Mohrhagen, Kai : Räumliche Verteilung von Kalziumsignalen in Bergmanngliazellen als Antwort auf neuronale Aktivität

72

Kapitel 5. Diskussion

5.1 Kalziumsignale in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation

In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern mit Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration reagieren. Dabei konnten Unterschiede zwischen der Empfindlichkeit der Ausläufer und des Somas festgestellt werden. Die Ausläufer reagieren schon auf einen einzigen Spannungspuls mit einer deutlichen Kalziumerhöhung, während das Soma erst auf zehn Pulse mit einer sehr viel größeren Pipette reagiert. Im folgenden wird diskutiert, worauf dieser Mechanismus beruht und was die funktionelle Bedeutung sein könnte.

Kalzium ist einer der wichtigsten sekundären Botenstoffe in der Zelle. Kalziumerhöhungen können für die Expression von ‚immediate early’ Genen verantwortlich sein ( Lerea, L. et al., 1995 ). Die Expression dieser Gene kann im weiteren Verlauf den funktionellen Zustand der Zellen beeinflussen.

Kalzium reguliert eine wichtige neuroprotektive Funktion der Astroglia ( Wedler, F. et al., 1994 ). Astrogliazellen nehmen das in hohen Konzentrationen neurotoxische Glutamat auf ( Schousboe, et al., 1997 ), metabolisieren es zu Glutamin und geben es wieder in den Extrazellulärraum ab. Glutamin wird durch aktiven Transport in die umgebenden Neurone aufgenommen, wieder in Glutamat umgewandelt und als solches in den Synapsosomen gesammelt ( Schousboe, et al., 1977 , Westergaard, et al., 1995 ). Anschließend steht es für eine erneute Ausschüttung in die Synapse zu Verfügung.

5.1.1 [Ca2+]i Signale im Soma

Ziel der vorliegenden Arbeit war, regionale Unterschiede der Kalziumantworten verschiedener Zellbereiche als Antwort auf elektrische Stimulation gegenüberzustellen. Es wurde untersucht, ob das Zellsoma ebenso empfindlich auf neuronale Aktivität reagiert wie die Zellausläufer. Ein Vergleich der Ergebnisse aus Abschnitt 4.2.1 und 4.7.1 zeigt, daß eine erhebliche höhere Reizstärke notwendig ist, um eine somatische Kalziumreaktion auszulösen, als man benötigt, um eine Kalziumreaktion im Ausläufer hervorzurufen. Die somatische Kalziumantwort ist


73

also durch ihre geringere Sensitivität gegenüber synaptischer Aktivität gekennzeichnet. Mit einer entsprechend gewählten Reizstärke (s. Abschnitt 4.2.1) reagiert die Zelle sofort (im Rahmen der zeitlichen Auflösung) nach der Stimulation mit einem zeitlich eng begrenzten Signal.

In dieser Arbeit ist es gelungen, methodische Probleme auszuschließen, die frühere Ansätze zu Messung somatischer Kalziumantworten auf elektrische Stimulation hatten. Es wurden Experimente in Gegenwart von Blockern neuronaler Aktivität durchgeführt. Die deutliche Reduktion des Effektes durch Kadmium und kalziumfreie Lösung zeigt, daß sich dieser Effekt einwandfrei auf neuronale Aktivität zurückführen läßt. TTX ist sogar in der Lage Kalziumantworten auf elektrische Stimulation vollkommen zu unterbinden. Die Effekte aller drei Blocker sind nahezu vollständig reversibel.

Somatische Kalziumreaktionen von Astrogliazellen auf neuronale Aktivität sind aus der neueren Literatur bekannt. So zeigen Astrogliazellen im optischen Nerv Kalziumantworten auf elektrische Stimulation des Nervs ( Kriegler, S. und Chiu, S. Y., 1993 ). Carsten Ohlemeyer hat im Rahmen seiner Dissertation somatische Kalziumreaktionen von Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation des Corpus callosum gezeigt. Elektrophysiologische Untersuchungen an Bergmann Gliazellen weisen eine Depolarisation der Zellen während elektrischer Stimulation der Parallelfasern nach ( Clark, B. A. und Barbour, B., 1997 ). Kalziumtransienten in Ausläufern von Bergmann Gliazellen wurden von Grosche et. al. ( Grosche, et al., 1999 ) auf elektrische Stimulation der Parallelfasern hin beobachtet. Eine Untersuchung, die somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern, nachgewiesen hat, ist aber neu. Jüngste Untersuchungen ( Newman, E. A. und Zahs, K. R., 1998 ) zeigen, daß Kalziumwellen im Astrogliasynzytium die Übertragungseffizienz neuronaler Verbindungen erhöhen können.

5.1.2 Ausläufer

Der Nachweis von Kalziumreaktionen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Bergmann Gliazellausläufern ist das erste Mal in Grosche, et al., 1999 gelungen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine spezielle Methode zur Auswertung von Kalziumimagingdaten entwickelt, die zum Ziel hat, das zeitliche und räumliche


74

Verhalten von Kalziumantworten in den langgestreckten Ausläufern geeignet zu visualisieren. Wie oben schon diskutiert lassen sich die Kalziumtransienten im Ausläufer, anders als die somatischen Reaktionen, schon mit einer verhältnismäßig schwachen Stimulation auslösen. Unter diesen Bedingungen lassen sich keine Kalziumwellen erkennen. Auch bei einer Steigerung der Reizstärke (durch mehr Repitationen) ändert sich diese Beobachtung nicht.

Auf Grund der zahlreichen Daten über Kalziumwellen in Astrogliazellen aus der Literatur ( Newman, E. A. und Zahs, K. R., 1997 ; Simpson, P. et al., 1998 ) wird die These formuliert, daß eine Kalizumwelle im Zellausläufer startet und in das Soma hinaufläuft. Im Rahmen dieser Arbeit wurde in Abschnitt der zeitliche Verlauf der im Ausläufer gemessenen Kalziumsignale mit Hilfe der sogenannten Raum-Zeit-Bilder untersucht. Aus den Ergebnissen wird die Wanderung einer Kalziumwelle vom Ausläufer in das Soma nicht ersichtlich. Allerdings begrenzen technische Limitationen, nämlich die Sättigung des Photomultipliers im proximalen Bereich des Ausläufers die Aussagekraft. Verbesserte Färbetechniken können in Zukunft dieses Problem überwinden und die Fragestellung einer neuen Untersuchung zugänglich machen. Es ist möglich, transgene Tiere zu erzeugen, die einen Kalziumindikator zelltypspezifisch exprimieren ( Miyawaki, et al., 1997 ). Einen weiteren Hinweis gibt das zeitliche Verhalten der somatischen Kalziumantworten. Sollte eine Kalziumwelle vom Ausläufer in das Soma hineinwandern, dann wäre eine Verzögerung des Signals im Soma zu erwarten. Die Untersuchungen an den somatischen Kalziumantworten zeigen jedoch keine Verzögerung des Signals, das die Hypothese unterstützen würde. Im Gegenteil tritt die somatische Reaktion auf elektrische Stimulation hin sofort ein (s. Abbschnitt ). Allerdings sind die Daten nur begrenzt vergleichbar, da das Stimulationsprotokoll, das für Messungen am Soma verwendet wurde, nicht dem entspricht, das für die Messungen am Ausläufer eingesetzt wurde. Die These, daß Kalziumwellen den Ausläufer hinauf in das Soma hineinwandern, kann nicht abschließend verneint werden.

In der Literatur wurde von Grosche ( Grosche, et al., 1999 ) für die Ausläufer der Bergmann Gliazellen das Konzept der Mikrodomänen eingeführt. Mikrodomänen sind der Definition nach vom Zellkörper diffusionsunabhängige, funktionelle Regionen der Zelle, die zeitlich und räumlich begrenzt auf ihre Umgebung reagieren können. Morphologisch entsprechen sie den „leave-like-structures“, die aus


75

elektronenmikroskopischen Untersuchungen von Palay und Chan-Palay ( Chan-Palay, V. und Palay, S. L., 1987 ) bekannt sind. Mikrodomänen messen ca. 15 µM in allen drei Achsen. Die Raum-Zeit-Bilder, die in dieser Arbeit gewonnen wurden, weisen darauf hin, daß zumindest bei einzelnen elektrischen Stimulationspulsen die Kalziumerhöhungen auf Bereiche des Ausläufers beschränkt bleiben, die den Mikrodomänen in ihrer Größe entsprechen. Erst wenn mit Hilfe einer größere Stimulationspipette global stimuliert wird, zeigt der Zellkörper ebenfalls Kalziumantworten.

Die Vorstellung von einer lokalen Begrenzung von Kalziumsignalen in den Ausläufern auf Bereiche in der Größe einer Mikrodomäne wird von den Ergebnissen von Takechi ( Takechi, et al., 1998 ) unterstützt. In dieser Veröffentlichung wird mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie gezeigt, daß Teile von Dendritenbäumen von Purkinjezellen mit lokalen Kalziumtransienten auf elektrische Stimulation der Parallelfasern antworten. Die räumliche Ausdehnung dieser Signale entspricht denen der Mikrodomänen.

Eine erhöhte Kalziumkonzentration in Zytosol hat einen negativen Einfluß auf die Leitfähigkeit der Gap-Junctions, die Astrogliazellen zu einem Synzytium verbinden ( Giaume, C. und McCarthy, K. D., 1996 ; Müller, et al., 1996 ). Die Funktion der Gap-Junctions zwischen Astrogliazellen ist wichtig für die Erhaltung neuronaler Aktivität. Hohe Kaliumkonzentrationen im Extrazelluärraum, die bei neuronaler Aktivität entstehen, werden durch Astroglia ( Kuffler, S. et al., 1966 ) bzw. durch Bergmann Gliazellen gepuffert ( Siegel, et al., 1991 ). Astrogliazellen nehmen extrazelluläres Kalium durch plasmamembranständige Kaliumkanäle auf und leiten es mit Hilfe der Gap-Junctions intrazellulär an die umgebenen Astrogliazellen weiter. Dieser Mechanismus stellt eine extrazellulär homogene Kaliumkonzentration sicher. Die verminderte Leitfähigkeit von Gap-Junctions bzw. die reduzierte Fähigkeit Kalium abzuführen, stellt einen schnellen, auf eine Mikrodomäne eingeschränkten „feed-back“-Mechanismus von Astrogliazellen auf neuronale Erregbarkeit dar. Auf diese Weise kann eine regionale Kopplung von Synapsen erreicht werden.


76

5.2 Pharmakologische Charakterisierung der Kalziumsignale

Es sind zahlreiche Untersuchungen zu Kalziumagonisten für Gliazellen ( Verkhratsky, A. und Kettenmann, H., 1996 ) und Bergmann Gliazellen ( Kirischuk, et al., 1996 ; Tuschick, S., 1997 ; Tuschick, et al., 1997 ) veröffentlicht worden. In diesen Arbeiten wurde eine reiche Ausstattung an Rezeptoren auf Gliazellen nachgewiesen, deren Aktivierung zu Kalziumsignalen führt. In dieser Arbeit haben wir uns auf die Untersuchung von Neurotransmittern als mögliche Auslöser für die von elektrischer Stimulation hervorgerufenen Kalziumsignale beschränkt. Eine vollständige Untersuchung aller im Kleinhirn gefundenen Neurotransmitter in Bezug auf ihre Fähigkeit, Kalziumsignale in Bergmann Gliazellen hervorzurufen, liegt mit der Dissertation von Sebastian Tuschik ( Tuschick, S., 1997 ) vor. Die in Frage kommenden Transmitter sind demnach Glutamat, Histamin, Adrenalin, Noradrenalin, Adenosin-tri-Phosphat (ATP) und Endothelin (in allen drei bekannten Isoformen). Bis auf Glutamat wirken alle Transmitter auf metabotrope Rezeptoren, d.h. sie sind abhängig vom endoplasmatischen Retikulum als Kalziumquelle. In der vorliegenden Arbeit wurden für jeden der oben genannten Transmitter zwei Vorgehensweisen verfolgt, um seine Beteiligung an den beobachteten Signalen zu untersuchen. Ein genereller Ansatz blockiert jeden G-Protein gekoppelten Rezeptor, der über den PLC-IP3 Weg (s. unten) Kalziumreaktionen hervorruft. Dazu wird mit Hilfe von Thapsigargin und wiederholter Applikation von ATP das Kalzium aus dem endoplasmatischen Retikulum entfernt. Der zweite Ansatz verfolgt die Möglichkeit, spezifische Blocker gegen die einzelnen Transmitterrezeptoren zu applizieren. Im folgenden soll diskutiert werden, welchen Anteil die metabotropen Rezeptoren, die auf Bergmann Gliazellen bislang nachgewiesen werden konnten, an den Kalziumantworten dieser Zellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern haben.

5.2.1 Beteiligung des endoplasmatischen Retikulums

Das endoplasmatische Retikulum spielt in der Kalziumhomöostase eine wichtige Rolle. Zum einen sorgt es im Ruhezustand der Zelle durch die SERCA-Pumpe für ein gleichbleibend niedriges Kalziumniveau im Zytosol. Zum anderen kann es durch Öffnen von IP3-Rezeptoren (resp. Ryanodinrezeptoren in Neuronen) für schnelle Kalziumtransienten sorgen. Durch Store Operated Calcium Channels (SOCC) können schnelle, kurzeitige Kalziumantworten aus dem endoplasmatischen


77

Retikulum durch lang anhaltende (im Bereich von mehreren Minuten) Plateauphasen erweitert werden. Kalziumkanäle vom SOCC-Typ öffnen sich gegenüber dem Extrazellulärraum, so daß die Plateauphase von extrazellulärem Kalzium abhängig ist ( Hartmann, J. und Verkhratsky, A., 1998 ; Toescu, E. et al., 1998 ).

Seit der Entdeckung eines ersten Vertreters 1995 ( Kirischuk, et al., 1995 ) sind auf der Bergmann Gliazelle zahlreiche metabotrope Rezeptoren als Quelle zytoplasmatischer Kalziumsignale nachgewiesen worden. Diese Rezeptoren aktivieren mit Hilfe von G-Proteinen die Phospholipase C (PLC), welche das membrangebundene Phospholipid Phosphatidyinositol 4,5-Biphosphat (PIP2) hydrolysiert. Dabei entsteht Inositol 1,4,5 Triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG, ein Aktivator für Proteinkinase C). IP3 ist in der Lage, durch IP3-Rezeptoren in der Membran des endoplasmatischen Retikulums zytoplasmatische Kalziumtransienten hervorzurufen (zur Übersicht: Ferris, C. D. und Snyder, S. H., 1992 ). In der vorliegenden Arbeit ist versucht worden, diesen Weg auszuschalten.

Thapsigargin wurde in dieser Arbeit als ein irreversibler Antagonist der SERCA-Pumpe ( Thastrup, et al., 1990 ; Lytton, et al., 1991 ) eingesetzt. Es verhindert, daß nach Aktivierung der IP3-Rezeptoren das endoplasmatische Retikulum durch diese Pumpe wieder mit Kalzium befüllt wird. Anschließend wurden die Speicher durch mehrmalige Applikation von ATP geleert ( Kirischuk, et al., 1995 ). In Abschnitt dieser Arbeit wird gezeigt, daß sich mit elektrischer Stimulationen auch im weiteren Verlauf Kalziumreaktionen in unverminderter Intensität hervorrufen ließen, obwohl ATP nicht mehr in der Lage war, Kalziumtransienten auszulösen. Neuere Untersuchungen weisen auf alternative, Thapsigargin insensitive Wiederbefüllungsmechanismen des endoplasmatischen Retikulums hin. In der Arbeit wurde gezeigt, daß auch eine Kontrollapplikation von ATP nach der Stimulation keine Antwort hervorruft, was gegen das Vorhandensein eines solchen Mechanismus auf Bergmann Gliazellen spricht. Das Ausbleiben der Reaktion könnte auch auf eine Desensitivierung der Rezeptoren (etwa auf Basis einer Internalisierung der Rezeptoren) zurückzuführen sein. Dem kann entgegengehalten werden, daß es ohne vorherige Applikation von Thapsigargin möglich ist, mit ATP in zahlreichen Wiederholungen auf Bergmann Gliazellen Kalziumsignale auszulösen. Voraussetzung ist, daß man den Zellen ausreichend Zeit läßt, die


78

internen Speicher wieder zu befüllen (ca. 10 min; Kirischuk, et al., 1995 ). Allein durch dieses Experiment läßt sich eine Beteiligung von Rezeptoren, die über den PLC-IP3-Weg wirken, ausschließen.

5.2.2 Glutamatrezeptoren

Glutamat ist der exzitatorische Neurotransmitter der Körnerzellen bzw. der Parallelfasern. Glutamatrezeptoren sind damit die aussichtsreichsten Ziele für eine pharmakologische Untersuchung der Herkunft von Kalziumantworten auf elektrische Stimulation der Parallelfasern. Glutamatrezeptoren lassen sich in drei Arten gliedern. Zwei Arten von Glutamatrezeptoren sind ionotrop. Dabei handelt es sich um NMDA-Rezeptoren und um Rezeptoren vom AMPA/Kainat-Typ. Diese Rezeptoren bilden membranständige Ionenkanäle, die nicht von zellinternen Kalziumspeichern abhängen. Die dritte Art von Glutamatrezeptoren, die metabotropen Glutamatrezeptoren, gliedern sich in drei Klassen. Die erste dieser Klassen ist an den PLC-IP3-Mechanismus gekoppelt ( Hollmann, M. und Heinemann, S., 1994 ). Diese Rezeptoren wurden auf Bergmann Gliazellen nachgewiesen ( Lopez, Colome AM, Ortega, et al., 1997 ).

Im letzten Abschnitt wird auf die Glutamattransporter eingegangen. Diese Membranmoleküle sind sowohl auf der Bergmann Gliazelle als auch auf den umliegenden Neuronen exprimiert ( Lehre, K. P. und Danbolt, N. C., 1998 ; Dehnes, et al., 1998 ). Sie sorgen durch die Aufnahme des ausgeschütteten Glutamats für eine Terminierung des synaptischen Signals ( Lehre, K. P. und Danbolt, N. C., 1998 ) und üben eine neuroprotektive Wirkung aus, indem sie das in hoher Konzentration neurotoxische Glutamat einer Metabolisierung in das unwirksame Glutamin zuführen ( Peng, et al., 1993 ; Trotti, et al., 1998 ).

5.2.2.1 Metabotrope Glutamatrezeptoren

In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung von metabotropen Glutamatrezeptoren an durch elektrische Stimulation vermittelten Kalziumsignalen auf zwei Weisen ausgeschlossen. Einerseits kann man schon aus dem oben beschriebenen Ergebnis über die Beteiligung des endoplasmatischen Retikulums als Kalziumquelle einen Einfluß von metabotropen Glutamatrezeptoren ausschließen. Andererseits wurden verschiedene für die Klasse I der metabotropen Glutamatrezeptoren spezifischen Antagonisten eingesetzt. An erster Stelle sei AIDA


79

genannt, daß als sehr potenter Antagonist für die Klasse I metabotroper Glutamatrezeptoren gilt ( Moroni, et al., 1997 ). Dieser Antagonist zeigt bei alleiniger Applikation eine signifikante Wirkung (s. Abschnitt 4.5.1). Allerdings konnte bei einer Applikation eines Cocktails von verschiedenen Antagonisten für metabotrope Glutamatrezeptoren (s. Abschnitt 4.5.1), in dem außer AIDA noch E4CPG und PhCCC enthalten war, ( Sekiyama, et al., 1996 ; Annoura., 1996 ) keine Erhöhung der Wirkung erzielt werden. Der Anteil der blockierten Reaktion ist in diesem Cocktail geringer als bei AIDA für sich allein genommen. Für diesen Effekt können verschiedene mögliche Ursachen als Erklärung angenommen werden. So z.B. ist nicht ausgeschlossen, daß AIDA eher über eine Veränderung des Brechungsindex der Lösung als über eine physiologische Reaktion wirksam erscheint. In dem Cocktail könnte diese Wirkung wieder aufgehoben sein.

5.2.2.2 Rezeptoren vom AMPA/Kainat Typ

Die Experimente, die in dieser Arbeit vorgestellt werden, lassen eine Beteiligung dieser Rezeptoren an den Kalziumantworten auf elektrische Stimulation als sehr wahrscheinliche Möglichkeit erscheinen. Rezeptoren vom AMPA/Kainat-Typ sorgen in Neuronen auf der postsynaptischen Seite für eine schnelle Depolarisierung der Membran im Falle synaptischer Aktivität ( Kandel, E. et al., 1991 ). Der Nachweis kalziumpermeabler Rezeptoren dieses Typs auf Bergmann Gliazellen stellte 1993 ( Müller, et al., 1992 ) eine große Sensation dar.

In dieser Arbeit wurde CNQX als spezifischer Antagonist für den AMPA/Kainat-Rezeptortyp eingesetzt. Dieser Blocker unterbindet in Konzentrationen von 20 µM zuverlässig die Wirkung von 100µM Kainat, wenn es über die Badlösung appliziert wird ( Müller, et al., 1992 ). Der Anteil der blockierten Reaktion von nur 23.7% ist überraschend gering, zumal CNQX gelblich gefärbt ist und daher zu einer Verminderung des Signals auf rein optischem Wege führt. Auf Grund der optischen Wirksamkeit von CNQX war es nicht möglich, die Konzentration des Blockers auf 100µM zu erhöhen. Es erscheint möglich, daß die in dem synaptischen Spalt auftretende Glutamatkonzentration verhältnismäßig hoch ist im Vergleich zu der Konzentration des Agonisten in der optischen Meßebene bei einer Applikation über die Badlösung. Denn anders als im Stimulationsexperiment muß die applizierte Substanz erst in die entsprechende Tiefe des Schnittes


80

hineindiffundieren. CNQX ist ein kompetetiver Blocker ( Hollmann, M. und Heinemann, S., 1994 ), so daß die relativen Konzentrationen von Glutamat zu CNQX eine ausschlaggebende Rolle spielen.

5.2.2.3 Rezeptoren vom NMDA Typ

Der Einfluß von NMDA-Rezeptoren auf Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf die elektrische Stimulation der Parallelfasern ist in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht worden. Obwohl man bei der Applikation von NMDA auf einen Kleinhirnschnitt durchaus Kalziumsignale in Bergmann Gliazellen nachweisen kann, sprechen die im folgenden kurz skizzierten Ergebnisse von Shao für einen indirekten Effekt ( Shao, Y. und McCarthy, K. D., 1997 ). NMDA ist in der Lage, Körnerzellen zu aktivieren und somit Glutamat (oder den Kotransmiter ATP) in der Molekularschicht freizusetzen. In der Kleinhirnschnittpräparation ist es möglich, NMDA vermittelte Kalziumsignale in Bergmann Gliazellen durch TTX zu inhibieren. Aktionspotentialweiterleitung ist also essentiell für Kalziumreaktionen in Bergmann Gliazellen bei NMDA-Gabe. Dieses System eröffnet eine weitere Möglichkeit, Neuron-Glia-Interaktionen auf physiologischer Ebene im Modell der Bergmann Gliazelle zu untersuchen. Der Vorteil ist, daß die Zellen zu einem größeren Anteil reagieren als bei der elektrischen Stimulation, da die Reaktion nicht von der passenden Plazierung der Stimulationselektrode abhängt. Der Nachteil liegt darin, daß sich diese Methode einer auf den NMDA-Rezeptor zugeschnittenen, pharmakologischen Vorgehensweise verschließt. Da die direkte Wirkung (in Gegenwart von TTX) von NMDA auf Bergmann Gliazellen nur elektrophysiologisch ( Müller, et al., 1993 ) nicht aber im Kalziumimaging meßbar ist, wiegt dieser Nachteil für Kalziummessungen nicht schwer. In dem später folgenden Ausblick über „Long Term Depression“ (LTD) und Bergmann Gliazellen wird die Hypothese aufgestellt, daß postsynaptische NMDA Rezeptoren auf den Purkinjeneuronen in Verbindung mit einem retrograden Botenstoff indirekt für Kalziumsignale in der Bergmann Gliazelle verantwortlich sind. Für die Untersuchung dieser Fragestellung ist das in dieser Arbeit etablierte System der elektrischen Stimulation zu Aktivierung der Parallelfasern der Gabe von NMDA überlegen.


81

5.2.2.4 Glutamattransporter

In dieser Arbeit konnte ein Einfluß von Glutamattransportern auf die durch elektrische Stimulation vermittelten Kalziumantworten von Bergmann Gliazellen nicht nachgewiesen werden. Glutamattransporter auf Bergmann Gliazellen sind wichtig für die Terminierung synaptischer Aktivität und um neurotoxische Effekte von Glutamat zu unterbinden ( Lehre, K. P. und Danbolt, N. C., 1998 ). Der Transporter ist energieabhängig. Die Energie wird über den Kotransport von Glutamat mit drei Natriumionen und einem Proton gewonnen ( Vandenberg, R. J., 1998 ). Aber auch Kalzium kann auf diese Weise durch den Glutamattransporter in die Zelle eindringen. Eine andere Möglichkeit beachtet den Umstand, daß Natrium durch den Glutamattransporter in die Zelle einströmt. In hohen intrazellulären Konzentrationen kann Natrium zu einer Umkehrung des Na+/Ca2+-Austauschers führen und so einen signifikanten Kalziumeinstrom hervorrufen ( Kirischuk, et al., 1997 ).

Clark und Babour konnten in ihren Experimenten zeigen, daß die Stimulation der Parallelfasern zu einer Membrandepolarisation führt, die zum Teil auf den Glutamattransporter zurückgeht ( Clark, B. A. und Barbour, B., 1997 ). Der von Clark und Babour gemessene Effekt ließ sich zum größten Teil durch l-PDC, einem Glutamattransporter Antagonisten, blockieren. In den Experimenten der vorliegenden Arbeit ergibt sich eine Reduktion des Signals um ca. 25%, wenn nur l-PDC ohne weitere Substanzen appliziert wird (Abschnitt 5.5.2). Man kann diesen Effekt auf die Blockade der beiden oben beschriebenen Mechanismen zurückführen.

Im Widerspruch zu diesem Ergebnis stehen die Daten, die in dieser Arbeit in Verbindung mit der Blockierung der SERCA Pumpe, also bei entleerten Kalziumspeichern des endoplasmatischen Retikulums, gewonnen wurden (Abschnitt ). In diesem Fall führt eine Blockade des Austauschers durch l-PDC zu einer deutlichen Erhöhung des Signals. Dieser Effekt läßt sich durch die Anreicherung von Glutamat im Extrazellulärraum erklären. Das Glutamat wird nicht mehr in die Zellen aufgenommen, also wird das Signal größer. Es bleibt weiteren Untersuchungen vorbehalten, zu erkunden, wie die Kalziumspeicher des endoplasmatischen Retikulums auf die Glutamattransporter wirken.


82

5.2.3 Purinozeptoren

In den Ergebnissen aus dieser Arbeit ist ein Einfluß von metabotropen Purinozeptoren auf Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation nicht nachweisbar. Wie im folgenden dargestellt wird, ist ATP neben Glutamat als Kotransmitter in den synaptischen Endigungen der Parallelfasern ein wichtiger Kandidat für die Vermittlung von neuronaler Aktivität.

ATP ist hauptsächlich aufgrund seiner wichtigen Funktion als intrazellulärer Energieträger im Energiestoffwechsel der Zellen bekannt. Eine mögliche Rolle als Transmitter wurde zwar schon in den 50er Jahren beschrieben, jedoch dauerte es bis in die 80er Jahre, bis ATP und seinen Rezeptoren eine größere Aufmerksamkeit der Physiologen widerfuhr (zur Übersicht: Dalziel, H. H. und Westfall, D. P., 1994 ). Zu Beginn der 90er Jahre wurde die Rolle von ATP als Neurotransmitter etabliert ( Stone, T. W., 1981 ; Burnstock, G., 1990 ; Evans, R. et al., 1992 ; Edwards, F. et al., 1992 ; zu Übersicht: Zimmermann, H., 1994 ). Die Rezeptoren von ATP (P2) bilden zusammen mit den Rezeptoren von Adenosin (P1) die Gruppe der Purinozeptoren ( Burnstock, G. und Kennedy, C., 1985 ). Die ATP-Rezeptoren werden aufgrund ihrer Gewebsverteilung und unterschiedlicher Sensitivität für verschiedene Agonisten weiter in P2T, P2U, P2X P2Y und P2Z-Rezeptoren unterteilt. Die P2T, P2U und P2X-Rezeptoren sind Ionenkanal-gekoppelt, während die P2Y und P2U-Rezeptoren G-Protein gekoppelte Rezeptoren sind (zur Übersicht: Fredholm, B. et al., 1994 ).

Der Nachweis von ATP-Rezeptoren auf Astrozyten gelang erstmals Salter und Hicks ( Salter, M. W. und Hicks, J. L., 1994 ). Metabotrope Purinorezeptoren auf der Bergmann Gliazelle wurden das erste Mal 1996 von S. Kirischuk nachgewiesen ( Kirischuk, et al., 1996 ). In der gleichen Arbeit wird gezeigt, daß ionotrope Purinorezetoren auf diesen Zellen nicht vorkommen.

Das Experiment, das wie bereits beschrieben, die Kalziumspeicher des endoplasmatischen Retikulums unter zur Hilfenahme von Thapsigargin entleert, macht deutlich, daß eine Beteiligung metabotroper Purinozeptoren unwahrscheinlich ist. Der P2-spezifische Antagonist PPADS ( Charlton, S. et al., 1996 ) und der unspezifische Blocker Evans Blue ( Whittenburg., 1996 ), die in dieser Arbeit untersucht wurden, hatten beide aufgrund ihrer starken roten bzw. blauen Färbung starke, optische Effekte und ließen sich nicht auswerten. Die entsprechenden


83

Abbildungen sind daher nicht in den Ergebnisteil dieser Arbeit eingegangen. Vertiefende Untersuchungen können in Zukunft mit Hilfe anderer, optisch inaktiver Blocker das Ergebnis für P2-Rezeptoren untermauern.

5.2.4 Histaminerge Signale

In der vorliegenden Arbeit ist ein Einfluß von G-Protein gekoppelten Histaminrezeptoren auf Kalziumsignale in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation untersucht worden. Histamin, ein biogenes Amin, wirkt im ZNS als Neurotransmitter: Die Somata der histaminergen Neurone liegen ausschließlich im Corpus mamillare des Hypothalamus. Ihre Fasern projizieren nahezu in alle Gehirnregionen, vorwiegend an Varikositäten, aber kaum aus den für Neurone typischen präsynaptischen Strukturen. Eine gemeinsame Freisetzung mit anderen Transmittern, wie GABA und ATP wird angenommen (zur Übersicht: Wada, et al., 1991 ). Als weitere, nicht neuronale Histaminquelle im Gehirn wurden Mastzellen beschrieben, deren Einfluß auf Gehirnfunktionen aber umstritten ist (zur Übersicht: Schwartz, J. et al., 1991 ).

Histaminerge Effekte werden durch die Aktivierung der G-Protein gekoppelten Histamin-Rezeptoren vermittelt. Es sind drei Rezeptortypen bekannt (H1, H2 und H3, zur Übersicht: Haaksma, E. et al., 1990 ; Arrang, J. M., 1994 ), die alle auch im Gehirn exprimiert werden. Aufgrund dieser allgemeinen Präsenz histaminerger Signale im ZNS wird angenommen, daß Histamin übergreifende Hirnfunktionen beeinflußt, darunter den inneren Erregungszustand, die Thermoregulation, lokomotorische Aktivität und den Energieumsatz (zur Übersicht: Wada, et al., 1991 ; Wada, et al., 1991 ; Wada, et al., 1991 ).

Aus der Arbeit von Kirischuk et al. ( Kirischuk, et al., 1996 ) ist bekannt, daß durch Histamin rezeptorvermittelte Kalziumtransienten auf Bergmann Gliazellen ausgelöst werden können. Mit pharmakologischen Mitteln wurden H1-Histaminrezeptoren als ausschlaggebend für diese Signale charakterisiert. Die Kalziumtransienten werden dabei durch die Aktivierung IP3-sensitiver Rezeptorkanäle der Kalziumspeicher des endoplasmatischen Retikulums hervorgerufen.

In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die Rolle der H1-Histaminrezeptoren bei der Generierung von Kalziumtransienten durch elektrische Stimulation der Parallelfasern einzukreisen. Da weder die irreversible Entleerung der


84

Kalziumspeicher des endoplasmatischen Retikulums (Abbschnitt 4.3) noch ein spezifischer Blocker (Abbschnitt 4.4.3) für histaminerge Rezeptoren zu einer statistisch signifikanten Reduktion der Antworten führte, kann man davon ausgehen, daß die H1-Rezeptoren nicht für die Vermittlung dieses Signals verantwortlich sind. Dieses Ergebnis verträgt sich mit der Vorstellung speziell die glutamatergen Parallelfasern zu stimulieren. Die Funktion der Histamin-vermittelten Kalziumtransienten bleibt damit weiter ungeklärt.

5.2.5 Endothelinrezeptoren

Ein Einfluß von Endothelinrezeptoren auf Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation konnte in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden. Endothelin wurde zunächst als vasoaktives Peptid beschrieben, das in den Endothelzellen der Blutgefäße synthetisiert wird ( Yanagisawa, et al., 1988 ). Endothelin gilt als der stärkste bekannte Vasokonstriktor, dessen blutdrucksteigernde Wirkung auf einer Erhöhung des Tonus in der glatten Muskulatur der Gefäßwände beruht. Von Endothelin sind drei Isoformen bekannt: ET-1, ET-2 und ET-3 ( Inoue, et al., 1989 ). Diese werden jeweils von einem eigenen Gen codiert und sind eng verwandt mit den kardiotoxischen Sarafotoxinen S6a, S6b, S6c und S6d aus dem Gift der Natter Atractapsis engaddensis (zur Übersicht: Kloog, Y. und Sokolovsky, M., 1989 ).

Für jede Endothelin-Isoform bildet ein vergleichsweise großes Vorläuferpeptid ‚prepro-ET’ den Beginn des Biosyntheseweges. Das Peptid wird zu einer Zwischenform, dem ‚big-ET’ gespalten, das seinerseits durch ein ‚endothelin converting enzyme‘ (ECE) durch Hydrolyse in die aktive Form überführt wird. (zur Übersicht: Turner, A. J. und Murphy, L. J., 1996 ). Es wurden zwei membrangebundene ECE-Isoformen identifiziert: ECE-1 ( Xu, et al., 1994 ) ist in der Lage sowohl intra- als auch extrazelluläres ‚big-ET’ zu spalten, während ECE-2 ( Emoto, N. und Yanagisawa, M., 1995 ) vermutlich im Lumen von trans-Golgi Vesikeln aktiv ist. Obwohl bisher nur ‚big-ET’ als Substrat der ECE-Isoformen nachgewiesen wurde, werden weitere Funktionen dieser Enzyme nicht ausgeschlossen (zur Übersicht: Turner, A. J. und Murphy, L. J., 1996 ).

Die drei bekannten Endothelinrezeptoren sind alle G-Protein gekoppelt (zur Übersicht: Huggins, J. et al., 1993 ): ETA( Arai, et al., 1990 ), ETB ( Sakurai, et al., 1990 ) und ETC ( Karne, et al., 1993 ), letzterer wurde bisher nicht in Säugetieren gefunden. Die Klassifizierung der Endothelin-Isoformen beruht auf ihren Affinitäten für die Endothelin-Isoformen ( Masaki, et al., 1994 ): Der ETA-Rezeptor bindet ET-1 stärker als ET-3, der ETB-Rezeptor bindet alle Endothelin-Isoformen mit gleicher Affinität und der ETC-Rezeptor bindet ET-3 stärker als ET-1.

Trotz ihrer starken Vasoaktivität sind Endothelin-Signale nicht auf das Kreislaufsystem beschränkt: Endothelin-Biosynthese, Endothelin-Bindung und Endothellin-Rezeptorexpression wurde in allen Organen inklusive dem ZNS gezeigt (zur Übersicht: Rubanyi, G. M. und Polokoff, M. A., 1994 ).

Tuschik und Kirischuk konnten durch Einzelzell RT-PCR Analyse und auf pharmakologischem Wege ETB-Rezeptoren auf Bergmann Gliazellen nachweisen. Im Unterschied zu anderen Kalziumagonisten für Bergmann Gliazellen desensitivieren Endothelin vermittelte Antworten nachhaltig. Als wahrscheinlichste Ursache für die Desensitivierung wird die Internalisierung des Rezeptors diskutiert. In dieser Arbeit wurde die Desensitivierung genutzt, um die Beteiligung des ETB-Rezeptors an Kalziumsignalen in Verbindung mit elektrischer Stimulation der Parallelfasern auszuschließen. Es gibt zwei Schlußfolgerungen, die eine Rolle der Endothelin-Rezeptoren an diesen Signalen ausschließen. Da weder eine irreversible Entleerung der Kalziumspeicher des endoplasmatischen Retikulums (Abbschnitt 4.3) noch ein Zusammenspiel eines Agonisten (um die Internalisierung der Rezeptoren auszulösen) und eines Antagonisten für ETB-Rezeptoren zu einer statistisch signifikanten Reduktion der Antworten führte (Abbschnitt 4.4.5), kann man davon ausgehen, daß diese Rezeptoren nicht für die Vermittlung des Signals verantwortlich sind. Dieses Ergebnis paßt sehr gut zu der Idee, speziell die glutamatergen Parallelfasern zu stimulieren. Die Funktion der Endothelin vermittelten Kalziumtransienten bleibt damit weiter ungeklärt.

5.3 Ausblick: Bergmann Gliazellen und Long Term Depression

Neben dem Phänomen der Long-Term-Potentiation (LTP), das im Hippocampus intensiv studiert wurde, ist die Long-Term-Depression (LTD) in der Molekuarschicht des Kleinhirns ein zweites gut untersuchtes System, in dem Lernen und Gedächtnis mit der Effizienzsteigerung einzelner Synapsen in Verbindung gebracht wird. Beide Vorgänge sind bis in die molekulare Ebene hinein erforscht. Die Ergebnisse dieser


86

Arbeit lassen die Rolle der Bergmann Gliazellen als weniger passiv erscheinen, als bisher angenommen wurde. Eine Beteiligung an LTD kann nicht ausgeschlossen werden.

Die Schlüsselrolle in diesem Vorgang nimmt der NMDA-Rezeptor durch die bislang nur an diesem Rezeptor beobachteten Eigenschaft, sowohl durch die Membranspannung, als auch durch einen Liganden gesteuert zu sein. Nur wenn es zu einer deutlichen Depolarisation des postsynaptischen Neurons, wie sie im Falle paralleler Aktivität mehrerer benachbarter Synapsen auftritt, und wenn außerdem der Ligand Glutamat an den Rezeptor bindet, dann entweicht ein Magnesiumion aus der Pore, das den Kanal in Abwesenheit einer der beiden Faktoren undurchlässig macht ( Hollmann, M. und Heinemann, S., 1994 ). Durch den Kanal kann Natrium und Kalzium in die Zelle einstömen ( Burnashev, et al., 1995 ). Eine spezifische Blockade des NMDA-Rezepors durch APV inhibiert LTP zuverlässig ( Zhou, et al., 1997 ).

Zukünftige Untersuchungen können eine Verbindung zwischen Kalziumtransienten in der Bergmann Gliazelle und LTD aufdecken. Da in dieser Arbeit kein Signalweg gefunden wurde, der einen bekannten Neurotransmitter einschließt und die Kalziumsignale blockieren konnte, ist es nicht auszuschließen, daß ein retrograder Botenstoff von der postsynaptischen Purkinjezelle ausgeht (wie z.B. NO) und einen Kalziumeinstrom ( Malcolm, et al., 1996 ) in die Bergmann Gliazelle hervorruft. Wie in Newman, E. A. und Zahs, K. R., 1998 gezeigt wurde, sind Kalziumsignale in Astrogliazellen hinreichend, um die synaptische Übertragungseffizienz zu steigern.


© Die inhaltliche Zusammenstellung und Aufmachung dieser Publikation sowie die elektronische Verarbeitung sind urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung. Das gilt insbesondere für die Vervielfältigung, die Bearbeitung und Einspeicherung und Verarbeitung in elektronische Systeme.

DiML DTD Version 2.0
Zertifizierter Dokumentenserver
der Humboldt-Universität zu Berlin
HTML - Version erstellt am:
Thu Sep 19 11:06:18 2002