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3  Ergebnisse

3.1 Morphologie von Mikrotubulus-, Aktin- und Intermediärfilamenten in unstimulierten kultivierten Endothelzellen (Kontrollzellen)

In der vorliegenden Arbeit wurde das Permeabilitätsverhalten stimulierter pulmonaler Endothelzellen unter Berücksichtigung der Morphologie des Zytoskeletts untersucht. Abb. 1 zeigt die drei zytoskelettären Hauptkomponenten Mikrotubulus-, Mikrofilament- und Intermediärfilament-System (MT, MF, IF) unstimulierter ECs (Kontrollzellen).

Abb. 1-A : Mikrotubuli bilden ein System von Einzelfasern, welche sternförmig von dem paranukleär gelegenen Zentrosom in die Peripherie ausstrahlen. Durch die paranukleäre Lage des MT-Keimbildungszentrums scheint die Verteilung der MT-Filamente optisch unsymmetrisch. Die Hauptausrichtung der Mikrotubulusstrukturen deutet die Zell-Polarität an. Aufgrund der Färbetechnik (indirekte Immunfluoreszenz) werden sowohl filamentäre MT-Strukuren als auch Tubulin-Einzelmoleküle grün angefärbt. Abb.1-B : Endotheliale Aktinfilamente zeigen sich als quervernetzte Geflechte und Bänder, die nahe der Zellmembran lokalisiert sind und ein typisches wabenartiges Relief bilden („peripheral dense bands“). Optisch verleihen die Mikrofilamente der Zelle Form und bilden eine Abgrenzung zu Nachbarzellen. Aufgrund der Färbetechnik (direkte Immunfluoreszenz) sind hierbei im Gegensatz zu der MT-Färbung, bei welcher auch einzelne Tubulinmoleküle angefärbt werden, nur Aktin-Filamente und nicht G-Aktinmoleküle erkennbar. Abb.: 1-C : Neben Mikrotubulus- und F-Aktin-Systemen bilden Intermediärfilamente die dritte zytoskelettäre Hauptkomponente eukaryoter Zellen. Intermediärfilamente (hier Vimentin) sind kräftige und dauerhafte Proteinfilamente, die sich in gleichmässig gebogenen Anordnungen vom Kern bis zum Zellrand erstrecken.


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Abb. 1-A: Mikrotubulus-System. Mikrotubuli von ruhenden Endothelzellen sind als System von Einzelfasern zu erkennen, die sternförmig vom paranukleären Zentrosom, dem Mikrotubulus-Keimbildungszentrum (Pfeile), in die Zellperipherie ausstrahlen.

Abb. 1-B: F-Aktin (Mikrofilamente). Aktinfilamente sind Proteinverbindungen, die sich innerhalb des ruhenden Endothelzellverbandes als quervernetzte Geflechte und Bänder darstellen, die, in der Peripherie angeordnet, ein typisches wabenartiges Relief bilden (peripheral dense bands).


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Abb. 1-C: Intermediärfilamente (Vimentin). Intermediärfilamente sind kräftige und dauerhafte Proteinfilamente, die sich in gleichmässig gebogenen Anordnungen vom Kern bis zum Zellrand erstrecken.

3.2 Barrierefunktionsstörungen pulmonaler Endothelzellen durch Mikrotubulus-Toxine

3.2.1.1 Colchicin erhöht die Permeabilität pulmonaler Endothelzellen

In dieser Experimentreihe wurde die Frage untersucht, ob MT-Hemmung die Barrierefunktion pulmonaler Endothelzellen beeinflussen kann. Colchicin hemmt die MT-Synthese und führt zu einem verstärkten MT-Abbau.

Abb. 2 zeigt die Zunahme der hydraulischen Konduktivität nach Bolus-Gabe und anschließender kontinuierlicher Zufuhr von Colchicin in den Konzentrationen von 1 µM, 10 µM und 100 µM. Colchicin erhöhte die hydraulische Konduktivität gesealter Endothelzellmonolayer zeit- und dosisabhängig und führte in vitro zu einer endothelialen Barrierestörung.


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Abb. 2: Zunahme der endothelialen Permeabilität nach Zugabe von Colchicin. Zum Zeitpunkt t=0 Min. wurde auf die gesealten Monolayer Colchicin in Konzentrationen von 1 µM, 10 µM und 100 µM für 170 Minuten gegeben. Es zeigte sich ein zeit- und dosisabhängiger Anstieg der Wasserfiltration. Die Permeabilität ist als hydraulische Konduktivität (x 10-5cm x s-1 x cm H2O-1) aufgezeichnet. Unstimulierte Kontrollfilter blieben im Versuchszeitraum stabil und reagierten prompt auf Pertubation mit 10 µg/ml Staphylococcus aureusα -Toxin. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM von jeweils 6 unabhängigen Experimenten.

Bei einer Colchicin-Konzentration von 1 µM kam es nach ca. 80 Minuten zu einem langsamen Anstieg der Wasserfiltration, die nach 160 Minuten bis ca 1,5 x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1 zunahm. Bei höheren Colchicin-Konzentrationen trat der Anstieg früher ein. Nach 160 Minuten lagen die Filtrationswerte der


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Monolayer nach 10 µM Colchicinkonzentration bei 2,7 x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1 und nach 100 µM bei 4,8 x 10-5cm x s-1 x cm H2O-1. Im Vergleich zu den Kontrollzellen entprach die gemessene Wasserfiltration einer 5-10fachen Permeabilitätszunahme. Unstimulierte Kontrollzellen blieben im gesamten Beobachtungszeitraum stabil und zeigten keine Permeabilitätszunahme. Die Wasserflussrate bei Kontrollzellen betrug dabei weniger als 0,5 x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1. Die gesealten Kontrollfilter reagierten am Ende der Versuche auf die Gabe von Staphylococcus aureusα-Toxin mit deutlicher Permeabilitätszunahme als Zeichen der Vitalität.

3.2.1.2 MT-Depolymerisation nach Colchicin-Gabe führt zu einer vermehrten Stressfaserbildung und zur endothelialen Zell-Retraktion mit interendothelialer Lückenbildung

Colchicin hemmt die MT-Synthese und führt zu einem MT-Abbau. In dieser Versuchsreihe sollten die morphologischen Auswirkungen von MT-Inhibition auf F-Aktin und Endothelzellen untersucht werden. Das Spindelgift wurde den Endothelzellen in Konzentrationen von 0,1 µM bis 100 µM über einen Zeitraum von 120 Minuten appliziert. Mit zunehmender Colchicin-Konzentration änderte sich sowohl die Mikrotubulus- als auch die Mikrofilament-Morphologie im Vergleich zu den Kontrollzellaufnahmen (Abb. 3). Die Stimulation der Endothelzellen mit 0,1 µM Colchicin führte bereits zu einer leichten Reduktion mikroskopisch erkennbarer Tubulinfilamente (Abb. 3-F). Die Depolymerisation von Mikrotubuluseinheiten und die daraus resultierende Anhäufung von Tubulineinzelmolekülen bewirkten eine diffuse Grünfärbung des Zytoplasmas der Endothelzellen. Das physiologische „Wabenrelief” der Mikrofilamente blieb nach 0.1 µM Colchicin überwiegend bestehen. Dennoch kam es im Vergleich mit den Kontrollzellen zu diskreten Veränderungen (nicht gezeigt). Es zeigten sich insbesondere leichte zytoplasmatische Verdichtungen des F-Aktins sowie


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Stressfaserbildungen (Abb. 3-F) . Mit zunehmenden Colchicin-Konzentrationen war morphologisch eine verstärkte MT-Depolymerisation festzustellen. Nach 1 µM Colchicin (Abb. 3-C) waren vergleichsweise mit Kontrollzellen deutlich weniger MT-Einzelfasern erkennbar. Die Zentrosomen, die aktiven Zentren der Mikrotubulus-Polymerisation, zeigten sich als kleine asterenartige Gebilde. Das Mikrofilamentsystem (Abb. 3-D) bildete nicht mehr die Form schlanker peripherer Bänder, sondern füllte überwiegend das Zytoplasma der Zellen aus (der Zellkern blieb bei den meisten Zellen abgrenzbar). 1 µM Colchicin führte zu Zellretraktionen mit Auflösungen der sonst kontinuierlichen Verbindungen zwischen Nachbarzellen in Form von interzellulären Spalten und Lücken (vgl. weisse Pfeile in Abb. 3-D). Bei höheren Colchicin-Dosierungen mit 10 µM und 100 µM Colchicin bestätigten sich die beschriebenen Befunde in deutlicherer Ausprägung. Die Endothelzellen zeigten eine allgemeine Retraktion und eine großflächige Auflösung von Zell-Zell-Kontakten. Die Zellverbindungen innerhalb des Monolayers bestanden dabei aus dünnen Zellbrücken, die filamentäres Aktin enthielten (nicht gezeigt). Die MT-Färbungen zeigten gleichmässige von depolymerisierten Tubulineinzelmolekülen angefärbte Zytoplasmata ohne erkennbare MT-Einzelfasern. Die MT-Keimbildungszentren (Zentrosomen) waren auch bei hohen Colchicin-Dosierungen (100 µM) diskret feststellbar. Filamentäres Aktin war in diesen hohen Konzentrationen diffus im gesamten Zytoplasmata verteilt erkennbar (nicht gezeigt).


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Abb. 3: Mikrotubulus-und Aktinfilamente nach Stimulation mit Colchicin für 120 Minuten. A-B : unbehandelte Kontrollzellen; C-D : 1 µM Colchicin, D : Zellretraktionen, zytoplasmatische F-Aktinverdichtung und Stressfasern, Pfeile zeigen Gaps; E : Doppelbelichtung von Kontrollzellen; F : Doppelbelichtung 0,1 µM Colchicin: zunehmende MT-Depolymerisation führt zu zytoplasmatischer F-Aktinumverteilung (Pfeile) und Zelllückenbildung (Pfeilköpfe); Grüne Färbung: Mikrotubulus-System; Rote Färbung: F-Aktin; (*): Gleicher Bildausschitt. Typische Ausschnitte aus 4 Versuchen.


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3.2.1.3  Colchicin erhöht intrazelluläres F-Aktin

In dieser Versuchsreihe wurde endotheliales F-Aktin nach Colchicinapplikation für einen Zeitraum von 0 bis 120 Minuten fluorometrisch gemessen. Eine Konzentrationsreihe mit 0,1 µM, 1 µM, 10 µM und 100 µM Colchicin wurde pulmonalen Endothelzellen zugegeben. 0.1 µM Colchicin (Abb. 4-A) zeigte dabei im Zeitfenster 0-60 Minuten bezogen auf die Kontrollzellen zum Zeitpunkt t=60 zunächst einen leichten F-Aktin-Abfall von 4,9 % (von 0,184 auf 0,175 ng/µg Protein). Im weiteren Verlauf wurde ein nicht signifikanter F-Aktinanstieg festgestellt, der näherungsweise dem der Kontrollzellen nach 120 Minuten entsprach. Bei einer Colchicin-Konzentration von 1 µM (Abb. 4-B) stieg der F-Aktinwert im Zeitfenster 60-120 Minuten deutlicher um 11,2 % (von 0,179 auf 0,199 ng/µg Protein). Nach 10 µM Colchicin-Applikation (Abb. 4-C) entwickelte sich kontinuierlich eine leichte F-Aktinzunahme. Nach 60 Minuten wurde ein Anstieg von 7,9 % (von 0,177 ng/µg Protein auf 0,191 ng/µg Protein) und nach 120 Minuten eine signifikante F-Aktinzunahme von 10,9 % (auf 0,195 ng/µg Protein) gemessen. Bei einer Colchicin-Konzentration von 100 µM (Abb.4-D) konnte über die Versuchsdauer zweimal ein deutlicher F-Aktin-Anstieg gemessen werden. Zunächst stieg der Filamentwert nach 30 Minuten signifikant um 10,2 % (von 0,177 auf 0,195 ng/µg Protein). Nach 60 Minuten wurden 4,5 % F-Aktin-Zunahme gemessen. Nach 90 Minuten erfolgte ein erneuter Anstieg um 9 % (auf 0,193 ng/µg Protein). Nach 120 Minuten wurden 0,187 ng/µg Protein gemessen. Dies entsprach einer F-Aktin-Zunahme von 5,6 %. Die Positivkontrolle unter Zugabe von Cytochalasin D (Abb. 4-D) zum Zeitpunkt t=0 Minuten zeigte einen signifikanten F-Aktin-Verlust der Endothelzellen. Der Mikrofilamentanteil fiel nach 30 Minuten von 0,180 ng/µg Protein auf 0,133 ng/µg ab. Dies entspricht einem F-Aktin-Verlust von 27,3 %.


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Abb. 4: Konzentrations- und zeitabhängige Veränderung des endothelialen F-Aktin-Gehaltes bei Stimulation mit Colchicin. A : 0,1 µM; B : 1 µM; C : 10 µM; D : 100 µM und Positivkontrolle Cytochalasin D 1 µg/ml. - Die Zweiwegvarianzanalyse zeigte einen geringen F-Aktin-Anstieg bei 1 µM, 10 µM und 100 µM. Ein signifikanter F-Aktin-Abfall lies sich für Cytochalasin D nachweisen. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte (± SEM) aus 4 unabhängigen Versuchen.


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3.2.2.1  Vinblastin erhöht die Permeabilität pulmonaler Endothelzellen

Vinblastin hemmt in niedriger Dosierung die Polymerisation der MT-Systeme und führt in höherer Dosierung zu einer Zerteilung von MT-Strukturen in parakristalline Aggregate. Es sollte in dieser Versuchsreihe die Auswirkung der MT-Hemmung auf die endotheliale Barrierefunktion getestet werden.

Abb. 5: Permeabilitätszunahme von Endothelzellmonolayer nach Vinblastingabe. Zum Zeitpunkt t=0 Min. wurde auf die gesealten Monolayer Vinblastin in Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM, und 10 µM als Bolus mit anschließend kontinuierlicher Zuführung für 180 Minuten gegeben. Es zeigte sich ein zeit- und dosisabhängiger Anstieg der Wasserfiltration nach Vinblastin-Applikation. Kontrollzellmonolayer reagierten prompt mit einem Filtrationsanstieg auf Staphylococcus aureusα -Toxin. Die Permeabilität ist als hydraulische Konduktivität (10-5cm x s-1 x cm H2O-1) aufgezeichnet. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM aus 4 separaten Experimenten.


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Abb. 5 zeigt die Zunahme der Wasserflussrate gesealter endothelialer Monolayer nach Bolus-Gabe und anschließender kontinuierlicher Zufuhr von Vinblastin in den Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM und 10 µM. Vinblastin führte dosis- und zeitabhängig zu einer Permeabilitätszunahme der Endothelzellmonolayer. Während bei unbehandelten Kontrollzellen die Wasserfiltration weniger als 0,5 x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1 im Untersuchungszeitraum betrug, wurden nach 0,1 µM Vinblastin 1,156-, nach 1 µM 1,7 und nach 10 µM 2,6 x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1 Wasserflussrate gemessen. Die unstimulierten Kontrollzellfilter blieben über den gesamten Versuchszeitraum stabil und reagierten gegen Ende des Experiments rasch auf die Bolus-Gabe von Staphylococcus aureusα -Toxin mit einer massiven Permeabilitätserhöhung.

3.2.2.2 MT-Hemmung nach Vinblastin-Gabe führt zu einer vermehrten Stressfaserbildung und endothelialer Retraktion mit interendothelialer Lückenbildung

Die morphologischen Zelluntersuchungen nach MT-Depolymerisation durch Vinblastingabe erfolgten mit der Fragestellung nach Sekundäreffekten auf F-Aktin und die Auswirkung auf das Endothel im Hinblick auf die gemessenen Permeabilitätszunahmen. Vinblastin wurde zur Untersuchung von MT und MF in Konzentrationen von 10 nM bis 100 µM über einen Zeitraum von 120 Minuten appliziert. Mit zunehmender Vinblastin-Konzentration kam es verglichen mit unstimulierten Kontrollzellen (Abb. 6-A) zu deutlichen Veränderungen des endothelialen Zytoskeletts. Konzentrationen von 10 nM Vinblastin (nicht gezeigt) führten schon zu einer leichten Depolymerisation der MT-Filamente, die in diffuser Grünfärbung der Zytoplasmen erkennbar war. Mikrofilamente zeigten eine geringfügige Verdichtung der Filamente in der Peripherie der Versuchszellen . Nach Stimulation der Endothelzellen mit 0,1 µM


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Vinblastin (Abb. 6-C) waren Mikrotubuli in Form struktureller Fasergeflechte nicht mehr erkennbar. Die depolymerisierten Tubulineinzelmoleküle führten zu einer gleichmäßigen Grünfärbung des Zytoplasmas. Die Zentrosomen als aktives MT-Keimbildungszentrum und Hinweis auf MT-Synthese zeigten sich als paranukleare Aufhellung (vgl. Pfeil). Die mikrotubulären Veränderungen nach Applikation von 0,1 µM Vinblastin führten zur verstärkten Umverteilung von F-Aktin (Abb. 6-D). Das Mikrofilamentsystem schien jetzt deutlicher verdichtet und reichte über das gesamte Zytoplasma von der Zellperipherie bis hin zum Nukleus (vgl. Pfeile). Zusätzlich traten vereinzelt interzelluläre Lücken zwischen benachbarten Zellen auf (vgl. Pfeilköpfe). Nach Stimulation mit 1 µM Vinblastin (nicht gezeigt) wurden einzelne, stark fluoreszierende MT-Fragmente, sogenannte parakristalline Aggregate, erkennbar. Mit ansteigender Vinblastinkonzentration (10 µM-100 µM) war eine quantitative Zunahme dieser MT-Aggregate bei gleichzeitiger Größenabnahme festzustellen (Abb. 6-E) . Mit zunehmender Depolymerisation von MT-Filamenten verstärkte sich der vorbeschriebene Verlauf für das Mikrofilamentsystem: Diffuse Anfärbung der Zytoplasmen mit F-Aktin, Stressfaserbildung, Loslösung von kontinuierlichen Zell/Zellkontakten mit Lücken-Bildung bei noch weitgehendem Zusammenhalt der Monolayer (0,1 µM Vinblastin), zunehmende Zellretraktionen nach 10- und 100 µM Vinblastin mit deutlicher Gap-Bildung und Interzellularbrückenbildung (Abb. 6-E). Nach Applikation von 100 µM Vinblastin (Abb. 6-E) war die Ausbildung von parakristallinen Aggregaten mit gleichmässiger Verteilung über das Zytoplasma am stärksten ausgeprägt. Gleichzeitig zeigte sich eine maximale Retraktion der Zellen mit Ausbildung langer mikrofilamentärer Interzellularbrücken (vgl. Pfeil).


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Abb. 6: Mikrotubulus- und Aktinfilamente nach Stimulation mit Vinblastin für 120 Minuten. A-B : unbehandelte Kontrollen; C-D : 0,1 µM Vinblastin: C : trotz MT-Depolymerisation werden MT synthetisiert (Pfeil markiert Zentrosom); D : Pfeile markieren F-Aktin-Umverteilung im Zytoplasma; Pfeilköpfe markieren Gap-Bildung. E : 100 µM Vinblastin: Doppelbelichtung zeigt MT-Depolymerisation mit maximaler Fragmentierung und Zellretraktion mit F-Aktin-Brücken (Pfeil). Grüne Färbung: Mikrotubulus-System; Rote Färbung: F-Aktin. Repräsentative Bildausschnitte aus 5 Versuchen.


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3.2.2.3  Vinblastin erhöht intrazelluläres F-Aktin

In dieser Versuchsreihe wurde die Frage untersucht, ob MT-Hemmung durch Vinblastin den intrazellulären F-Aktingehalt beeinflusst. Es wurde eine Konzentrationsreihe von 0,1 µM, 1µM, 10 µM und 100 µM erstellt. Vinblastin-Inkubation (1 µM, 10 µM) führte zu einem signifikant erhöhten intraendothelialen F-Aktingehalt. Bei 0,1 µM Vinblastin (Abb. 7-A) zeigte sich über den gesamten Zeitraum eine leichte F-Aktin-Zunahme (nicht signifikant), die im Vergleich zu den Kontrollzellen zwischen 4,4 % und 6 % lag. Bezogen auf den Ausgangswert zum Zeitpunkt t=0 stieg der endotheliale F-Aktin-Gehalt nach 60 Minuten um 8,2 % (von 0,183 ng/µg Protein auf 0,198 ng/µg Protein). Nach 90 und 120 Minuten wurden annähernd gleiche Werte gemessen (F-Aktinzunahme bezogen auf t=0 nach 90 Minuten: 8,2 %; nach 120 Minuten: 7,6 %). Im Vergleich mit 0,1 µM Vinblastin entwickelte sich nach Stimulation mit 1 µM Vinblastin (Abb. 7-B) ein höherer F-Aktin-Anstieg. Nach 30 Minuten vergrösserte sich der endotheliale F-Aktin-Wert signifikant um 13,1 % (von 0,183 ng/µg Protein auf 0,207 ng/µg Protein). Im Zeitfenster 30 bis 120 Minuten stabilisierte sich der F-Aktin-Zuwachs bei 0,208 ng/µg Protein. Dies entsprach einer Zunahme von 13,7 %. Die Applikation von 10 µM Vinblastin (Abb. 7-C) führte im Vergleich zu allen anderen Konzentrationen zur höchsten filamentären Aktin-Zunahme in den Versuchszellen. Bezogen auf den Ausgangswert zum Zeitpunkt t=0 stieg der Proteinanteil signifikant um 19,1 % (von 0,183 auf 0,218 ng/µg Protein). Im weiteren Verlauf sank der F-Aktingehalt nach 90 Minuten um 8,7 % (auf 0,199 ng/µg Protein) und stieg nach 120 Minuten wieder auf einen Wert von 0,204 an, was einer Mikrofilament-Zunahme von 11,4 % entsprach. Bei Applikation von 100 µM Vinblastin (Abb. 7-D) erfolgte zunächst eine leichte F-Aktin-Zunahme um 4,4 % (von 0,183 auf 0,191 ng/µg Protein) und im Zeitfenster 60 bis 120 Minuten eine F-Aktin-Abnahme, die nach 90 Minuten am stärksten ausgeprägt war. Hier


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lag der F-Aktingehalt bei 0,175 ng/µg Protein. Dies entsprach bezogen auf die Kontrollmessung unstimulierter Endothelzellen zum Zeitpunkt t=30 einer F-Aktin-Abnahme von 8,4 %. Nach 120 Minuten erhöhte sich der Mikrofilamentgehalt wieder leicht, blieb jedoch sowohl unter dem F-Aktin-Ausgangswert bei t=0 als auch unter der entprechenden Kontrollmessung unstimulierter Endothelzellen zum Zeitpunkt t=120.

Abb. 7: Konzentrations- und zeitabhängiger Verlauf des endothelialen F-Aktin nach Stimulation mit Vinblastin. A : 0,1 µM; B : 1 µM; C : 10 µM D : 100 µM. Die Zweiwegvarianzanalyse zeigte einen signifikanten F-Aktin-Anstieg nach 1µM und 10 µM Vinblastin. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte (± SEM) aus 5 separaten Versuchen.


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3.2.3.1  Vincristin erhöht die Permeabilität pulmonaler Endothelzellen

Ähnlich dem Wirkprofil von Vinblastin hemmt auch Vincristin suffizient die MT-Polymerisation und führt in höheren Konzentrationen zu einer MT-Aufspaltung in parakristalline Aggregate. Abb. 8 zeigt die Zunahme der hydraulischen Konduktivität gesealter endothelialer Monolayer nach Bolus-Gabe und anschließend kontinuierlicher Zufuhr von Vincristin in den Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM und 10 µM.

Abb. 8: Permeabilitätszunahme von Endothelzellmonolayer nach Vincristin-Applikation. Zum Zeitpunkt t=0 Min. wurde auf die gesealten Monolayer Vincristin in Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM, und 10 µM als Bolus mit anschließend kontinuierlicher Zuführung gegeben. Vincristin führte zeit- und dosisabhängig zu einer Zunahme der Wasserflussrate gesealter Endothelzellmonolayer. Gezeigt sind Mittelwerte ± SE aus 4 separaten Experimenten.


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Vincristin führte zu einer dosis- und zeitabhängigen Permeabilitätszunahme der Endothelzellmonolayer. Im Untersuchungszeitraum wurden nach Vincristin-konzentrationen von 0,1 µM 0,8, nach 1 µM 1,02 und nach 10 µM 2,03 x 10-5cm x s-1 x cm H2O-1 Wasserflussrate gemessen. Die Filtration der unbehandelten Kontrollfilter betrug während des Untersuchungszeitraumes weniger als 0,5 x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1.

3.2.3.2 MT-Hemmung nach Vincristin-Gabe führt zu einer vermehrten Stressfaserbildung und zur endothelialen Retraktion mit interendothelialen Lücken

Die Endothelzellen wurden mit Vincristin über einen Zeitraum von 120 Minuten in einer Konzentrationsreihe von 10 nM bis 100 µM stimuliert. Bezüglich der Veränderungen des Mikrotubulus-, Mikrofilamentsystems und der Zellmonolayer ähnelten die Resultate im wesentlichen den Ergebnissen nach Stimulation mit Vinblastin (vgl. Kap. 3.2.2.2). Die Stimulation von 10 nM und 0,1 µM Vincristin führte zur Depolymerisation von Mikrotubulus-Einzelfasern und Grünfärbung des Zytoplasmas (nicht gezeigt). Die Ausbildung parakristalliner MT-Aggregate konnte nach Inkubation mit 1 µM Vincristin beobachtet werden (Abb. 9-C). Eine Zunahme dieser fluoreszierenden Fragmente innerhalb der Zelle erfolgte mit weiter ansteigenden Vincristin-Konzentrationen. D as Mikrofilamentsystem zeigte nach Stimulation mit 10 nM und 0,1 µM Vincristin im Vergleich zu den Kontrollzellen eine Umverteilung innerhalb des Zytoplasmas. Dabei verdichteten sich die Aktinfilamente von der Zellperipherie bis hin zum Zellnukleus. Mit zunehmender MT-Hemmung (0,1 µM und 1 µM Vincristin) bildeten sich interzellulare Zwischenräume aus (vgl. Abb. 9-D). Nach Zugabe von 10 µM und 100 µM Vincristin kam es zur Ausbildung von Stressfasern, Interzellularlücken bis hin zu ausgeprägten


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Retraktionen der einzelnen Endothelzellen mit Bildung aktinfilamentärer Interzellularbrücken.

Abb. 9: Verteilung von Mikrotubulus-und Aktinfilamenten nach Stimulation mit Vincristin über 120 Minuten. A-B : unbehandelte Kontrollen; C-D : 1 µM Vincristin; C : MT-Depolymerisation mit Ausbildung parakristalliner MT-Aggregate (Pfeile). D : zytoplasmatische F-Aktin-Umverteilung, Pfeile markieren Gap-Bildung. Grüne Färbung: Mikrotubulus-System; Rote Färbung: F-Aktin. Repräsentative Bildausschnitte aus 3 separaten Versuchen.


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3.2.4.1  MT-Stabilisation durch Paclitaxel führt zu keiner Permeabilitätszunahme pulmonaler Endothelzellen

In dieser Versuchsreihe wurde untersucht, ob Mikrotubulus-stabilisierende Agenzien zu einer Veränderung der Barrierefunktion endothelialer Monolayer führen.

Abb. 10: Permeabilität pulmonaler Endothelzellmonolayer nach Paclitaxel-Exposition. Zum Zeitpunkt t=0 Min. wurde auf die gesealten Monolayer Paclitaxel in Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM, und 10 µM als Bolus mit anschließend kontinuierlicher Zuführung gegeben. Paclitaxel führte zu keiner signifikant erhöhten Wasserflussrate pulmonaler Endothelzellmonolayer. Die Filtration der unbehandelten Kontrollfilter betrug während des Untersuchungszeitraumes weniger als 0,5 x 10-5cm x s-1 x cm H2O-1 und die Kontrollzellen reagierten mit einem raschen Filtrationsanstieg auf Staphylococcus aureusα-Toxin. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM aus 6 separaten Experimenten.


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Abb. 10 zeigt den Verlauf der Endothelzellpermeabilität nach Paclitaxel-Applikation über einen Beobachtungszeitraum von 180 Minuten. Die Stimulation der Substanz in Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM und 10 µM führte in 6 separaten Experimenten zu keinem signifikanten Anstieg der pulmonalendothelialen Wasserflussrate. 10 µM Paclitaxel führte am Ende des Beobachtungszeitraums zu einer geringen Zunahme der Wasserflussrate bis 1,3 x 10-5cm x s-1 x cm H2O-1. Die Kontrollzellen blieben über den gesamten Versuchszeitraum stabil und reagierten am Ende des Experiments nach Bolus-Gabe von Staphylolcoccus aureusα -Toxin mit einer Permeabilitätserhöhung.

3.2.4.2 Konfluente Endothelzellmonolayer nach MT-Stabilisierung durch Paclitaxel

Bei diesen Experimenten sollte die Frage untersucht werden, ob MT-Stabilisierung zu Sekundärreaktionen des F-Aktins und der Endothelzellen führt. Paclitaxel stabilisiert MT-Systeme durch Bildung anormaler MT und durch Hemmung der MT-Depolymerisation. Bei entstehendem Mangel an freiem Tubulin wird die Bildung neuer funktionsfähiger MT unterdrückt. Paclitaxel wurde zur Untersuchung des Mikrotubulus- und Mikrofilamentsystems konfluent gewachsener pulmonaler Endothelzellen in Konzentrationen von 10 nM bis 10 µM über einen Zeitraum von 180 Minuten appliziert. Mit ansteigender Konzentration von Paclitaxel kam es zu einer deutlichen Veränderung der filamentären Mikrotubulusstrukturen. Ausgehend vom MT-Organisationszentum, dem Zentrosom, das deutlich als paranukleäre Aufhellung zu erkennen war, erstreckten sich die filamentären Fasern nach 10 nM Paclitaxel über das gesamte Zytoplasma bis in periphere Bereiche der Zellen. Das Aktinfilamentsystem zeigte nach dieser Paclitaxel-Konzentration keine auffälligen Veränderungen. Die peripher gelegenen schlanken


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Aktingeflechte der Endothelzellmonolayer waren ähnlich gleichmäßig strukturiert wie die Aktinfilamente der Kontrollzellen. Nach Inkubation von 0,1 µM und 1 µM Paclitaxel (vgl. Abb. 11-C) zeigten einzelne Mikrotubuli eine verdichtete Beschaffenheit und traten dadurch besonders in den Vordergrund. In ungewöhnlich geraden Linien bildeten die „anormalen" MT unterschiedliche Winkel zueinander und reichten bis zur Zellperipherie (vgl. Pfeile). Die Endothelzellen erhielten daher eine vergleichsweise kantige Gestalt. Zentrosomen waren als paranukleäre Aufhellung als „aktiv" erkennbar. Mikrofilamente lagen nach dieser Paclitaxel-Konzentration weiterhin als periphere, dichte Bänder in Membrannähe und die Endothelzellmonolayer zeigten konfluente Zellstrukturen ohne interzelluläre Lückenbildungen (vgl. Abb. 11-D). Nach Gabe von 10 µM Paclitaxel war eine „Ordnung" innerhalb der Mikrotubulusstrukturen nicht mehr erkennbar (nicht gezeigt). Es zeigten sich „Haufen“ von MT-Gruppen über die Zytoplasmen verteilt. Die Endothelzellmonolayer wirkten nach dieser Toxinapplikation etwas unruhiger und unregelmässiger. Das F-Aktinsystem zeigte im Vergleich zu den Kontrollzellen Stressfaserzunahmen bei einem überwiegend konfluenten Endothelzellverband.


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Abb. 11: Mikrotubulus- und Aktinfilamente nach Stimulation mit Paclitaxel über 180 Minuten. A-B: unstimulierte Kontrollzellen; C-D : 1 µM Paclitaxel; C : Pfeile markieren anormale MT in der Zellperipherie. D : Trotz anormaler MT-Strukur zeigten sich konfluente EC-Monolayer. Grüne Färbung: Mikrotubulus-Systeme; Rote Färbung: F-Aktin. (*): identischer Bildausschnitt. Repräsentative Bildausschnitte aus 3 separaten Experimenten.


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3.3  Barrierefunktionsstörungen pulmonaler Endothelzellen durch granulozytäre Wirkstoffe

3.3.1 HNE und H2 O2 erhöhen die Permeabilität pulmonaler Endothelzellen

Abb.12 zeigt die Zunahme der hydraulischen Konduktivität gesealter endothelialer Monolayer nach Bolusgabe und anschließend kontinuierlicher Zufuhr von humaner neutrophiler Elastase und 1 mM H2 O2 .

Abb. 12: Endotheliale Barrierefunktion nach Applikation von humaner neutrophiler Elastase und H 2 O 2 . Pulmonalarterielle Endothelzellen reagierten nach Stimulation mit proteasehaltigen Überständen (HNE) von 33 x 106 polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten und 1 mM H2 O2 mit signifikanten Zunahmen der Wasserflussrate. (∗) kennzeichnet die Boluszugabe zum Zeitpunkt t=0 Minuten. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM aus 4 separaten Experimenten.


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Bei beiden granulozytären Wirkstoffen zeigte sich im Versuchzeitraum zwischen 30 und 60 Minuten eine deutliche Barrierestörung der Endothelzellmonolayer. Nach ca. 70 Minuten führte die Stimulation von HNE zu einer signifikanten Zunahme der Wasserflussrate bis 6,8 x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1. Im Untersuchungszeitraum von 100 Minuten konnte nach Zugabe von 1 mM H2O25,1 x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1 Wasserflussrate gemessen werden. Die Filtration der unbehandelten Kontrollfilter betrug während des Untersuchungszeitraumes weniger als 0,5 x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1.

3.3.2 Zellretraktionen, Stressfaser- und Lücken-Bildung nach Applikation humaner neutrophiler Elastase

Proteasehaltige PMN-Überstände (vgl Kap. 2.5.1) wurden zur Untersuchung der Mikrotubulus- und Mikrofilament-Strukturen für 120 Minuten in den Mengen 100 µl, 200 µl und 400 µl auf die Endothelzellen gegeben. Morphologisch waren nach Stimulation mit granulozytären Proteasen keine eindeutigen Veränderungen des Mikrotubulussystems der Endothelzellen erkennbar (vgl. Abb. 13-C). Die MT-Strukturen zeigten nach Inkubation mit allen drei proteasehaltigen PMN-Überständen feingliedrige filamentäre Fasern, die vom paranukleär gelegenen Zentrosom in die Zellperipherie ausstrahlten. Das Zytoplasma der Zellen zeigte im Vergleich zu den Kontrollzellen (vgl. Abb. 13-A) eine etwas stärkere Grünfärbung als Hinweis für eine MT-Neusynthese. Exposition von Endothelzellen gegenüber proteasehaltigen PMN-Überständen führte konzentrationsabhängig zu Veränderungen des Mikrofilament-Systems. Nach 100 µl PMN-Überstand war eine Verdichtung der Aktinfilamente im gesamten Zytoplasma erkennbar (nicht gezeigt). Stressfaserbildung und Zellretraktionen führten vereinzelt zu Lückenbildung zwischen Nachbarzellen. Nach Stimulation mit 200 µl und 400 µl (vgl. Abb. 13-D) des PMN-Überstandes kam es im Endothelzellmonolayer zu ausgedehnter Stressfaserbildung (vgl. Pfeile) und verstärkter Zellretraktion mit interzellulärer


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Gap-Bildung. An einigen Stellen entstanden größere Lücken zwischen Nachbarzellen (vgl. Sterne). Zusätzlich waren vermehrt F-Aktin-Fragmentierungen erkennbar (vgl. Pfeilköpfe).

Abb. 13: Mikrotubulus- und Aktinfilamente nach Stimulation mit proteasehaltigen PMN-Überständen für 120 Minuten. A-B : unstimulierte Kontrollzellen; C-D : 400 µl PMN-Überstand: D : Sterne markieren Zelllücken; Pfeile zeigen F-Aktin-Stressfasern, Pfeilköpfe demonstrieren F-Aktin-Fragmentierung. Grüne Färbung zeigt MT-Systeme, die rote Färbung zeigt F-Aktin. Typische Bildausschnitte aus 2 unabhängigen Versuchen. (*): identischer Bildausschnitt.


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3.3.3  Zellretraktionen, Stressfaser- und Lücken-Bildung nach H2O2-Applikation

Pulmonale Endothelzellen wurden zur Untersuchung des Mikrotubulus- und Mikrofilament-Systems für 120 Minuten mit H2O2 in den Konzentrationen 10 µM, 100 µM und 1 mM stimuliert. Nach Applikation von 10 µM H2O2 (vgl. Abb. 14-C) zeigten sich keine eindeutigen Veränderungen der MT-Strukturen. Zentrosomen und filamentäre MT-Strukturen waren erkennbar. Die MT-Systeme wirkten aber ungleichmässig ausgebildet. Die Zytoplasmen zeigten eine stärkere Grünfärbung, hinweisend auf eine beginnende MT-Depolymerisation oder eine verstärkte Neusynthese von Tubulinmolekülen. Aktinfilamente, die sich in der Kontrollzellaufnahme als periphere Geflechte schlanker Bänder darstellten, verdichteten sich nach der Stimulation mit 10 µM H2O2 im Zytoplasma und bildeten massiv Stressfasern aus (Abb. 14-D). Außerdem kam es lokal zu Zellretraktionen mit Bildung kleinerer interzellulärer Lücken (vgl. Pfeile). Nach 100 µM H2O2-Exposition (nicht gezeigt) zeigten filamentäre Mikrotubuli nicht mehr die typische feingliedrige MT-Ausrichtung, sondern wirkten in ihrer Morphologie in den einzelnen Zellen ungerichtet und unpolar. Darüber hinaus war eine diffuse Grünfärbung des Endothels festzustellen, welche auf eine verstärkte MT-Depolymerisation oder Neusynthese hinwies. Die Zentrosomen waren an wenigen Stellen noch diskret erkennbar. 1 mM H2O2 führte zu ausgedehnten MT-Verlusten mit deutlichem Verblassen der Immunfluoreszenz-Färbung möglicherweise infolge Proteolyse (nicht gezeigt). Das Zytoplasma dieser Zellen wirkte daher vergleichsweise blass und war von griesartigen Einschlüssen durchsetzt. Zentrosomen waren hierbei nicht mehr zu erkennen. F-Aktin wurden nach Stimulation mit 100 µM und 1 mM H2O2 deutlich verändert. Es zeigten sich Zelllücken ohne Stressfaserbildung. In der höheren Dosierung konnten MF-Anteile nicht mehr angefärbt werden. Die ursprüngliche Wabenstruktur der peripheren Aktinbänder war bei wenigen Zellen nur noch rudimentär erkennbar. Der Endothelzellmonolayer war nicht


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mehr konfluent. Es zeigten sich größere Lücken zwischen den Zellen (nicht gezeigt).

Abb. 14: Mikrotubulus- und Aktinfilamente nach Stimulation mit H 2 O 2 für 120 Minuten. A-B : unbehandelte Kontrollzellen; C-D : 10 µM, C : MT ungleichmässig angeordnet, Zytoplasma-Grünfärbung bei MT-Depolymerisation oder MT-Neusynthese; D : massive Stressfaserbildung, Pfeile markieren Gaps; Grüne Färbung: Mikrotubulus-System; Rote Färbung: F-Aktin. (*): identischer Bildausschnitt. Repräsentative Bildausschnitte aus 3 separaten Versuchen.


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3.4  Barrierefunktionsstörungen pulmonaler Endothelzellen durch F-Aktin-wirksame Toxine

3.4.1 Cytochalasin D und Clostridium difficile- Toxin B-10463: Massive Permeabilitätszunahmen pulmonaler Endothelzellen

Abb. 15 Permeabilitätszunahme pulmonaler Endothelien nach Bolus-Zugabe von Cytochalasin D und Clostridium difficile- Toxin B. (∗ ) kennzeichnet Boluszugabe zum Zeitpunkt t=0 Minuten. Zum Zeitpunkt t=0 wurde auf die gesealten Monolayer 1µg/ml CD und 100 ng/ml TcdB-10463 als Bolus gegeben. Es zeigte sich bei CD ein rascher und reversibler Anstieg der Permeabilität mit einem Maximum nach 20 Minuten und im weiteren Verlauf eine stetig abfallende hydraulische Konduktivität. 100 ng/ml TcdB-10463 führte zu einer kontinuierlichen, signifikanten Zunahme der Wasserflussrate. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM aus 3 separaten Experimenten.


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Der Pilzmetabolit Cytochalasin D bindet mit hoher Affinität reversibel an Aktin-Filamente und führt zu ihrer Zerteilung in kürzere Fragmente. Nach Bolus-Applikation von 1 µg/ml Cytochalasin D zeigte sich ein rascher Zuwachs der Wasserflussrate gesealter Endothelzellen. Nach 20 Minuten wurden Höchstwerte der Filtration bis 9,5 x 10-5cm x s-1 x cm H2O-1 gemessen, die sich im weiteren Verlauf der Versuchsdurchführung deutlich zurückbildeten.

Clostridium difficil- Toxin B-10463 führt durch Hemmung von Rho-Proteinen zu einem F-Aktinverlust in Endothelzellen. Nach 100 ng/ml ToxB-10463 Bolus-Applikation zeigte sich im Versuchzeitraum zwischen 30 und 60 Minuten eine signifikante Barrierestörung der Endothelzellmonolayer. Nach ca. 120 Minuten der Toxin-Stimulation lag die Wasserflussrate bei ca. 6 x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1. Die Filtration der unbehandelten Kontrollfilter betrug während des Untersuchungs-zeitraumes weniger als 0,5 x 10-5cm x s-1 x cm H2O-1.

3.4.1.1 Intakte MT-Systeme bilden interzelluläre Verbindungen bei massiver Cytochalasin D-induzierter F-Aktin-Fragmentierung

Zur Untersuchung des MT- und MF-Systems wurde Cytochalasin D pulmonalen Endothelzellen für 30 Minuten in den Konzentrationen 0,5 µg, 1 µg und 2 µg appliziert. Cytochalasin D führte durch eine ausgeprägte F-Aktin-Fragmentierung zu deutlichen Formveränderungen von Endothelzellen und endothelialen Monolayern. Wie in Abb. 16-C gezeigt führte die Substanz zu keinem Abbau von MT-Strukturen. Morphologisch intakte filamentäre MT-Strukturen konnten nach allen Cytochalasin D-Konzentrationen beobachtet werden (vgl. Abb. 16-E). Ebenso wurden auch beginnende Zellteilungen mit Ausbildung morphologisch intakter Mitosespindeln gesehen (hier nicht gezeigt). Aufgrund der durch massive F-Aktinfragmentierungen entstandenen Zellretraktionen zeigten sich ungewöhnliche Zellformen. Durch ihre deutlich


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retrahierten Zellkörper und lang ausgestreckten Zellbrücken erinnerten diese an Nervenzellen. Mikrotubulusfilamente fanden sich dabei sowohl sternförmig in die Zellperipherie ausstrahlend als auch in komprimierter Form in den länglichen Zellbrücken, die Kontakte zu den Nachbarzellen bildeten. Bei solchen interzellulären Verbindungen konnten F-Aktinfragmente als „Bindeglied" zwischen interzellulären MT-Verbindungen beobachtet werden. Die Doppelbelichtung in Abb. 16-G zeigt Mikrotubulus-Brücken, die nur an solchen Stellen der Nachbarzellen binden, wo Aktinfragmente lokalisiert sind. Cytochalasin D führte, wie oben beschrieben, zu einer massiven Fragmentierung des F-Aktinsystems (Abb. 16-D, 16-F) . Nach Inkubation der Monolayer mit 0,5 µg, 1 µg und 2 µg Cytochalasin D war die für ruhende Endothelzellen typische wabenartige Aktinstruktur (Abb. 16-B) nicht mehr festzustellen. Die F-Aktinfragmente verteilten sich dabei scheinbar ungeordnet über das Zytoplasma der Endothelzellen. Kontinuierliche Zell-Zell-Kontakte waren unterbrochen und große interzelluläre Spalten und Lücken zu beobachten.


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Abb. 16: Mikrotubulus- und Aktin-Filamente nach Stimulation mit Cytochalasin D für 30 Minuten. A-B : unstimulierte Kontrollzellen; C-D : 0,5 µg, C : MT-System intakt, D : massive F-Aktin-Fragmentierung mit ausgeprägten Zellretraktionen; E-F-G : 2 µg, E : Optisch intaktes MT-System, F : fragmentiertes F-Aktin; G : Doppelimmunfluoreszenz zeigt ausgeprägte Zellretraktionen mit interzellulärer MT-Brückenbildung. Pfeile markieren MT-MF-Kolokalisationen. - (*): identischer Bildausschnitt. Repräsentative Bildausschnitte aus 3 separaten Experimenten.


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3.4.1.2  F-Aktin-Fragmentierung und intakte MT-Systeme pulmonaler Endothelzellen nach Applikation von Clostridium difficile- Toxin B-10463

TcdB-10463 führte vergleichbar mit Cytochalasin D zu einem F-Aktin-Verlust in pulmonalen Endothelzellen. Die Endothelzellen wurden über 240 Minuten mit Toxin B in Konzentrationen von 10 ng, 100 ng und 200 ng stimuliert. Das Toxin zeigte keine eindeutigen morphologischen Veränderungen am Mikrotubulus-System. Die Filamente waren nach Applikation aller drei Konzentrationen mikroskopisch erkennbar und reichten in typischer Anordnung sternförmig vom paranukleär lokalisierten Zentrosom in die Peripherie zur Zellmembran. In Abb. 17- C sind nach Applikation von 100 ng Toxin B Mikrotubulus-Systeme erkennbar. Neben filamentären Mikrotubuli und den Zentrosomen (vgl. Pfeile) wurden auch Zellteilungen mit Mikrotubulus-Spindel ge sehen, was auf ein eher intaktes Mikrotubulus-System hindeutet. Nach Stimulation mit 100 ng und 200 ng Toxin B kam es zu vermehrten Zellretraktionen innerhalb des Monolayers (nicht gezeigt). Die retrahierten Zellen wirkten grün überstrahlt. Die geschrumpften Zellen zeigten lange mikrotubuläre Zellbrücken. TcdB-10463 führte zu einem Verlust filamentären Aktins. Nach Applikation von 10 ng/ml Toxin B kam es im Bereich der Mikrofilamente bereits zu leichten Veränderungen (nicht gezeigt). Die wabenartige Struktur der peripheren Aktinfilamente war bei dieser Toxinkonzentration noch zu erkennen, jedoch zeigten sich vermehrt F-Aktin-Verdichtungen, Stressfasern und Fragmentierungen von Mikrofilamenten. Insgesamt schien der Monolayer im Vergleich zu unstimulierten Zellen sehr unruhig. Nachbarzellen rückten leicht auseinander, wodurch sich kleine Zellzwischenräume bildeten. Nach Applikation von 100 ng und 200 ng Toxin B- 10463 (Abb. 17-D) zeigten sich deutliche Veränderungen der Monolayer. An vielen Stellen bildeten sich retrahierte Zellen, deren mikrofilamentäres Zytoplasma in komprimierter Form zu roten Überstrahlung in den Abbildungen


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führten. Lange Plasmabrücken mit fragmentiertem F-Aktin bildeten die Verbindungen zwischen den retrahierten Endothelzellen und ihren Nachbarzellen (vgl. Pfeile in Abb. 17-D). Nichtretrahierte Zellen zeigten in ihrem Zytoplasma fragmentiertes filamentäres Aktin. Durch die zahlreichen Zellschrumpfungen kam es zu einer ausgeprägten Lückenbildung innerhalb der Endothelzell-Monolayer.

Abb. 17: Mikrotubulus- und Aktin-Filamente nach Stimulation mit Clostridium difficile- Toxin B-10463. A-B : unbehandelte Kontrollzellen; C-D : 100 ng/ml, C : Intaktes MT-System mit MT-Mitose-Spindel (Pfeil), Pfeilköpfe markieren Zentrosomen; D : Abrundungen von Endothelzellen bei ausgepägter F-Aktin-Fragmentierung, Pfeile markieren fragmentiertes F-Aktin in Interzellulärbrücken; Grüne Färbung: Mikrotubulus-Systeme; Rote Färbung: F-Aktin. Typische Bildausschnitte aus 3 separaten Experimenten.


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3.5  Barrierefunktionsstörungen pulmonaler Endothelzellen durch bakterielle Toxine

3.5.1  Staphylococcus aureus-α -Toxin erhöht die Permeabilität pulmonaler Endothelzellen

Die Bolusgabe von 10 µg/ml Staphylococcus aureus α -Toxin führte zu einem schnellen und deutlichen Anstieg der Filtrationsrate. Höchstwerte lagen bei 8,0 x 10-5cm x s-1 x cm H2O-1 Wasserflussrate. Eine Reversibilität durch Rückbildung der filtrierten Flüssigkeitsmengen nach Bolusgabe im Versuchszeitraum war nicht erkennbar.

Abb. 18: Permeabilitätszunahme pulmonaler Endothelzellen nach Bolus-Gabe von Staphylococcus aureus- α -Toxin. (∗ ) kennzeichnet Boluszugabe zum Zeitpunkt t=0 Minuten. Zum Zeitpunkt t=0 wurde auf die gesealten Monolayer 10 µg/ml α -Toxin als Bolus gegeben. Staphylococcus aureusα -Toxin zeigte einen raschen Anstieg der Wasserflussrate mit Plateauphase . Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM aus 3 separaten Experimenten.


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3.5.2  Destruktion von MT-Filamenten und F-Aktin nach Applikation von Staphylococcus aureus-α -Toxin

Pulmonale Endothelzellen wurden zur Untersuchung des Mikrotubulus- und Mikrofilamentsystems über 60 Minuten mit Staphylococcus aureus-α -Toxin in Konzentrationen von 10 µg/ml und 40 µg/ml stimuliert. Nach Inkubation mit 10 µg/ml des α -Toxins (Abb. 19-C) zeigten sich im Vergleich zu ruhenden Zellen (Abb. 19-A) diskrete Veränderungen endothelialer Mikrotubulusstrukturen. MT-Filamente waren vom Zentrosom auswachsend bis zur Zellmembran erkennbar. Das Zytoplasma war entsprechend einer verstärkten MT-Depolymerisation oder Neusynthese von Tubulineinzelmolekülen grün angefärbt. Die paranukleär gelegenen Zentrosomen traten optisch in den Vordergrund (vgl. Pfeile Abb. 19-C), was auf Aktivität der Mikrotubulus-Neusynthese hinwies. Das F-Aktin-System der Endothelien zeigte nach 10 µg/ ml α -Toxin (Abb. 19-D) zytoplasmatische Verdichtung der wabenartigen F-Aktin-Strukturen. Darüber hinaus waren Stressfasern, Zellretraktionen und Öffnungen kleiner interzellulärer Spalten zu beobachten. In einigen Zellen waren feine mikrofilamentäre granuläre Strukturen erkennbar (vgl. Pfeilkopf). 40 µg/ml α -Toxin (Abb. 19-E) führten zu anormalen Mikrotubulus-Strukturen. Die Fasern lagen zirkumferent im gesamten Zytoplasma und ihre „korbartige" Morphologie erinnerte eher an die Gestalt von Intermediär-Filamenten (s. Abb. 1-C). In vielen Zellen liessen sich keine MT-Strukturen anfärben. Zentrosomen, die ein Hinweis auf aktive MT-Synthese darstellen, waren in keiner der Zellen erkennbar. Nach Applikation von 40 µg/ml α -Toxin (Abb. 19-F) fanden sich F-Aktin-reiche Zellen mit Stressfaserbildung neben solchen Endothelzellen, in deren Zytoplasma kaum F-Aktin in Form von Bündeln und Geflechten vorhanden war. Stressfasern konnten nur in solchen Zellen beobachtet werden, in denen auch Mikrotubulusstrukturen vorhanden waren. In anderen Zellen zeigte sich ein feines granuliertes F-Aktin (vgl. Stern). Einzelne Zellen lösten


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sich aus dem Zellverband und hinterliessen große Zelllücken im Endothelzellmonolayer (vgl. Pfeil).

Abb. 19: Mikrotubulus- und Aktin-Filamente nach Stimulation mit Staphylococcus aureus- α -Toxin für 60 Minuten. A-B : Kontrollzellen; C-D : 10 µg/ml, C : Pfeile markieren optisch betonte Zentrosomen, D : Pfeile markieren Gaps, Pfeilköpfe markieren F-Aktin-Fragmentierung; E-F : 40 µg/ml, E: anormale und destruierte MT-Strukturen, F : Zytolyse, Destruktion von F-Aktin, Pfeil markiert Zellkollaps, Stern markiert geschädigte Endothelzelle mit feingranuliertem F-Aktin; (*): identischer Bildausschnitt. Typische Bildausschnitte aus 3 separaten Experimenten.


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3.6  Auswirkungen von Kombinationen Mikrotubulus-stabilisierender und MT-destabilisierender Substanzen auf das Zytoskelett pulmonaler Endothelzellen

Zur Klärung der Frage, wie endotheliale Mikrotubulus-Systeme auf eine Kombination von MT-depolymerisierenden und MT-stabilisierenden Agenzien reagieren, wurde diese Versuchsreihe durchgeführt. Es sollten ausserdem die Veränderungen der F-Aktin-Systeme und Veränderungen der Endothelzellmonolayer im Hinblick auf den jeweiligen MT-Status (MT-Stabilität vs. MT-Abbau) beobachtet werden.

Da Vinca-Alkakoide neben bekannter MT-Depolymerisation auch optisch gut darstellbare Tubulin-Aggregatbildung induzieren, wurde diese Substanzgruppe gegenüber Colchicin bevorzugt. Pulmonale Endothelzellen wurden über einen Zeitraum von 180 Minuten mit Paclitaxel in den Konzentrationen 0,1 µM, 1 µM und 10 µM inkubiert. Nach 60 Minuten Inkubationszeit wurden 100 µM Vincristin auf die stimulierten Endothelzellen dazugegeben.

3.6.1 Retraktionen, Stressfaser- und Lücken-Bildung pulmonaler Endothelzellen korrelieren mit MT-Stabilisation bzw. Destabilisation

Nach Vorinkubation der Endothelzellen mit 0,1 µM Paclitaxel und anschließend erneuter Stimulation mit 100 µM Vincristin (Abb. 20-A) zeigte das endotheliale Mikrotubulus-System wenig stabilisierte Mikrotubuli bei deutlich ausgeprägter parakristalliner Aggregatbildung (Paclitaxel-Wirkung vgl. Kap. 3.2.4.2; Vincristin-Wirkung vgl. Kap. 3.2.3.2). Die Zytoplasmen der Zellen waren grün angefärbt, was auf eine erhöhte Plasmakonzentration an Tubulineinzelmolekülen hindeutete. Das Mikrofilament-System zeigte in dieser


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Konzentrationskombination (Abb. 20-B) deutlich zytoplasmatische F-Aktin-Verdichtungen, Stressfaserbildung, allgemeine Zellretraktionen mit Lückenbildung (vgl. Pfeile Abb. 20-B). Im Vergleich mit 100 µM Vincristin ohne Paclitaxelzusatz zeigten sich hierbei aber deutlich schwächere Effekte. Mit zunehmender Paclitaxelkonzentration (vgl. Abb. 20-C) bei gleichbleibender Vincristindosierung (Paclitaxel 1 µM und Vincristin 100 µM) nahmen die stabilisierten Mikrotubuli quantitativ zu (vgl. Pfeile) bei gleichzeitiger Abnahme von parakristallinen Aggregaten (vgl. Pfeilköpfe). Dies führte zu einem Überwiegen von stabilisierten MT mit deutlich weniger ausgeprägter Zellretraktion, Stressfaser- und Lückenbildung (Abb. 20-D). Die beschriebene Tendenz setzte sich sich bei der nächst höheren Paclitaxel-Konzentration fort (Paclitaxel 10 µM und Vincristin 100 µM, nicht gezeigt). Die Endothelzellen zeigten bei eindeutigem Überwiegen von stabilisierten MT einen konfluenten Monolayer mit nur gering ausgeprägter Stressfaserbeteiligung, Lückenbildung und Zellretraktionen.


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Abb. 20: Mikrotubulus- und Aktin-Filamente nach Stimulation pulmonaler Endothelzellen mit 100 µM Vincristin bei Paclitaxel-Vorinkubation. A-B : Paclitaxel 0,1 µM, A : Überwiegen von Vincristin-induzierter MT-Depolymerisation und MT-Aggregatbildung; B : F-Aktin-Umverteilung und Gap-Bildung (Pfeile); C-D : Paclitaxel 1 µM, C : Überwiegen stabilisierter MT-Systeme, D : Moderate F-Aktin-Umverteilung und reduzierte Gap-Bildung im Vergleich zu 10-B; (*): identischer Bildausschnitt.


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29.01.2004