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2  Methodik und Material

2.1 Isolation und Kultivierung von pulmonalarteriellen Endothelzellen des Schweins

Die Isolierung von Endothelzellen erfolgte aus Pulmonalarterien frisch geschlachteter Schweine. Hierzu wurde die Herzmuskulatur 2-3 cm unterhalb des Truncus pulmonalis sowie die Arteria pulmonalis in Höhe der Bifurkation durchtrennt. Das präparierte Material wurde, in einem Einmalhandschuh auf Eis gelagert, vom Schlachthof zum Labor transportiert. Nach Ligation der Pulmonalarterien kurz oberhalb der Klappenebene konnten die Aorta ascendens sowie die Ventrikelmuskulatur entfernt werden. Der entstandene Gefäßsack wurde mit sterilem HBSS +/+ pH 7,4 mehrfach gespült und in ein Becherglas mit 37°C temperierten HBSS +/+ eingehängt. In den Gefäßsack wurde für 15 Minuten 37°C warme steril filtrierte Collagenase (0.05 %) eingefüllt. Die Collagenase wurde danach abpipettiert. Um die aus der Arterienwand abgelösten Zellen aufzunehmen, wurde 37°C warmes Medium 199 (mit Streptomycin 100 mg/l, Penicillin 100000 IE/l und Amphotericin B 1 mg/l) hinzugefügt. Durch 15faches Spülen und vorsichtiges Massieren konnte ein Maximum an Endothelzellen gewonnen werden. Der Inhalt einer Pulmonalarterie wurde auf zwei Zentrifugenröhrchen verteilt und zweimal bei 350 g für jeweils 10 Minuten zentrifugiert. Währendessen wurden 19 ml komplettes Medium 199 (mit 10 % fetalem Kälberserum (FCS), Streptomycin 100 mg/l, Penicillin 100000 IE/l und Amphotericin B 1 mg/l) in gelatinierte Zellkulturflaschen (T 75) vorgelegt. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand abgesaugt und das gewonnene Zellpellet in 1 ml des gleichen Mediums resuspendiert und in die T 75-Kulturflaschen überführt. Die Zellkulturen wurden im Brutschrank bei 37°C mit 95 % steriler Raumluft und 5 % CO2-Zusatz inkubiert.


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Innerhalb von 7-10 Tagen bildete sich am Boden der Zellkulturflaschen eine konfluente Zellschicht. Diese zeigte sich im Phasenkontrastmikroskop bei einhundertfacher Vergrößerung als eine vollständige und gleichmäßige Bedeckung polygonaler Zellen ohne sichtbare Zellzwischenräume. Der konfluente Monolayer wurde nun „gesplittet”, d.h. die Zellen dieser Kultur wurden auf drei neue T 75 Kulturflaschen verteilt. Zunächst erfolgte dazu eine Spülung der Zellen mit 37°C warmen HBSS -/-, pH 7,4. Die Zellen wurden dann unter Trypsingabe durch vorsichtiges Klopfen vom Boden gelöst. Das Ablösen der Zellen vom Boden der Kulturflaschen wurde mit dem Phasenkontrastmikroskop kontrolliert. Durch Zugabe von 37°C warmem Medium mit 10 % FCS und o.g. Antibiotika entstand eine Zellsuspension, die auf drei neue gelatinierte T 75 Kulturflaschen verteilt wurde. Die gewonnenen Zellkulturen wurden als Zellen der zweiten Passage bezeichnet und erneut inkubiert. Dieses Splitting ließ sich jeweils nach Erreichen eines konfluenten Stadiums mehrere Male wiederholen. Für die in dieser Arbeit vorgestellten Versuche wurden Zellen der dritten oder vierten Passage verwendet.

2.2 Quantifizierung der endothelialen Permeabilität

2.2.1 Vorbereitung der Polycarbonatfiltermembranen

Vor dem Bepflanzen mit Endothelzellen wurden die Filtermembranen für eine Stunde in 0,2 % Gelatine und für 30 Minuten in 3 % Glutaraldehydlösung gelegt. Anschließend erfolgte für mindestens 60 Minuten eine Sterilisierung der Membranen in 70 % Ethanol. Die sterilisierten Polykarbonatfilter wurden im Brutschrank für maximal 3 Tage gelagert.


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2.2.2  Bepflanzen der Filtermembranen mit Endothelzellen

Jede wie im Kapitel 2.2.1 vorbehandelte Filtermembran wurde in eine Petrischale (∅ 6 cm) gelegt, dreimal mit sterilem HBSS -/- gespült und nach dem Entfernen der Pufferlösung unter die Sterilbank zum Trocknen gelegt. Anschließend wurden die Filter zentriert und mit einer heißen Kanüle auf dem Boden der Schale fixiert.

Zum Bepflanzen von fünf Filtermembranen wurden zwei konfluente T 75 Kulturflaschen der zweiten Passage, die aus derselben Zellcharge stammten, verwendet. Zuerst wurde das Kultur-Medium aus den Flaschen abgesaugt und die Zellmonolayer mit HBSS -/- (37°C, pH 7,4) gewaschen. Anschließend wurden 3,5 ml Trypsin-EDTA Lösung (0,035 %, 37°C) in jede Flasche überführt. Unter phasenkontrastmikroskopischer Kontrolle zeigte sich nach ca. 1 Minute ein Abrunden und Ablösen der Zellen. Durch vorsichtiges Beklopfen der Flaschen lösten sich die Endothelzellen vollständig vom Boden der Kulturflasche ab und gingen in Suspension. Durch Addition von 6 ml Medium 199 mit FCS (10 %), L-Glutamin (100 mg/l), Amphotericin B (1 mg/l), Streptomycin (100 mg/l) und Penicillin (100000 IE/l) wurde die Trypsinwirkung gestoppt. Die Zellsuspension wurde auf zwei Zentrifugenröhrchen verteilt und fünf Minuten bei 200 g zentrifugiert. Danach wurde der Überstand abgesaugt und das Zellsediment mit 2,5 ml Medium 199 mit obengenannten Zusätzen resuspendiert. Die Zellsuspension wurde nun gleichmäßig auf fünf Filtermembranen in den Petrischalen verteilt. Dadurch ergab sich eine Zellkonzentration von ca. 2 x 106 Zellen/Filter. Nach 4 Stunden Inkubation im Brutschrank hafteten die Endothelzellen an den Filtermembranen an. Anschließend wurde mit 10 ml Medium 199 mit 10 % FCS aufgefüllt. Innerhalb von drei bis vier Tagen entwickelte sich ein konfluenter Endothelzellmonolayer.


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2.2.3  Messung der endothelialen Permeabilität

Nach drei bis vier Tagen waren die Endothelzellen auf den Filtermembranen konfluent gewachsen und konnten zur Permeabilitätsmessung in die Versuchsanlage integriert werden. Dazu wurde jeweils eine bewachsene Filtermembran in eine für diese Versuche angefertigte Kammer mittels zweier Gummiringe und einer Plastikscheibe mit Drehgewinde befestigt. Oberhalb des Endothelzellmonolayers befanden sich in der Plastikscheibe zwei Zugänge. Der erste ermöglichte es, unter Verwendung von HBSS +/+ pH 7,4, einen kontinuierlichen hydrostatischen Druck von 10 cm Wassersäule auf die Oberfläche des Monolayers einzustellen, während der zweite Zugang den Applikationsort unterschiedlicher Stimulantien bildete. Das Volumen zwischen eingespannter Filtermembran und Plastikscheibe betrug 1 ml. Der Kammerbereich unterhalb des eingespannten Filters war Teil eines halboffenen rezirkulierenden Perfusionssystems mit einem Gesamtvolumen von 10 ml. Dieses wurde mit HBSS +/+ pH 7,4 blasenfrei aufgefüllt und mittels eines beheizten Bades auf eine konstante Puffertemperatur von 37°C eingestellt. Mit Hilfe einer Rollerpumpe wurde ein kontinuierlicher Flow von 10 ml/min erzeugt. Das durch den Endothelzellmonolayer filtrierte Volumen addierte sich zu dem Gesamtvolumen und wurde mittels skalierter Glaskapillare quantifiziert. Ein filtriertes Volumen von 10 µl konnte zuverlässig erkannt werden.


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Schema 4: Schematische Darstellung der Versuchsanlage zur Messung endothelialer Permeabilität. Eine mit Endothelzellen bepflanzte Polycarbonatfiltermembran wurde in die Messkammer eingelegt. Über einen Zugang zur luminalen Seite erfolgte die kontinuierliche Applikation eines Druckes von 10 cm Wassersäule. Über ein zweiten Zugang (sideport) wurden die Stimulantien appliziert. Unterhalb der Membran wurde durch eine Rollerpumpe (P) eine Zirkulation von 10 ml Pufferlösung 37°C aufrechterhalten. Die durch die Endothelzell-Filtermembran filtrierte Flüssigkeitsmenge addierte sich messbar zu dem zirkulierenden Gesamtvolumen und konnte an einer skalierten Glaskapillare abgelesen werden.

2.2.4 Versuchsprotokoll für Permeabilitätsmessung

Nach dem Einlegen des Polycarbonatfilters in die Messkammer und nach Integration in das Messsystem wurde der Endothelzellmonolayer einem hydrostatischen Druck


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von 10 cm Wassersäule ausgesetzt. Dabei sank die anfänglich hohe Pufferfiltration von zunächst 50-100 µl/min innerhalb eines Zeitraums von 10-25 Minuten auf einen Basalwert von weniger als 10 µl/min („Sealing"). Dies entsprach einer hydraulischen Konduktivität von < 0,5 x 10-5 x cm .s-1.

Nach erfolgreichem „Sealing” der Endothelzellmonolayer wurden die untersuchten Testsubstanzen/Toxine über den zweiten Zugang (Sideport) zugeführt: Colchicin 160 min, Vinblastin/Vincristin 160 min, Paclitaxel 180 min, HNE 90 min, H2O2 90 min, TcdB-10463 120 min, Cytochalasien D 80 min und α-Toxin 40 Minuten. Während Colchicin, Vinblastin/Vincristin, Paclitaxel, HNE und H2O2 über Druckzulauf infundiert wurden, erfolgte die Zugabe von Cytochalasin D, α -Toxin und TcdB-10463 nur als Bolus. Die Flüssigkeitsstände wurden in 5 Minuten-Intervallen an den kalibrierten Glaskapillaren abgelesen und protokolliert.

Das in jeder Versuchsreihe mitlaufende Kontrollfilter blieb unstimuliert und enthielt die Konzentration an Lösungsmittel, die für die Lösung der Testsubstanzen der anderen Filter notwendig war. Am Ende des Versuchs wurde den Kontrollfiltern Staphylococcus aureusα -Toxin zugesetzt, um die Vitalität und Reaktionsfähigkeit der Zellen zu überprüfen. Bei spontanem Ansteigen der Wasserflussrate während der Versuchsdurchführung oder bei Ausbleiben des Permeabilitätsanstiegs nach α -Toxin-Bolusgabe wurden die Versuchsergebnisse nicht gewertet.

2.2.5 Berechnung der hydraulischen Konduktivität

Die hydraulische Konduktivität berechnet sich aus der Filtration (Volumen/Zeit) pro Oberflächeneinheit pro Einheit hydrostatischer Druckdifferenz. Bei dem zuvor erläuterten Modell ergibt sich demnach beispielsweise aus einem filtrierten Volumen von 100 µl/min eine hydraulische Konduktivität von 4,82 x 10-5 x cm x s-1 x cm H2O-1. In diese Berechnung gehen die für die Filtration effektiv zur Verfügung stehende [Seite 32↓] Fläche von 3,46 cm2, der hydrostatische Druck von 10 cm H2O und das filtrierte Volumen pro Zeiteinheit (100 µl/min entprechen dabei 0,1 cm3/min bzw. ca. 1,7 10-3 cm3/s) ein. Damit ergibt sich ein Divisionsfaktor von 20,78 für die Errechnung der hydraulischen Konduktivität aus der Filtrationsrate (51, 136, 133, 143).

2.3 Untersuchung der Morphologie von pulmonalarteriellen Endothelzellen

2.3.1 Bepflanzung von Glass-Chamber-Slides mit Endothelzellen

Für die morphologischen Untersuchungen der Endothelzellen wurden Glasobjektträger verwendet, auf die jeweils acht Kammern mit einem Aufnahmevolumen von je 1000 µl aufgesetzt waren. Vor dem Bepflanzen mit Pulmonalarterienendothelzellen wurde in die Glass-Chambers-Slides 500 µl 0,2 %iger Gelatine gegeben und unter der Sterilbank für eine Stunde gelagert.

Zum Bepflanzen von 10 Chamber-Slides wurde eine T 75 Kulturflasche mit Endothelien der zweiten Passage verwendet. Nach zwei Waschgängen mit HBSS -/- und der Zugabe von 3,5 ml Trypsin wurden, nachdem sich die Zellen von dem Flaschenboden gelöst hatten, 60 ml auf 37°C erwärmtes Kulturmedium M199 (Zusätze wie unter Kap. 2.2.2) hinzugegeben. Anschließend wurden 6 ml der Zellsuspension mit 34 ml M199 in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen gemischt und auf die Chamber-Slides verteilt. Innerhalb von 2-3 Tagen entwickelten sich im Brutschrank konfluente Endothelzellmonolayer auf den gekammerten Objektträgern.


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2.3.2  Doppelimmunfluoreszenz: Untersuchung des Mikrotubulus- und Aktinfilament-Systems pulmonalarterieller Endothelzellen

2.3.2.1 Methodische Grundlagen

Für die Anfärbung des Mikrotubulus-Systems der Endothelzellen wurde die Methodik der indirekten Immunfluoreszenz angewendet (42, 89). Nach Markierung des α -Tubulins mit einem monoklonalen Anti-α -Tubulin-Antikörper der Maus (primärer Antikörper) wurde ein mit Fluoreszein (FITC) gekoppelter sekundärer Anti-Maus IgG-Antikörper der Ziege zugegeben. Der FITC-gekoppelte Antikörper erlaubte die Visualisierung des Mikrotubulussystems im Fluoreszenzmikroskop. (Fluoreszin: Excitation: 495 nm, Emission: 525 nm, Farbe: grün).

Die Methodik zur Darstellung filamentären Aktins basierte auf direkter Immunfluoreszenz. Phalloidin, ein Gift des Knollenblätterpilzes Amanita p halloides, bindet spezifisch an F-Aktin (15, 123). Durch den an Phalloidin gekoppelten Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC) kann filamentäres F-Aktin unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden (Rhodamin: Excitation: 552 nm; Emission: 570 nm; Farbe: rot).

2.3.2.2 Versuchsdurchführung

Den 2-3 Tage alten Endothelzellkulturen, die auf Glass-Chamber-Slides gewachsen waren, wurde 24 Stunden vor Versuchsbeginn frisches Kulturmedium M199 mit 2 % FCS (weitere Zusätze wie unter Kap. 2.2.2) zugeführt. Am Versuchstag wurden die Endothelzellen zunächst zweimal mit 37°C warmen Medium M199 (Zusätze wie oben beschrieben) gewaschen und im Brutschrank für 30 Minuten inkubiert. Nach einer phasenkontrastmikroskopischen Konfluenz-Kontrolle wurden den Zellen die unterschiedlichen Stimuli zugesetzt. Eine Kammer blieb als Kontrollkammer mit dem [Seite 34↓] entsprechenden Lösungsmittel der zu untersuchenden Testsubstanz unstimuliert. Anschließend wurden die Zellen für zwanzig Minuten mit frisch angesetzten 4 %igen Paraformaldehyd fixiert und für fünf Minuten durch Zugabe von Triton X-100 0,1% bei 4°C permeabilisiert (42, 89).

Nach zwei vorsichtigen Waschschritten mit HBSS -/- pH 7,4 bei Raumtemperatur erfolgte nun für zwanzig Minuten die Absättigung unspezifischer Bindungen mit Hilfe von 2 %igen fettsäurefreien BSA. Der Anti-α -Tubulin Antikörper der Maus wurde in HBSS-/- pH 7,4 und 2 %igen BSA auf eine Konzentration von 1 : 700 verdünnt und die Zellen für 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einem Waschgang mit HBSS -/- und 2 %igen BSA wurden nun unter Verdunklung sowohl der zweite Antikörper (1 : 700), ein mit Fluoreszin (FITC) gekoppelter Anti-Maus IgG Antikörper als auch TRITC-Phalloidin in einer Konzentration von 0,175 µg/ml den Endothelzellen für 30 Minuten zugesetzt.

Nach einem Waschgang mit HBSS-/- pH 7,4 wurden die Zellen unter dem Fluoreszensmikroskop untersucht. Durch die gleichzeitige Gabe von Tubulin- und Aktin-bindenden fluoreszierenden Substanzen und die Möglichkeit, innerhalb des Mikroskopes mit Filtern unterschiedlicher Wellenlängen zu arbeiten, konnte zeitgleich sowohl die Beschaffenheit des Mikrotubulus- als auch des Aktinsystems der eingestellten Vergrößerung beurteilt werden. Die Dokumentation erfolgte mit einer Olympus OM-2 auf Fuji S-400.

2.3.2.3 Filme und Fotos

Die Dokumentation der Doppelimmunfluoreszenz-Untersuchung von Mikrotubulus- und Mikrofilamenten erfolgte mit einer Olympus OM-2-Kamera auf Fuji S-400. Fotos, die exakt den gleichen Bildausschnitt zeigen, sind mit einem Stern (*) gekennzeichnet. Außerdem wurden Doppelbelichtungen erstellt, die das [Seite 35↓] morphologische Verhältnis der beiden zytoskelettären Filamenttypen besonders anschaulich darstellen. Dabei entstand durch positive Farbaddition (grün und rot) eine Gelbfärbung im Bereich von Aktin- und Mikrotubulus-Überlagerungen.

2.4 Fluorometrische Bestimmung von F-Aktin

2.4.1 Methodische Grundlagen

Die quantitative Bestimmung filamentären Aktins wurde fluorospektro-photometrisch, wie bei R.B. Wysolmerski beschrieben und von Suttorp und Mitarbeitern modifiziert (139, 157), durchgeführt. Basis dieser Methode ist die spezifische Bindung von Phalloidin, einem Gift des Knollenblätterpilzes Amanita phalloides, an F-Aktin (15, 123). Durch den an Phalloidin gekoppelten Fluoreszenzfarbstoff Tetramethylrhodamin-Isothiocyanat (TRITC) kann F-Aktin markiert werden. Die Bindung von TRITC-Phalloidin an F-Aktin wird durch Extraktion mit Methanol wieder gelöst. Die Konzentration des extrahierten TRITC-Phalloidin kann im Fluorometer gemessen werden und ist proportional zum endothelialen F-Aktin-Gehalt (15, 123, 139).

2.4.2 Versuchsdurchführung

Für die Bestimmung von F-Aktin fanden konfluente Endothelzellmonolayer in T 25-Kulturflaschen Verwendung. Diese wurden wie in Kap. 2.1 beschrieben isoliert und gesplittet. Vor der Stimulation der Zellen wurden alle T 25 unter dem Phasenkontrastmikroskop auf Konfluenz untersucht und die Kulturflaschen nummeriert. Das Medium wurde abgesaugt und die Zellen zweimal mit 37°C warmen H/H+/+ pH 7,4 gewaschen. Anschließend wurden die Kulturflaschen aufgestellt und 2 ml H/H+/+ mit der zu untersuchenden Substanz (Colchicin, Vinblastin) eingefüllt. Mit dem Umdrehen der T 25-Kulturflaschen wurden die Endothelzellmonolayer mit der [Seite 36↓] Testsubstanz überspült. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen zweimal mit 37°C warmem Stabilitätspuffer-1 (SB1: In Aqua dest.: KCL 5,592 g/l, MgSO4 739,44 mg/l, EGTA 380,4 mg/l, Imidazolhydrochlorid 680,8 mg/l, Dithiothreitol 30,84 mg/l pH 7,2) gespült. Nach 10-minütiger Permeabilisierung unter Verwendung von je 2 ml 0,03 %iger Saponinlösung bei Raumtemperatur wurde zweimal vorsichtig mit SB1-Puffer gewaschen. Anschließend erfolgte für 20 Minuten die Fixierung mit frisch zubereiteter 3 % iger Formaldehyd-Lösung in SB1-Puffer bei Raumtemperatur. Die fixierten Zellen wurden mit 0,175 µg/ml TRITC-Phalloidin bei 20°C für 30 Minuten im Dunkeln gefärbt. Nach dreimaligem Spülen mit SB2-Puffer (in SB1-Puffer zusätzlich Aprotinin 10 mg/l, PMSF 17,42 mg/l) wurden jeder Kulturflasche jeweils 2 ml tiefgekühltes Methanol (-20°C) zugesetzt. Die Lagerung der Kulturflaschen bei –20 °C für 12 Stunden führte zur Extraktion des TRITC-Phalloidins. 800 µl Überstand wurde in Eppendorfhütchen pipettiert, mit 8000 g für 10 Minuten zentrifugiert und dann für die Fluoreszenzmessung am Spektrophotofluorometer (Firma AMINCO-BOWMANN) eingesetzt. Jeweils 400 µl Probenvolumen wurden in Mikro-Quarzküvetten bei Wellenlängen von 542 nm (Exzitation) und 563 nm (Emission) gemessen und mittels einer Standardreihe aus TRITC-Phalloidin umgerechnet (1,0-80 ng TRITC-Phalloidin/ml Methanol). Die Ergebnisse wurden auf den Proteingehalt des Endothelzellmonolayers bezogen (ng TRITC-Phalloidin/µg Protein).

2.4.3 Bestimmung des Zellproteins

Die Proteinbestimmmung wurde anhand der von Bradford (9) beschriebenen Methode mit dem BIO-RAD-PROTEIN-ASSAY durchgeführt. Die durch 0,1%ige Triton X-100 Lösung permeabilisierten Endothelzellmonolayer wurden vom Boden jeder T 25 ausgekratzt und 800 µl der Suspension in Eppendorfreaktionsgefässe pipettiert. Nach 5 Minuten Zentrifugieren wurden 50 µl des Überstandes mit 750 µl H2O in Glas-Küvetten gefüllt und mit je 200 µl Farbstoff (BIO-RAD-PROTEIN-ASSAY) [Seite 37↓] gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten wurde die Extinktion bei einer Wellenlänge von 595 nm mit dem Spectrophotometer (UVICON 860) gemessen. Als Proteinstandard diente Rinderserumalbumin (BSA).

2.5 Isolierung von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN)

Zur Gewinnung humaner polymorphkerniger neutrophiler Granulozyten wurde heparinisiertes Vollblut gesunder Spender auf einen diskontinuierlichen Percollgradienten geschichtet (127, 138). Die Herstellung des Percoll-Gradienten erfolgte durch Verdünnung mit destilliertem Wasser zu 55 %igem und 69 %igem Percoll. Durch Zugabe von 1,5 molarer NaCl wurde Blutisotonie eingestellt (55ml Percoll + 10ml NaCl + 35 ml Aqua dest. bzw. 69 ml Percoll + 10 ml NaCl + 21 ml Aqua dest.). 4 ml 55 %iger Percoll wurde in Polysterolreagenzröhrchen pipettiert und mit 4 ml 69 %igem Percoll unterschichtet. Anschließend wurde vorsichtig unter Verwendung einer großkalibrigen Kanüle mit Liquemin 25000 IE (ca. 20 IE/ml Blut) heparinisiertes Blut aufgeschichtet. Die Röhrchen wurden dann für 25 Minuten bei 350 g und Raumtemperatur zentrifugiert. Dadurch verteilten sich die Blutbestandteile auf verschiedene Phasen: Die oberen drei Schichten, bestehend aus Plasma, Monozyten, Lymphozyten, Thrombozyten und 55 %igem Percoll, wurden mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe bis knapp oberhalb der darunterliegenden Granulozyten-Bande abgesaugt. Die Granulozyten wurden mit einer großkalibrigen Kanüle in eine Spritze aufgenommen und in ein mit 37°C erwärmtes H/H +/+ pH 7,4 gefülltes Zentrifugenröhrchen überführt. Um die noch verbliebenen Percollreste zu entfernen, wurde die Zellsuspension zweimal mit 37° warmem H/H +/+ pH 7,4 durch Zentrifugation für jeweils 10 Minuten bei 180 g gewaschen. Der Überstand wurde dekantiert und das Zellsediment in 37°C warmem Medium RPMI 1640 mit 10 % FCS und L-Glutamin resuspendiert. Nach dem zweiten Waschgang wurden die Zellen erneut in RPMI 1640 resuspendiert und die Granulozytenzahl in einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Anschließend wurden die Zellen in RPMI 1640 Nährmedium [Seite 38↓] aufgenommen und bei 37°C für 90 Minuten im Brutschrank gelagert (sog. Erholungsphase). Nach der Erholungsphase wurden die Granulozyten für fünf Minuten bei 350 g zentrifugiert, der Überstand dekantiert und die Zellen in 37°C warmem Medium 199 resuspendiert. Dieser Waschgang wurde dreimal wiederholt, um Serumreste des Nährmediums zu entfernen.

2.5.1 Stimulation von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten

Die gereinigte Zellsuspension wurde in ein Reaktionsgefäß überführt und mit 250 ng PMA (Phorbol-12-Myrisat–13-Acetat) stimuliert. Anschließend folgte die Inaktivierung von H2O2 durch Zugabe von 10.000 U/ml Katalase. Die mit PMA und Katalase behandelte Medium 199-Zellsuspension wurde vorsichtig gemischt und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die 30 minütige Inkubationszeit diente dazu, eine maximale Sekretion von granulozytären Proteasen zu erreichen und eventuelle Effekte kurzlebiger O2-Radikale zu vermeiden. Zur weiteren Aufbereitung des PMN-Überstandes wurde die PMN-Zellsuspension für zwei Minuten bei 560 g zentrifugiert und der Überstand durch Milliporefilter der Größe 0,45 µm, Typ HV filtriert. Anschließend wurden Alliquots (100 µl, 200 µl, 400 µl) des PMN-Überstandes direkt den Endothelzellen zugesetzt und diese für eine Stunde im Brutschrank inkubiert.

2.6 Material

2.6.1 Kulturmedien und Pufferlösungen

Medium 199: a100 mg/l L-Glutamin und 2,2 g/l Natriumbicarbonat von der Firma Gibco, Karlsruhe. Zugesetzt wurden zu 500 ml Medium 500 µg Amphotericin B und 50 mg Streptomycin, 50000 I.E Penicillin, beide von der Firma Boehringer, [Seite 39↓] Mannheim. Um ein komplettes Medium zu erhalten, wurden noch 10 % oder 20 % fetales Kälberserum (FCS der Firma Boehringer, Mannheim) zugefügt.

HBSS: (Hanks balanced salt solution) der Firma Gibco, Karlsruhe (KCL 4g/l, KH2PO4 0,6 g/l, NaCl 80 g/l, Na2HPO4 x 7 H2O 0,9 g/l, pH 7,4). Wenn im Text als „+/+” bezeichnet: mit 1,4 g/l CaCl2 ,1 g/l MgCl2 und 1 g/l MgSo4. Wenn im Text als „-/-” bezeichnet : Ohne Kalzium und Magnesium, steril angesetzt.

HEPES: (N-[2-Hydroxyethyl] piperazin-N’-[2-Ethansulfonsäure]) der Firma C. Roth, Karlsruhe, wurde in einer Konzentration von 6 g/l zu HBSS zugesetzt.

PBS: Dulbecco’s phosphat buffered saline, ohne Kalzium und Magnesium (KCL 0,2 g/l, KH2PO4 0,2 g/l, NaCl 8,0 g/l, Na2HPO4 x 7H2O 2,16 g/l), der Firma Gibco, Karlsruhe.

SB1-Puffer (Salt-buffer): In Aqua dest.: KCL 5,592 g/l, MgSO4 739,44 mg/l, EGTA 380,4 mg/l, Imidazolhydrochlorid 680,8 mg/l, Dithiothreitol 30,84 mg/l

PH 7,2

SB2-Puffer: In SB1-Puffer: Aprotinin 10 mg/l, PMSF 17,42 mg/l

2.6.2 Toxine

Colchicin: Alkaloid von Colchicum autumnale von der Firma Calbiochem.

Cytochalasin D: Toxin von Zygosporium mansonii von der Firma Sigma, München.

Vinblastin: Alkaloid von Vinca rosea von der Firma Sigma, München.


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Vincristin: Alkaloid von Vinca rosea von der Firma Sigma, München.

Taxol: Taxane Paclitaxel von der Firma Sigma, München.

Staphylococcus aureusα -Toxin: freundlicherweise von Prof. Dr. S. Bhakdi, Abteilung für Medizinische Mikrobiologie, Johannes-Gutenberg Universität, Mainz, zur Verfügung gestellt.

Clostridium difficile Toxin B-10463: Tox-B wurde freundlicherweise von Prof. Dr. C. v. Eichel-Streiber, Institut für Medizinische Mikrobiologie, Johannes-Gutenberg Universität, Mainz, zur Verfügung gestellt.

2.6.3 Antikörper und fluoreszierende Substanzen

FITC-Antikörper: Anti-Maus IgG (Fab spezifisch), FITC-markierter Ziegen-Anti-Maus-Antikörper der Firma Sigma, München.

Monoklonal Anti-alpha-Tubulin-Antikörper: Maus Ascites Flüssigkeit, Klon Nr: B-5-1-2 der Firma Sigma, München.

TRITC-Phalloidin: mit Tetramethylrhodamin-Isocyanat (TRITC) markiertes Phalloidin von Amanta phalloides (MG 1305,6) der Firma Sigma, München.

Monoclonal Anti-Vimentin-Antikörper: Maus Ascites Flüssigkeit, Klon Nr: VIN-4-7-1 der Firma Sigma, München.


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2.6.4  Sonstige Reagenzien

Kollagenase (Typ CLS II) wurde von der Firma Worthington Corp., Freehold, NJ (USA), bezogen. Fetales Kälberserum, Trypsin-EDTA und Amphotericin B (250µg/ml) von der Firma Boehringer, Mannheim. Gelatine Typ I vom Schwein, Glutaraldehyd (Grad II, 25 % wässrige Lösung) und H2O2 (30 %) wurde von der Firma Sigma, München geliefert. Rinderserumalbumin von der Paesel GmbH, Frankfurt/M.. Triton X-100 (Alkylphenylpolyethylenglycol) lieferte die Firma Fluka AG, Bucgs/Schweiz. Alle für diese Arbeit verwendeten Substanzen besaßen den höchstmöglichen Reinheitsgrad.

2.6.5 Zubehör

Zellkulturflaschen (T 75 und T 25), Petrischalen (6 cm Durchmesser), Glass-Chamber-Slides wurden von der Firma Nunc, Wiesbaden, geliefert.

Polycarbonatfiltermembranen mit dem Durchmesser von 25 mm und der Porengröße von 5 µm wurden von der Firma Millipore, Eschborn, bezogen.

2.6.6 Geräte

Spectrophotometer: UVICON 860 von Fa. Kontron Instruments

Spectrophotofluorometer: Fa. AMINCO Bowmann

Mikroskop 1: Olympus IMT 2 Phasenkontrastmikroskop

Mikroskop 2: Olympus Optical Co, Modell: BH2-RFL-T2 (Fluoreszenz-mikroskop)


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2.7  Statistische Auswertung

Die Daten der Abbildungen zur Permeabilitäts- und F-Aktin-Messung wurden mittels Zweiwegvarianzanalyse für unverbundene Stichproben auf Signifikanz untersucht. Angegeben sind Mittelwerte ± SEM. Verwendet wurde das Statistikprogramm Graph Pad PRISM der Fa. Graph Pad Software Incorporated San Diego. Ein signifikanter Unterschied wurde bei p ≤ 0,05 angenommen.


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29.01.2004