Mohrhagen, Kai : Räumliche Verteilung von Kalziumsignalen in Bergmanngliazellen als Antwort auf neuronale Aktivität

Aus der Fachgruppe Zelluläre Neurowissenschaften
(Leiter: Prof. Kettenmann)
des Max-Delbrück-Centrums Berlin
(Leiter: Prof. Dr. Ganten)


DISSERTATION
Räumliche Verteilung von Kalziumsignalen in Bergmanngliazellen als Antwort auf neuronale Aktivität

Zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum medicarum (Dr. rer. medic.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Herrn Dipl.-Math. Kai Mohrhagen ,

aus: Lübeck

Dekan: Prof. Dr. med. M. Dietel

Gutachter:
1. Prof. Dr. Helmut Kettenmann
2. Prof. Dr. Robert Nietsch
3. Prof. Dr. Andreas Reichenbach

Datum der Promotion: 18. Dezember 2000

Abstrakt

Bergmann Gliazellen reagieren auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Ihrem Soma Kalziumsignalen. Diese Signale sind sensitiv gegenüber den Antagonisten TTX, kalziumfreie Lösung und Cadmium. Ein Antagonist spannungaktivierter Kaliumkanäle, der synaptische Ereignisse verlängert, führt zu erheblich verstärkten Antworten. Um Kalziumantworten in Bergmann Gliazellsomata auszulösen ist eine erheblich stärkere elektrische Stimulation notwendig, als man für Kalziumantworten im Ausläufer der Zellen benötigt Es wurde eine Methode entwickelt, Raum-Zeit-Bilder von Kalziumantworten in Bergmann Gliazellausläufern auf elektrische Stimulation zu erzeugen. Die Darstellungen zeigen zeitlich und räumlich eingeschränkte Reaktionen auf teilen der Ausläufer. Beispiele für das Fortschreiten einer Kalziumwelle vom Ausläufer in das Zellsoma (oder umgekehrt) ließen sich nicht finden. Die räumlich Ausdehnung der beobachteten Signale unterstützt das in Grosche et al. (Grosche, et al, 1999) entwickelte Konzept von Mikrodomänen in Bergmann Gliazellausläufern. Die gemessenen Kalziumsignale sind nicht von den Kalziumspeichern des endoplasmatischen Retikulums abhängig. Dies schließt die Beteiligung G-Protein gekoppelter Rezeporen, die unter Aktivierung von endoplasmatischen IP3-Rezeptoren zu zytosolischen Kalziumsignalen führen, an der Generierung diese Signale aus. Die Beteiligung der Neurotransmitter Adrenalin, Noradrenalin, Histamin, Endothelin, Adenosin-tri-Phosphat und des Neurotransmitters Glutamat auf dem Wege der Aktivierung metabotroper Glutamatrezeptoren an der Detektion stimulationsvermittelter Kalziumsignale wurde über die Applikation spezifischer Antagonisten ausgeschlossen. Die Rolle von Glutamattransportern konnte nicht abschließend geklärt werden, da der Antagonist bei einer alleinigen Applikation zu einer Reduktion des Signals um 20 % führt. Bei einer Applikation mit geleertem endoplasmatischen Retikulum führt er zu einer Steigerung der Signalamplitude um 31.9 %. Die somatischen Kalziumantworten auf elektrische Stimulation ließen sich zu einem Prozentsatz von 23.7 % durch den Antagonisten CNQX für ionotrope Glutamatrezeptoren vom AMPA/Kainat-Typ blockieren. In Bergmann Gliazellen sind diese Rezeptoren anders als in Neuronen kalziumpermeabel (Müller et al, 1992), da diese Zelle nicht die Untereinheit GluR2 des Kanals exprimieren. Es wurde eine funktionelle Bedeutung dieser Genexpression in der Detektion synaptischer Aktivität nachgewiesen

Schlagwörter:
Bergmannglia, Kalzium, Neuron-Glia Interaktion, elektrische Stimulation

Abstract

Bergmann glia cells react to electrical stimulation of parallel fibers with calcium signals in their somata. These signals are sensitive against antagonists of neuronal activity, namly TTX calcium free solution and cadmium. An antagonist of voltage activated potassium channels, which is able to prolong synaptic events, leads to increased calcium responses. To elicit calcium responses in Bergmann glia somata much stronger stimulation compared to these required to elicit calcium responses in Bergmann glia processes is needed. A method was developed to get space-time images of calcium responses to electrical responses in Bergmann glia processes. The images show reactions restricted in time and space in parts of the processes. Examples of processing of calcium waves from the processes to the somata (or the other way around) could not be found. The special expansion of the observed signals supports the concept of micro domains as developed by Grosche et al. (Grosche, et al, 1999). Calcium signals measured do not depend on the calcium stores of the endoplasmatic reticulum. This excludes the involvment of G-protein coupled receptors, which lead to cytosolic calcium signals via IP3-receptors, in the generation of these calcium signals. The involvment of the neurotransmitter adrenalin, noradrenalin, histamin, endothelin and adenosin-tri-phosphate in the generation of stimulation induced calcium signals was additionally excluded by the application of specific antagonists. The roll of glutamate transporter could not be fully clarified. The application of the antagonist l-PDC alone leads to a reduction of 20% of the signals amplitude, while the application in presence of emptied endoplasmatic calcium stores leads to an increase by 31.9%. Somatic calcium responses to electrical stimulation were able to be blocked by 23.7 % using the antagonist CNQX specific for ionotrope glutamate receptors of the AMPA/Kainat-Typ. In Bergmann glia cells these receptors differ from the AMPA/Kainat-Typ receptors on neuron with regard to their calcium permeability (Müller et al, 1992) as result of leak in expression of the GluR2 subunit. A functionel involvment of this specific gene expression in the detection of synaptic activity by Bergmann glia cells was proved

Keywords:
Bergmannglia, calcium, neuron-glia interaction, electrical stimulation


Seiten: [6] [7] [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] [15] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [61] [62] [63] [64] [65] [66] [67] [68] [69] [70] [71] [72] [73] [74] [75] [76] [77] [78] [79] [80] [81] [82] [83] [84] [86] [87] [88] [89] [90] [91] [92] [93] [94] [95] [96] [97] [98] [99] [100] [101] [102]

Inhaltsverzeichnis

TitelseiteRäumliche Verteilung von Kalziumsignalen in Bergmanngliazellen als Antwort auf neuronale Aktivität
1 Einleitung
1.1Gliazellen sind eine wichtige Zellgruppe im zentralen Nervensystem
1.2Klassifizierung von Gliazellen
1.2.1Astroglia
1.2.2Oligodendroglia
1.2.3Mikroglia
1.3Das Kleinhirn
1.3.1Funktion
1.3.2Der cerebellare Cortex
1.4Bergmann Gliazellen
1.4.1Bergmann Gliazellen stehen in enger morphologischer Interaktion mit den Purkinjeneuronen
1.4.2Bergmanngliazellen exprimieren zahlreiche Rezeptoren für Neurotransmitter
1.4.3Bergmanngliazellen detektieren synaptische Aktivität
1.5Allgemeine Mechanismen der Kalziumregulation in tierischen Zellen
1.5.1Regulation der zytosolischen Ruhekonzentration von freien Kalziumionen
1.5.2Zytosolische Kalziumsignale
1.6Neurotransmitter Glutamat
1.6.1Glutamatrezeptoren vom NMDA Typ
1.6.2Glutamatrezeptoren vom AMPA/KainatTyp
1.6.3Nachweis von Glutamat Rezeptoren im Cerebellum
1.7Neuron-Glia Interaktionen
2 Zielsetzung
3 Material und Methoden
3.1Präparation der Dünnschnitte aus dem Kleinhirn der Maus
3.2Zusammensetzung der Lösungen
3.2.1Herkunft der Substanzen
3.2.2Zusammensetzung der Badlösung
3.2.3Zusammensetzung der Pipettenlösung
3.3Aufbau des Meßstandes
3.4Kalziummessung mit Fura-2
3.4.1Zur Anwendung des Fluoreszenzindikators Fura-2
3.4.2Das Kalziummeßverfahren mit Fura-2
3.5Kalziummessung mit Oregon Green Bapta 1
3.6Konfokale Mikroskopie
3.7Die Patch-Clamp Methode
3.8Analyse von Kalziumantworten in Zellausläufern
3.9Statistische Auswertung der Kalziumantworten in Bergmann Gliazellsomata
4 Ergebnisse
4.1Identifizierung der Bergmann Gliazellen im Kleinhirnschnitt
4.2Kalziumsignale in Bergmann Gliazellsomata als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern
4.2.1Messung der Kalziumsignale
4.2.2Wahl optimaler Stimulationsparameter
4.2.3Neuronale Aktivität ist notwendig für stimulationsvermittelte Kalziumantworten
4.2.4TTX blockiert stimulationsvermittelte Kalziumantworten
4.2.5Kalziumfreie Lösung blockiert stimulationsvermittelte Kalziumantworten
4.3Die Rolle IP3-vermittelter Kalziumreaktionen
4.4Wirkung spezifischer Neurotransmitter Antagonisten
4.4.1Die Rolle alpha1-adrenerger Rezeptoren
4.4.2Histamin
4.4.3Die Rolle des H1-Histaminrezeptoren
4.4.4Endothelin
4.4.5Die Rolle des ETB-Rezeptor
4.5Die Rolle von Glutamat bei stimulationsvermittelten Kalziumantworten
4.5.1Einzelapplikationen von Glutamatrezeptor Antagonisten
4.5.1.1Glutamatrezeptoren vom AMPA/Kainat-Typ
4.5.2Die Rolle von Glutamattransportern
4.5.3Kombination von Antagonisten für Glutamat vermittelte Kalziumreaktionen
4.6Verstärung der Reaktion durch Kaliumkanal Antagonisten
4.6.1Kaliumkanäle terminieren Aktionspotentiale
4.6.2Blockade von Kaliumkanälen führt zur Verstärkung stimulationsvermittelter Kalziumantworten
4.7Kalziumsignale in Bergmann Gliazellausläufern als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern
4.7.1Darstellung der zeitlichen und räumlichen Ausbreitung des Kalziumsignals in den Ausläufern
5 Diskussion
5.1Kalziumsignale in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation
5.1.1[Ca2+]i Signale im Soma
5.1.2Ausläufer
5.2Pharmakologische Charakterisierung der Kalziumsignale
5.2.1Beteiligung des endoplasmatischen Retikulums
5.2.2Glutamatrezeptoren
5.2.2.1Metabotrope Glutamatrezeptoren
5.2.2.2Rezeptoren vom AMPA/Kainat Typ
5.2.2.3Rezeptoren vom NMDA Typ
5.2.2.4Glutamattransporter
5.2.3Purinozeptoren
5.2.4Histaminerge Signale
5.2.5Endothelinrezeptoren
5.3Ausblick: Bergmann Gliazellen und Long Term Depression
6 Zusammenfassung
Bibliographie Literaturverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Links: Nisselfärbung eines Frontalschnittes eines Kleinhirn von der Ratte. Man erkenntdie Dreigliederung in den Vermis und zwei lateral gelegene Hemisphären. Rechts: Vergrößerte Ansicht eines Ausschnitts aus der Molekularschicht. Von außen nach innen folgen die Schichten Pia Mater, Molekularschicht, Purkinjezellschicht, Körnerzellschicht und Markschicht. Die Bergmann Gliazell haben ihre Somata in der Purkinjezellschicht und senden 3-6 Ausläufer durch die Molekularschicht bis an die Pia Mater (Färbungen aus Altman, J. und Bayer, S. A., 1997 ).
Abbildung 2: Bergmann Gliazellen mit dem Farbstoff Fura-2_AM im „bulk loading“-Verfahren gefärbt. Man erkennt die Zellsomata und proximale Anteile der Ausläufer.
Abbildung 3: Fluoreszenzintensität von Fura-2 bei einer Emissionswellenlänge lambdaE =510 nm in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge und verschiedenen Kalziumkonzentrationen.
Abbildung 4: Schema zur Funktion der konfokalen Mikroskopie. Durch eine Lochblende wird Störlicht ausgeblendet.
Abbildung 5: Kalziumantworten von Bergmann Gliazellen auf drei aufeinanderfolgende elektrische Stimulationen zu je zehn biphasischen Spannungspulsen a ±50 V für jeweils 200 µs im Abstand von 20 ms (50 Hz). A) Dargestellt ist die repräsentative Reaktion einer Bergmann Gliazelle. Eine Veränderung der Form oder Amplitude des Signals ist nicht zu erkennen. Die Spuren zeigen eine Änderung des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses bei den Anregungswellenlängen 340 nm zu 380 nm. Dieser Wert ist proportional zur intrazellulären Konzentration freier Kalziumionen. Der Pfeil markiert den Moment der Stimulation. Die Abtastrate betrug in diesem Experiment 3 Bilder pro Sekunde. B) Das Diagramm zeigt die statistische Auswertung von 21 Bergmann Gliazellen. Dargestellt ist das arithmetische Mittel der Verhältnisse der maximalen Amplituden der zweiten und dritten Reaktion im Verhältnis zum entsprechenden Wert der ersten Reaktion der untersuchten Zellen. Eine statistisch signifikante Änderung (gepaarter t-Test) der Amplitude in Laufe der drei Stimulationen ist nicht zu erkennen (* markiert signifikante Unterschiede).
Abbildung 6: Biphasische Reaktion einer Bergmann Gliazelle auf elektrische Stimulation der Parallelfasern. In der ersten Stimulation folgt der initialen Spitze ein länger (ca. 6 sec) andauerndes Plateau. Das Plateau ist in der zweiten und dritten Stimulation nicht mehr zu beobachten.
Abbildung 7: Kalziumreaktion einer Bergmann Gliazelle auf drei aufeinanderfolgende Stimulationen mit jeweils 100 Pulsen. Eine schnelle initiale Spitze geht in eine lang andauernde, relativ langsam ansteigende Reaktion über. Im Laufe zweier weiterer Stimulationen zeigt sich, daß die zweite Phase der Antwort in Form, Dauer und Zeitpunkt des Beginns nicht stabil bleibt.
Abbildung 8: Kalziumantwort einer Bergmann Gliazelle auf verschiedene Anzahlen von Pulsen in der elektrischen Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die repräsentative Antwort einer Zelle. Die initiale Spitze bleibt in allen Reaktionen deutlich vorhanden. Bei mehr als 80 Pulsen tritt eine zweite, langanhaltende Plateauphase auf. B) Bezugspunkt der dargestellten Prozente ist die mittlere, maximale Signalamplitude bei 100 Pulsen. Die mittlere Signalamplitude steigt im Schritt von 5 zu 10 Pulsen auf nahe zu das Doppelte an. Bei einer weiteren Steigerung der Pulszahlen erhöht sich die maximale Signalamplitude nur noch unwesentlich. Bei Stimulationen mit mehr als 20 Pulsen ergibt der Mann-Whitney-Test nur noch teilweise einen signifikanten Unterschied zu dem Bezugspunkt.
Abbildung 9: Kalziumantwort einer Bergmann Gliazelle auf elektrische Stimulation mit 80 Pulsen bei verschiedenen Spannungen. A) Die Zelle wird mit 80 Pulsen bei verschiedenen Spannungen zuerst mit ±50 V, dann mit ±10 V, ±20 V, ±30 V, ±40 V und zuletzt wieder mit ±50 V stimuliert. Die Kalziumspuren zeigen keine Reaktion auf Stimulationen mit ±10 V - ±30 V. Auf Stimulationen mit mehr als ±40 V reagiert die Zelle deutlich. B) In dem Diagramm ist das Verhältnis der Antworten auf die verschiedenen Stimulationen zu der Antwort auf die erste Stimulation mit ±50 V dargestellt. Die Zellen antworten erst auf Stimulationsspannungen von mindestens ±40 V. Der gepaarte t-Test zeigt eine signifikante Abnahme (n=10) der Reaktionsamplituden der späteren Versuche im Vergleich zu der ersten Stimulation, auch wenn mit der gleichen Spannung stimuliert wird. Dieser Effekt tritt bei 80 Pulsen, nicht aber bei 10 Pulsen auf.
Abbildung 10: Kalziumantworten einer Bergmann Gliazelle bei elektrischer Stimulation mit 10 Pulsen bei verschiedenen Frequenzen. A) In den Kalziumspuren zeigt sich keine Antwort bei 1 Hz, aber schon bei 5 Hz ist mehr als die volle Amplitude der Bezugsmessung erreicht. Darüberhinaus zeigen die Spuren, daß ein zeitlicher Zusammenhang zwischen der Dauer der Stimulation und der zeitlichen Länge der Antwort besteht. Je länger stimuliert wird, desto länger fällt die Antwort aus. B) Die Verhältnisse beziehen sich auf die Messung mit 50 Hz Stimulationsfrequenz. Das Diagramm zeigt, daß der Bereich von 5 Hz bis 100 Hz maximale Reaktionsamplituden erreicht. Der gepaarte t-Test zeigt signifikante Unterschiede zwischen der Bezugsmessung und allen weiteren Messungen außer der Stimulation mit 10 Hz. Auffällig ist ein Ausreißer bei einer Stimulationsfrequenz von 20 Hz, bei der die Signalamplitude fast verdoppelt ist.
Abbildung 11: 1 µM TTX unterbindet somatische Kalziumantworten in der Bergmann Gliazelle als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern reversibel. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Gabe von 1 µM TTX. In Gegenwart von TTX ist keine Reaktion mehr zu erkennen. Die Pfeile zeigen den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Gabe von TTX. Die Reaktion ist in Gegenwart von TTX vollständig blockiert (2.4 %) und stellt sich nach dem Auswaschen des Blockers zu nur 67.0 % wieder her. Der gepaarte t-Test (n=43) ergibt, daß sowohl die Blockade des Signals als die Wiederherstellung signifikante Effekte sind.
Abbildung 12: Kalziumfreie Lösung (0.5 mM EGTA) unterbindet somatische Kalziumantworten in der Bergmann Gliazelle als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern reversibel. A) Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation der kalziumfreien Lösung. In Gegenwart von kalziumfreier Lösung ist die Reaktion deutlich reduziert. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation von kalziumfreier Lösung. Die Reaktion ist in Gegenwart von kalziumfreier Lösung deutlich reduziert (29.8 %). Die Reaktion stellt sich nach dem Einwaschen der normalen Badlösung nahezu vollständig wieder ein (93.9 %). Der gepaarte t-Test (n=15) ergibt, daß sowohl die Blockade des Signal als die Wiederherstellung signifikante Effekte sind.
Abbildung 13: 100µM Cadmium unterbindet somatische Kalziumantworten in der Bergmann Gliazelle als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern reversibel. A) Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation von 100 µM Cadmium. In Gegenwart von kalziumfreier Lösung ist die Reaktion deutlich reduziert. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die Reaktion ist in Gegenwart von 100 µM Cadmium deutlich reduziert (28.9 %). Die Reaktion stellt sich nach dem Einwaschen der normalen Badlösung zum großen Teil wieder ein (74.0 %). Der gepaarte t-Test (n=32) ergibt, daß sowohl die Blockade des Signal als die Wiederherstellung signifikante Effekte sind.
Abbildung 14: Kalziumantwort in einem Bergmann Gliazellsoma als Antwort auf elektrische Stimulation der Parallelfasern mit entleertem endoplasmatischem Retikulum. Die Abbildung zeigt: 1. Reaktion der Zelle vor Entleerung der Speicher und Applikation von 1µM Thapsigargin 2. Zelle reagiert nicht mehr auf 100µM ATP nach Inkubation mit 1µM Thapsigargin und mehreren Applikationen von 100µM ATP 3. Die Zelle reagiert unvermindert auf elektrische Stimulation 4. Abschließende Applikation von ATP, keine Reaktion, die Speicher sind leer.
Abbildung 15: Wirkung von Prazosin auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation von 1 µM Prazosin. Prazosin ist in dieser Konzentration nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 1 µM Prazosin nahezu unverändert (95.4 %). Die Reaktion bleibt im Mittel nach dem Auswaschen des Blocker unverändert (95.5 %). Der gepaarte t-Test (n=29) kann keine signifikanten Effekte finden.
Abbildung 16: Wirkung von Prazosin auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation von 10 µM Prazosin. Die Anwesenheit von 10 µM Prazosin reduziert die stimulationsvermittelten somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen. Dieser Effekt ist aber nicht umkehrbar. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 10 µM Prazosin auf 76.9 % reduziert. Nach dem Auswaschen des Antagonisten steigt die Reaktion wieder auf 86.8 % der Kontrolle an. Der gepaarte t-Test (n=8) erkennt die Applikation des Antagonisten als signifikanten Effekt, die Erholung des Signals nach Auswaschen des Blockers ist aber nicht signifikant.
Abbildung 17: Wirkung von Chloropheniramin auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation von 10 µM Chloropheniramin. 10 µM Chloropheniramin ist nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 10 µM Chloropheniramin leicht erhöht (107.2 %). Die Reaktion bleibt im Mittel nach dem Auswaschen des Blocker unverändert (98.8 %). Der gepaarte t-Test (n=18) kann keine signifikanten Effekte finden.
Abbildung 18: Wirkung von BQ788 auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Blockers. 0.1 µM BQ788 ist nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Vor dem Antagonisten wurde der ETB-Rezeptor Agonist BQ3020 appliziert, um den Rezeptor zu desensitivieren. Der Antagonist zeigt keine erkennbare Wirkung. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation von BQ788 und BQ3020. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 0.1 µM BQ788 leicht erhöht (107.4 %). Die Reaktion reduziert sich im Mittel nach dem Auswaschen des Blocker auf 85.0 % der Kontrolle. Der gepaarte t-Test (n=14) kann keine signifikanten Effekte finden.
Abbildung 19: Wirkung von E4CPG auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Blockers. 100 µM E4CPG ist nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 100 µM E4CPG leicht erhöht (106.4 %). Die Reaktion bleibt im Mittel nach dem Auswaschen des Blockers unverändert (108.9 %). Der gepaarte t-Test (n=10) weist keinen signifikanten Effekt nach.
Abbildung 20: Wirkung von AIDA auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach des Blockers. 100 µM AIDA bewirkt eine Reduktion der somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 100 µM AIDA deutlich auf 77.7 % verringert. Die Reaktion kann nach dem Auswaschen des Blocker nahezu unverändert (98.2 %) reproduziert werden. Der gepaarte t-Test (n=9) erkennt einen signifikanten Unterschied sowohl im Verhältnis der Reaktion vor und während, als auch im Verhältnis während und nach Applikation des Blockers.
Abbildung 21: Wirkung von CPCCO auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Blockers. 100 µM CPCCO ist nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 100 µM CPCCO auf 92.7 % reduziert. Die Reaktion bleibt im Mittel auch nach dem Auswaschen des Blockers unverändert (98.2 %). Der gepaarte t-Test (n=7) weist keinen signifikanten Effekt nach.
Abbildung 22: Applikation eines Cocktails von Antagonisten für metabotrope Glutamatrezeptoren auf Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen bei elektrischer Stimulation A) Der Cocktail verschiedener Antagonisten, spezifisch für metabotrope Glutamatrezeptoren, bestehend aus 100 µM E4CPG, 100 µM AIDA und 100µM PhCCC, ist nicht effektiv, um somatische Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation der Parallelfasern zu unterdrücken. Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Cocktails. Die Applikation läßt keine Wirkung erkennen. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation der Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude bleibt in Gegenwart des Cocktails nahezu gleich (95.6 %). Nach dem Auswaschen des Blockers reduziert sich die maximale Reaktionsamplitude im Mittel auf 82.9 %. Der gepaarte t-Test (n=17) erkennt keinen signifikanten Unterschied im Vergleich von Blocker und Kontrolle oder im Vergleich von Gegenwart des Blockers und der Stimulation nach dem Auswaschen des Blockers.
Abbildung 23: . Wirkung von CNQX auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Blockers. Die Applikation läßt in der Spur keine sichtbare Wirkung erkennen. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 20 µM CNQX deutlich auf 76.3 % verringert. Die Reaktion kann nach dem Auswaschen des Blockers nur reduziert (81.9 %) reproduziert werden. Der gepaarte t-Test (n=48) erkennt einen signifikanten Unterschied sowohl im Verhältnis der Reaktion vor und während, als auch im Verhältnis während und nach Applikation des Blockers.
Abbildung 24: Wirkung von 1-PDC auf die somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation. A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation von 100 µM l-PDC. Die Applikation läßt in der Spur keine sichtbare Wirkung erkennen. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 100 µM l-PDC deutlich auf 80.0 % verringert. Der blockierte Anteil der Reaktion kann nach dem Auswaschen des Blockers nicht wieder (81.3 %) reproduziert werden. Der gepaarte t-Test (n=23) erkennt einen signifikanten Unterschied sowohl im Verhältnis der Reaktion vor und während Applikation des Blockers. Im Verhältnis während und nach Applikation des Blockers kann der gepaarte t-Test (n=23) keinen Unterschied erkennen.
Abbildung 25: Wirkung von 1-PDC auf die Kalziumantworten von Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach des Blockers. 250 µM l-PDC bewirkt keine Änderung der somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 250 µM l-PDC mit 98.0 % der Ausgangsamplitude nahezu unverändert. Nach dem Auswaschen des Blockers fällt die mittlere Signalamplitude auf 82.0 % des Ausgangssignals ab. Der Wilcoxon-Test (n=14) erkennt in keiner der Änderungen einen signifikanten Unterschied.
Abbildung 26: Auswirkung gleichzeitiger Blockierung verschiedener glutamaterger Signalwege auf somatische Kalziumantworten auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Bergmann Gliazellen. A) Die gepunktete Linie repräsentiert den Zeitpunkt der Stimulation. a) Kontrollreaktion vor Applikation neuromodulativer Substanzen b) Letzte von 8 Applikationen von 100 µM ATP nach Gabe von 1 µM Thapsigargin für 10 min c) Stimulation bei von Kalzium entleertem endoplasmatischem Retikulum d) Applikation von 100µM l-PDC für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum (nach Protokoll II) e) Applikation von 20µM CNQX für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum (nach Protokoll I) f) Applikation von 20 µM CNQX und 100 µM l-PDC für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum g) Nach 10 min Auswaschen von CNQX und l-PDC B) Statistische Auswertung: die Buchstaben c-g repräsentieren Stimulationen, die zu denen im Schema (s. C) angegeben Zeitpunkten durchgeführt wurden. c) Stimulation bei entleertem endoplasmatischem Retikulum d) Applikation von 100µM l-PDC für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum (nach Protokoll II) e) Applikation von 20 µM CNQX für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum (nach Protokoll I) f) Applikation von 100 µM l-PDC und 20 µM CNQX für 10 min bei entleertem endoplasmatischem Retikulum (beide Protokolle) g) Reaktion 10 min nach dem Auswaschen aller Blocker C) Applikationsschemata: I: erst CNQX, dann l-PDC, II: erst l-PDC, dann CNQX
Abbildung 27: Wirkung von 4-AP auf Kalziumsignale in Bergmann Gliazellen als Antwort auf elektrische Stimulation A) Die Kalziumspuren zeigen die Reaktion einer Zelle vor, während und nach Applikation des Blockers. 500 µM 4-AP bewirkt erhebliche Erhöhung der somatischen Kalziumantworten in Bergmann Gliazellen auf elektrische Stimulation. Die Kalziumantwort vergrößert sich in der Amplitude und verlängert sich. Nach einen schnellen Anstieg kommt es zu einem exponentiellen Abfall. Die gesamte Reaktion dehnt sich auf über 20 sec aus. Der Pfeil zeigt den Moment der Stimulation. B) Das Diagramm zeigt die Signalamplitude im Verhältnis zur Kontrollmessung vor Applikation des Antagonisten. Die mittlere Reaktionsamplitude ist in Gegenwart von 500 µM 4-AP auf 420.7 % der Ausgangsamplitude vergrößert. Nach dem Auswaschen des Blockers fällt die mittlere Signalamplitude auf 144.6 % des Ausgangssignals ab. Der Wilcoxon-Test (n=11) erkennt der Änderung des Ausgangssignals zum Signal in Gegenwart von 4-AP einen signifikanten Unterschied. Der Effekt ist nach dem Mann-Whitney-Test (n=11 in Gegenwart des Blockers vs. n=8 nach dem Auswaschen) signifikant umkehrbar.
Abbildung 28: Kalziumantworten auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Bergmann Gliazellausläufern. Das Bild zeigt eine späte, proximale Reaktion auf zehn Pulse. Der distale Teil des Ausläufers ist nicht betroffen.
Abbildung 29: Kalziumantworten auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Bergmann Gliazellausläufern. Das Bild zeigt eine frühe, medial gelegene Reaktion auf zehn Pulse. Der distale und proximale Teil des Ausläufers sind nicht betroffen.
Abbildung 30: Kalziumantworten auf elektrische Stimulation der Parallelfasern in Bergmann Gliazellausläufern. Das Bild zeigt eine frühe Reaktion auf zehn Pulse, die im gesamten Ausläufer stattfindet.

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Thu Sep 19 11:06:18 2002