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1  Einleitung

1.1 Das Akute Respiratorische Distress-Syndrom (ARDS)

1967 beschrieben Ashbaugh et al. das Auftreten einer akuten respiratorischen Insuffizienz ohne kardiale oder pulmonale Primärerkrankung (3). Mittlerweile wird ein akutes nicht-kardiales Lungenödem nach extrapulmonalen Ereignissen unter dem Namen Akutes Respiratorisches Distress-Syndrom (ARDS) zusammengefasst und stellt ein persistierendes intensivmedizinisches Problem dar (37, 153). Die Letalität des ARDS liegt trotz intensiver Forschung und differenzierter Therapie bei etwa 60 % (37, 109, 150, 153). Ein ARDS kann auch bei bisher Lungengesunden als Folge eines massiven extrapulmonalen Prozesses auftreten, z.B. nach Sepsis, Polytrauma, hochgradigen Verbrennungen oder Schock. Ebenso können gravierende pulmonale Reize, z.B. Aspiration oder Pneumonie, das akute Krankheitsbild auslösen (37, 133). Die dem ARDS zugrundeliegenden Ereignisse führen zu einer Freisetzung von potenten inflammatorischen Entzündungsmediatoren. In Folge kommt es zu einer akuten pulmonalen Hypertension sowie zu einer Störung der endothelialen und epithelialen Schrankenfunktion der Lunge (37, 109, 150). Die vaskulär-endotheliale Permeabilität nimmt zu und es entwickelt sich ein zunächst interstitielles, später alveoläres Lungenödem bei normalen linksatrialen Druckwerten („non-cardiogenic pulmonary edema“). Nach dem Verlust der alveolo-epithelialen Barrierefunktion entsteht ein proteinreiches alveoläres Lungeninfiltrat, das zur Schädigung der Typ II-Pneumozyten beiträgt und zu einer Behinderung des Surfactantsystems führt (3, 133). Durch die Verminderung der Surfactantproduktion entstehen im weiteren Verlauf Mikroatelektasen, die eine Vergrößerung des Shunt-Volumens bewirken und in eine akute pulmonale Hypertension münden. Insgesamt resultiert aus diesen Veränderungen eine massive Verringerung der Gasaustauschfläche. Der Wirkungsgrad der Ventilation wird erheblich einschränkt. Dies führt meist zu einer schweren globalen respiratorischen Insuffizienz (37, 121). Eine schwere Hypoxämie [Seite 2↓] sowie die zunehmende Erschöpfung des Patienten machen häufig die kontrollierte Beatmung mit einem hohem positiven endexpiratorischen Druck (PEEP) und hoher Sauerstoffkonzentration erforderlich. Überlebt der Patient die akute Phase, kann sich eine proliferativ-fibrosierende Spätphase anschließen, die zu einem bindegewebigen Umbau der Gasaustauschfläche mit bleibender Beeinträchtigung der Lungenfunktion führt (37, 150, 153).

Für die Entstehung einer endothelialen Schrankenstörung mit Zunahme der Permeabilität spielt das pulmonal-endotheliale Zytoskelett eine wichtige Rolle (116, 123, 124, 139). Es setzt sich aus drei filamentären Polymeren zusammen: dem F-Aktin [Mikrofilamente (MF)], dem Mikrotubulussystem (MT) und den Intermediärfilamenten (IF). Diese drei Filamenttypen formen im Zusammenspiel mit spezifischen Bindeproteinen ein dynamisches 3-dimensionales Netzwerk, das der Zelle eine spezifische Form verleiht und auch zu Formveränderungen beitragen kann (41).

1.2 Pulmonale Endothelzellen

Vaskuläre Endothelzellen (EC) bilden einen kontinuierlichen Monolayer, welcher die innere Oberfläche (Intima) des gesamten vaskulären Gefäßsystems auskleidet. Haupaufgabe dieses Zellverbandes ist die Regulation der Barrierefunktion zwischen Blut und Interstitium (1, 21, 124). Aufgrund seiner anatomischen Lokalisation ist der Endothelzellverband permanent hämodynamischen Belastungen ausgesetzt, die durch Blutfluss, Blutdruck und Gefäßwandausdehnung entstehen. Die Funktion als eingeschränkt durchlässiges System und Barriere zwischen Blut und Interstitium (semipermeable Barriere) setzt die strukturelle innere Integrität des Endothelzell-Monolayers voraus. Dieser muss gegenüber wechselnder hämodynamischer Belastung und einer Vielzahl zusätzlich widriger Bedingungen wie beispielsweise Ischämie, Hypoxie oder Exposition gegenüber bakteriellen und zellulären Toxinen anpassungsfähig sein (21, 135, 138). Darüber hinaus reagiert das Endothel auf [Seite 3↓] Gefäßverletzungen mit einem spezifischen Reparaturmechanismus in Form von Angiogenese und Reendothelialisation (1, 21). Viele dieser notwendigen Fähigkeiten des EC-Monolayers erfordern aktive Veränderungen der Zellform und gleichzeitige Anpassung der inneren isometrischen Kräfte. Viele Studien zu diesem Thema belegen, dass ein Aktin- und Myosin-gesteuertes kontraktiles Zytoskelett für aktive zelluläre Formveränderungen mitverantwortlich ist (21, 74, 116, 137). Neuere Arbeiten zeigen, dass auch dem Mikrotubulussystem in der Regulation kontraktiler Prozesse eine wichtige Funktion zukommt (57, 63, 104, 159).

1.3 Das Aktinfilamentsystem

In Skelettmuskelzellen, der Herzmuskulatur und in den glatten Muskelzellen führen Aktinfilamente im kontrollierten Zusammenspiel mit Myosin zu einem geordneten Kontraktionsablauf. In vielen Eukaryontenzellen ist Aktin mit 5% das häufigste Zellprotein (1). In Endothelzellen ist der Anteil dieses Proteins mit 10,1% höher als im Vergleich zu den meisten anderen Nichtmuskelzellen (21, 45). Myosin ist in Verbindung mit Mikrofilamenten die aktiv-kraftauslösende Komponente. Nach Phosphorylierung der leichten Ketten des Myosinproteins beispielsweise durch die Myosinleichtkettenkinase wird in Gegenwart von Ca2+ und Calmodulin die Kontraktion in Verbindung mit F-Aktin reguliert (1, 73, 116). In ruhenden Endothelzellen findet sich der Hauptanteil des filamentären Aktins in der Zellperipherie. In engem Kontakt zur Zellmembran bildet es dort ein dichtes Netzwerk („peripheral dense band"), das der Zelle mechanische Stabilität verleiht und über spezifische Bindeproteine Kontakte zu Nachbarzellen und zur extrazellulären Matrix aufrechthält (1, 41, 74, 156).


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1.3.1  Aufbau des Aktinfilamentsystems

Aktinfilamente (F-Aktin) bestehen aus polymerisierten Aktinmonomeren (G-Aktin). Mit einem Durchmesser von ca. 7 nm stellen sie die dünnste filamentäre Struktur des Zytoskeletts dar und werden daher auch als Mikrofilamente (MF) bezeichnet. Aktinfilamente sind dynamische Strukturen, d.h. sie sind in einem permanenten Auf- und Abbau. Es können drei Gruppen filamentären Aktins in Endothelzellen unterschieden werden, die unterschiedliche zelluläre Aufgaben erfüllen (vgl. Kap. 1.3.3): 1. F-Aktinnetz des Zellkortex, 2. F-Aktin des Adhäsionsgürtels und der Fokalkontakte, 3. F-Aktin der Stressfasern. Die unterschiedlichen Aufgaben werden über eine große Anzahl Aktin-bindender Proteine gesteuert (vgl. Kap. 1.3.2).

Filamentäres Aktin entsteht durch Polymerisation von glomerulären Aktinmolekülen (G-Aktin) (99, 123, 126). G-Aktinmoleküle liegen als Monomere im Zytoplasma vor. An jedes G-Aktinmonomer sind ein Ca2+- und ein ATP-Molekül gebunden. Sie können sich sehr schnell zusammenlagern und wieder trennen (110, 126). Die Anlagerung an das sog. „barbed" Ende eines Aktinfilaments (s.u.) erfolgt durch Hydrolyse von ATP zu ADP. Der erste Schritt zur Polymerisation verläuft durch Bildung eines Dimers aus zwei G-Aktinmonomeren und anschließender Verknüpfung zu einem Trimer (Nukleation) (1, 64, 99). Die weitere Verlängerung (Elongation) zu einem Polymerfaden vollzieht sich mit zunehmender Wachstumsgeschwindigkeit, die ein konstantes Polymerisationsplateau entwickelt, wenn eine kritische Konzentration an Aktinmonomeren erreicht ist (1, 11, 64). Aktinfilamente besitzen eine strukturelle Polarität, d.h. obwohl grundsätzlich beide Enden zur Polymerisation imstande sind, besteht jeweils eine unterschiedliche Polymerisationskinetik und eine entsprechend unterschiedliche kritische Konzentration der beiden Filament-Enden. Am „barbed" Ende (Plus-Ende) polymerisieren die monomeren Aktinmoleküle bei einer niedrigeren G-Aktin-Konzentration als am „pointed" Ende (Minus-Ende) (1, 11, 73). Da die G-Aktin-Konzentration unter physiologischen Voraussetzungen zwischen den kritischen Konzentrationen im Bereich der beiden Filamentenden liegt, führt dies am „barbed" [Seite 5↓] Ende zur Polymerisation und am „pointed" Ende zu Abdissoziation. Dabei herrscht ein Fließgleichgewicht, an dem im gleichen Maße Aktinmonomere an einem Ende angelagert und am anderen Ende abgespalten werden (siehe Schema 1), so dass das Nettowachstum der Filamente gleich Null ist. Dieser Vorgang wird als „Treadmilling“ bezeichnet (1, 11, 64, 99, 123).

Schema 1: Modellvorstellung des F-Aktin-Gleichgewichtes. Durch Anlagerung von G-Aktin-Molekülen am „barbed end" und Abdissoziation am „pointed end" des Aktinfilaments entsteht ein dynamisches Gleichgewicht.

1.3.2 F-Aktin-assoziierte Proteine

Tatsächlich ist diese Modellvorstellung des Schema 1 sehr vereinfachend, denn es existieren eine Reihe Aktin-bindender Proteine, die den dynamischen Umsatz des Aktins kontrollieren können und unter anderem Lage und Länge, Aktivierung und Abbruch der Aktinpolymerisation bestimmen (1, 73, 101, 123). So konnten in


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Untersuchungen unterschiedlichen F-Aktin-assoziierten Proteinen spezifische Funktionen zugeordnet werden. Zum Beispiel führte das Protein Profilin durch Bindung von G-Aktinmonomeren zu einer Aktivierung der Polymerisation neuer Aktinfilamente. Sogenannte Capping-Proteine, wie das Ca2+-abhängige Gelsolin, konnten Aktinfilamente durchtrennen und sich anschließend selektiv an das „barbed" Ende des Filamentbruchstücks binden. Auf diese Weise wurde eine weitere Anlagerung von G-Aktinmonomeren gehemmt (1, 5, 30, 123). Tropomyosin schützte dagegen die Filamente durch Längsstabilisierung vor Fragmentierung und modulierte die Aktin-Myosin-Interaktion (1, 123, 130). Mitglieder der Myosin-Superfamilie wurden als molekulare Transporter beschrieben, die Lasten über die MF-Oberfläche transportieren können. Ferner bilden Myosinmoleküle in Verbindung mit Aktinfilamenten zelluläre kontraktile Einheiten (1, 5, 67, 116). Einer anderen Gruppe von Aktin-assoziierten Proteinen, Filamin und Spectrin, konnten zwei F-Aktin-Bindungsstellen nachgewiesen werden, die durch Quervernetzung (cross-linking) von Mikrofilamenten die Bildung von intrazellulären gelartigen Netzwerken ermöglichen. Die F-Aktin-assoziierten Proteine Fimbrin und α— Actinin führten zu einer Bündelung von parallel angeordneten Aktinfilamenten (1, 5, 130).

1.3.3 Funktion des F-Aktin-Systems

1.3.3.1 Zellkortex und Mikrofilamente

In Endothelzellen bilden Aktinfilamente mit den filamentären Hauptkomponenten Myosin und Fodrin (analog des erythrozytären Spectrin) in der Zellperipherie in engem Kontakt mit der Plasmamembran ein dichtes Netzwerk, den Zellkortex. Beobachtungen an Endothel- und Nichtendothelzellen zufolge trägt der Zellkortex u. a. zur mechanischen Stabilisierung der Zelle bei, beteiligt sich an der Umformung der Plasmamembran und steuert die Prozesse der Endo- und Exocytose (21, 41, 156).


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1.3.3.2  Junktionale F-Aktin-Verbindungen

Junktionale Aktinfilamente dehnen sich mehr oder weniger kontinuierlich über die gesamte Peripherie der EC aus und werden häufig als „peripheral dense band" bezeichnet. Vielen Studien zufolge sind solche Mikrofilamente erheblich an der Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des Endothelzellverbandes beteiligt (2, 21, 24, 74, 116). Durch verschiedene Bindeproteine (z. B. α -Actinin, Vinculin, Talin und Fibronectin-Rezeptor) bestehen indirekte lokale Verknüpfungspunkte zwischen intrazellulären Mikrofilamenten und der extrazellulären Matrix (Fokalkontakte) bzw. den benachbarten Endothelzellen (Adhäsionsgürtel) (1, 6, 21, 74). Depolymerisation von Aktinfilamenten (z.B. durch Cytochalsin D, Botulinum C2-Tox.) führten zur interzellulären Lückenbildung (Gaps) einhergehend mit einer ausgeprägten Barrierestörung des Endothels (24, 139), während Stabilisierung der MF durch Phalloidin den Monolayer geschlossen hielt (2, 21, 24). Eine Permeabilitätszunahme konnte auch durch Hemmung der kleinen GTP-bindenden Rho-Proteine beobachtet werden. Die Inkubation mit Clostridium difficile Toxin B-10463 führte über Glykosylierung an Threonin 37 zu einer Hemmung der Rho-Proteine, was einen Verlust von Aktinfilamenten bewirkte. Vorinkubation mit Phalloidin führte zu keiner Permeabilitätszunahme (51). Diese Beobachtungen zeigten, dass junktionale Aktinfilamente eine Stützfunktion der Adhäsionsverbindungen ausüben und daher anteilig die Barrierefunktion der Endothelzelllayer und den parazellulären Austausch von Lösungen und Makromolekülen regulieren.

1.3.3.3 Mikrofilamentäre Stressfasern

Mikrofilamentäre Stressfasern (SF) ähneln in ihrem Aufbau den Sarkomeren der Muskulatur. Ihre Hauptkomponente besteht aus dicht gebündeltem F-Aktin. Zusätzlich enthalten SF Myosinfilamente sowie weitere Proteine wie α -Actinin, Tropomyosin, Myosinleichtkettenkinase, Caldesmon und Vinculin (12, 21, 67). SF [Seite 8↓] wird eine protektive Funktion innerhalb von EC und Endothelmonolayer gegenüber Verletzungen durch erhöhte Scherkräfte zugesprochen (10, 21, 22, 25, 29, 156). In EC wurde vermehrte Stressfaserbildung insbesondere in solchen Bereichen beobachtet, die strömungsbedingten Scherkräften ausgesetzt waren (21, 29, 41, 156). SF sind häufig nahe der oberflächlichen Plasmamembran lokalisiert und reichen mit ihren Enden in Bereiche der Plasmamembran, die mit der extrazellulären Matrix (Fokalkontakte) eng verbunden sind. Die Fähigkeit zur Kontraktion und die Verbindung mit Fokalkontakten innerhalb der Plasmamembran ermöglicht es SF nach aussen gerichteten Zugkräften entgegen zu wirken und die Zelle vor Verletzungen zu schützen (5, 12, 22, 25, 29, 133, 156). F-Aktinverlust durch Doxorubicin und Cytochalasin D zeigte einen signifikanten Rückgang des Widerstandes gegenüber strömungsbedingten Scherkräfte (21). Ferner können SF im Zusammenwirken mit Myosin und der MLCK kontraktile Einheiten bilden, die zu Gap-Bildung und Permeabilitätszunahmen pulmonaler EC führen (34, 73, 116, 121, 124, 158).

1.4 Mikrotubulussystem der Zelle

1.4.1 Aufbau des Mikrotubulussystems

Mikrotubili (MT) bilden zylindrische Strukuren, die sternförmig vom paranukleär lokalisierten Zentrosom (MT-Keimbildungszentrum) in die Zellperipherie ausstrahlen. Mit einem Durchmesser von 25 nm stellt dieses System den dicksten zytoskelettären Filamenttyp (1, 72, 75). Ein Mikrotubulus setzt sich aus 13 Protofilamenten zusammen, die jeweils aus einer Folge von polymerisierten Dimeren aufgebaut sind. Ein Dimer besteht aus zwei ähnlich strukturierten globulären Proteinen, dem α - und β -Tubulin (77, 78). Eukaryonte Zellen besitzen verschiedene Isoformen von α— und β— Tubulin. Zusätzlich sind im Zentrosom γ -Tubuline lokalisiert. γ -Tubuline werden als Ausgangspunkt des Wachstums der mikrotubulären Filamente beschrieben (77, 78, 85, 87, 160). Alle Protofilamente sind parallel und mit der gleichen α/β— Ausrichtung [Seite 9↓] aneinander gelagert. Durch diese Anordnung der Protofilamente erhält jedes Mikrotubulusfilament eine Polarität mit einem „Plus-Ende" und einem „Minus-Ende" (1, 72, 81). Jedes Plus-Ende zeigt vom Zellkern in Richtung Zellmembran, während das Minus-Ende in die entgegengesetzte Richtung weist und im Zentrosom verankert ist.

Schema 2: Schematische Darstellung der Polymerisation und der Depolymerisation von MT-Systemen. GTP-gebundene Tubulin-Dimere lagern sich vornehmlich an die Plus-Enden existierender MT an. Nach dem Einbau erfolgt die GTP-Hydrolyse zu GDP. MT, die eine GTP-Kappe tragen, sind stabiler und können weitere GTP-Tubuline anlagern. MT, die eine GDP-Kappe tragen, sind instabiler und können rasch depolymerisieren.

Die Polymerisation am Plus-Ende von Mikrotubulusfilamenten erfolgt unter Aggregation von globulären Tubulinuntereinheiten bei GTP-GDP-Nukleotid-Hydrolyse. Schnelles Filamentwachstum führt zu einer „GTP-Kappe", die eine höhere Affinität zu Tubulin-Untereinheiten besitzt als GDP. Dies führt zur beschleunigten Anlagerung weiterer Tubulinmoleküle und zum schnelleren Wachstum des Filamentes (72, 77, 78, 84, 85). Umgekehrt hat ein langsames Filamentwachstum den Verlust der


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GTP-Kappe zur Folge. Da GDP-Tubuline eine niedrige Affinität zu Tubulinuntereinheiten besitzen und leichter vom Mikrotubulusfilament abdissoziieren, verliert das Mikrotubulusende mit GDP-Kappe schneller Untereinheiten. Eine beschleunigte Depolymerisation ist die Folge, was wiederum zu einem rasanten Zerfall der Mikrotubulusfasern führt (1, 69, 78, 85). Man bezeichnet diese charakteristische Mikrotubuluskinetik als „dynamische Instabilität" (1, 32, 72, 77, 84, 125). Es wird vermutet, dass die dynamische Instabilität das MT-System dazu befähigt spezielle Bereiche in der Zellmembran „zu suchen und einzufangen“ (32). Stetiges Wachstum oder rasanter Zerfall bewirken, dass sich die Ausrichtung der vom Zentrosom aus wachsenden Mikrotubulussysteme in der Zelle ständig ändern kann. Um den raschen Abbau eines wachsenden Mikrotubulus zu hemmen, kann das schnell wachsende Plus-Ende des Filaments durch Capping-Proteine fixiert werden (84). An prädisponierten Stellen innerhalb der Zelle (1, 32), beispielsweise an der Zellmembran, kann durch Verknüpfung des Mikrotubulus-Filamentendes eine Fixierung und Stabilisierung des Mikrotubulus bewirkt werden (vgl. Schema 3).


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Schema 3: Modellvorstellung zur selektiven Stabilisierung von Mikrotubuli. Durch das Fixieren der schnellwachsenden mikrotubulären Plus-Enden (grün dargestellt) an prädisponierten Stellen in der Zellmembran durch Capping-Proteine werden die mikrotubulären Filamente stabilisiert (schwarz dargestellt), und die Zelle wird von einer unpolarisierten (A) in eine polarisierte Form (B) überführt. Auswachsende Mikrotubuli, die nicht stabilisiert wurden, werden instabil (dynamische Instabilität) und zerfallen in Tubulineinzelmoleküle (rot-gestrichelt dargestellt).

Auf diese Weise kann von bestimmten Zellstrukturen, zum Beispiel Capping-Proteinen der Zellmembran, eine Art selektive Auswahl von Mikrotubuli erfolgen. In neusten Studien wird ein Protein der CLIP-Gruppe (cytoplasmatic linker protein) beschrieben, welches auf dem wachsenden MT-Plus-Ende akkumuliert und als „MT-Fänger“ spezielle kortikale Regionen erkennen kann (32). Die molekulare Verbindung zwischen Plus-Ende und Zellkortex ist derzeit noch unklar, jedoch könnte nach


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Fukata et al. eine Komplexverbindung zwischen CLIP-170 und den aktivierten GTPasen Cdc42 und Rac1 im Aktinkortex entstehen (32). Es konnte gezeigt werden, dass Cdc42 und Rac1 das Plus-Ende der MT im Zellkortex einfangen konnten (32). Diesen kleinen GTPasen wird eine Schlüsselfunktion in der Regulation der Zellpolarität zugesprochen (32, 47). Durch die Lageänderung von Mikrotubuli innerhalb der Zelle kann die Ausrichtung von Zellorganellen neu strukturiert und die Zellpolarität verändert werden (1, 32, 75). Dieser Vorgang ist essentiell bei polarisierten zellulären Prozessen, wie z.B. bei gerichteten Zellbewegungen, Aufstellung der mitotischen Spindel oder Ausrichtung von T-Zellen zum Antigen (1, 32, 40, 84).

1.4.2 Mikrotubulus-assoziierte Proteine

Zur Ausbildung und Organisation der Mikrotubulusstruktur in Zellen tragen eine Vielzahl von MT-assoziierten-Proteinen (MaP) bei (1, 72, 90). MaPs regulieren den Transport membrangebundener Vesikel in antero- oder retrograder Richtung über die als Leitschienen fungierenden MT-Filamente (108, 113, 131). MaPs sind an der Verbindung von Mikrotubuli und zytoplasmatischen Organellen beteiligt (108). Ferner initiieren die Proteine Tubulin-Polymerisation und stabilisieren MT-Systeme (46, 75, 113). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass MaPs bei der mikrotubulären Verbindung mit Intermediärfilamenten (7, 103, 113) und Mikrofilamenten beteiligt sind (18, 44, 113) und zur Ausbildung der dynamischen 3-dimensionalen Form des Zytoskeletts beitragen (1, 56, 108, 113). Man unterscheidet zwei Hauptgruppen von Mikrotubulus-assoziierten Proteinen: die strukturellen und die dynamischen MaPs (72, 77). Zu den strukturellen MaPs zählen die Hochmolekularproteine MaP1 und MaP2 und die niedermolekularen Tau-Proteine, die zur Polymerisation von Tubulinmolekülen und zur Stabilisierung der Mikrotubulusstruktur beitragen (75, 90, 113). Zu den dynamischen MaP-Familien gehören die Motorproteingruppen Kinesine und Dyneine. Dabei handelt es sich um Proteine, die als „Carrier" spezifisch an MT [Seite 13↓] binden. Ihre wesentliche Aufgabe besteht im zytoplasmatischen Membranverkehr, Endo- und Exocytose und der Organellenausrichtung (108, 117, 147). Die Endeckung von Kinesin durch Vale 1985 und Dynein von Paschal 1987 als Kraft erzeugende dynamische Mikrotubulus-assoziierte Proteine führte erstmalig zu der Hypothese, dass Motor-Proteine Zellkomponenten entlang der Mikrotubuli bewegen können (117). Dabei zeigte sich, dass Kinesin membrangebundene Vesikel in Richtung der Zellmembran (Plus-Ende) der Mikrotubulusstränge und Dynein in die entgegengesetzte Richtung zum Minus-Ende ziehen (68, 72, 78, 117, 146, 147, 148). Für die gezielte und spezifische Aktivierung der Motorproteine Kinesin und Dynein, die membrangebundene Komponenten entlang der Mikrotubuli bewegen, wurden weitere Proteine gefunden (95, 96). Schroer et al. (118) identifizierten spezifische lösliche Faktoren „Aktivatoren I-II" für die Ingangsetzung des Motorprotein Dynein. Andere Hauptkomponenten solcher dynamischer Komplexe wurden als p150 glued (54) und Dynactin (36, 39) beschrieben. Eine Reihe von „cytoplasmic linker proteins" (CLIPs) scheint in die Bindung endozytischer Vesikel an Mikrotubuli (96) und in die Komplexbildung zwischen MT und Zellkortex im Rahmen der Zellpolarisation (32) involviert zu sein.

1.4.3 Funktion des Mikrotubulus-Systems

Mikrotubulus-Systeme spielen eine wesentliche Rolle bei der inneren und äußeren Organisation eukaryontischer Zellen (1, 72). Als Komponente des dreidimensionalen zytoskelettären Netzwerkes filamentärer Strukturen sind MT am Aufbau und Erhalt der Zellform und Zellpolarität beteiligt (57, 75, 91). Innerhalb zellulärer Austauschprozesse wie Sekretion, Endozytose und Transzytose liefert dieser Filamenttyp die Basis für gezielten Transport zytoplasmatischer Bestandteile (71, 108, 147). Durch die langen und steifen Röhren, die sich zellkernnah in die Peripherie erstrecken und von prädisponierten Capping-Proteinen in der Zellmembran fixiert werden können, entsteht ein stabiles, flexibles und effektives Leit- und [Seite 14↓] Transportsystem. Entlang dieser dynamischen „Schienen" werden gleichzeitig Klassen unterschiedlicher Organellen (z.B. Endosomen, Lysosomen, Mitochondrien, variierende Typen von sekretorischen Vesikeln) geführt und mit Hilfe von Motorproteinen in anterograde oder retrograde Zielrichtungen bewegt und positioniert (48, 71, 75, 80, 94, 131). Eine der Hauptfunktionen von MT-Systemen besteht in der Aufrechterhaltung der strukturellen Stabilität von Zytoskelett und Zellform (35, 56, 91). MT beeinflussen die Zellpolarität einer Zelle (1, 32, 75) und sind durch die Ausrichtung der Zellorganellen und die Ausspannung der Intermediärfilamente in die Veränderung bzw. Regulation der Zellform involviert (35, 91). Durch die spezifische Polymerisationskinetik der steifen MT-Röhren (dynamische Instabilität) können nach außen gerichtete Zugkräfte der Zellwand aufgebaut werden, wodurch einwärts gerichteten Kräften des Aktin-Zytoskeletts entgegengewirkt werden kann (19, 20, 56, 59). MT-Systeme scheinen darüber hinaus an der Regulation und Koordination von Zellbewegungen beteiligt zu sein. MT-depolymerisierende Substanzen zeigten in Experimenten mit Fibroblasten eine deutliche Kontraktilitätszunahme, den Verlust der Zielbewegungsrichtung und die Aufhebung der Zellpolarität (33, 57, 149). Die Applikation von Colcemid führte bei Untersuchung mit Nerven-Wachstums-Kegeln zu einer signifikanten Retraktion (20, 59). Studien Enemotos zufolge können MT zu einer Integration unkoordinierter F-Aktindynamik in koordinierte und direktionale Bewegungsabläufe führen (23). So zeigte der Einsatz depolymerisierender Substanzen in mehreren Studien mit Fibroblasten unkoordinierte Bewegungsabläufe. Darüber hinaus stellte sich nach MT-Depolymerisation neben unkoordinierten Zellmotilitätszunahmen eine Ausreifung fokaler Adhäsionen kombiniert mit Stressfaserbildung heraus (6, 23, 70, 97). Eine weitere wichtige Funktion von MT-Strukturen scheint daher in der Koordination und Regulation von Zell/Zell- und Zell/Matrixverbindungen zu bestehen. Rinnerthaler et al. zufolge sind freie MT-Enden mit fokalen Adhäsionen verknüpft und beeinflussen und beschleunigen die fokale Kontaktentwicklung (105). Eine wichtige Bedeutung scheint in diesem Zusammenhang den kleinen GTP-bindenden Rho-Proteinen zuzukommen, die ihrerseits fokale Adhäsionen, Stressfaser-Bildung und [Seite 15↓] Zellkontraktilität induzieren können (63, 70, 106). Vorinkubation mit Rho-Kinase-Inhibitoren vor MT-Zerstörung zeigten abgeschwächte Effekte bezüglich der Ausbildung von fokalen Adhäsionen und Stressfasern. Die Resultate führten zu dem Schluss, dass MT-Systeme über Rho-Kinase-Signalwege und MLC-Phosphorylierung eine regulatorische Funktion auf aktomyosin-basierende Kontraktion, Stressfaser- und Fokalkontakt-Bildung ausüben (63, 70, 106, 159).

Die unterschiedlichen Funktionen von MT-Systemen wie Zellformerhaltung, Transportfunktion, Zellbewegungen und Koordination von Zell-Zell- und Zell-Matrixverbindungen legen die Vermutung nahe, dass MT auch zur Aufrechterhaltung der endothelialen Barrierefunktion beitragen. Neuere Untersuchungen von Verin et al. zeigten anhand elektrischer transendothelialer Widerstandsmessungen eine direkte Korrelation zwischen der MT-Depolymerisation und endothelialer Barrierefunktionsstörung (151).

1.5 Interaktionen von Mikrotubulus- und Aktinfilament-Systemen

Das Verständnis der Funktion des Zytoskeletts in Zellen und Geweben erschließt sich nach Einschätzung Ingbers nur teilweise durch die isolierte Analyse von Einzelsubstanzen, sondern vielmehr durch das globale Verständnis ihrer gegenseitigen Verknüpfung (56). MT-Interaktionen mit Intermediärfilamenten (7, 103) und mit Mikrofilamenten (18, 44, 113) konnten beschrieben werden. MT und MF bilden auf der Basis von inneren Zugspannungen und Druckkräften Komponenten einer ausbalancierten „höheren molekularen Architektur" (56). Trotz unterschiedlicher Grundfunktionen, unterschiedlicher molekularer Zusammensetzung und differierender zellulärer Lokalisation scheinen die zytoskelettären Systeme miteinnander verwoben zu sein und in mancherlei Hinsicht zu kooperieren. 1978 konnten die Interaktionen zwischen Mikrotubulus- und Aktinfilamentsystemen von Griffith und Pollard biochemisch belegt werden (43, 44, 122). Sie zeigten, dass Mixturen von gereinigten [Seite 16↓] Aktin- und Mikrotubulusfilamenten eine höhere Viskosität aufwiesen als die individuellen Komponenten. Den filamentassoziierten Proteinen wurde in diesem Zusammenhang als Interaktionskomponente eine wesentliche Funktion zugesprochen. MT-assoziierte Proteine (MaP) können mit Aktinfilamenten Verbindungenen eingehen, Kreuzbrücken aufbauen und Aktinfilamente bündeln (18, 19, 113). Es konnte gezeigt werden, dass in vitro Interaktionen von MaPs und Aktinfilamenten durch Phosphorylierung der MaPs reguliert wurden (86, 113, 122). Darüber hinaus zeigten Cross et al., dass Tau-Proteine neben ihrer stabilisierenden Interaktion mit MT-Oberflächen ebenso an mikrofilamentäre Stressfasern binden konnten (18). Die Feststellung, dass Mixturen von MaP, Aktin- und MT-Filamenten gelartige Netzwerke bilden, führte zu der Vermutung, dass MaPs mindestens zwei Bindungsregionen (Mikrotubulus/Aktin-Domäne) aufweisen müssen, die räumlich getrennt auf dem Molekül lokalisiert sind (18, 113). Interaktionen zwischen MT und MF bestehen auch innerhalb des intrazellulären Membranverkehrs. Beide Systeme verfügen über Motorproteine, die den Membrantransport entlang der Filamente regulieren. So konnte gezeigt werden, dass membranöse Vesikel sowohl über MT- als auch über Aktinfilamente geführt wurden. Dies würde eine gemeinsame Leitschienenfunktion mit gemeinsamem Aktin- (Myosin) und MT-Motorproteinen (Dynein, Kinesin) auf Vesikeloberflächen voraussetzen (39).

Filamentäre Verknüpfungsmöglichkeiten zwischen MT und MF bestehen auch im Bereich der Zell/Zell- und Zell/Matrixverbindungen. In umfangreichen Studien konnte demonstriert werden (vgl. Kap. 1.3.3.2 und Kap. 1.4.3), dass MT-Depolymerisation zu fokalen Adhäsionen, Stressfaser-Bildung und Aktomyosin-basierender Kontraktionszunahme führte. Die meisten Untersuchungen stellten ursächlich eine Aktivierung der Rho-induzierten Signalkaskade in den Vordergrund. Neuste Studien stellen in diesem Zusammenhang mit GEF-H1 ein an MT gebundenes Protein vor, welches die MT-induzierte Interaktion und Regulation mit F-Aktin steuern könnte (65). MT-Depolymerisation führte zur Freisetzung und Aktivierung von GEF-H1, wodurch die Rho-Kaskade mit aktinfilamentärer Kontraktilitätszunahme und [Seite 17↓] Stressfaserbildung in Gang gesetzt wurde. Inwieweit direkte MT-MF-Verknüpfungen in Zell/Zell- und Zell/Matrixverbindungen zur Aufrechterhaltung von Adhäsionsverbindungen und Barrierefunktion bestehen, ist derzeit noch unklar. Eine Kolokalisation zwischen MT und Stressfasern im Bereich fokaler Kontakte in Fibroblasten wurde von Rinnerthaler et al. beschrieben (105).

1.6 Endothel-Permeabilität

Endothelzellen bilden als Grenzschicht zwischen intra- und extravasalem Raum eine semipermeable Barriere, die unterschiedlichen physikalischen Einflüssen (Schubspannung, Blutdruck) ausgesetzt ist und sowohl den Austausch von im Blut gelösten Substanzen als auch die Passage korpuskulärer Elemente kontrolliert. Verschlechterung der endothelialen Barrierefunktion resultiert in vaskulären „Leakage" und interstitieller Ödembildung (21, 74, 137). Aufgrund seiner exponierten Lage kann der Endothelzellmonolayer Ziel unterschiedlicher Stimuli werden, die auf unterschiedlichen Wegen zu einer vaskulären Permeabilitäts-Zunahme führen. Inflammatorische Prozesse sind häufig Ursache parazellulärer Flüssigkeitszunahmen. Unter entzündlichen Bedingungen bilden sich als Antwort auf verschiedene endogene und exogene Mediatoren interzelluläre Lücken und Spalten (Gaps) zwischen benachbarten ECs (49, 74, 116, 127). Viele Studien belegen die Kontrollfunktion des kontraktilen aktinfilamentären-Zytoskeletts bei der Regulation parazellulärer endothelialer Permeabilität (21, 51, 74, 116, 137, 139). Depolymerisation von Aktin-Filamenten durch Cytochalasin D oder Botulinum C2-Toxin resultierten in einem Zusammenbruch der endothelialen Barrierefunktion (24, 51, 123), während die Stabilisierung der MF mit Phalloidin die Schrankenfunktion der Monolayer nicht verschlechterte (2, 21, 24.). Studien von Schnittler und Mitarbeitern demonstrierten, dass Gap-Formierung durch Aktomyosin-abhängige kontraktile Mechanismen über die MLCK (in Gegenwart von ATP und Ca2+) gesteuert wurden und die Kontraktionen im Bereich der junktionalen Netzwerke entstanden (34, 116, 124). [Seite 18↓] Komplexe Aktin-basierende Systeme verankern Zell/Zell- bzw. Zell/Matrix-Verbindungen. Im Bereich fokaler Kontakte verbinden Transmembranrezeptoren (z.B. Integrine) über junktionale Bindeproteine (z.B. Vinculin, Talin, α -Actinin) indirekt F-Aktin. Als Antwort auf entzündliche Mediatoren werden Signalwege diskutiert, die über junktionale Aktin-Systeme zu einer Permeabilitätszunahme führen. Ein Signalweg basiert auf der über Proteinkinase C (PKC) spezifischen Phosphorylierung junktionaler Bindeproteine. Dies führte zu Aktin-Reorganisation, Zellabrundungen und Zunahme parazellulärer Permeabilität (23, 74). Ein anderer Signalweg erfolgte über die Aktivierung der Myosin-Leichtketten-Kinase (MLCK), welche zu einer auf Aktomyosin-basierenden zellulären Kontraktion führte (63, 70). Die EC-Barriere wird über kontraktile Kräfte und „Zugseilmechanismen" reguliert, die in ihrer Funktion ein intaktes Zytoskelett (MF, MT, IF) voraussetzen (56, 151). Neuere Studien zeigten, dass auch Mikrotubulussysteme an der Regulation kontraktiler Prozesse beteiligt sind (56, 57, 63, 125, 104, 159). Studien von Verin und Mitarbeitern zufolge führte Depolymerisation von MT zu einer Erniedrigung transendothelialer elektrischer Widerstände (Barrierestörung), während Vorinkubation des MT-Stabilisators Paclitaxel diesen Effekt abschwächte (151). Die biochemischen Wege, die zytoskelettäre Veränderungen und Kontraktionen nach MT-Störung verursachen, sind nicht eindeutig geklärt. Doch deuten einige Untersuchungen darauf hin, dass MT-Zerstörung zu einer Freisetzung von GEF-H1 und konsekutiv zu einer Zunahme der MLC-Phosphorylierung über eine Aktivierung der kleinen GTP-bindenden Rho-Proteine führt (63, 65, 70, 151).

1.6.1 In vitro Modell zur Messung endothelialer Permeabilität

Zur Untersuchung endothelialer Permeabilität finden zahlreiche Modelle Anwendung. Während in vivo-Modelle und/oder Untersuchungen an isolierten Organsystemen [ z.B. isolierte, blutfrei perfundierte und ventilierte Kaninchenlunge (120)] auf applizierte Stimuli komplexe Summenantworten ergeben, können in vitro-Modelle an isolierten Zellen die biologische Komplexität des Systems deutlich verringern und [Seite 19↓] kleinere Informationseinheiten hoher analytischer Aussagefähigkeit gewinnen. Zahlreiche Transwell-Modelle arbeiten bei der Bestimmung der Permeabilität kultivierter EC auf dem Prinzip der Diffusion (49, 50). Im Vergleich zu anderen in vitro-Modellen unterscheidet sich das in der vorgelegten Arbeit verwendete Modell insbesondere durch die Applikation eines hydrostatischen Drucks auf die luminale Seite des Endothelzellmonolayer während des gesamten Versuchzeitraums (50, 51, 116, 133, 136, 138, 139). Die Untersuchung der endothelialen Permeabilität isolierter Zellen erfolgt bei diesem Modell somit nicht unter diffusiblen, wie bei oben genannten Transwell-Systemen, sondern unter konvektiven Versuchsbedingungen. Dabei reagierten die Endothelzellen zu Versuchsbeginn mit einer erhöhten Wasserflussrate bei geringer Selektivität des Monolayers. Nach 20-40 Minuten kam es dann zu einem Abfall der Wasserfiltration und zu einem Anstieg der Membranselektivität für Albumin („Sealing") auf Werte, die weitgehend der vivo-Situation entsprechen (16, 133, 136, 137).

1.7 Toxine, die in die Regulation des Mikrotubulussystems eingreifen

Zur Untersuchung der Bedeutung des MT-Systems für die Regulation der endothelialen Barriere können Spindelgifte eingesetzt werden. Diese Substanzen hemmen die MT-Synthese und führen zu einer Störung der Spindelbildung in der Mitose. Zu dieser Gruppe zählen u.a. Colchicin, die Vinca-Alkaloide und Paclitaxel.

1.7.1 Colchicin

Colchicin ist ein aus der Herbstzeitlosen (Colchicum autumnale ) gewonnenes Alkaloid, das seit Jahrhunderten als antiinflammatorisches Medikament Verwendung findet (1, 119). Der Haupteffekt der Substanz besteht in der Hemmung der Mikrotubulussynthese. Colchicin bindet spezifisch an Tubulin („site-specific-binding") [Seite 20↓] und verhindert die Polymerisation zu Multimeren ohne die Depolymerisation zu beeinflussen. Dies führt zu verstärktem Mikrotubulusabbau (1, 17, 27, 66, 91, 152). Therapeutisch wird Colchicin in niedriger Dosierung zur prophylaktischen, in hoher Dosierung zur therapeutischen Behandlung des akuten Gichtanfalls eingesetzt (119). Durch Hemmung der Leukozytenbeweglichkeit kommt es wahrscheinlich zu einer Hemmung der Phagozytose von Urat (1, 17, 26). Neuere Studien deuten auf eine Intervention der Substanz auch in die Neutrophilen-Endothel-Interaktion hin (17, 66).

1.7.2 Vinca-Alkaloide

Vinca-Alkaloide ist die Sammelbezeichnung für Alkaloide aus Immergrünarten, besonders Catharanthus roseus (Vinca rosea). Vinblastin und Vincristin sind natürliche Alkaloide aus Vinca rosea und werden als Chemotherapeutika bei verschiedenen Krebserkrankungen eingesetzt (79, 102). Obwohl die Alkaloide Vinblastin und Vincristin nur kleine strukturelle Unterschiede aufweisen und sich in der Tubulin-Interaktion ähnlich verhalten, unterscheiden sie sich deutlich in ihrer Toxizität und klinischen Aktivität (58, 107). Diese Substanzen spalten in hohen Konzentrationen Mikrotubli und hemmen in niedrigen Konzentrationen die Tubulinpolymerisation zu MT-Polymeren (58). Durch Sequestrierung von Tubulin-Untereinheiten induzieren sie die Bildung parakristalliner Tubulin-Aggregate, die Reduktion freier Tubulin-Spiegel und die MT-Depolymerisation (1, 6, 58). Dadurch hemmen diese Substanzgruppen die mikrotubuläre Spindelbildung der Inter-, Pro- und Metaphase und blockieren die Mitose (26, 79, 107).


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1.7.3  Paclitaxel

Paclitaxel ist ein zyklisches Diterpen, das aus Rinde und Nadeln der pazifischen Eibe gewonnen wird. 1982 endeckten Horwitz und Mitarbeiter die Wirkung dieser Substanz (26, 55). Durch reversible Bindung an polymerisierte MT fördert Paclitaxel die Bildung anormaler, extrem stabiler, nichtfunktioneller Mikrotubuli aus Tubulin und verhindert gleichzeitig die Depolymerisation der Tubulinfilamente (8, 26, 90, 111). Die Paclitaxel-induzierte Polymerisation der MT erfolgt ohne GTP und MT-assoziierte Proteine, die normalerweise für die MT-Synthese erforderlich sind (55). Es entsteht ein Ungleichgewicht zwischen polymerisierten MT und freien Tubulin-Dimeren. Der Mangel an freiem Tubulin hemmt die Bildung neuer funktionsfähiger Mikrotubuli (8, 26, 55). Durch Stabilisierung der MT und die behinderte Neupolymerisation kommt es zur Störung normaler zellulärer Aktivitäten, in welche MT involviert sind, wie z.B. Mitosevorgänge, Aufrechterhaltung von Zellform, Zellbeweglichkeit und Organellentransport (55). Die Substanz wird in Kombination mit anderen Zytostatika z.B. zur Behandlung von Ovarial- und Mammakarzinomen eingesetzt (26, 102).

1.8 Toxine mit direkter oder indirekter Wirkung auf das endotheliale Zytoskelett

Verschiedene Toxine und Substanzen zeigen teils direkte [z.B. Cytochalasin D, Clostridium difficile (TcdB-10463)], teils indirekte Wirkung (Staphylococcus aureus α-Toxin, H2O2, h umane neutrophile Elastase) auf das endotheliale Zytoskelett. Alle Substanzen führten in Studien mit Endothelzellen zu einer signifikanten Barrierestörung.


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1.8.1  Cytochalasin D

Cytochalasin D, ein Pilzmetabolit der Gruppe der Cytochalasine, wurde mit Erfolg zur Erforschung des Mikrofilaments eingesetzt (11, 13, 15, 123). Cytochalasin-Moleküle binden mit hoher Affinität an das „barbed-end" der Aktinfilamente und hemmen sowohl die Polymerisation als auch die Depolymerisation des Proteins (11, 13, 15, 114). Am entgegengesetzten „pointed-end" wird Cytochalasin D nicht gebunden (15). Darüber hinaus führt Cytochalasin D reversibel zu einer passiven Zellretraktion und Zerteilung von Mikrofilamenten in kürzere Abschnitte (15, 51, 124).

1.8.2 Toxin B von Clostridium difficile

Toxin B von Clostridium difficile (TcdB-10463) ist ein einkettiges 270-kDa Molekül, das über Endozytose in den Zielzellen aufgenommen wird. Innerhalb der Zellen wirkt das Toxin als Enzym, das Rho-Proteine an Threonin 37 durch UDP-Glukosylierung inaktiviert (51, 60, 61). Die kovalente Modifikation führt zu einer Inaktivierung der Rho-Proteinfunktion. Rho-Proteine gehören zur Ras-Superfamilie kleiner GTP-bindender Proteine, denen eine Schlüsselrolle in der Regulation des Mikrofilamentsystems zugeschrieben wird (47, 51, 106). Studien von Hippenstiel und Mitarbeitern zeigten, dass die Hemmung der Rho-Proteine durch TcdB-10463 in Endothelzellen zu einem Verlust von F-Aktin und der Barrierefunktion von Endothelzellen führte (51).

1.8.3  Staphylococcus aureusα -Toxin

Staphylococcus aureus α -Toxin ist ein porenbildendes Exotoxin, das in pathogenen Staphylokokkenstämmen vorkommt (31). Es wird als wasserlösliches 3S Molekül sezerniert, das nach Kontakt mit Lipid-Bilayern in die Membran inseriert und [Seite 23↓] transmembranöse Kanäle bildet (31, 140). Das Toxin stimuliert wahrscheinlich durch Ca2+-Einstrom den kontraktilen Apparat von Endothelzellen und führt zu massiver endothelialer Barrierestörung (133). α -Toxin gilt als ein bedeutender pathologischer Faktor der Staphylokokken-Infektion und wird in Zusammenhang mit der Entstehung von akuter pulmonaler Hypertonie und Lungenödem gebracht, welche beim septischen Lungenversagen als gefürchtete Komplikationen auftreten können. Studien von Suttorp und Seeger zeigten, dass das Toxin die Arachidonsäure-Kaskade sowohl in kultivierten Endothelzellen als auch in isoliert perfundierten und ventilierten Kaninchenlungen stimuliert (120, 136, 140, 141). In Experimenten mit Kaninchenlungen bewirkte die Substanz eine pulmonalarterielle Hypertension mit Permeabilitätszunahme (120, 136). Suttorp und Mitarbeiter zeigten ferner, dass Staphylococcus aureus α -Toxin bei kultivierten Endothelzellen die Permeabilität für Wasser und Albumin erhöhte und diese Veränderungen von interzellulärer Lückenbildung („gaps") in dem Endothelzellmonolayer begleitet waren (136).

1.8.4 Granulozytäre Wirkstoffe

Im Rahmen akuter Inflammation kommt es zur Aktivierung polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten (PMN), deren Inhaltsstoffe in der Zellmembran und in zytoplasmatischen Granula der antimikrobiellen Verteidigung dienen. Pathogenetisch können aktivierte PMNs aber auch zu einer Bedrohung für den Organismus selbst werden (127). Stimulierte PMNs wurden beispielsweise mit der Entwicklung eines durch endotheliale Permeabilitätszunahme hervorgerufenen Lungenödems in Verbindung gebracht (127, 132). Weitere Untersuchungen zeigten, dass aktivierte PMNs zu schweren Schäden von Lungengeweben und Lungenzellen beitrugen (132, 142). Dabei scheinen für die Pathogenese die Adhäsion der PMN an vaskuläre Endothelzellen und ihre Aktivierung zur Ausschüttung von Sauerstoffmetaboliten und granulozytäre Proteasen wie HNE von Bedeutung zu sein (127, 138). Darüber hinaus [Seite 24↓] konnte gezeigt werden, dass granuläre Inhaltsstoffe, insbesondere H2O2 und Proteasen, zu einer endothelialen Barrierestörung führen (4, 132, 138).

1.8.4.1 Wasserstoffperoxid (H2O2)

Die Exposition des stark oxidierenden Agens H2O2 führte zu einer Vielzahl von Stoffwechselveränderungen in der betroffenen Zelle: es erhöhte den intrazellulären Ca2+-Spiegel, schädigte DNA-Stränge und führte zu einem ATP-, cAMP-und NAD-Abfall (110, 132, 154, 155, 156). Weiterhin kam es nach H2O2-Exposition zu einer Proteolyse und zur Hemmung der Glykolyse (110). Darüber hinaus zeigten Studien einen Einfluss von Wasserstoffperoxid auf zytoskelettäre Filamente (4). So demonstrierten Barnard und Malik H2O2-induziertePermeabilitätszunahmen von Endothelzellmonolayern und die Ausbildung interendothelialer Zellzwischenräume („gaps"). In diesen Studien konnte gezeigt werden, dass H2O2 durch die Aktivierung von Protein Kinase C zu einer „Aktin-Reorganisation" und Permeabilitätszunahme führte (4). Andere Untersuchungen zeigten eine deutliche Permeabilitätszunahme gegenüber Wasser und Albumin als Resultat einer oxidativen Endothelzellschädigung durch Destruktion des Zytoskeletts (143, 154).

1.8.4.2 Humane neutrophile Elastase

Humane neutrophile Elastase (HNE) ist im Vergleich zu anderen granulozytären PMN-Proteasen nicht nur anteilig mehr vorhanden, sondern bezüglich ihrer breiten Substratspezifität und Proteolysekinetik wesentlich potenter (138). Dieser Enzymklasse wird ein wesentlicher Beitrag zur Pathogenese der endothelialen Schrankenstörung zugesprochen (93, 127, 133). Während die Effekte von HNE auf endotheliale Permeabilität offensichtlich sind, ist der Mechanismus der HNE-Wirkung weitgehend unverstanden. Es ist unklar, ob HNE rein enzymatisch zur [Seite 25↓] Endothelzellschädigung mit den konsekutiven Barrierestörungen führt, oder ob die Substanz als Kation-Protein wirkt (93, 138). In Studien zur Untersuchung der endothelialen Permeabilität unter Verwendung von HNE zeigten sich deutliche Zunahmen der Wasserflussrate und Öffnung von interzellulären Spalten (138).

1.9 Fragestellung

In der vorliegenden Dissertationsschrift wurde der Einfluss der dynamischen zytoskelettären Filamente MT und F-Aktin auf die Regulation der Endothel-Permeabilität untersucht. Es sollen in dieser Arbeit im einzelnen folgende Fragen beantwortet werden:

  1. Welche Auswirkungen hat die Mikrotubulus-Inhibition auf die endotheliale Barrierefunktion?
  2. Welche Zusammenhänge bestehen zwischen MT- und F-Aktin-Systemen? Welche Auswirkung hat die MT-Depolymerisation auf F-Aktin? Welche Rolle spielt das MT-System innerhalb junktionaler Adhäsionskomplexe?
  3. Welche Auswirkungen hat die F-Aktin-Hemmung auf Mikrotubulus-Systeme und die endotheliale Barrierefunktion?
  4. Welche Aussagen bezüglich des Zytoskeletts (MT, MF) und der endothelialen Barrierefunktion lassen sich nach Stimulation mit Cytochalasin D, Clostridium difficile Toxin B-10463, Staphylococcus aureusα-Toxin, H2O2, und granulozytären Proteasen treffen?


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29.01.2004