen könnte, und da die zu diesem Zeitpunkt gemachten theoretischen Überlegungen auf eine geänderte Funktion des IL‑4Rα_IT hinwiesen, wurde eine größere Gruppe von Patienten gezielt auf die Expression des IL‑4Rα_IT in einer kompetitiven RT-PCR quantitativ in Relation zum IL‑4Rα untersucht.

In der Auswertung zeigte sich, daß beim Vergleich der Proben von Patienten zur Zeit einer ALL-Ersterkankung mit Proben von Rezidivpatienten in der Gruppe der Rezidivpatienten IL‑4Rα_IT in Relation zum IL‑4Rα, ausgedrückt als sAUC(IL‑4Rα_IT), signifikant stärker exprimiert wurde als in der Gruppe mit Ersterkrankungen (Abb. 21). Zwischen unterschiedlichen Materialien (Blut, KM) jeweils derselben Patienten und zwischen Proben von Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose oder in Remission gab es keinen Unterschied (Abb. 20), so daß der Anteil an leukämischen Blasten in den Proben keinen Zusammenhang mit der Expression der Splice-Variante zu haben schien. Dies führte zunächst zu der Hypothese, daß es eine individuelle Disposition gäbe, einen bestimmten Anteil des IL‑4Rα_IT zu exprimieren. Daraus mußte dann gefolgert werden, daß die Patienten, die IL‑4Rα_IT im Rezidiv stark exprimierten, eine ähnlich starke Expression auch schon zum Zeitpunkt ihrer ALL-Ersterkrankung gezeigt haben müssen. Proben jeweils derselben Patienten zum Zeitpunkt der Ersterkrankung und des Rezidives zur Überprüfung dieser Annahme standen nicht zur Verfügung. Der sehr viel größere Anteil der Proben mit starker Expression von IL‑4Rα_IT in der Gruppe mit Rezidivpatienten sprach außerdem für eine Selektion dieser Patienten im Rezidiv, was den Schluß nahelegte, daß die Patienten, die IL‑4Rα_IT stark exprimierten, eine größeres Risiko haben, ein Rezidiv zu erleiden.

Hinzu kam zu diesem Zeitpunkt die Beobachtung, daß in den untersuchten Proben einer derzeit kleinen Gruppe von gesunden Probanden die sAUC(IL‑4Rα_IT) durchgehend niedrig war. Diese Gruppe von Probanden bestand ausschließlich aus Mitarbeitern unseres Labores, so daß das Material direkt nach der Abnahme aufgearbeitet wurde. Bei der Untersuchung weiterer gesunder Kontrollpersonen fiel eine stärkere Expression von IL‑4Rα_IT in den Fällen auf, in denen das abgenommene Blut aus organisatorischen Gründen nicht am selben Tag aufgearbeitet werden konnte. Versuche, in denen dies nachgestellt wurde, indem Blut eines Probanden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Abnahme aufgearbeitet wurde, bestätigten diese Beobachtung. Eine erneute Auswertung der Ergebnisse, zeigte die Abhängigkeit der IL‑4Rα_IT-Expression vom meist transportbedingten Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung der Proben (Abb. 24).

Der hoch signifikante Unterschied der sAUC(IL‑4Rα_IT) zwischen Ersterkrankungen und Rezidiven, der zu der anfänglichen Fehlinterpretation der Ergebnisse geführt hatte, ließ sich nun dadurch erklären, daß die Patienten mit Ersterkrankung hauptsächlich an unserer Abteilung behandelt werden, während uns das Untersuchungsmaterial der Rezidivpatienten aus ganz Deutschland zukommt, was häufig längere Transportzeiten mit sich bringt. Diese ungleiche Verteilung von Patienten mit Ersterkrankung und Rezidiv auf die unterschiedlichen Transportzeiten wird in der Abb. 39 im Streudiagramm deutlich.

Abb. 39: Verteilung der Patienten mit Ersterkrankung oder Rezidiv auf die Transportzeit des Untersuchungsmaterials. Jeder Strich der „Sonnenblumen“ steht für eine ausgewertete Probe. An der Y-Achse ist die Transportzeit in Tagen aufgetragen.

Expression von IL‑4Rα_IT bei verzögerter Probenaufarbeitung

Die Faktoren, die die mRNA-Menge in einer Zelle beeinflussen können, sind zum einen die Generierung der mRNA durch Transkription und nachfolgendes Splicing der gemeinsamen pre-mRNA zu den reifen mRNA-Varianten und ihre Abbaurate. Hieraus ergeben sich auch die Mechanismen, die das Mengenverhältnis der beiden mRNA-Splice-Varianten bei verzögerter Probenaufarbeitung verändern könnten. Entweder durch die unterschiedliche Synthese der beiden mRNAs auf der Ebene des Splicing oder die unterschiedliche Degradation infolge ungleicher Stabilitäten.

mRNA-Degradation von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT

Unter Hemmung der Transkription mit einem geeigneten Zytostatikum ist es möglich, den Abbau der mRNA isoliert zu betrachten. Actinomycin D verhindert durch Interkalieren mit der DNA die Transkription und wird daher für solche mRNA-Stabilitäts-Tests häufig verwendet. Neuere Untersuchungen haben jedoch gezeigt, daß Actinomycin D einen direkten stabilisierenden Effekt auf die mRNA hat, wobei die zugrundeliegenden Mechanismen noch nicht geklärt sind[128, 129, 130]. Obwohl dadurch die absolute mRNA-Halbwertzeit unter Actinomycin D verlängert ist, sollen dennoch die relativen Abbauraten der mRNAs erhalten bleiben[131], so daß diese Methode trotzdem dazu geeignet ist, nachzuweisen, ob die Veränderung des Verhältnisses der mRNA-Mengen von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT auf einer stärkeren Degradation der IL‑4Rα-mRNA beruht.

Auch unter Hemmung der Transkription kam es in den Proben, die verzögert nach Abnahme aufgearbeitet worden waren, zu einer Zunahme der sAUC(IL‑4Rα_IT). Unter der Voraussetzung, daß Actinomycin D, wie oben erwähnt, die mRNA zwar stabilisiert, die Relation der Halbwertzeiten unterschiedlicher mRNAs aber nicht beeinflußt, spricht dies für eine größere Stabilität der IL‑4Rα_IT-mRNA. Eine Mitbeteiligung von Abbauvorgängen an dem beobachten Phänomen kann also nicht ausgeschlossen werden.

Obwohl sich die beiden mRNAs für IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT bei einer Gesamtlänge von ca. 3500 nt innerhalb der kodierenden Sequenz nur um 50 nt voneinander unterscheiden, wäre ein Einfluß dieser geänderten Struktur auf die mRNA-Stabilität durchaus denkbar. Die Degradierung einer mRNA wird durch RNasen, Endo- sowie Exonukleasen, vermittelt. Bestimmte Sequenzen in der 3‘‑untranslatierten Region, der Poly-A-Trakt und sogenannte AU-reiche Elemente, aber auch Elemente innerhalb der kodierenden Sequenz beeinflussen die Stabilität einer mRNA. Durch Bindung an diese Sequenzen schützen mRNA-bindende Proteine die mRNA vor dem Angriff durch Endonukleasen. Dies beinhaltet, daß Veränderungen der primären Sequenz und/oder nachfolgende Änderungen der Sekundärstruktur den Abbau einer mRNA entscheidend beeinflussen können[132].

Zunahme der Expression von IL‑4Rα_IT

Die Zunahme der sAUC(IL‑4Rα_IT) bei verzögerter Probenaufarbeitung war in den Proben ohne Hemmung der Transkription jedoch deutlich stärker ausgeprägt als mit Transkriptionshemmung. Dies spricht dafür, daß ein zusätzlicher aktiver Prozeß im Sinne einer Verschiebung des Verhältnisses von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT in Richtung der Splice-Variante bei der Generierung der beiden mRNAs aus einer gemeinsamen pre-mRNA beteiligt ist. Ein weiteres Argument ist auch, daß sich der gleiche Effekt in unterschiedlich starker Ausprägung auch bei der Untersuchung der Expression der mRNAs von Splice-Varianten anderer Zytokine und Zytokin-Rezeptoren beobachten ließ, wie bei den Varianten von IL-7, IL-15, IL-7R, γ_C und β_C, so daß ein Zusammenhang mit dem eigentlichen Prozeß des alternativen Splicing wahrscheinlich ist.

An dieser Stelle soll noch einmal betont werden, daß in der Versuchsanordnung der kompetitven RT-PCR nur das Mengenverhältnis der untersuchten mRNAs quantifiziert werden kann. Die sAUC(IL‑4Rα_IT) gibt also keinen absoluten Wert für die Expression der Splice-Variante wieder, sondern ist nur ein Maß für die Relation der Expression von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT. Mit dieser Methode kann also nicht entschieden werden, ob ein höherer Wert für die sAUC(IL‑4Rα_IT), wie bei den Materialien mit langer Transportzeit beobachtet wurde, auf einen Anstieg der Splice-Variante, auf einen Abfall des IL‑4Rα oder auf eine Kombination aus beidem zurückzuführen ist.

Die Untersuchung der einzelnen Transkripte mit jeweils spezifischen Primer-Paaren in einer semiquantitativen RT-PCR erlaubte eine Beurteilung des Expressionsunterschiedes der einzelnen Transkripte zwischen den Proben. Hierbei zeigte sich, daß die Zunahme der sAUC(IL‑4Rα_IT) in den verzögert aufgearbeiteten Proben durch eine Hochregulation von IL‑4Rα_IT und eine Herunterregulation von IL‑4Rα bedingt ist. Wurden die Zellen, die sich in einem solchen Zustand befanden, wieder in Kultur genommen, war diese Situation innerhalb der kurzen Zeit von ca. 6 h wieder vollständig reversibel, die Expression von IL‑4Rα_IT nahm wieder ab, die Expression von IL‑4Rα dagegen wieder zu. Dieser Umstand deutet ebenfalls auf ein aktives Geschehen hin.

Gale et al. haben in ihrer Publikation über die Splice-Variante von β_C, genannt β_IT, ähnliche Beobachtungen gemacht[112], sie aber anders gedeutet. In deren Arbeit zeigte sich eine eher niedrige Expression von β_IT in den hämatopoietischen Zellinien TF-1, HL60 und U937, ebenso in CD34-positiven Zellen und in Knochenmark und Granulozyten von gesunden Probanden. In Blasten von Patienten mit akuten Leukämien (ALL und AML) waren bei großer Variationsbreite allerdings Werte für den relativen Anteil der β_IT-mRNA bis >90% zu beobachten. Um zu untersuchen, ob ein Zusammenhang zwischen dem Differenzierungsgrad der Blasten und der Expression von β_IT besteht, wurden Blasten von Patienten mit AML in Kultur unter Stimulation mit IL‑3, G-CSF und GM-CSF zur Differenzierung gebracht und morphologisch der Anteil differenzierter Zellen bestimmt. Die Beoachtung, daß die Expression von β_IT bei Kultivierung dieser Zellen abnahm und gleichzeitig der Anteil der differenzierten Zellen deutlich zunahm, veranlaßte die Autoren zu der Spekulation, daß ein Zusammenhang zwischen der Expression von β_IT und dem Differenzierungsgrad der Blasten bestünde. Eine Korrelation mit dem immunologisch erfaßbaren Differenzierungsgrad der AML-Blasten nach der FAB-Klassifikation konnte aber nicht beobachtet werden.

Es ist durchaus möglich, daß den in der oben zitierten Arbeit gemachten Beobachtungen dieselben Mechanismen zugrunde liegen, wie sie in der hier vorgestellten Arbeit beobachtet wurden, und so ebenfalls zu Fehlinterpretationen der Ergebnisse geführt haben. Über den Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung der Proben sind in dieser Publikation keine Angaben gemacht. In eigenen Versuchen wurde jedoch beobachtet, daß die relative Zunahme von β_IT bei verzögerter Probenaufarbeitung sogar noch stärker ausgeprägt ist als bei IL‑4Rα_IT (Abb. 27). Unter diesem Aspekt ist fraglich, ob in der Arbeit von Gale et al. wirklich ein Zusammenhang der β_IT-Expression mit der Differenzierung der Blasten besteht oder ob unabhängig davon die Herunterregulation von β_IT auch als „Erholung“ zu sehen ist. Die Expression von β_ITwurde nach einer Kulturzeit von 9-10 Tagen bestimmt, ein Zeitpunkt zu dem der größte Anteil der Blasten differenziert war. Angaben darüber, ob bereits zu einem früheren Zeitpunkt vor Differenzierung der Zellen, z.B. nach wenigen Stunden Kultur, die Expression von β_IT bestimmt wurde und wie die Expression zu diesem Zeitpunkt war, wurden in der Arbeit nicht gemacht.

Was für die Zunahme der Splice-Varianten von IL‑4Rα_IT, aber auch der Varianten von IL-7, IL-7R, IL-15, β_IT und γ_C verantwortlich ist, ist im Moment nicht zu klären. Wichtig dafür wäre zu wissen, welche Mechanismen in den Zellen in der Zeit zwischen Abnahme und Aufarbeitung ablaufen. Wahrscheinlich erfahren die Zellen in gewisser Weise eine Schädigung, die vielleicht in der ungenügenden Nährstoffzufuhr, dem Entzug beeinflussender Wachstumsfaktoren und/oder dem Anfall von Stoffwechselendprodukten und damit verbundenen Milieuänderungen begründet ist. Sicherlich würde ein Beibehalten dieses Zustandes zum Tod der Zellen, möglicherweise durch Apoptose, führen. Fest steht, daß, zumindest zu einem großen Anteil, ein aktiver Prozeß der Veränderung des Verhältnisses der Splice-Varianten zugrundeliegt. Anders ließe sich die Hochregulation von IL‑4Rα_IT nicht erklären.

Eine interessante Erklärung würde die Hoch- oder Herunterregulierung der Menge bzw. der Aktivität von Splicing-Faktoren darstellen. Es ist bekannt, daß während der Apoptose, im Rahmen von proteolytischen Prozessen, Splicing-Faktoren gespalten werden[133, 134]. Bisher ist nicht geklärt, ob dies auch Auswirkungen auf die Expression von Splice-Varianten in dieser Phase hat. Desweiteren stellt sich die Frage, ob in diesem Fall die Kaskade der proteolytischen Prozesse der Apoptose so weit fortgeschritten ist, daß sie irreversibel zum Tod der Zelle führt. Spekuliert man, daß solche Vorgänge ursächlich für die beobachteten Veränderungen sind, würde sich dies jedoch nicht mit der von uns gemachten Beobachtung vereinbaren lassen, daß IL‑4Rα_ITbei erneuter Kultivierung, also wahrscheinlich bei Wegfallen der Noxe, wieder herunterreguliert wird, in den Zellen also eine „Erholung“ stattfindet, die zeigt, daß es sich um ein zumindest bis zu einem bestimmten Punkt reversibles Geschehen handelt.

Der Apoptose-protektive Faktor Bcl-x_L ist in zytoplasmatischen und nukleären Membranen lokalisiert und kann durch Erhalt der Homöostase der mitochondrialen Membran Apoptose verhindern. In mit Bcl-x_L transfizierten Zellen konnte nach Behandlung mit anti-Fas-Antikörpern als Apoptose-induzierendem Stimulus zu einem großen Anteil die Apoptose der Zellen vehindert werden[135]. Da die Protease-Aktivität nach Stimulierung mit anti-Fas in den transfizierten Zellen im Vergleich zu den untransfizierten Kontroll-Zellen, die ausnahmslos apoptotisch wurden, nur unwesentlich verändert war, schien der protektive Mechanismus nicht in einer Hemmung der Protease-Aktivität zu liegen. Vielmehr zeigte sich ein Schutz der Zellen durch die Stabilisierung der mitochondrialen Membran in den transfizierten Zellen. In Gegenwart der anti-Fas Antikörper im Kulturmedium fand allerdings keine Proliferation der mit Bcl-x_L transfizierten Zellen statt. Nach Entfernung des Antikörpers war dies voll reversibel, während die untransfizierten Zellen unbeeinflußt auch nach Abwaschen des Antikörpers zu einem Zeitpunkt, an dem zwar schon Proteaseaktivität nachweisbar, das mitochondriale Membranpotential in den meisten Zellen aber noch erhalten war, in die Apoptose übergingen.

Diese Untersuchungen zeigen, daß nach Einwirken eines Apoptose-induzierenden Stimulus auch nach Auslösung der proteolytischen Kaskade die Vorgänge unter bestimmten Voraussetzungen vollständig reversibel sein können. Es stellt sich allerdings die Frage, ob vergleichbare Voraussetzungen auch in vivo denkbar wären und eine relevante Rolle spielen. Sicherlich kann nicht jeder die Zelle schädigende oder potentiell Apoptose auslösende Stimulus als Trigger eines „alles oder nichts“-Ereignisses angesehen werden, sondern es gibt vermutlich auch verschiedene langsam letale oder subletale Stimuli, aus denen die Zelle unbeschadet wieder hervorgehen kann. Es ist durchaus möglich, daß dabei zum Teil bzw. bis zu einem gewissen Punkt dieselben Mechanismen ablaufen wie bei der Apoptose.

Utz et al.[106] beschreiben, daß sich nach Auslösung von Apoptose über verschiedene Stimuli durch U1-snRNP-erkennende Antiseren vier Phosphoproteine präzipitieren lassen, die wahrscheinlich phosphorylierten SR-Proteinen entsprechen. Ob diese Proteine nach Auslösung der Apoptose phosphoryliert werden oder ob bereits phosphorylierte Proteine zum U1-snRNP-Komplex rekrutiert werden, läßt sich nicht mit Sicherheit beurteilen. Interessant ist jedoch, daß in einer weiteren Arbeit der Autoren in Lysaten apoptotischer Zellen eine phosphorylierte Serin/Threonin-Kinase gefunden wurde, die sich in nicht-apoptotischen Zellen nicht präzipitieren ließ[136]. Diese Beobachtungen suggerieren, daß regulatorische Mechanismen der Apoptose bzw. prä-apoptotischer Zustände unter anderem auf der Ebene des mRNA-Splicing stattfinden könnten. Experimentell konnte gezeigt werden, daß es von verschiedenen Apoptose-agonistischen Faktoren alternativ gespleißte Transkripte gibt, die Apoptose-protektiv wirken können. So werden Zellen, die die zur Familie der Bcl-2-Proteine gehörende größere Splice-Variante des bcl-x-Genes (Bcl-x_L) exprimieren, wie oben bereits erwähnt wurde, vor Apoptose geschützt, während die kleinere Splice-Variante Bcl-x_S die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber apoptotischen Stimuli steigert[137]. Ähnliche Mechanismen sind für den death domain-Rezeptor LARD[138], das Genprodukt von ced-4, ein für die Apoptose essentieller Faktor des Nematoden Caenorhabditus elegans[139], und für die Caspase 2 (Nedd2/Ich1)[140] bekannt. Es ist denkbar, daß alternatives Splicing in subletalen Zuständen einen kritischen Mechanismus darstellt, der evtl. zu der Entscheidung beiträgt, ob eine Zelle den endgültigen, irreversiblen Weg der Apoptose beschreitet. Die von uns beobachtete Hochregulation der Zytokin‑/bzw. Zytokin-Rezeptor Splice-Varianten könnte dabei nur ein „Nebenprodukt“ dieses Mechanismus darstellen. Vielleicht kommt ihr aber auch eine eigene, in ihrer Funktion noch nicht geklärte, relevante Bedeutung zu.

Problem der verzögerten Probenaufarbeitung bei multizentrischen Studien

Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigen, daß die verzögerte Aufarbeitung von Untersuchungsmaterial zu signifikanten Veränderungen der relativen mRNA-Mengen dieser Proben geführt hat. Nachgewiesen wurde dies für die mRNA einiger Splice-Varianten von Zytokinen und Zytokinrezeptoren, es ist jedoch nicht ausgeschlossen, daß diverse andere mRNAs ebenfalls davon betroffen sind. In dieser Arbeit führte dies zu einem scheinbaren Zusammenhang mit Patienten-Kollektiven und so zunächst zu einer Fehlinterpretation der Ergebnisse. Der weitaus größte Teil der Untersuchungsmaterialien, die verspätet aufgearbeitet wurden, war aus anderen Kliniken zu uns gesandt worden, aus der eigenen Klinik konnten nur einzelne Proben aus organisatorischen Gründen nicht am selben Tag aufgearbeitet werden. Dies zeigt, daß das Problem vor allem in der Organisation des Transportes der Untersuchungsmaterialien liegt.

Es stellt sich die Frage, inwiefern bei großen multizentrischen Studien solche Verzögerungen infolge der weiten Transportwege zu vermeiden sind. Eine Kühlung der Proben während des Transportes würde die Situation vielleicht verbessern, stellt aber sicherlich trotzdem keine ideale Lösung dar. Das bestmögliche Vorgehen wäre zweifellos die Aufarbeitung des Untersuchungsmaterials vor Ort direkt nach Abnahme; dies ist aber schwerlich in die Praxis umzusetzen. Bis zu einer Lösung dieses Problemes muß sicherlich sehr genau überlegt werden, inwieweit mRNA-Quantifizierungen im Rahmen von solchen multizentrischen Studien überhaupt sinnvoll sind, wenn nicht ein Einfluß einer verzögerten Materialaufarbeitung auf die Expression der zu quantifizierenden mRNAs von vornherein ausgeschlossen worden ist .