Mohrhagen, Kai : Räumliche Verteilung von Kalziumsignalen in Bergmanngliazellen als Antwort auf neuronale Aktivität

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Kapitel 4. Ergebnisse

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die elektrische Stimulation der Parallelfasern über die Ausschüttung von Neurotransmittern zu Kalziumsignalen in Bergmann Gliazellen führt. Eine Kombination zweier Techniken zur Messung von intrazellulären Kalziumkonzentrationen eröffnet einen Vergleich zwischen somatischen Reaktionen und solchen im Ausläufer der Zelle. Mit Hilfe pharmakologischer Untersuchungen wurde versucht, die zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären. Dazu wurde die Beteiligung intrazellulärer Kalziumquellen und verschiedener Neurotransmitter untersucht.

4.1 Identifizierung der Bergmann Gliazellen im Kleinhirnschnitt

Die Bergmann Gliazellen wurden im frontalen Schnitt des Kleinhirns nach morphologischen Kriterien identifiziert. Die Somata der Bergmann Gliazellen liegen in der Purkinjezellschicht, die sich durch die überdurchschnittlich großen Somata (40-50µM) der Purkinjeneurone sehr leicht finden läßt. Von den Purkinjeneuronen lassen sie sich eindeutig an Hand ihrer sehr viel kleineren (10-15µM) Somata unterscheiden. Um eine Verwechslung mit den Körnerzellen auszuschließen, wurden nur Zellen in die Auswertung aufgenommen, deren Somata eindeutig zwischen Purkinjeneuronen oder auf der der Molekularschicht zugewandten Seite der Purkinjezellschicht liegen. Desweiteren wurde die charakteristische, langgestreckte, oft birnenförmig in mehrere Ausläufer mündende Form der Bergmann Gliazellen zur Hilfe genommen. Diese Form hebt sich deutlich von der runden Morphologie der Körnerzellen ab.

Zur Identifizierung der Zellen, die über eine Patch-Pipette mit einem Kalziumindikator beladen werden, wurden zusätzlich elektrophysiologische Kriterien zur Hilfe genommen. Das Ruhepotential der Bergmann Gliazellen liegt zwischen -66 und -75mV ( Tuschick, S., 1997 ). Ausgehend von einem Haltepotential von -70mV wurde die Membran auf Spannungen im Bereich von -160mV bis +120mV im Abstand von 10mV geklemmt. Im Falle der Bergmann Gliazellen treten bei diesem Protokoll nur Stromänderungen auf, die auf passive Ionenkanäle


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zurückgehen. Im Unterschied zu Neuronen treten keine spannungsaktivierbaren Ionenkanäle auf.

4.2 Kalziumsignale in Bergmann Gliazellsomata als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern

4.2.1 Messung der Kalziumsignale

Für Messungen an den Zellsomata wurden ausschließlich im „bulk-loading“-Verfahren (s. Material und Methoden 3.4.1) geladene Schnitte verwendet. Die Identifizierung erfolgte nach morphologischen Kriterien. Zur Analyse der Zellausläufer wurden die Zellen über eine Patch-Clamp-Pipette mit einem Kalziumindikator dialysiert (s. Material und Methoden 3.6).

Um Neuron-Glia Interaktionen mit Hilfe von Kalziumignalen in den Bergmann Gliazellsomata nachzuweisen, wurde die neuronale Verschaltung des cerebellaren Cortex ausgenutzt. Die Neurone der Körnerzellschicht senden ihre Axone in die Molekularschicht, in der sie sich T-förmig aufspalten, um dann parallel zur Purkinjezellschicht zu verlaufen. Die Axone terminieren auf den dendritischen Spines der Purkinjeneurone. Die Bergmann Gliazellen umschließen diese Synapsen mit ihren Ausläufern.

Zur elektrischen Stimulation wurde eine Stimulationselektrode (s. Material und Methoden 3.6) im Abstand von ca. 200µM vom beobachteten Ausschnitt etwa in der Mitte der Molekularschicht plaziert. An die Elektrode wurde zehn Mal im Abstand 20 ms (50 Hz) für jeweils 200 µs eine Spannung von erst +50 V und dann -50 V angelegt. Unter diesen Umständen ließ sich in ca. 20% der Versuche ein Kalziumsignal in den beobachteten Bergmann Gliazellsomata auslösen (Abb. 5).


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Abbildung 5: Kalziumantworten von Bergmann Gliazellen auf drei aufeinanderfolgende elektrische Stimulationen zu je zehn biphasischen Spannungspulsen a ±50 V für jeweils 200 µs im Abstand von 20 ms (50 Hz). A) Dargestellt ist die repräsentative Reaktion einer Bergmann Gliazelle. Eine Veränderung der Form oder Amplitude des Signals ist nicht zu erkennen. Die Spuren zeigen eine Änderung des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses bei den Anregungswellenlängen 340 nm zu 380 nm. Dieser Wert ist proportional zur intrazellulären Konzentration freier Kalziumionen. Der Pfeil markiert den Moment der Stimulation. Die Abtastrate betrug in diesem Experiment 3 Bilder pro Sekunde. B) Das Diagramm zeigt die statistische Auswertung von 21 Bergmann Gliazellen. Dargestellt ist das arithmetische Mittel der Verhältnisse der maximalen Amplituden der zweiten und dritten Reaktion im Verhältnis zum entsprechenden Wert der ersten Reaktion der untersuchten Zellen. Eine statistisch signifikante Änderung (gepaarter t-Test) der Amplitude in Laufe der drei Stimulationen ist nicht zu erkennen (* markiert signifikante Unterschiede).


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Abbildung 6: Biphasische Reaktion einer Bergmann Gliazelle auf elektrische Stimulation der Parallelfasern. In der ersten Stimulation folgt der initialen Spitze ein länger (ca. 6 sec) andauerndes Plateau. Das Plateau ist in der zweiten und dritten Stimulation nicht mehr zu beobachten.


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Abbildung 7: Kalziumreaktion einer Bergmann Gliazelle auf drei aufeinanderfolgende Stimulationen mit jeweils 100 Pulsen. Eine schnelle initiale Spitze geht in eine lang andauernde, relativ langsam ansteigende Reaktion über. Im Laufe zweier weiterer Stimulationen zeigt sich, daß die zweite Phase der Antwort in Form, Dauer und Zeitpunkt des Beginns nicht stabil bleibt.


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Abbildung 8: Kalziumantwort einer Bergmann Gliazelle auf verschiedene Anzahlen von Pulsen in der elektrischen Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die repräsentative Antwort einer Zelle. Die initiale Spitze bleibt in allen Reaktionen deutlich vorhanden. Bei mehr als 80 Pulsen tritt eine zweite, langanhaltende Plateauphase auf. B) Bezugspunkt der dargestellten Prozente ist die mittlere, maximale Signalamplitude bei 100 Pulsen. Die mittlere Signalamplitude steigt im Schritt von 5 zu 10 Pulsen auf nahe zu das Doppelte an. Bei einer weiteren Steigerung der Pulszahlen erhöht sich die maximale Signalamplitude nur noch unwesentlich. Bei Stimulationen mit mehr als 20 Pulsen ergibt der Mann-Whitney-Test nur noch teilweise einen signifikanten Unterschied zu dem Bezugspunkt.


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Abbildung 9: Kalziumantwort einer Bergmann Gliazelle auf elektrische Stimulation mit 80 Pulsen bei verschiedenen Spannungen. A) Die Zelle wird mit 80 Pulsen bei verschiedenen Spannungen zuerst mit ±50 V, dann mit ±10 V, ±20 V, ±30 V, ±40 V und zuletzt wieder mit ±50 V stimuliert. Die Kalziumspuren zeigen keine Reaktion auf Stimulationen mit ±10 V - ±30 V. Auf Stimulationen mit mehr als ±40 V reagiert die Zelle deutlich. B) In dem Diagramm ist das Verhältnis der Antworten auf die verschiedenen Stimulationen zu der Antwort auf die erste Stimulation mit ±50 V dargestellt. Die Zellen antworten erst auf Stimulationsspannungen von mindestens ±40 V. Der gepaarte t-Test zeigt eine signifikante Abnahme (n=10) der Reaktionsamplituden der späteren Versuche im Vergleich zu der ersten Stimulation, auch wenn mit der gleichen Spannung stimuliert wird. Dieser Effekt tritt bei 80 Pulsen, nicht aber bei 10 Pulsen auf.

4.2.2 Wahl optimaler Stimulationsparameter

Zur Bestimmung optimaler Parameter für die weiteren Untersuchungen wurden die Anzahl der Pulse, die Frequenz und die Stimulationsspannung der Pulsgaben variiert.


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Es hat sich gezeigt, daß mindestens zehn Pulse notwendig sind, um ein zuverlässig meßbares Kalziumsignal im Zellsoma hervorzurufen. Bei den Versuchen konnten bis zu zwei verschiedene Phasen beobachtet werden.

Ein kurzes (1-2 sec) initiales Kalziumsignal (im weiteren: Reaktion bzw. Signal) tritt zuverlässig und häufig wiederholbar auf. Die Auswertung der beobachteten Reaktionen beruht auf den gemessenen maximalen Reaktionsamplituden. Das Vorhandensein und die deutliche Ausprägung (Maximum der Reaktion - Ruhelevel > 0.01[F340/F380]) des kurzen, initialen Kalziumsignals in der ersten Stimulation dient im folgenden als Einschlußkriterium für die statistische Auswertung einer Zelle. Das in Abb. 5 dargestellte Experiment wiederholt die Gabe von zehn biphasischen Spannungspulsen dreimal. Der gepaarte t-Test (n= 21) erkennt keine signifikante Abschwächung der maximalen Reaktionsamplituden in der zweiten und dritten gegenüber der ersten Stimulation. Im Mittel fällt die zweite Reaktion um 3.4 % höher und die dritte um 5.6 % niedriger aus als die Reaktion auf die erste Stimulation (gemessen als Verhältnis zur Reaktionsamplitude bei der ersten Stimulation).

In zahlreichen Beispielen folgt dem ersten Signal eine zweite langsamere (5-10 sec) Phase (Abb. 6). In der zweiten oder dritten Wiederholung der Stimulation ist die zweite Phase nicht mehr nachweisbar. Steigert man die Zahl der Pulse auf 20 bis 100 Pulse, so tritt die zweite Phase häufiger auf, klingt aber ebenfalls ohne erkennbare Gesetzmäßigkeit im Laufe weniger Wiederholungen ab (Abb. 7 zeigt ein Beispiel für 100 Pulse). Je mehr Pulse man zur Stimulation verwendet, desto wahrscheinlicher ist, daß die initiale schnelle Antwort nicht mehr erkennbar ist und als Teil in der langsamen Phase aufgeht (Abb. 8).

Mit Hilfe eines Experiments, in dem die Anzahl der Pulse zwischen 1-100 Pulsen (1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 100 Pulse) variiert wurde, konnten 10 Pulse als optimale Anzahl von Pulsen für pharmakologische Untersuchungen bestimmt werden. Die initiale Spitze läßt sich vor allem bei kleineren Pulsanzahlen gut vermessen. Bei mehr als 80 Pulsen tritt eine zweite, langanhaltende Plateauphase auf. Die mittlere Signalamplitude steigt im Schritt von 5 zu 10 Pulsen auf nahezu das Doppelte an. Bei einer weiteren Steigerung der Pulszahlen erhöht sich die maximale Signalamplitude nur noch unwesentlich. Im Vergleich der Stimulationen mit mehr als 20 Pulsen zu den Stimulationen mit 100 Pulsen ergibt der Mann-Whitney-Test


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(n=45 für einen Puls; n=35 für 5 Pulse; n=42 für 10 Pulse; n=20 für 20 Pulse; n=23 für 30 Pulse; n=23 für 40 Pulse; n=23 für 50 Pulse; n=25 für 80 Pulse; n=37 für 100 Pulse) nur noch teilweise (50, 30 Pulse) einen signifikanten Unterschied.

In einem weiteren Versuch wurde die optimale Stimulationspannung ermittelt. Nach einer Kontrollstimulation mit ±50 V wurde die Stimulationsspannung von ±10 V bis auf ±50 V in ±10 V Schritten erhöht. Abbildung 9 stellt das Ergebnis dar. Ein alles-oder-nichts-Effekt (Steigerung 2.1 % auf 52.5 % gemessen als Verhältnis zur ersten Stimulation) tritt bei dem Schritt von ±30 V zu ±40 V auf. In dem Schritt von ±40 V zu ±50 V zeigt sich ein leichter Abfall der mittleren Signalamplitude von 2.8 %. Der gepaarte t-Test zeigt eine signifikante Abnahme (n=10) der Reaktionsamplituden der späteren Versuche im Vergleich zu der ersten Stimulation, auch wenn mit der gleichen Spannung stimuliert wurde. Dieser Effekt tritt bei 80 Pulsen, nicht aber bei 10 Pulsen (s. oben) auf.


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Abbildung 10: Kalziumantworten einer Bergmann Gliazelle bei elektrischer Stimulation mit 10 Pulsen bei verschiedenen Frequenzen. A) In den Kalziumspuren zeigt sich keine Antwort bei 1 Hz, aber schon bei 5 Hz ist mehr als die volle Amplitude der Bezugsmessung erreicht. Darüberhinaus zeigen die Spuren, daß ein zeitlicher Zusammenhang zwischen der Dauer der Stimulation und der zeitlichen Länge der Antwort besteht. Je länger stimuliert wird, desto länger fällt die Antwort aus. B) Die Verhältnisse beziehen sich auf die Messung mit 50 Hz Stimulationsfrequenz. Das Diagramm zeigt, daß der Bereich von 5 Hz bis 100 Hz maximale Reaktionsamplituden erreicht. Der gepaarte t-Test zeigt signifikante Unterschiede zwischen der Bezugsmessung und allen weiteren Messungen außer der Stimulation mit 10 Hz. Auffällig ist ein Ausreißer bei einer Stimulationsfrequenz von 20 Hz, bei der die Signalamplitude fast verdoppelt ist.

In dieser Arbeit wurde 50 Hz als Stimulationsfrequenz gewählt, da diese Frequenz ein typischer Wert in der Literatur ist ( Newman, E. A. und Zahs, K. R., 1998 ). Zusätzlich wurde der Signalverlauf der Kalziumantworten in Abhängigkeit von der


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Stimulationsfrequenz untersucht (Abb. 10). Die Parallelfasern wurden mit 1, 5, 10, 20, 50, 100 und 200 Hz stimuliert. Die maximalen Signalamplituden der Reaktionen wurden ins Verhältnis zu der Bezugsmessung mit einer Stimulationsfrequenz von 50 Hz gesetzt. Während bei einer Stimulationsfrequenz von 1 Hz keine Antwort (4.3 %) zu erkennen ist, steigert sich die Reaktionsamplitude im Schritt auf eine Stimulationsfrequenz von 5 Hz auf 111.8 %. Die Signalamplituden im höheren Frequenzbereich nehmen unwesentlich ab (90 % bei 100 Hz; 76.1 % bei 200 Hz). Auffällig ist der Ausreißer bei 20 Hz (175.0 %). In den Kalziumspuren zeigt sich, daß die zeitliche Länge der Antwort bei niederfrequenten Stimulationen ansteigt. Zu berücksichtigen ist, daß die Dauer der Reizung bei niederfrequenten Stimulationen ebenfalls ansteigt.

4.2.3 Neuronale Aktivität ist notwendig für stimulationsvermittelte Kalziumantworten

Um methodische Probleme auszuschließen, wurden verschiedene Antagonisten für neuronale Übertragung appliziert. Sowohl mit Tetrodotoxin (TTX) als auch mit Kadmium und kalziumfreier Lösung konnte die beobachtete Antwort unterbunden werden. In allen Fällen konnte das Signal in nahezu seiner ursprünglichen Form wiederhergestellt werden, nachdem der Antagonist ausgewaschen war (Abb. 11).

4.2.4 TTX blockiert stimulationsvermittelte Kalziumantworten

In dieser Arbeit wurde Tetrodotoxin (TTX), ein Antagonist spannungsaktivierter Natriumkanäle, auf die Messung von Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern angewendet. Tetrodotoxin verhindert die Ausbreitung von Aktionspotentialen. In Gegenwart von Tetrodotoxin kann eine elektrische Stimulation der Fasern keine Reizleitung auslösen. Die Ausschüttung von Neurotransmittern an der Synapse unterbleibt. Ein Kalziumsignal, das auf synaptische Aktivität zurückgeht, wird unterbunden.


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Abbildung 11: 1 µM TTX unterbindet somatische Kalziumantworten in der Bergmann Gliazelle als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern reversibel. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Gabe von 1 µM TTX. In Gegenwart von TTX ist keine Reaktion mehr zu erkennen. Die Pfeile zeigen den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Gabe von TTX. Die Reaktion ist in Gegenwart von TTX vollständig blockiert (2.4 %) und stellt sich nach dem Auswaschen des Blockers zu nur 67.0 % wieder her. Der gepaarte t-Test (n=43) ergibt, daß sowohl die Blockade des Signals als die Wiederherstellung signifikante Effekte sind.

Durch die Gabe von 1 µM TTX konnte in allen durchgeführten Experimenten die Auslösung von Kalziumsignalen durch Stimulation der Parallelfasern reversibel unterbunden werden. Nach einer Kontrollstimulation, die als Referenz für die nachfolgenden Signalgrößen dient, wurde 1 µM TTX eingewaschen. Die Stimulationen der Parallelfasern in Gegenwart des Antagonisten wurden 1-3 min nach dem Einwaschen durchgeführt. Weitere Kontrollstimulationen wurden 10-20 min nach dem Auswaschen durchgeführt. Ein typisches Beispiel für eine solche Sequenz wird in Abb. 11 gezeigt. Wie die statistische Auswertung in Abb. 11 B) zeigt, reduziert TTX die Reaktion im Mittel um 97.6 %. Nach dem


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Auswaschen des Blockers stellen sich 67.0 % der ursprünglichen Reaktion wieder ein. Der gepaarte t-Test (n=43) zeigt, daß sowohl die Blockade gegenüber der Kontrollmessung als auch die Wiederherstellung des Signals nach dem Auswaschen von TTX gegenüber der Blockade signifikante Effekte sind. TTX ist sehr wirkungsvoll, um die stimulationsvermittelten Kalziumsignale in den untersuchten Bergmann Gliazellen zu blockieren.

4.2.5 Kalziumfreie Lösung blockiert stimulationsvermittelte Kalziumantworten

Die durch Aktionspotentiale hervorgerufene Depolarisierung der präsynaptischen Endigung führt zum Einstrom von Kalzium aus dem Extrazellulärraum durch spannungsaktivierte Kalziumkanäle. Die erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentration löst die Fusion der Synaptosomen mit der Plasmamembran und in Folge die Ausschüttung der gespeicherten Neurotransmitter in den synaptischen Spalt aus. In kalziumfreier Lösung ist dieser Mechanismus blockiert.

In den Bergmann Gliazellen konnten in kalziumfreier Badlösung nur deutlich reduzierte stimulationsvermittelte Kalziumantworten hervorgerufen werden. Dieser Effekt konnte durch das Einwaschen der normalen Badlösung rückgängig gemacht werden. Nach einer Kontrollstimulation, die als Referenz für die nachfolgenden Signalgrößen diente, wurde kalziumfreie Lösung eingewaschen. Die Stimulationen der Parallelfasern wurden 3 min nach dem Einwaschen der kalziumfreien Lösung durchgeführt. 10-20 min nach dem Auswaschen erfolgte eine weitere Kontrollstimulation. Ein typisches Beispiel für eine solche Sequenz wird in Abb. 12 gezeigt. Die statistische Auswertung in Abb. 12 zeigt, daß kalziumfreie Lösung die Reaktion im Mittel um 70.2 % im Verhältnis zu Anfangsreaktion reduziert. Durch Einwaschen normaler Badlösung kann im Mittel 93.9 % der Kontrollreaktion wiederhergestellt werden. Der gepaarte t-Test (n=15) zeigt, daß sowohl die Blockade gegenüber der Kontrollmessung als auch die Wiederherstellung des Signals nach dem Einwaschen normaler Badlösung gegenüber der Blockade signifikante Effekte sind. Kalziumfreie Lösung ist sehr wirkungsvoll, um die stimulationsvermittelten Kalziumsignale in den untersuchten Bergmann Gliazellen zu blockieren.


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Abbildung 12: Kalziumfreie Lösung (0.5 mM EGTA) unterbindet somatische Kalziumantworten in der Bergmann Gliazelle als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern reversibel. A) Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation der kalziumfreien Lösung. In Gegenwart von kalziumfreier Lösung ist die Reaktion deutlich reduziert. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation von kalziumfreier Lösung. Die Reaktion ist in Gegenwart von kalziumfreier Lösung deutlich reduziert (29.8 %). Die Reaktion stellt sich nach dem Einwaschen der normalen Badlösung nahezu vollständig wieder ein (93.9 %). Der gepaarte t-Test (n=15) ergibt, daß sowohl die Blockade des Signal als die Wiederherstellung signifikante Effekte sind.

1.3.5 Cadmium blockiert stimulationsvermittelte Kalziumantworten

Wie oben beschrieben ist der Einstrom von extrazellulärem Kalzium durch spannungsaktivierte Kalziumkanäle essentiell für die synaptische Aktivität. Cadmium blockiert die spannungsaktivierten Kalziumkanäle und unterbindet Neurotransmitterausschüttung.


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Abbildung 13: 100µM Cadmium unterbindet somatische Kalziumantworten in der Bergmann Gliazelle als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern reversibel. A) Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation von 100 µM Cadmium. In Gegenwart von kalziumfreier Lösung ist die Reaktion deutlich reduziert. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die Reaktion ist in Gegenwart von 100 µM Cadmium deutlich reduziert (28.9 %). Die Reaktion stellt sich nach dem Einwaschen der normalen Badlösung zum großen Teil wieder ein (74.0 %). Der gepaarte t-Test (n=32) ergibt, daß sowohl die Blockade des Signal als die Wiederherstellung signifikante Effekte sind.

In den durchgeführten Experimenten zeigt sich, daß Cadmium Kalziumantworten im Soma von Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern reversibel blockiert. Nach einer Kontrollstimulation, die als Referenz für die nachfolgenden Signalgrößen diente, wurde 100 µM Cadmium eingewaschen. Stimulationen der Parallelfasern in Gegenwart des Antagonisten wurden 1-2 min nach dem Einwaschen des Antagonisten durchgeführt. Weitere


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Kontrollstimulationen wurden 10-20 min nach dem Auswaschen durchgeführt. Ein typisches Beispiel für eine solche Sequenz wird in Abb. 12 gezeigt. Die statistische Auswertung in Abb. 12 zeigt, daß Kadmium die Reaktion im Mittel um 71.1 % im Verhältnis zu Anfangsreaktion reduziert. Durch Einwaschen normaler Badlösung kann im Mittel 74.0 % der Kontrollreaktion wiederhergestellt werden. Der gepaarte t-Test (n=32) zeigt, daß sowohl die Blockade gegenüber der Kontrollmessung als auch die Wiederherstellung des Signals nach dem Einwaschen normaler Badlösung gegenüber der Blockade signifikante Effekte sind. Cadmium ist sehr wirkungsvoll, um die stimulationsvermittelten Kalziumsignale in den untersuchten Bergmann Gliazellen zu reduzieren.

4.3 Die Rolle IP3-vermittelter Kalziumreaktionen

Durch das folgende Experiment wurde die Beteiligung des endoplasmatischen Retikulums als Kalziumquelle an dem zytosolischen Kalziumanstieg untersucht.

Zu Beginn wurde die Reaktion auf eine Stimulation gemessen. Das Ergebnis dient als Bezugspunkt für die nachfolgenden Messungen. Anschließend wurde die Sakro-Endoplasmatische-Retikulum-Kalzium-Pumpe (sacro endoplasmatic reticulum calcium pump, SERCA) durch zehnminütige Gegenwart von 1 µM Thapsigargin blockiert. Das endoplasmatische Retikulum ist danach nicht mehr in der Lage seine Kalziumspeicher wieder aufzufüllen. Allerdings muß nach Deaktivierung von SERCA sichergestellt werden, daß kein Kalzium mehr in dem endoplasmatischen Retikulum gespeichert ist. Die wiederholte Aktivierung von IP3-Rezeptoren führt zum Entleeren der Speicher. Als Agonist für den IP3-Weg bietet sich Adenosin-tri-Phosphat (ATP) an. Aus der Arbeit von S. Kirischuk ( Kirischuk, et al., 1995 ) ist bekannt, daß die wiederholte Applikation von 100 µM ATP zuverlässig zur Freisetzung von Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum über den IP3-Weg und so zur Entleerung der Thapsigargin sensitiven intrazellulären Kalziumspeicher führt. Nach Applikation von Thapsigargin führt die fünfte bis achte Applikation zu keinem meßbaren Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration (Abb. 14). Ist dieser Zustand erreicht, so kann man davon ausgehen, daß Thapsigargin sensitive intrazelluläre Kalziumspeicher nicht an der Generierung weiterer Kalziumsignale beteiligt sind.


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Abbildung 14: Kalziumantwort in einem Bergmann Gliazellsoma als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern mit entleertem endoplasmatischem Retikulum. Die Abbildung zeigt: 1. Reaktion der Zelle vor Entleerung der Speicher und Applikation von 1µM Thapsigargin 2. Zelle reagiert nicht mehr auf 100µM ATP nach Inkubation mit 1µM Thapsigargin und mehreren Applikationen von 100µM ATP 3. Die Zelle reagiert unvermindert auf elektrische Stimulation 4. Abschließende Applikation von ATP, keine Reaktion, die Speicher sind leer.

In Abbildung 14 wird ein typisches Experiment gezeigt. Die letzte Applikation von 100 µM ATP führt zu keiner meßbaren Antwort mehr. Die Auswertung in Abbildung 14 B), zeigt, daß Reaktion auf elektrische Stimulation unvermindert ist (94.0 % der Kontrolle). Der Mann-Whitney-Test findet keinen signifikanten Unterschied zwischen der Kontrollstimulation (n=43) und der Stimulation mit entleerten Kalziumspeichern des endoplasmatischen Retikulums (n=29). Eine abermalige Applikation von 100 µM ATP bewirkt keine Kalziumantwort in der Bergmann Gliazelle. Man kann schlußfolgern, daß sich die intrazellulären Speicher in der Zwischenzeit nicht wieder durch eine Thapsigargin insensitive Form einer Kalziumpumpe aufgeladen haben. Eine Beteiligung des endoplasmatische Retikulums an Kalziumantworten in Bergmann Gliazellsomata auf elektrische Stimulation kann nicht nachgewiesen werden.


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4.4 Wirkung spezifischer Neurotransmitter Antagonisten

Neben einem systematischen Ansatz, die Quelle der Kalziumsignale einzukreisen, wurde versucht, durch spezifische Antagonisten für die bekannten, Kalzium induzierenden Neurotransmitter den vermittelnden Mechanismus zu identifizieren. Bei der Auswahl der Antagonisten boten die Vorarbeiten aus der Dissertation von Sebastian Tuschik ( Tuschick, S., 1997 ) eine Stütze. Im folgenden werden die in dieser Arbeit untersuchten Neurotransmitter und die Wirkung ihrer Antagonisten auf stimulationsbedingte Kalziumsignale beschrieben.

1.5.1 Adrenalin und Noradrenalin

Wie in der Arbeit von Kirischuk und Tuschik ( Kirischuk, et al., 1996 ) gezeigt, sind die Katecholamine Noradrenalin und Adrenalin in der Lage, Kalziumsignale auf Bergmann Gliazellen auszulösen. Mit Hilfe spezifischer Agonisten und Antagonisten konnte gezeigt werden, daß Bergmann Gliazellen über alpha1-adrenerge Rezeptoren verfügen. Die Aktivierung dieser Rezeptoren bewirkt über den PLC-IP3 Weg eine Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration. Die Signale sind Thapsigargin sensitiv, so daß man auf die Kalziumspeicher im endoplasmatischen Retikulum als Ursprung des Signals schließen kann. Um die Beteiligung alpha1-adrenerger Rezeptoren an Kalziumantworten auf elektrische Stimulation zu untersuchen, sind zwei Ansätze verwendet worden. Zum einen ist die Wirksamkeit des alpha1-Antagonisten Prazosin untersucht worden und zum anderen kann das Ergebnis des Versuchs in Gegenwart von Thapsigargin verwendet werden.


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Abbildung 15: Wirkung von Prazosin auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation von 1 µM Prazosin. Prazosin ist in dieser Konzentration nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 1 µM Prazosin nahezu unverändert (95.4 %). Die Reaktion bleibt im Mittel nach dem Auswaschen des Blocker unverändert (95.5 %). Der gepaarte t-Test (n=29) kann keine signifikanten Effekte finden.


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Abbildung 16: Wirkung von Prazosin auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation von 10 µM Prazosin. Die Anwesenheit von 10 µM Prazosin reduziert die stimulationsvermittelten somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen. Dieser Effekt ist aber nicht umkehrbar. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 10 µM Prazosin auf 76.9 % reduziert. Nach dem Auswaschen des Antagonisten steigt die Reaktion wieder auf 86.8 % der Kontrolle an. Der gepaarte t-Test (n=8) erkennt die Applikation des Antagonisten als signifikanten Effekt, die Erholung des Signals nach Auswaschen des Blockers ist aber nicht signifikant.

4.4.1 Die Rolle alpha1-adrenerger Rezeptoren

Mit Hilfe des für alpha1-adrenerge Transmitterrezeptoren spezifischen Antagonisten Prazosin wurde die Beteiligung der Neurotransmitter Adrenalinan und Noradrenalin an stimulationsvermittelten Kalziumsignalen in Bergmann Gliazellen untersucht.

Nach einer Kontrollstimulation, die als Referenz für die nachfolgenden Signalgrößen diente, wurde 1 µM bzw. 10µM Prazosin eingewaschen. Die Stimulation der Parallelfasern in Gegenwart von Prazosin wurden 3-7 min nach dem Einwaschen durchgeführt. Weitere Kontrollstimulationen werden 10-20 min nach dem Auswaschen durchgeführt. Ein typisches Beispiel einer solchen Sequenz wird in Abb. 15 für 1 µM Prazosin und in Abb. 16 für 10 µM Prazosin gezeigt. Eine


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Veränderung der Form oder Amplitude in Gegenwart von Prazosin läßt sich in keiner der benutzen Konzentrationen nachweisen. Die statistische Auswertung unterscheidet sich für die beiden verwendeten Konzentrationen. In einer Konzentration von 1 µM zeigt der gepaarte t-Test (n=29) keine signifikanten Effekte. Die Reaktionen bleiben bei 95.4 % (von Kontrolle) in Gegenwart des Blockers und bei 95.5 % nach dem Auswaschen des Blockers stehen. Bei einer Applikation von 10 µM Prazosin ist eine signifikante Reduktion der geblockten Reaktion auf 76.9 % der Bezugsmessung zu beobachten. Nach dem Auswaschen des Blockers kann das Signal aber nicht signifikant wiederhergestellt werden (gepaarter t-Test, n=8, 86.8 % von Kontrolle). Prazosin ist in keiner der getesteten Konzentrationen effektiv, um die stimulationsvermittelten Kalziumsignale in den untersuchten Bergmann Gliazellen zu blockieren. Der Effekt der bei einer Konzentration von 10 µM auftritt kann nicht unbedingt gewertet werden, da er nicht reversibel ist.

4.4.2 Histamin

Wie in der Arbeit von Kirischuk et al.( Kirischuk, et al., 1996 ) gezeigt worden ist, stellt Histamin in einer Konzentration von mindestens einem µM einen Kalziumagonisten auf Bergmann Gliazellen dar. Mit Hilfe pharmakologischer Mittel konnte gezeigt werden, daß Bergmann Gliazellen über H1-Histaminrezeptoren verfügen. Die Aktivierung dieser Rezeptoren bewirkt über den PLC-IP3 Weg eine Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration. Die Signale sind Thapsigargin sensitiv, so daß man auf eine Beteiligung der Kalziumspeicher im endoplasmatischen Retikulum schließen kann. Um die Beteiligung von H1-Histaminrezeptoren an Kalziumsignalen im Falle elektrischer Stimulation der Parallelfasern zu untersuchen, sind zwei Ansätze verwendet worden. Zum einen ist die Wirksamkeit des spezifischen H1-Antagonisten Choropheniramine untersucht worden und zum anderen kann das Ergebnis des Versuchs in Gegenwart von Thapsigargin verwendet werden (Abb. 14).


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Abbildung 17: Wirkung von Chloropheniramin auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation von 10 µM Chloropheniramin. 10 µM Chloropheniramin ist nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 10 µM Chloropheniramin leicht erhöht (107.2 %). Die Reaktion bleibt im Mittel nach dem Auswaschen des Blocker unverändert (98.8 %). Der gepaarte t-Test (n=18) kann keine signifikanten Effekte finden.

4.4.3 Die Rolle des H1-Histaminrezeptoren

Nach einer Kontrollstimulation, die als Referenz für die nachfolgenden Signalgrößen dient, wird 10 µM Choloropheniramin eingewaschen. Stimulationen der Parallelfasern in Gegenwart des Antagonisten werden 2 min nach dem Einwaschen durchgeführt. Weitere Kontrollstimulationen werden 10-20 min nach dem Auswaschen durchgeführt. Ein typisches Beispiel für eine solche Sequenz wird in Abb. 17 gezeigt. Die statistische Auswertung in Abb. 17 B zeigt, daß die Erhöhung der maximalen Reaktionsamplitude auf 107.2 % in Gegenwart des Blockers durch einen gepaarten t-Test (n=18) als nicht signifikant beurteilt wird. Die anschließende Reduktion der Signalamplitude auf 98.8 % der ersten Stimulation nach dem


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Auswaschen des Antagonisten ist ebenfalls nicht signifikant (gepaarter t-Test, n=18). Cholorpheniramin ist in der beschrieben Verwendungweise nicht effektiv, um die stimulationsvermittelten Kalziumsignale in den untersuchten Bergmann Gliazellen zu blockieren.

Ebenso wie im Falle der alpha1-adrenergen Rezeptoren kann der in Abb. 14 gezeigte Versuch herangezogen werden, um eine Beteiligung der H1-Histaminrezeptoren an dem zytosolischen Kalziumanstieg auszuschließen. Die H1-Histaminrezeptoren sind G-Protein gekoppelt und wirken auf die IP3-Rezeptoren des endoplasmatischen Retikulums und setzen Kalzium aus intrazellulären Speichern frei. Da in dem Versuch dieser Signalweg ausgeschlossen wurde, kann man den Versuch als weiteren Hinweis werten, daß die H1-Histaminrezeptoren nicht an den stimulationsvermittelten Kalziumsignalen beteiligt sind.

4.4.4 Endothelin

Wie in der Arbeit von Tuschik et al. ( Tuschick, et al., 1997 ) gezeigt worden ist, stellt jede der drei Isoformen ET-1, ET-2 und ET-3 von Endothelin in einer Konzentration von mindestens 0.1 µM einen Kalziumagonisten auf Bergmann Gliazellen dar. Durch eine Affinitätsstudie konnte gezeigt werden, daß Bergmann Gliazellen über ETB-Rezeptoren verfügen. Eine Besonderheit dieser Rezeptoren stellt die schnelle Desensitivierung der Rezeptoren dar, die vermutlich auf eine Internalisierung zurückgeht. Schon bei der zweiten Applikation auf eine Zelle sind Endothelin Isoformen kaum noch in der Lage, ein meßbares Signal hervorzurufen. Die Aktivierung dieser Rezeptoren bewirkt über den PLC-IP3 Weg eine Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration. Die Signale sind Thapsigargin sensitiv, so daß man auf eine Beteilung der Kalziumspeicher im endoplasmatischen Retikulum schließen kann. Um die Beteiligung von ETB-Rezeptoren an Kalziumsignalen im Falle elektrischer Stimulation der Parallelfasern zu untersuchen, sind zwei Ansätze verwendet worden. Es wurde die Wirksamkeit des spezifischen ETB-Rezeptor-Antagonisten BQ788 untersucht. Dabei wurde auch der inhibierende Effekt durch Desensitivierung ausgenutzt, indem vor Gabe des Blockers für 30s der spezifische Agonist BQ3020 appliziert wurde. Außerdem kann das Ergebnis des Versuchs in Gegenwart von Thapsigargin herangezogen werden Abb. 14.


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4.4.5 Die Rolle des ETB-Rezeptor

Nach einer Kontrollstimulation, die als Referenz für die nachfolgenden Signalgrößen dient, wird µM BQ3020 eingewaschen, um die Desensitivierung auszulösen. Anschließend wurde BQ788 appliziert. Stimulationen der Parallelfasern in Gegenwart des Antagonisten werden 10 min nach dem Einwaschen durchgeführt. Weitere Kontrollstimulationen werden 10-20 min nach dem Auswaschen durchgeführt. Ein typisches Beispiel für eine solche Sequenz wird in Abb. 18 gezeigt. Wie die statistische Auswertung in Abb. 18 B) zeigt, ist BQ788 und die durch BQ3020 ausgelöste Desensitivierung nicht effektiv, um die stimulationsvermittelten Kalziumsignale in den untersuchten Bergmann Gliazellen zu blockieren.

Abbildung 18: Wirkung von BQ788 auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Blockers. 0.1 µM BQ788 ist nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Vor dem Antagonisten wurde der ETB-Rezeptor Agonist BQ3020 appliziert, um den Rezeptor zu desensitivieren. Der Antagonist zeigt keine erkennbare Wirkung. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation von BQ788 und BQ3020. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 0.1 µM BQ788 leicht erhöht (107.4 %). Die Reaktion reduziert sich im Mittel nach dem Auswaschen des Blocker auf 85.0 % der Kontrolle. Der gepaarte t-Test (n=14) kann keine signifikanten Effekte finden.


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Ebenso wie im Falle der alpha1-adrenergen Rezeptoren kann der in Abb. 14 gezeigte Versuch herangezogen werden, um eine Beteiligung der ETB-Rezeptoren an dem zytosolischen Kalziumanstieg auszuschließen. Die ETB-Rezeptoren wirken auf die IP3-Rezeptoren des endoplasmatischen Retikulums und setzen Kalzium aus diesem intrazellulären Speicher frei. Da dieser Signalweg in dem Versuch ausgeschlossen ist, kann man das Experiment als weiteren Hinweis werten, daß die ETB-Rezeptoren nicht an den stimulationsvermittelten Kalziumsignalen beteiligt sind.

4.5 Die Rolle von Glutamat bei stimulationsvermittelten Kalziumantworten

Glutamat ist der hauptsächliche Neurotransmitter der Körnerzellen. Bei elektrischer Stimulation der Parallelfasern erwartet man in erster Linie eine Ausschüttung von Glutamat. Auf Bergmann Gliazellen sind sowohl ionotrope Glutamatrezeptoren vom AMPA/Kainate Typ als auch metabotrope Glutamatrezeptoren der Gruppe I nachgewiesen worden. Außerdem exprimieren die Zellen Glutamattransporter. Daher wurde in dieser Arbeit besondere Aufmerksamkeit auf die Pharmakologie der Glutamatrezeptoren und Transporter verwendet.

4.5.1 Einzelapplikationen von Glutamatrezeptor Antagonisten

In dieser Arbeit wurden spezifische Antagonisten für die einzelnen Arten von Glutamatrezeptoren bzw. Glutamattransporter verwendet, um den jeweilige Anteil an den stimulationsvermittelten Kalziumreaktionen zu bestimmen. Hierbei handelt es sich insbesondere um Rezeptoren vom AMPA/Kainat-Typ, die auf Bergmann Gliazellen anders als auf Neuronen kalziumpermeabel sind ( Müller, et al., 1992 ). Außerdem wurden metabotrope Glutamatrezeptoren der Gruppe I mit einer Reihe verschiedener Antagonisten untersucht.

1.6.1.1 Metabotrope Glutamatrezeptoren

Wie Lopez et al. ( Lopez, Colome AM, Ortega, et al., 1997 ) zeigen konnten, lösen spezifische Agonisten für metabotrope Glutamatrezeptoren der Gruppe I


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Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen aus. Die Aktivierung dieser Rezeptoren bewirkt über den PLC-IP3 Weg eine Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration. Die Signale sind Thapsigargin sensitiv, so daß man auf eine Beteiligung der Kalziumspeicher im endoplasmatischen Retikulum schließen kann. Das Ergebnis des Versuchs unter Benutzung von Thapsigargin kann zu einer Aussage über die Beteiligung metabotroper Glutamatrezeptoren herangezogen werden (Abb. 14).

In der vorliegenden Arbeit wurden die Antagonisten AIDA, E4CPG, CPCCO und ein Cocktail aus AIDA, E4CPG und PhCCC eingesetzt. Alle Blocker (auch innerhalb des Cocktails) wurden in einer Konzentration 100 µM verwendet.

Unter diesen Blockern erwies sich einzig die Applikation von AIDA als wirkungsvoll (Abb. 20). In der Applikation führt es zu einer Reduktion der Antwort auf 77.7 %. Dieser Effekt läßt sich durch Auswaschen des Blockers umkehren. Die Antwort erreicht dann im Mittel 98.2 % des Ausgangssignals. Sowohl die Reduktion als auch die Wiederherstellung des Signals werden durch den gepaarten t-Test (n=7) als signifikant erkannt.

Der Antagonist E4CPG war nicht geeignet, die stimulationsvermittelten Antworten zu reduzieren (Abb. 19). Im Gegenteil stieg die Reaktionsamplitude auf 106.4 % der Bezugsreaktion an. Auch nach dem Auswaschen des Blockers blieb die Reaktionsamplitude mit 108.9 % geringfügig über dem Ausgangssignal. Der gepaarte t-Test (n=10) erkennt diese Änderung nicht als signifikant.

Ebenso ineffektiv erwies sich die Substanz CPCCO. Nach Applikation des Blockers reduzierte sich die Signalamplitude auf 92.7 % der Bezugsreaktion. Nach dem Auswaschen erholte sich die Kalziumreaktion auf 98.2 %. Ein gepaarter t-Test (n=7) erkennt diese Änderungen als nicht signifikant.

Die Applikation der Blockercocktails bewirkte eine Reduktion der Kalziumantwort auf 95.6 %. Diese Änderung ist nach Aussage des gepaarten t-Tests (n=17) ebenfalls nicht signifikant. Nach Auswaschen des Cocktails ergab sich eine weitere Reduktion auf 82.0 % des Ausgangssignals, die ebenfalls keine signifikante Änderung (gepaarter t-Test, n=17) gegenüber der blockierten Kalziumantwort darstellt.


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Abbildung 19: Wirkung von E4CPG auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Blockers. 100 µM E4CPG ist nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 100 µM E4CPG leicht erhöht (106.4 %). Die Reaktion bleibt im Mittel nach dem Auswaschen des Blockers unverändert (108.9 %). Der gepaarte t-Test (n=10) weist keinen signifikanten Effekt nach.


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Abbildung 20: Wirkung von AIDA auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach des Blockers. 100 µM AIDA bewirkt eine Reduktion der somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 100 µM AIDA deutlich auf 77.7 % verringert. Die Reaktion kann nach dem Auswaschen des Blocker nahezu unverändert (98.2 %) reproduziert werden. Der gepaarte t-Test (n=9) erkennt einen signifikanten Unterschied sowohl im Verhältnis der Reaktion vor und während, als auch im Verhältnis während und nach Applikation des Blockers.


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Abbildung 21: Wirkung von CPCCO auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Blockers. 100 µM CPCCO ist nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 100 µM CPCCO auf 92.7 % reduziert. Die Reaktion bleibt im Mittel auch nach dem Auswaschen des Blockers unverändert (98.2 %). Der gepaarte t-Test (n=7) weist keinen signifikanten Effekt nach.


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Abbildung 22: Applikation eines Cocktails von Antagonisten für metabotrope Glutamatrezeptoren auf Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen bei elektrischer Stimulation A) Der Cocktail verschiedener Antagonisten, spezifisch für metabotrope Glutamatrezeptoren, bestehend aus 100 µM E4CPG, 100 µM AIDA und 100µM PhCCC, ist nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Cocktails. Die Applikation läßt keine Wirkung erkennen. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation der Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude bleibt in Gegenwart des Cocktails nahezu gleich (95.6 %). Nach dem Auswaschen des Blockers reduziert sich die maximale Reaktionsamplitude im Mittel auf 82.9 %. Der gepaarte t-Test (n=17) erkennt keinen signifikanten Unterschied im Vergleich von Blocker und Kontrolle oder im Vergleich von Gegenwart des Blockers und der Stimulation nach dem Auswaschen des Blockers.

4.5.1.1 Glutamatrezeptoren vom AMPA/Kainat-Typ

Glutamatrezeptoren vom AMPA/Kainate-Typ sind in Bergmann Gliazellen, anders als auf anderen Zellen kalziumpermeabel. Da sie ionotrop funktionieren, also nicht von den intrazellulären Kalziumspeichern des endoplasmatischen Retikulums abhängen, fallen sie als möglicher Übertragungsweg nicht durch das Experiment in Verbindung mit Thapsigargin aus. Sie lassen sich zuverlässig und spezifisch durch CNQX blockieren.


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Abbildung 23: . Wirkung von CNQX auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Blockers. Die Applikation läßt in der Spur keine sichtbare Wirkung erkennen. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 20 µM CNQX deutlich auf 76.3 % verringert. Die Reaktion kann nach dem Auswaschen des Blockers nur reduziert (81.9 %) reproduziert werden. Der gepaarte t-Test (n=48) erkennt einen signifikanten Unterschied sowohl im Verhältnis der Reaktion vor und während, als auch im Verhältnis während und nach Applikation des Blockers.

Nach einer Kontrollstimulation, die als Referenz für die nachfolgenden Signalgrößen dient, wird 20 µM CNQX appliziert. Stimulationen der Parallelfasern in Gegenwart des Antagonisten werden 2 min nach dem Einwaschen durchgeführt. Weitere Kontrollstimulationen werden 10-20 min nach dem Auswaschen durchgeführt. Ein typisches Beispiel für eine solche Sequenz wird in Abb. 23 gezeigt. Die statistische Auswertung in Abb. 23 B) zeigt, daß in Gegenwart des Antagonisten eine Reduktion des Signals auf 76.3 % des Ausgangssignals eintritt. Nach dem Auswaschen von CNQX erholt sich das Signal auf 81.9 % der ursprünglichen Amplitude. Ein gepaarter t-Test (n=48) ergibt, daß beide Änderungen signifikant sind. Mit CNQX ist es in der beschriebenen Verwendungsweise möglich, die stimulationsvermittelten Kalziumsignale in den untersuchten Bergmann Gliazellen zu reduzieren.


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4.5.2 Die Rolle von Glutamattransportern

Glutamattransporter sind Membrankanäle, die im Kotransport mit Glutamat drei Natriumionen und ein Proton aufnehmen. Die Aktivität von Glutamattransportern kann zu einer deutlichen und meßbaren Erhöhung des intrazellulären Natriumspiegels führen. Durch die hohe Konzentration intrazellulären Natriums kann es zu einer Umkehrung des Na+/Ca2+-Austauschers kommen. Dies führt wiederum zu einer Erhöhung des intrazellulären Kalziumspiegels. Eine Blockade des Transporters ist durch den kompetativen Inhibitor l-PDC möglich.

Abbildung 24: Wirkung von 1-PDC auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation von 100 µM l-PDC. Die Applikation läßt in der Spur keine sichtbare Wirkung erkennen. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 100 µM l-PDC deutlich auf 80.0 % verringert. Der blockierte Anteil der Reaktion kann nach dem Auswaschen des Blockers nicht wieder (81.3 %) reproduziert werden. Der gepaarte t-Test (n=23) erkennt einen signifikanten Unterschied sowohl im Verhältnis der Reaktion vor und während Applikation des Blockers. Im Verhältnis während und nach Applikation des Blockers kann der gepaarte t-Test (n=23) keinen Unterschied erkennen.


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Abbildung 25: Wirkung von 1-PDC auf die Kalziumantworten von Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach des Blockers. 250 µM l-PDC bewirkt keine Änderung der somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 250 µM l-PDC mit 98.0 % der Ausgangsamplitude nahezu unverändert. Nach dem Auswaschen des Blockers fällt die mittlere Signalamplitude auf 82.0 % des Ausgangssignals ab. Der Wilcoxon-Test (n=14) erkennt in keiner der Änderungen einen signifikanten Unterschied.

Nach einer Kontrollstimulation, die als Referenz für die nachfolgenden Signalgrößen dient, wurde 100 µM bzw 250 µM l-PDC eingewaschen. Stimulationen der Parallelfasern in Gegenwart des Antagonisten wurden 2-5 min nach dem Einwaschen durchgeführt. Weitere Kontrollstimulationen wurden 10-20 min nach dem Auswaschen durchgeführt. Ein typisches Beispiel für eine solche Sequenz wird für eine Applikation von 100 µM l-PDC in Abb. 24 und für eine Applikation von 250 µM l-PDC in Abb. 25 gezeigt. In der statistischen Auswertung zeigen sich Unterschiede zwischen den beiden Konzentrationen. Während 100 µM l-PDC zwar mit einer Verminderung auf 80.0 % des Ausgangssignals zu einer deutlichen und signifikanten (gepaarter t-Test, n=23) Reduktion des Signals führt, bleibt die Signalamplitude unter der höheren Konzentration von 250 µM mit einer


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Verminderung auf 98.0 % nahezu gleich. Diese Änderung ist nicht signifikant (Wicoxon-Test, n=14). Nach dem Auswaschen von 100 µM l-PDC erholt sich die Signalamplitude nicht mehr signifikant (81.3 %, gepaarter t-Test, n=23). Das Auswaschen der Konzentration von 250 µM l-PDC bewirkt eine Reduktion der gemessenen Signalamplitude auf 82.0 %. Diese Änderung wird vom Wilcoxon-Test (n=14) nicht als signifikant erkannt. In Anbetracht der widersprüchlichen Resultate für die verschiedenen Konzentrationen läßt nicht der Schluß ziehen, daß es mit l-PDC in der beschrieben Verwendungsweise möglich ist, die stimulationsvermittelten Kalziumsignale in den untersuchten Bergmann Gliazellen zu blockieren.

4.5.3 Kombination von Antagonisten für Glutamat vermittelte Kalziumreaktionen

Da sich bei der Applikation von Antagonisten einzelner, durch Glutamat geöffneter Eintrittswege für Kalzium in das Zytosol nur eine teilweise Inhibierung erreichen ließ, wurde eine Kombination von Antagonisten für die bekannten Glutamat induzierten Kalziumeintrittswege appliziert.

Nach einer Kontrollstimulation (Zeitpunkt a), die als Referenz für die nachfolgenden Signalgrößen dient, wird die SERCA-Pumpe irreversibel durch die Gabe von 1 µM Thapsigargin blockiert. Anschließend wurde durch eine Applikation von 100µM ATP für 30 sec der Phospholipase C-Inositol-1,4,5-Triphosphat Weg stimuliert, um einen Kalziumaustritt aus dem endoplasmatischen Retikulum zu erreichen. Diese Applikation wurde solange wiederholt, bis sich keine Kalziumtransienten mehr auslösen ließen (Zeitpunkt b für die letzte ATP-Stimulation). Anschließend wurde eine Stimulationen der Parallelfasern durchgeführt (Zeitpunkt c für die elektrische Stimulation). Die nächste Stimulation wurde in Gegenwart von entweder 20 µM CNQX (Protokol I, Zeitpunkt e) oder 100 µM l-PDC (Protokoll II, Zeitpunkt d) durchgeführt, dabei wurde der jeweilige Antagonist 10 min vor der Stimulation eingewaschen. Anschließend wurde der jeweils andere Antagonist hinzugefügt, wobei die Kombination der Blocker für weitere 10 min appliziert wurde, bevor eine Stimulation (Zeitpunkt f) durchgeführt wurde. Weitere Kontrollstimulationen (Zeitpunkt g) wurden 10-20 min nach dem Auswaschen durchgeführt. Wie die Auswertung in zeigt und wie in Abschnitt bereits ausgeführt


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wurde, ist Thapsigargin in der beschrieben Verwendungweise nicht in der Lage, Einfluß auf die stimulationsvermittelten Kalziumsignale in den untersuchten Bergmann Gliazellen zu nehmen (Zeitpunkt c: Reduktion der Signalamplitude (n=43) auf 94.0 % der Ausgangsamplitude (n=29, Zeitpunkt a), kein signifikanter Unterschied nach dem Mann-Whitney-Test). Die Applikation des Glutamattransporterantagonist l-PDC führt zu einer Erhöhung des Signals auf 131.9 % (n=25, Zeitpunkt d) gegenüber der ersten Stimulation (n=29, Zeitpunkt a). Die Änderung (Zeitpunkt d) ist gegenüber der Stimulation nach Leerung der Kalziumspeicher des endoplasmatischen Retikulums (n=29, Zeitpunkt c) nach den Mann-Whitney-Test signifikant. Wenn man CNQX direkt nach Entleerung der intrazellulären Kalziumspeicher appliziert (n=18, Zeitpunkt e), führt es zu einer Reduktion um 35.6 % auf 58.4 % des Ausgangssignals (Zeitpunkt a) gegenüber der vorangegangenen Stimulation (Zeitpunkt c). Der Mann-Whitney-Test erkennt diese Reduktion nicht als signifikant (Zeitpunkt c, n=29 vs. Zeitpunkt e, n=18). Fügt man den jeweils fehlenden Antagonisten hinzu (Zeitpunkt f, n=36) erhält man einen Wert von 82.7 % der Ausgangsamplitude (Zeitpunkt a). Diese Änderung (Zeitpunkt f) ist gegenüber der Stimulation nach Entleerung der Speicher (Zeitpunkt c) nach dem Mann-Whitney-Test nicht signifikant. Im letzten Schritt wurde durch Auswaschen der Blocker (Zeitpunkt g, n=43) versucht, die gemessenen Effekte umzukehren. Der Vergleich durch den Mann-Whitney-Test mit der vorangegangenen Stimulation (Zeitpunkt f) zeigt keinen signifikanten Unterschied.

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Abbildung 26: Auswirkung gleichzeitiger Blockierung verschiedener glutamaterger Signalwege auf somatische Kalziumantworten auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Bergmann Gliazellen. A) Die gepunktete Linie repräsentiert den Zeitpunkt der Stimulation. a) Kontrollreaktion vor Applikation neuromodulativer Substanzen b) Letzte von 8 Applikationen von 100 µM ATP nach Gabe von 1 µM Thapsigargin für 10 min c) Stimulation bei von Kalzium entleertem endoplasmatischem Retikulum d) Applikation von 100µM l-PDC für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum (nach Protokoll II) e) Applikation von 20µM CNQX für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum (nach Protokoll I) f) Applikation von 20 µM CNQX und 100 µM l-PDC für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum g) Nach 10 min Auswaschen von CNQX und l-PDC B) Statistische Auswertung: die Buchstaben c-g repräsentieren Stimulationen, die zu denen im Schema (s. C) angegeben Zeitpunkten durchgeführt wurden. c) Stimulation bei entleertem endoplasmatischem Retikulum d) Applikation von 100µM l-PDC für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum (nach Protokoll II) e) Applikation von 20 µM CNQX für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum (nach Protokoll I) f) Applikation von 100 µM l-PDC und 20 µM CNQX für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum (beide Protokolle) g) Reaktion 10 min nach dem Auswaschen aller Blocker C) Applikationsschemata: I: erst CNQX, dann l-PDC, II: erst l-PDC, dann CNQX


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4.6 Verstärung der Reaktion durch Kaliumkanal Antagonisten

4.6.1 Kaliumkanäle terminieren Aktionspotentiale

Im Zuge eines Aktionspotentials kommt es in der ersten Phase zu einer schnellen Depolarisation der Membran durch die Öffnung spannungsaktivierter Natriumkanäle. Die Depolarisation führt im zweiten Schritt zur Öffnung spannungsaktivierter Kaliumkanäle, welche die Zellmembran hyperpolarisieren und weitere Aktionspotentiale während der Refraktärzeit unterbinden. Dieser Mechanismus ist für die Untersuchung von Neuron-Glia Interaktionen interessant, da sich durch eine Blockade der Kaliumkanäle die Depolarisation nach einem Aktionspotential länger aufrecht erhalten läßt. In der Folge sind die spannungsaktivierten Kalziumkanäle an den präsynaptischen Endigungen länger geöffnet. In der Konsequenz wird mehr Neurotransmitter in den synaptischen Spalt entlassen. Um die Auswirkung dieses Mechanismus zu untersuchen, wurde in dieser Arbeit die Wirkung des Kaliumkanalblockes 4-AP auf die stimulationsvermittelten Kalziumantworten untersucht.

4.6.2 Blockade von Kaliumkanälen führt zur Verstärkung stimulationsvermittelter Kalziumantworten

Um zu untersuchen, ob dieser Effekt eine Rolle in dem Modellsystem der Parallelfaser in Verbindung mit der Bergmann Gliazelle spielt, wurde der für spannungsaktivierte Kaliumkanäle spezifische Antagonist 4-AP appliziert. Nach einer Kontrollstimulation, die als Referenz für die nachfolgenden Signalgrößen dient, wurde 500 µM 4-AP eingewaschen. Stimulationen der Parallelfasern in Gegenwart des Antagonisten wurden 3 min nach dem Einwaschen durchgeführt. Weitere Kontrollstimulationen wurden 10-20 min nach dem Auswaschen durchgeführt. Ein typisches Beispiel für eine solche Sequenz wird in Abb. 27 gezeigt. Die Auswertung zeigt, daß eine Potenzierung der Kalziumantwort im Zellsoma auf 420.7 % stattfindet. Durch Auswaschen des Antagonisten läßt sich die Reaktion wieder auf 144.6 % der Ausgangsreaktion drücken. Der Wilcoxon-Test, der zwischen Ausgangssignal und Reaktion in Gegenwart des Antagonisten berechnet wurde, sowie der Mann-Whitney-Test, der zwischen Gegenwart des Antagonisten und Auswaschen verwendet wurde, zeigen einen signifikanten Effekt an. Der


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Kaliumkanalantagonist 4-AP ist äußerst effektiv, um die stimulationsvermittelten Kalziumsignale in den untersuchten Bergmann Gliazellen zu verstärken.

Abbildung 27: Wirkung von 4-AP auf Kalziumsignale in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Blockers. 500 µM 4-AP bewirkt erhebliche Erhöhung der somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation. Die Kalziumantwort vergrößert sich in der Amplitude und verlängert sich. Nach einen schnellen Anstieg kommt es zu einem exponentiellen Abfall. Die gesamte Reaktion dehnt sich auf über 20 sec aus. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 500 µM 4-AP auf 420.7 % der Ausgangsamplitude vergrößert. Nach dem Auswaschen des Blockers fällt die mittlere Signalamplitude auf 144.6 % des Ausgangssignals ab. Der Wilcoxon-Test (n=11) erkennt der Änderung des Ausgangssignals zum Signal in Gegenwart von 4-AP einen signifikanten Unterschied. Der Effekt ist nach dem Mann-Whitney-Test (n=11 in Gegenwart des Blockers vs. n=8 nach dem Auswaschen) signifikant umkehrbar.


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4.7 Kalziumsignale in Bergmann Gliazellausläufern als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern

Die Ausläufer von Bergmann Gliazellen reagieren bereits auf einen einzigen Spannungspuls mit einer relativ hochohmigen Stimulationselektrode ( Grosche, et al., 1999 ) mit einem meßbaren Kalziumtransienten. In der Veröffentlichung wird gezeigt, daß diese Signale TTX sensitiv sind. Man kann auf eine Neuron-Glia Wechselwirkung schließen.

4.7.1 Darstellung der zeitlichen und räumlichen Ausbreitung des Kalziumsignals in den Ausläufern

Der folgende Abschnitt zeigt eine besondere Auswertung der Meßergebnisse in den Zellausläufern. Dabei geht es um die gleichzeitige Darstellung der räumlichen, wie der zeitlichen Komponenten der Reaktion. Das Ziel der Auswertung ist es, eine etwaige Ausbreitung des Signals mit der Zeit im Raum, wie es im Falle einer Kalziumwelle der Falle wäre, geeignet zu visualisieren.

Vorbild für die Form der Auswertung ist der sogenannte Linescan-Modus der konfokalen Lasermikroskopie. Wie im Abschnitt „Material und Methoden“ beschrieben, tastet der Laser bei dieser besonderen Art der fluorometrischen Messung das zu beobachtende Feld zeilenweise ab. Aus den einzelnen Bildpunkten setzt der Computer erst die Zeilen und schließlich das gesamte Bild zusammen. Der Linescan-Modus beschränkt sich von vornherein auf die Abtastung einer einzigen Zeile (dies kann dafür mit sehr hoher Geschwindigkeit geschehen). Da es sich bei dem Zellausläufer um ein im wesentlichen eindimensionales Objekt handelt, wäre es wünschenswert, wenn man die abgetastete Zeile mit dem Ausläufer in Übereinstimmung bringt. Setzt man die einzelnen Zeilen zusammen, so bekommt man ein Bild, das entlang einer Kante den Raum repräsentiert und entlang der andern die Zeit. Die gemessenen Intensitäten bzw. relativen Kalziumkonzentrationen werden im Bild als Graustufen kodiert wiedergegeben.

Die Methode des Linescan-Modus steht zwar in den verwendeten Geräten zur Verfügung, aber die Ausläufer der Zellen stellen sich leider nicht so gerade dar, wie man es für die Verwendung dieser Technik benötigen würde. Daher wurde eine normale Bildfolge von einer Ausläuferreaktion genommen. Der Ausläufer wurde mit


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Hilfe mehrerer aufaneinanderfolgender Linien nachgezeichnet. Ein speziell in dieser Arbeit entwickeltes Programm geht für jedes Bild der Folge ab und ermittelt für jeden Punkt auf den Linien die gemessene Lichtintensität. Anschließend setzt es die ermittelten Intensitätsverläufe wie einen Linescan zu einem Raum-Zeit-Bild zusammen.

Die Abbildungen 28-30 zeigen drei typische Beispiele für Raum-Zeit-Bilder von Oregon-Green-Bapta-1 gefüllten Bergmann Gliazellausläufern, wie sie als Ergebnis elektrischer Stimulation der Parallelfasern entstehen. Es zeigt sich, daß sich zumindest eine oder mehrere aktive Zonen herausbilden, in der die Zellen reagieren. Es wird offensichtlich, daß sich die Signale in einem räumlich und zeitlich eng definierten Rahmen ereignen. Eine Ausbreitung im Sinne einer Kalziumwelle ließ sich nicht erkennen. Reaktionen fanden im wesentlichen in distalen Zonen des Ausläufers statt.

Abbildung 28: Kalziumantworten auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Bergmann Gliazellausläufern. Das Bild zeigt eine späte, proximale Reaktion auf zehn Pulse. Der distale Teil des Ausläufers ist nicht betroffen.


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Abbildung 29: Kalziumantworten auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Bergmann Gliazellausläufern. Das Bild zeigt eine frühe, medial gelegene Reaktion auf zehn Pulse. Der distale und proximale Teil des Ausläufers sind nicht betroffen.


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Abbildung 30: Kalziumantworten auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Bergmann Gliazellausläufern. Das Bild zeigt eine frühe Reaktion auf zehn Pulse, die im gesamten Ausläufer stattfindet.


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Thu Sep 19 11:06:18 2002