Mohrhagen, Kai : Räumliche Verteilung von Kalziumsignalen in Bergmanngliazellen als Antwort auf neuronale Aktivität

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Kapitel 3. Material und Methoden

3.1 Präparation der Dünnschnitte aus dem Kleinhirn der Maus

Die Kleinhirnschnitte wurden aus 20 bis 40 Tage alten Mäusen (P20 - P40) des Stammes NMRI (Naval Medical Research Institute) (modifiziert nach Llano, et al., 1991 ) gewonnen.

Die Tiere wurden durch Dekapitation getötet und die Kopfhaut entfernt. Der Schädel wurde dann einseitig lateral entlang der Schädelbasis aufgetrennt und rostal der Sutura lamdoidea (Naht zwischen dem Hinterhauptsbein und den beiden Scheitelbeinen) mit einem Frontalschnitt geöffnet. Der hintere Teil des Schädeldaches wurde mit Hilfe einer Pinzette abgehoben und das Kleinhirn sowie ein kaudal gelegener Teil des Großhirns in eiskalte Badlösung überführt. Der verbliebene Teil des Großhirns wurde abgetrennt und das Kleinhirn wurde mit der so entstandenen frontalen Schnittfläche mit Cyanmethacrylatkleber (Sekunden Alleskleber, Loctite, München) auf einem angerauhten Glasblock befestigt. Diese Anordnung wurde in der Schneidewanne eines Vibratoms (Vibracut, FTB, Bensheim) eingespannt und mit eiskalter Badlösung bedeckt. Alle verwendeten Gewebeschnitte wurden als Frontalschnitte aus dem Kleinhirn mit einer Stärke von 150 µm hergestellt.

Nach der Präparation wurden die Schnitte in Badlösung (s. unten) bis zu 6 Stunden bei Raumtemperatur (22-25°C) aufbewahrt. Die Schnitte wurden in mit Bicarbonat begaster Badlösung in einem Vorratsgefäß auf einem Netz aus Nylonfäden gelagert, so daß sie von allen Seiten mit Badlösung umspült wurden. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur (22-25 °C) durchgeführt.

3.2 Zusammensetzung der Lösungen

3.2.1 Herkunft der Substanzen

Die folgenden Substanzen wurden in konzentrierter Form in geeigneten Lösungsmitteln gelöst. Für die Experimente wurden diese Lösungen mit Badlösung verdünnt. Die folgende Tabelle zählt das Lösungsmittel, die Verdünnung, die Lagerbedingungen und den Lieferanten der Substanzen auf.

Substanz

Lieferant

Stammlösung

Verdünnung

Lagerung


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TTX

Tocris

1 mM in H2O

1:1000

+4°C

Thapsigargin

Tocris

1 mM in DMSO

1:1000

-20°C

Prazosin

Tocris

1 mM in Ethanol

1:1000

-20°C

BQ788

Calbiochem

100 µM in H2O

1:1000

-20°C

BQ3020

Calbiochem

100 µM in 2.5% NH4OH

1:1000

-20°C

E4CPG

Tocris

100 mM in 0.11 M NaOH

1:1000

-20°C

AIDA

Tocris

100 mM in 0.11 M NaOH

1:1000

-20°C

CPCCO

Tocris

100 mM in DMSO

1:1000

-20°C

PhCCC

Tocris

100 mM in DMSO

1:1000

-20°C

CNQX

Tocris

20 mM in H20

1:1000

-20°C

l-PDC

Tocris

100 mM in 0.1 M NaOH

1:1000

-20°C

ATP

Tocris

 

1:1000

-20°C

4-AP

Tocris

500 mM in Badlösung

1:1000

-20°C

PPADS

Tocris

100 mM inH2O

1:1000

-20°C

Reactive blue 2

Tocris

100 in H2O

1:1000

-20°C

DMSO

Sigma

 

1:1000

Raumtemperatur

Fura-2-AM

Molecular Probes

5 mM in DMSO

1:1000

-20°C

Oreegon-Green Bapta-1

Molecular Probes

2.5 mM in H2O

1:1000

-20°C

3.2.2 Zusammensetzung der Badlösung

Die Badlösung wurde vor jedem Experiment frisch angesetzt und setzte sich wie folgt zusammen:

Badlösung

NaCl

134,0 mM

KCl

2,5 mM

CaCl2

2,0 mM

MgCl2

1,3 mM

K2HPO4

1,25 mM

NaHCO3

26,0 mM

Glukose

10,0 mM

Die Lösung wurde ständig mit Bicarbonat (O2 95%, CO2 5%) begast. Der pH-Wert wurde dadurch auf 7,4 eingestellt.

Für die Herstellung der nominell Ca2+-freien Lösung wurde der CaCl2-Anteil durch MgCl2 ersetzt und 0,5 mM EGTA zugesetzt (alle Substanzen Merck, Darmstadt). Dazu wurden zwei 5fach konzentrierte Vorrats-Lösungen angesetzt und bei +4°C gelagert.


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Ca2+-freie Badlösung (Stock I)

NaCl

134,0 mM

KCl

2,5 mM

MgCl2

3,3 mM

Ca2+-freie Badlösung (Stock II)

K2HPO4

1,25 mM

NaHCO3

26,0 mM

Die fertige Lösung wurde vor dem Experiment durch Verdünnen der Stock-Lösungen 1 (Stock I) :1 (Stock II) :3 (dest. H2O) hergestellt. Außerdem wurden 10 mM Glukose und 0,5 mM EGTA zugegeben. Die Lösung wurde wie die Badlösung ständig mit Bicarbonat begast.

3.2.3 Zusammensetzung der Pipettenlösung

Für die Patch-Clamp-Untersuchungen wurden die Zellen mit folgender den Kalziumfarbstoff enthaltender Pipettenlösung dialysiert (nach Grosche, et al., 1999 )

Pipettenlösung

KCl

150 mM

MgCl2

2 mM

Na2 ATP

3 mM

HEPES

10 mM

Oregon-Green-BAPTA-1

0,5 mM

Der pH-Wert wurde durch die Zugabe von KCl auf 7,3 eingestellt und die Lösung bei -20°C aufbewahrt.

3.3 Aufbau des Meßstandes

Die gesamte Meßapparatur wurde auf einem schwingungsgedämpften Tisch (Microplan, Saarbrücken) montiert und gegen elektromagnetische Störungen sowie Streulicht durch einen Faraday‘schen Käfig aus Aluminiumplatten abgeschirmt. Die Präparate wurden in der Meßkammer durch ein aufrechtes Mikroskop (Axioskop FS, Zeiss, Oberkochen) mit einem Wasser-Immersionsobjektiv (LumPlanFL 40x 0.80w, Olympus) beobachtet. Um die Gewebeschnitte in der Meßkammer zu fixieren, wurde ein mit Nylonfäden bespannter U-förmig gebogener Platindraht verwendet (nach: Edwards, F. et al., 1989 ).

Auf dem Objekttisch des Mikroskops wurde eine Meßkammer aus Plexiglas mit Glasboden montiert. Mit Hilfe einer Peristaltikpumpe (Gilson) wurde ständig


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Badlösung aus einem Vorratsbehälter in eine Vorkammer der Meßkammer gepumpt. Über einen Überlauf gelangte die Badlösung in die Meßkammer. Auf der gegenüberliegenden Seite des Einlaufes befand sich ein Ablauf, aus dem mit Hilfe der Peristaltikpumpe die überständige Lösung absaugt wurde. Durch saugfähiges Papier konnte ein gleichmäßiger Pegel der Badlösung in der Meßkammer garantiert werden. Die Durchflußrate konnte über die Drehzahl der Peristaltikpumpe geregelt werden und betrug ca. 2-4 ml min-1. Durch den Wechsel der Vorratsbehälter können pharmakologisch wirksame Substanzen appliziert werden. Dabei ist zu berücksichtigen, daß sich alle Konzentrationsangaben auf die eingeleiteten Lösungen beziehen, aber nicht unbedingt die Konzentration an den Zellen angeben.

3.4 Kalziummessung mit Fura-2

Die Konzentration freier Kalziumionen läßt sich mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 messen, da das Exzitationsspektrum dieses Ca2+ Chelators von der Bindung freier Kalziumionen abhängig ist: Das Maximum des Exzitationsspektrums liegt für die kalziumgebundene Form von Fura-2 bei lambda1 = 340 nm, für die kalziumfreie Form bei lambda2 =380 nm; die maximale Emission erfolgt in beiden Fällen bei lambdaE =510 nm. Als eigentliche Meßgrößen dienen die Fluoreszenzintensitäten F1 und F2, die bei Anregung mit den Wellenlängen lambda1 und lambda2 emittiert werden. Für ein gegebenes optisches System verhält sich der Quotient R=F1/F2 proportional zur Konzentration freier Kalziumionen.

Abbildung 3: Fluoreszenzintensität von Fura-2 bei einer Emissionswellenlänge lambdaE =510 nm in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge und verschiedenen Kalziumkonzentrationen.


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Die Bildung des Quotienten R (ratiometrische Methode) bietet den Vorteil, daß Störungen des Fluoreszenzsignals, die auf Konzentrationsänderungen des Farbstoffs beruhen, durch die Division der konzentrationsabhängigen Terme entfallen. ( Grynkiewicz, et al., 1985 ).

3.4.1 Zur Anwendung des Fluoreszenzindikators Fura-2

Zur Messung der intrazellulären Konzentration freier Kalziumionen ([Ca2+]i) muß Fura-2 in das Zytosol der zu untersuchenden Zellen eingebracht werden. Hierzu bietet sich die folgende Methode an:

Fura-2 kann als lipophiler, nicht fluoreszierender, membranpermeabler Acetoxymethylester (Fura-2 AM) in der Badlösung appliziert werden. Der Farbstoff kann in dieser Form durch die Zellmembran in das Zytosol diffundieren, wo die Esterbindungen durch zelleigene Esterasen aufgespalten werden. Der nun polarisierte Farbstoff ist in dieser Form membranimpermeabel und fluoreszent. Diese Methode wird als „bulk loading“ bezeichnet ( Kirischuk, S. und Verkhratsky, A., 1996 ).

Das Laden der Zellen erfolgte durch Inkubation der Kleinhirnschnitte für 20 min bei 37°C (96 % Luftfeuchte, 5 % CO2) in Badlösung, die 10 µM Fura-2 AM (Stammlösung: 5 mM in DMSO) und 0,02% Pluronic F-127 enthielt (beide Substanzen Molecular Probes, Eugene, USA). Nach dem Laden wurden die Schnitte bei Raumtemperatur gelagert. Auswertbare Fluoreszenzintensitäten ließen sich mit fortschreitender Hydrolyse der Esterbindungen nach weiteren 30 min messen.

Nach diesem Protokoll lassen sich Bergmann Gliazellen erfolgreich mit Fura-2 AM beladen. Benachbarte Purkinje-Zellen lassen sich erst ab einer Inkubationszeit von 40 min mit Fura-2 beladen. Für Körnerzellen reicht eine Ladezeit von 10 min aus. Die zu erreichende zytosolische Fura-2 Konzentration liegt bei 20-30 µM. Bei diesen niedrigen Werten sind Nebeneffekte vernachlässigbar, die auf den kalziumpuffernden Eigenschaften des Farbstoffs beruhen ( Kirischuk, S. und Verkhratsky, A., 1996 ).

3.4.2 Das Kalziummeßverfahren mit Fura-2

Die Untersuchung von Kalziumantworten in Bergmann Gliazellsomata erfolgte mit einem Kalzium-Imaging-System. Die Präparate wurden durch einen Monochromator (Polychrome II, T.I.L.L. Photonics, Planegg) mit den Wellenlängen lambda1 = 340 nm und lambda2 = 380 nm beleuchtet. Die Messung der Fluoreszenzsignale F1 und F2 erfolgte mit


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einer Peltierelement-gekühlten CCD-Kamera (IMAGO CCD, T.I.L.L. Photonics, Planegg, maximale Bildauflösung 640x480 Pixel). Die Steuerung des gesamten Systems sowie die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm Vision 2.06 (T.I.L.L. Photonics, Planegg).

Bei der Durchführung der Messungen wurde mit den Exzitationswellenlängen lambda1 und lambda2 alle 0.2 sec ein Standbild aufgezeichnet. Auf einem dieser Bilder wurden einzelne Flächenelemente als „region of interest“ (ROI) markiert, in denen die mittlere Fluoreszenzintensität für jedes Standbild der aufgenommenen Sequenz errechnet wurde. Für jede ROI wurde der Quotient R = F1/F2 berechnet und über die Versuchszeit aufgetragen. Jede ROI wurde so gewählt, daß sie dem Soma und den proximalen Ausläufern der zu untersuchenden Zelle entsprach. Mit diesem Verfahren konnten mehrere Fura-2 AM geladene Zellen gleichzeitig in einem Experiment untersucht und anschließend einzeln ausgewertet werden.

3.5 Kalziummessung mit Oregon Green Bapta 1

Im Gegensatz zu Fura-2 handelt es sich bei Oregon Green Bapta 1 um einen nicht ratiometrischen, Einwellenlängen-Farbstoff. Um die Messung zu optimieren, wählt man eine Kombination von Exzitations- und Emissionswellenlängen, bei denen Änderungen der Kalziumkonzentration der Lösung zu maximalen Leuchtintensitätsänderungen führt. Der entscheidende Vorteil eines solchen Farbstoffes liegt in der Möglichkeit, ihn mit einer Laserwellenlänge des Edelgases Argon anzuregen. Dieser Farbstoff macht die Methode der ’confocal laser scanning microscopy‘ (CLSM) auf die Fragestellung der bildgebenden Kalziumkonzentrationsmessung an lebenden Organismen anwendbar. Die Nachteile eines solchen Farbstoffes liegen in der mangelnden Vergleichbarkeit von Messungen über einzelne Experimente hinweg, da die Fluoreszenzintensität nicht nur von der Kalziumkonzentration der Lösung abhängt, sondern auch von der Farbstoffkonzentration, der Anregungsintensität, der Bandbreite des Anregungslichtes, der Transmissivität der Optik, der Transmissivität der Emissionsfilter und der Empfindlichkeit der Lichtdetektoren. Man kann also nur relative Kalziumkonzentrationsänderungen messen, nicht aber die Kalziumkonzentrationen selbst. Außerdem werden solche Messungen durch


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Konzentrationsänderungen des Farbstoffes, die auf Bleicheffekte oder Volumenänderungen der vermessenen Zelle zurückgehen, beeinflußt.

3.6 Konfokale Mikroskopie

Die konfokale Laser-scanning Mikroskopie (Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM) ist eine mikroskopische Technik, die wesentliche Vorteile gegenüber der Epifluoreszenzmikroskopie bietet. Ein Laserstrahl wird durch ein Objektiv hoher numerischer Apertur fokussiert. Der Fokus des Lasers kann mit Hilfe beweglicher Teile der Optik zeilenweise über den untersuchten Ausschnitt des beobachteten Objektes geführt werden. Ein Photomultiplier (Verstärkerelektronik) setzt die Fluoreszenzintensität in ein elektrisches Signal um. Ein Computer kombiniert die Information über die Position des Laserfokus und die Fluoreszenzintensität zu einem Bild.

Abbildung 4: Schema zur Funktion der konfokalen Mikroskopie. Durch eine Lochblende wird Störlicht ausgeblendet.

Die Methode erhöht die axiale und die laterale Schärfe, indem sie Streulicht aus Objektebenen reduziert, die nicht beobachtet werden sollen. Das geschieht einerseits durch eine besser lokalisierte Anregung der Fluoreszenz mit Hilfe eines fokussierten Laserstrahls und andererseits durch das Ausblenden des Streulichts mit Hilfe einer Lochblende. Die Nachteile dieser Methode liegen zum einen in der eingeschränkten Wahl der Farbstoffe und zum anderen in dem relativ hohen Verlust von Fluoreszenzintensität an der Lochblende. Insbesondere ist der schnelle Wechsel zweier Anregungswellen wie beim Monochromator technisch nicht realisiert, so daß


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nur Einwellenlängen-Farbstoffe in Frage kommen (z.B. Fluo 3 oder Oregon Green Bapta 1). Diese Einschränkung ist besonders kritisch, da bei diesen Farbstoffen, anders als bei Zweiwellenlängen-Farbstoffen wie z.B. Fura 2, nicht um den Bleicheffekt während der Messung korrigiert werden kann und da auf Grund des Lichtverlustes an der Lochblende eine vergleichsweise hohe Lichtintensität bei der Anregung benötigt wird. Ein weiteres Problem ergibt sich bei hohen Bildraten. Auf Grund des sequenziellen Abtastverfahrens ist die Gleichzeitigkeit der Bildpunkte nur bedingt gegeben. So kann z.B. der letzte aufgenommene Bildpunkt eines Bildes zeitlich näher am ersten aufgenommen Bildpunkt des folgenden Bildes liegen als am ersten Bildpunkt desselben Bildes.

In dieser Arbeit ist das CLSM Odyssey XL der Firma Noran Instruments verwendet worden. Dieses Gerät erreicht durch eine akustooptische Ablenkungseinheit für die Steuerung der Laserposition eine Bildrate von 25 Bildern/s (Videorate). Geringere Bildraten wurden über die Mittelung aufeinanderfolgender Bilder erreicht. Zur Steuerung des Systems und zur Auswertung der Daten wurde eine IRIS Indigo von SGI eingesetzt. Zur Archivierung wurden die Daten auf CD gebrannt. Das Odyssey ist an ein Mikroskop der Marke Axioskop von Zeiss gekoppelt. Zur Fokussierung des Lasers bzw. zum Sammeln des emittierten Lichtes hat sich das Objektiv LumPlanFL 40x 0.80w von Olympus bewährt. Ausschlaggebend ist, daß kein Phasenring Lichtenergie absorbiert. Das System wurde auf einem schwingungsgedämpften Tisch der Firma Newport montiert.

3.7 Die Patch-Clamp Methode

Patch-Clamp Messungen in der Ganzzellkonfiguration machen es möglich, das Expressionsmuster von Ionenkanälen und Rezeptoren von einzelnen Zellen in kurzer Zeit zu analysieren ( Hamill, O. P. und Sakmann, B., 1981 ). Außerdem ist es möglich, die Zelle mit einer gegeben Lösung zu dialysieren. Auf diese Weise läßt sich die Zelle mit einem Kalziumindikator wie z.B. Oregon Green Bapta 1 befüllen und es können die Kalziumkonzentrationsänderungen einer einzelnen Zelle mit ihrem Strommuster verglichen werden.

Die feinen Glaspipetten wurden mit dem horizontalen Pipettenziehgerät P-87 der Firma Shutter Instruments aus Borosilikatglas (Hilgenberg, Malsfeld) mit einem Außendurchmesser von 1,5 mm und einem Innendurchmesser von 0.87 mm


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hergestellt. Die Parameter des Pipettenziehgerätes wurden so gewählt, daß der elektrische Widerstand der Pipetten ca. 6 MOhm betrug. Die Pipetten wurden mit einer dem intrazellulären Ionenniveau entsprechenden Pipettenlösung befüllt. Ein Filament auf der Innenseite der Kapillaren erleichterte das Befüllen.

Die Pipetten wurden auf einen Pipettenhalter gesteckt, so daß eine Ag/AgCl Elektrode (im folgenden Meßelektrode) in die Pipettenlösung eintaucht. Die Elektrode ist an einen Patch-Clamp-Verstärker EPC9 der Firma HEKA angeschlossen. Als Referenz dient eine weitere Ag/AgCl Elektrode, die in die Badlösung eintaucht (alle Angaben im folgenden verstehen sich in Bezug zu dieser Referenzelektrode).

Mit einem hydraulischem Mikromanipulator der Firma Narishige wird die Pipettenöffnung unter Mikroskopkontrolle auf der Zellmembran plaziert. Durch leichten Unterdruck in der Pipette legt sich die Zellmembran fest auf die Ränder der Pipettenöffnung, bis sich eine stabile Glas-Membranverbindung mit einem elektrischen Widerstand von 2-3 GOhm ergibt. Anschließender starker Unterdruck zerstört die Membran zwischen Pipette und Zytosol, so daß ein leitender Zugang zum Zellinneren entsteht. Durch schnellen Abgleich des Stromflußes von der Meßelektrode zur Referenzelektrode wird durch den Patch-Clamp-Verstärker eine gegebene Spannung über der Zellmembran eingestellt (Spannungsklemme) und die auftretenden Membranströme gemessen und aufgezeichnet.

Zur Steuerung des Verstärkers wird das Programm TIDA für Windows 4.11 eingesetzt, das im Labor entwickelt worden ist. Dieses Programm ermöglicht über seine flexible Makrosprache äußerst komplexe Spannungsprotokolle. Die Daten


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können mit Analysealgorithmen interaktiv ausgewertet werden. Die Eingabe von Stichwörtern erleichtert die Verwaltung der Daten.

3.8 Analyse von Kalziumantworten in Zellausläufern

Für diese Arbeit wurde eine besondere Auswertung für die gleichzeitige Darstellung der räumlichen, wie der zeitlichen Komponenten der Reaktion in Zellausläufern entwickelt. Das Ziel der Darstellung ist, eine etwaige Ausbreitung des Signals mit der Zeit im Raum, wie es im Falle einer Kalziumwelle der Falle wäre, geeignet zu visualisieren.

Das Verfahren wurde auf Daten des konfokalen Mikroskopsystems Odyssey XL angewendet. Aus der mitgelieferten Software wurden die Bilddaten im Tiff-Format exportiert. Diese Daten konnten in das frei verfügbare Bilddatenanalyseprogramm „Scion Image for Windows NT Beta 3b“ importiert werden. Mit dem „segmented line selection tool“ wurde der Ausläufer manuell nachgezeichnet. Die Funktion „Plot Profile“ gibt die Fluoreszenzintensitätswerte entlang des nachgezeichneten Ausläufers wider. Mit Hilfe eines für diese Arbeit entwickelten Makros konnte die Funktion automatisch auf alle Bilder des Datensatzes angewendet werden. Das Makro erzeugt eine Textdatei, in dem eine Zeile dem Fluoreszenzintensitätsverlauf des Ausläufers in einem Bild des Datensatzes entspricht. Diese Textdatei wurde in Microsoft Exel 97 importiert und dort mit weiteren Makros nachbearbeitet. Zuerst wird ein Medianfilter auf die Daten angewendet, anschließend wird das Mittel über zwei räumliche Nachbar-Datenpunkte und deren zeitliche Nachfolger gebildet. Aus der auf ein Viertel reduzierten Datenmenge werden die F/F0-Werte berechnet (s. oben). Diese werden mit der „Surface-Plot“-Funktion graphisch dargestellt. Die auf diese Weise erhaltene Graphik wird in das Zeichenprogramm Photoshop 4.0 kopiert und für den Ausdruck aufgearbeitet.

3.9 Statistische Auswertung der Kalziumantworten in Bergmann Gliazellsomata

Die Definition der „region of interest“ erfolgte vor dem Experiment mit Hilfe von Infarotaufnahmen und Fluorezsenzbildern des Schnittes. Dabei wurden die Somata eindeutig identifizierter Bergmann Gliazellen umkreist. Nachdem die Bilddaten im Experiment gewonnen waren, bot das Programm Vision 2.06 (T.I.L.L. Photonics,


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Planegg) die Möglichkeit, Textdateien mit den Verläufen der Kalziumkonzentrationen auf den definierten „region of interest“ zu speichern. Die Textdateien wurden in das Programm „TIDA für Windows 4.11“ importiert. Dort war es mit Hilfe der „Cursor“-Funktion möglich, die Signalamplitude interaktiv zu bestimmen. Diese Daten wurden in Microsoft Exel 97 Tabellen gesammelt. Signalamplituden wurden für die Darstellung in Diagrammen ins Verhältnis zur Signalamplitude bei der ersten Antwort der Zelle auf elektrische Stimulation gesetzt. Zellen, die auf die erste Stimulation nicht reagiert haben, wurden an dieser Stelle diskriminiert. Aus den so berechneten Verhältnissen wird das arithmetische Mittel gebildet und „standard error of mean“ berechnet. Für die Berechnung der statistischen Tests wurden die gemessenen Signalamplituden in das Programm SigmaStat 2.03 von SPSS überführt. Der Test wurde nach der Standardeinstellung des Programms durchgeführt. Lagen die zu testenden Daten paarweise vor und gelang ein Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung der Daten, dann wurde ein gepaarter t-Test verwendet. Gelang der Tests auf Normalverteilung nicht, wurde der Wilcoxon-Test gerechnet. Lagen die Daten nicht paarweise vor, wurde der Mann-Whitney-Test gewählt. Als Signifikanzniveau wurde gemäß den Vorgaben des Programms eine Irrtumswahrscheinlichkeit von höchstens 5 % gewählt.

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Thu Sep 19 11:06:18 2002