1  Einleitung

• 1.1 Interleukin-4

• 1.2 Interleukin-4 Rezeptor

  • 1.2.1 Aufbau des Interleukin-4 Rezeptors

  • 1.2.2 Prinzipien der Signaltransduktion über den IL‑4R

  • 1.2.3  Funktionelle Domänen des IL‑4R

• 1.3 RNA Splicing

  • 1.3.1 Konstitutives Splicing

    • 1.3.1.1 Intron-Konsensus-Sequenzen, Splicing Elemente im Intron[66]

    • 1.3.1.2 Mechanismus des RNA Splicing[66]

    • 1.3.1.3 SR-Proteine[74, 85]

    • 1.3.1.4 Interaktionen der SR-Proteine im Spliceosom[74, 85, 88]

    • 1.3.1.5 Regulation von SR-Proteinen

  • 1.3.2 Alternatives Splicing

    • 1.3.2.1 Regulation von alternativem Splicing, Rolle der SR-Proteine

    • 1.3.2.2 Alternatives Splicing bei Zytokin-Rezeptoren

2  Fragestellung

3 Material und Methoden

• 3.1 Patientenproben und Zellinien

  • 3.1.1 Patienten

  • 3.1.2 Zellinien

• 3.2  Material

  • 3.2.1 Chemikalien

  • 3.2.2  Puffer und Lösungen

  • 3.2.3 Gele

  • 3.2.4 Medien für die Zell-/Bakterienkultur

  • 3.2.5 Nukleinsäuren/Nukleotide

  • 3.2.6  Klonierung

  • 3.2.7 Zytokine

  • 3.2.8 Nukleinsäureextraktion

  • 3.2.9 Enzyme

    • 3.2.9.1 Restriktionsendonukleasen

    • 3.2.9.2 DNA-Polymerasen

    • 3.2.9.3 Weitere Enzyme

  • 3.2.10 Antikörper

  • 3.2.11 Sequenzierung

  • 3.2.12 RNase-Protection-Assay

  • 3.2.13 Zellproliferation

  • 3.2.14 Software

  • 3.2.15 Geräte

• 3.3 Statistische Auswertung

• 3.4 Allgemeine Methoden

  • 3.4.1 Zellkultur

  • 3.4.2 Isolierung der mononukleären Zellen

  • 3.4.3 RNA/DNA-Extraktion

  • 3.4.4  Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

    • 3.4.4.1  cDNA-Synthese

    • 3.4.4.2 Agarose-Gelelektrophorese

  • 3.4.5  Aufreinigung von PCR-Produkten

  • 3.4.6 Sequenzierungen

    • 3.4.6.1 Cycle-Sequencing

    • 3.4.6.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese

  • 3.4.7 Restriktionsverdaue

  • 3.4.8  Single Stranded Conformational Polymorphism (SSCP) Analyse

  • 3.4.9 Durchflußzytometrie

  • 3.4.10 Klonierung

    • 3.4.10.1  Unidirektionales TA-Cloning

    • 3.4.10.2  Phosphorylierung eines Primers

    • 3.4.10.3  Transformation kompetenter E. coli

    • 3.4.10.4  Plasmidpräparationen

• 3.5  Identifizierung und Charakterisierung der IL‑4Rα Splice-Variante (IL‑4Rα_IT)

  • 3.5.1  PCR

  • 3.5.2 Sequenzierung

  • 3.5.3  SSCP

  • 3.5.4  Quantitative Analyse

  • 3.5.5 Identifizierung der Grenzen des alternativ gespleißten Exons

    • 3.5.5.1 PCR

    • 3.5.5.2  Sequenzierung

  • 3.5.6 mRNA-Stabilitäts-Test

    • 3.5.6.1 Kompetitive RT-PCR

    • 3.5.6.2 Semiquantitative RT-PCR

• 3.6 Klonierung von IL‑4Rα- und IL‑4Rα_IT-cDNA

  • 3.6.1 PCR zur Herstellung der Inserts

    • 3.6.1.1  Externe PCR

    • 3.6.1.2  Interne PCR

  • 3.6.2 Ligation

  • 3.6.3  Transformation kompetenter E. coli-Stämme

  • 3.6.4 Sequenzierung

  • 3.6.5  Herstellung von pCR3.1/IL‑4Rα mit korrektem Insert

  • 3.6.6  Plasmidpräparationen (Maxipreps)

• 3.7 Transfektion der Zellinie Ba/F3

• 3.8 Durchflußzytometrische Untersuchung der Expression von IL‑4R und IL‑4R_IT

• 3.9  Proliferations-Assays

  • 3.9.1 Prinzip des MTS Zell-Proliferations-Test

  • 3.9.2 Durchführung des MTS Zell-Proliferations-Test

  • 3.9.3 Proliferation nach Zugabe von spezifischem Antikörper gegen hIL‑4Rα

• 3.10 Durchflußzytometrische Detektion apoptotischer Zellen

• 3.11 RNase-Protection-Assay

  • 3.11.1 In vitro-Transkription der Fluorescein-markierten RNA-Sonde

  • 3.11.2  RNase Protection

  • 3.11.3 Gene Scan

4  Ergebnisse

• 4.1  Identifizierung der IL‑4Rα_IT mRNA

• 4.2 Untersuchung der Expression der IL‑4Rα_IT mRNA an Patientenmaterial

• 4.3  Untersuchung der mRNA-Stabilität von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT

• 4.4  Semiquantitative RT-PCR der mRNA von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT

• 4.5 Reversibilität der Zunahme der Expression von IL‑4Rα_IT

• 4.6 Biologische Funktion von IL‑4Rα_IT

  • 4.6.1 Transfektion von Ba/F3 mit pCR3.1-Uni, pCR3.1/IL‑4Rα und pCR3.1/IL‑4Rα_IT

  • 4.6.2 Nachweis der Expression von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT

  • 4.6.3 Proliferationsassays

  • 4.6.4 Apoptose der transfizierten Zellen unter IL‑4-Stimulation

5  Diskussion

• 5.1 Probleme der Methoden

  • 5.1.1  Kompetitive und semiquantitative RT-PCR

  • 5.1.2 RNase Protection Assay

• 5.2  Charakterisierung der Splice-Variante IL‑4Rα_IT

• 5.3 Funktion von IL‑4Rα_IT

• 5.4 Expression von IL‑4Rα_IT in Material von Patienten mit ALL

• 5.5  Expression von IL‑4Rα_IT bei verzögerter Probenaufarbeitung

  • 5.5.1 mRNA-Degradation von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT

  • 5.5.2 Zunahme der Expression von IL‑4Rα_IT

  • 5.5.3 Problem der verzögerten Probenaufarbeitung bei multizentrischen Studien

6  Zusammenfassung

7 Abkürzungen

8 Referenzen

Anhang

Lebenslauf

Danksagung

Erklärung an Eides Statt

Tab. 1: Positionen und Sequenzen der verwendeten Primer: Die Zahlen bezeichnen die Position des 5‘-Nukleatids des Primers in der mRNA-Sequenz des IL‑4Rα gemäß der von Idzerda et al. veröffentlicheten Sequenz[122].

Abb. 1: Signaltransduktion über den IL‑4R (1): Durch Heterodimerisierung der Rezeptoruntereinheiten nach Bindung von IL‑4 kommt es zur Autophosphorylierung und Aktivierung der Januskinasen.

Abb. 2: Signaltransduktion über den IL‑4R (2): Wahrscheinlich sind die Januskinasen auch für die Phosphory­lierung des I4R-Motivs verantwortlich. Hier kann dann 4PS/IRS2 koppeln, das dann nach Phos­phorylie­rung durch die Januskinasen diverse andere Signalmoleküle bindet. Dieser Weg führt über weitere, noch weitgehend ungeklärte Mechanismen zur Proliferation der Zelle.

Abb. 3: Signaltransduktion über den IL‑4R (3): Die aktivierten Januskinasen phosphorylieren zwei Tyrosinreste im C-terminalen Bereich des Rezeptors. Dadurch entsteht eine Bindungsstelle für STAT6. STAT6 wird seinerseits durch die Januskinasen phosphoryliert und transloziert als Homodimer in den Zellkern, wo es an die Promotoren der dargestellten Gene bindet.

Abb. 4: Konsensus-Sequenzen der 5‘- und 3‘-splice site des Introns.

Abb. 5: Schematische Darstellung der Entstehung unterschiedlicher reifer mRNAs aus einer gemeinsamen precursor-mRNA. In A ist der „normale“ Splicing-Vorgang dargestellt, in B ist ein vollständiges Exon ausgelassen worden („exon skipping“), in C verbleibt in der mRNA ein vollständiges Intron, in D und E werden alternative splice sites innerhalb des Exons genutzt, so daß Teile des Exons ausgelassen werden, und in F kommte es zur alternativen Nutzung zweier unterschiedlicher Exons.

Abb. 6: Beispiele für Strukturen unterschiedlicher mRNA Splice-Varianten. Bei den Varianten B und C kommt es durch eine Verschiebung des Leserasters zur Entstehung eines vorzeitigen in frame-Stop-Codons, bei den Varianten D und E enthält ein zusätzliches Exon ein Stop-Codon. Die Variante F enthält zusätzliche Nukleotide, die für eine Protease-sensitive Region kodieren. Die mRNA in A kodiert für den Rezeptor voller Länge, aus den Varianten B, E und F resultieren lösliche Rezeptoren und aus den Varianten C und D membranständige Rezeptoren mit mehr oder weniger verkürzten intrazellulären Domänen.

Abb. 7: Schematische Darstellung des unidirektionalen TA-Cloning-Vektors für die gerichtete Ligation des PCR-Produktes mit dem Vektor. Da die Ligase ein phosphoryliertes 5‘-Ende für die Ligation benötigt, ist bei Dephosphorylierung eines Armes des Vektors und Phosphorylierung eines der beiden Enden des PCR-Produktes die Ligation nur in einer Richtung möglich.

Abb. 8: Prinzip des RNase-Protection-Assays (Erläuterung siehe Text)

Abb. 9: Entstehung der beiden Fragmente von 310 und 75 nt bei RNase-Protektion der Sonde durch IL‑4Rα_IT-mRNA. Der Bereich der Sonde, der der Sequenz des „Exon x“ komplementär ist, bindet nicht an die IL‑4Rα_IT-mRNA und wird daher von der RNase verdaut (siehe auch Abb. 10)

Abb. 10: Schematische Darstellung der RPA-Sonde. Nach Schneiden des Vektors mit EcoRI kann ein Fragment von 481 nt in vitro-transkribiert werden. Das durch die IL‑4Rα-mRNA geschützte Fragment hat nach Hybridisierung und RNase-Verdau eine Länge von 435 nt, von der IL‑4Rα_IT-mRNA werden zwei Fragmente von 310 und 75 nt Länge geschützt (siehe auch Abb. 9). Wird der Vektor mit der Restriktionsendonuklease BalI geschnitten, entsteht nach in vitro-Transkription ein Fragment von 193 nt. Dieses und das 481 nt lange Fragment wurden als Größenmarker eingesetzt.

Abb. 11: RT-PCR zur Amplifizierung von IL‑4Rα-cDNA. Dargestellt sind 6 Proben (PB oder KM) von Patienten mit ALL, bei denen sich zusätzlich zu der erwarteten Bande ein weiteres, 50 bp kürzeres Produkt in sehr unterschiedlicher Intensität nachweisen läßt. Auf die Entstehung der als Heteroduplexe bezeichneten Bande wird weiter unten eingegangen.

Abb. 12: Elektropherogramm der Sequenzierungen der PCR-Fragmente von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT. Der Pfeil bezeichnet in der Splice-Variante IL‑4Rα_IT die Stelle, an welcher im Vergleich zur vollständigen IL‑4Rα-cDNA 50 bp fehlen.

Abb. 13: mRNA-Struktur von of IL‑4Rα and IL‑4Rα_IT: Durch Auslassen des Exon x kommt es zur Verschiebung des Leserasters und zur Entstehung eines in frame-Stop Codons. Die schwarzen Pfeile bezeichnen die IL‑4Rα-spezifischen Primer IL‑4R 617 up/IL‑4R 1118 down (Tab. 1); SP: Signalpeptid; EX: extrazelluläre Domäne; TM: trans­membranöse Domäne; CYTO: zytoplasmatische Domäne; STOP: Stop-Codon.

Abb. 14: Sequenzvergleich des alternativ gepleißten Exon x der humanen IL‑4Rα-mRNA mit dem korrespondierenden Exon 11 der Maus (Homologie 74%).

Abb. 15: Lokalisation der Primerpaare IL‑4R 950 up/IL‑4R 1074 down und IL‑4R 1030 up/IL‑4R 1118 down zur Amplifizierung der an das „Exon x“ angrenzenden Introns der IL‑4Rα-DNA.

Abb. 16: Region des alternativ gespleißten Exon x der IL‑4Rα-mRNA (oben) und den angrenzenden Introns der genomischen DNA (unten). Die DNA-Sequenz der Exon-Intron-Grenzen ist unten aufgeführt. Exon-Sequenzen sind unterstrichen, die donor und acceptor splice sites sind fett gedruckt.

Abb. 17: A: Potentielle Proteinstruktur von IL‑4Rα_IT (rechts) im Vergleich zum vollständigen IL‑4Rα (links). Die schwarze Box stellt die Homologie-Box 1 dar, die in IL‑4Rα_IT erhalten ist, die schraffierte Box entspricht dem durch die Verschiebung des Leserasters veränderten C-terminalen Ende von 21 Aminosäuren. EX: extrazelluläre; TM: transmembranöse; CYTO: cytoplasmatische Domäne. GLU: Glutaminsäurereiche Region. Die Abbildung zeigt, daß alle Tyrosinreste und die für die Proliferation essentielle glutaminreiche Region in IL‑4Rα_IT fehlen. B: Potentielle Aminosäuresequenzen von IL‑4Rα_IT und IL‑4Rα. Der Pfeil bezeichnet den Beginn der durch die Verschiebung des Leserasters geänderten Sequenz.

Abb. 18: SSCP-Analyse der PCR-Produkte von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT zum Nachweis der Heteroduplex-Bande. Da die Heteroduplexe aus Einzelsträngen von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT bestehen, zeigt sich auch ein Bandenmuster, das sich aus den Banden von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT zusammensetzt.

Abb. 19: Profilanalyse zur Quantfizierung der Banden bei vier verschiedenen Patientenproben. Die grau getönten Flächen entsprechen den AUC’s für IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT. Die Werte für die sAUC(IL‑4Rα_IT) machen die sehr unterschiedliche Expression der Splice-Variante bei verschiedenen Patientenproben deutlich. Bei der zusätzlichen Bande zwischen den Banden von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IThandelt es sich um Heteroduplexe, die aufgrund der Ähnlichkeit der Amplifikate von IL‑4Rα und seiner Splice-Variante entstehen. Dies wurde durch eine SSCP(single stranded conformational polymorphism)-Analyse (siehe auch Abb. 18 und Abschnitt 4.1) nachgewiesen.

Abb. 20: Boxplots zum Vergleich unterschiedlicher Untersuchungsmaterialien jeweils derselben Patienten: Sowohl beim Vergleich von Blut mit KM zum Zeitpunkt der Diagnose (A) als auch von KM bei Diagnose mit Remissionsmark (B) zeigt die statistische Auswertung keinen signifikanten Unterschied.

Abb. 21: Vergleich der Expression von IL‑4Rα_IT, ausgedrückt als sAUC(IL‑4Rα_IT), in Proben von Patienten mit Ersterkrankung mit einer Gruppe von Rezidivpatienten, dargestellt in Boxplots.

Abb. 22: Expression von IL‑4Rα_IT mRNA im Verhältnis zu IL‑4Rα bei Aufarbeitung von mononukleären Zellen derselben Blutprobe direkt nach Abnahme oder 2 bzw. 4 Tage später: Der Anteil der Expression von IL‑4Rα_IT ist umso größer, je länger der Zeitraum zwischen Abnahme und Aufarbeitung der Proben war.

Abb. 23: Einfluß der Temperatur auf die Expression von IL‑4Rα_IT bei verzögerter Aufarbeitung. Bei Kühlung der Proben ist der Effekt der Zunahme der sAUC(IL‑4Rα_IT) weniger ausgeprägt.

Abb. 24: Vergleich unterschiedlich langer Transportzeiten des Untersuchungsmaterials. Deutlicher Anstieg der Expression der IL‑4Rα_IT bei längeren Transportzeiten. In A stammt das untersuchte Material (Blut oder KM) von Patienten mit Ersterkrankungen oder Rezidiven, in B wurden nur Rezidivpatienten, in C nur Patienten mit Ersterkrankung eine ALL ausgewertet.

Abb. 25: Stabilität der mRNA von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT. Bei Hemmung der Transkription mit Actinomycin D zur Beurteilung der Degradierung der beiden mRNA-Varianten zeigt sich bei verzögerter Aufarbeitung der Zellen ebenfalls eine Zunahme der sAUC(IL‑4Rα_IT).

Abb. 26: Vergleich der Proben mit und ohne Hemmung der Transkription. Bei den Proben mit Actinomycin D zeigen sich nach verzögerter Aufarbeitung deutlich höhere Werte für die sAUC(IL‑4Rα_IT) (B+D) als bei den Proben ohne Transkriptionshemmung (C+E).

Abb. 27: Expression von Splice-Varianten anderer Interleukine oder Interleukin-Rezeptoren in mononukleären Zellen eines gesunden Probanden, die mit oder ohne Hemmung der Transkription entweder direkt oder erst 2 bzw 4 Tage nach Abnahme aufgearbeitet wurden. Die Zunahme der sAUC der Splice-Varianten ist sehr unterschiedlich ausgeprägt. Regelmäßig ist die Zunahme unter Actinomycin D geringer oder gar nicht nachweisbar. Die in der Probe „Tag 4 ohne Actinomycin D“ nachweisbare zusätzliche Bande der γ_C ist in der veröffentlichten Literatur bisher nicht beschrieben. Vermutlich handelt es sich hier ebenfalls um das Amplifikat eines alternativ gespleißten Transkriptes mit zusätzlicher typischer Heteroduplex-Bande.

Abb. 28: Lokalisation der in der semiquantitativen RT-PCR eingesetzten, jeweils für IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT spezifischen Primerpaare. IL‑4R 1030 up sitzt im „Exon x“, das in IL‑4Rα_IT fehlt, und kann daher nur IL‑4Rα-cDNA amplifizieren, IL‑4R 1089IT down überspannt die Grenze der beiden dem „Exon x“ benachbarten Exons und ist daher spezifisch für IL‑4Rα_IT-cDNA.

Abb. 29: Bestimmung der Expressionsunterschiede von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT bei verzögerter Aufarbeitung der Zellen mit und ohne Hemmung der Transkription. Dargestellt ist die Auswertung der semiquantitativen PCR mit jeweils für die beiden Transkripte spezifischen Primern zur Beurteilung der relativen Expressionsunterschiede von IL‑4Rα bzw. IL‑4Rα_IT zwischen den Proben. Während in den Proben mit Hemmung der Transkription beide Transkripte abnehmen, zeigt sich in den Proben ohne Actinomycin D eine Hochregulation von IL‑4Rα_IT. Die gemessenen O.D. der einzelnen Banden von IL‑4Rα bzw. IL‑4Rα_IT jeder Probe sind in Bezug zur O.D. der Bande für GAPDH derselben Probe gesetzt worden. Zum anschaulicheren Vergleich der Proben wurden die ermittelten Werte am Tag 0 auf 100% Prozent gesetzt.

Abb. 30: Reversibilität der Zunahme der sAUC(IL‑4Rα_IT) nach Kultivierung der Zellen. Werden mononukleäre Zellen, die die IL‑4Rα_IT-mRNA nach einigen Tagen Stehen bei Zimmertemperatur relativ stark exprimieren, wieder in Kultur genommen, nimmt innerhalb weniger Stunden die sAUC(IL‑4Rα_IT) wieder deutlich ab (A). Die semiquantitative Bestimmung der Einzel­transkripte zeigt, daß die mRNA von IL‑4Rα_IT in diesen Zellen wieder herunterreguliert wird. Bei zusätzlicher Stimulation mit Concanavalin A oder IL‑4 werden im Vergleich zu den Zellen ohne zusätzliche Stimulation beide Transkripte stärker exprimiert (B).

Abb. 31: Nachweis der Integration der gesamten kodierenden Sequenz der DNA (oben) bzw. Expression der mRNA (unten) von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT in den transfizierten Ba/F3-Zellen mittels PCR bzw. RT-PCR exemplarisch für einige Klone. Die in der PCR oben dargestellte zusätzliche kürzere Bande von ca. 340 bp ließ sich in der RT-PCR nicht beobachten, war aber auch in den untransfizierten Ba/F3-Zellen nachweisbar (nicht dargestellt) und stellt vermutlich ein unspezifisches Produkt aus dem Maus-eigenen Genom dar.

Abb. 32: RNase-Protection-Assay zum Nachweis der Expression der IL‑4Rα- und IL‑4Rα_IT-mRNA in den mit pCR3.1/IL‑4Rα und pCR3.1/IL‑4Rα_IT transfizierten Ba/F3-Zellen, exemplarisch dargestellt für je einen Zellklon.

Abb. 33: Durchflußzytometrischer Nachweis der Expression von IL‑4Rα und IL‑4Rα_IT auf der Zelloberfläche der transfizierten Zellen exemplarisch für drei Klone. Der ausgefüllte Peak entspricht der Isotypkontrolle. Das Histogramm ganz rechts zeigt die fehlende Expression auf den mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen.

Abb. 34: Proliferationsverhalten der mit der vollständigen IL‑4Rα-Kette (oben), mit der Splice-Variante IL‑4Rα_IT (Mitte) und der mit dem leeren Vektor pCR3.1-Uni (links) trans­fizierten Ba/F3-Zellen unter Stimulation mit hIL‑4 im Vergleich zu mIL‑4 (4 ng/ml) über 42-48 Stunden. Mit Ausnahme eines Klones (Pfeil) proliferierten unter hIL‑4 alle mit IL‑4Rα transfizierten Klone, großenteils stärker als unter mIL‑4, während die mit der Splice-Variante und erwartungsgemäß auch die mit dem leeren Vektor trans­fizierten Zellen unter hIL‑4 kein Wachstum zeigten.

Abb. 35: Messung der Proliferation der mit IL‑4Rα, IL‑4Rα_IT oder dem leeren Vektor transfizierten Ba/F3-Zellen unter Stimulation mit mIL‑4 und hIL‑4 in unterschiedlichen Konzentrationen exemplarisch für je einen Zellklon. Alle Klone proliferierten wie erwartet konzentrationsabhängig unter mIL‑4. Der mit dem vollständigen hIL‑4Rα transfizierte Klon zeigt unter hIL‑4 ebenfalls Wachstum, während der mit der Splice-Variante und der mit dem leeren Vektor transfizierte Zellklon unter hIL‑4 nicht proliferierten. Dargestellt sind jeweils die gemittelten Werte aus drei Messungen.

Abb. 36: Hemmung der hIL‑4-vermittelten Proliferation eines mit dem vollständigen hIL‑4Rα transfizierten Ba/F3-Zellklones durch einen für den hIL‑4Rα spezifischen monoklonalen Antikörper. Der Antikörper hemmt nicht die über den mIL‑4R vermittelte Proliferation durch mIL‑4.

Abb. 37: Messung der Apoptose der mit IL‑4Rα (A), IL‑4Rα_IT (B) bzw. dem leeren Vektor (C) transfizierten Zellklone nach Kultur in wachstumsfaktorfreiem Medium oder unter Stimulation mit humanem oder murinem IL‑4 über 24 h. Dargestellt sind jeweils die Färbung mit Propidiumjodid als Histogramme und die dazu­gehörige Zweiparameter-Darstellung der Markierung mit Annexin-V-FITC gegen die Propidium­jodid-Färbung.

Abb. 38: Zusammenfassende graphische Darstellung der Untersuchung des Anteils apoptotischer Zellen unter Stimulation mit hIL‑4, mIL‑4 oder ohne Wachstumsfaktor. Zur Erläuterung siehe Abb. 37.

Abb. 39: Verteilung der Patienten mit Ersterkrankung oder Rezidiv auf die Transportzeit des Untersuchungs­materials. Jeder Strich der „Sonnenblumen“ steht für eine ausgewertete Probe. An der Y-Achse ist die Transportzeit in Tagen aufgetragen.