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4  Diskussion

Die Intaktheit des Mikrofilament-Systems ist eine wesentliche Voraussetzung für die Aufrechterhaltung der Barrierefunktion von Endothelzellen (21, 51, 74, 116, 137, 139). Die Funktion des Mikrotubulus-Systems ist in diesem Zusammenhang noch weitgehend unklar. In der vorgelegten Arbeit untersuchten wir primär das Verhältnis der beiden dynamischen Proteine (MT, MF) und ihre Bedeutung innerhalb der endothelialen Barriere. Es wurden MT-depolymerisierende und MT-stabilisierende Substanzen zur Untersuchung der Barrierefunktion und der zytoskelettären Filamente eingesetzt. Ferner fanden Substanzen Verwendung, bei denen Barrierestörungen endothelialer Zellen vorbeschrieben waren. Dabei wurden die Wirkungen und Wechselwirkungen bei Mikrotubulus- und Mikrofilamenten beobachtet.

4.1 Mikrotubulus-Systeme regulieren F-Aktin und die endotheliale Barrierefunktion

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass Mikrotubulus-Systeme in enger funktioneller Verbindung mit F-Aktin stehen und zur Endothel-Permeabilität wesentlich beitragen. Die Mikrotubulus-Depolymerisation pulmonaler Endothelzellen durch Colchicin und Vinca-Alkaloide führte zu einer signifikanten Barrierefunktionsstörung. Der MT-Abbau führte zeit- und dosisabhängig zu einer 5-10fachen Zunahme der hydraulischen Konduktivität. Dagegen zeigte die MT-stabilisierende Substanz Paclitaxel keine signifikant-messbare Permeabilitäts-Zunahme. Die in dieser Arbeit gezeigten morphologischen Befunde des Zytoskeletts nach MT-Abbau erklären die festgestellten Permeabilitäts-Veränderungen: Die Depolymerisation von Mikrotubulus-Systemen verändert morphologisch F-Aktin. Mit ansteigenden Spindelgift-Konzentrationen verteilen sich Aktin-Filamente über das gesamte Zytoplasma. Es werden Stressfasern ausgebildet und Zell-Retraktionen mit interzellulärer Lückenbildung werden erkennbar. Ein Anstieg der parazellulären Permeabilität wird somit verständlich. Die Umstrukturierung von F-Aktin nach MT-[Seite 83↓] Depolymerisation konnte in dieser Arbeit quantifiziert werden. Sowohl Colchicin als auch Vinblastin bewirkten intrazellulär teils deutlich erhöhte F-Aktin-Werte. Die genauen Zusammenhänge zur Klärung der F-Aktin-Umverteilung, Stressfaserbildung und Barrierestörung nach MT-Depolymerisation sind noch unklar. Sowohl biochemische als auch mechanische Aspekte bieten Erklärungsansätze der beschriebenen Ereignisse:

Es ist bekannt, dass junktionale Aktinfilamente sich kontinuierlich in der Peripherie der Endothelzellen ausdehnen („peripheral dense band") und wesentlich an der Barrierefunktion des Endothels beteiligt sind (2, 21, 24, 51). Die Adhäsionsverbindungen zwischen Endothelzellen und der extrazellulären Matrix werden durch einen komplexen Verbund von intrazellulärem F-Aktin und Bindeproteinen aufgebaut und durch komplexe Signalkaskaden reguliert (1, 21, 74). Studien zeigten, dass die kleinen GTP bindenden Rho-Proteine in Verbindungen mit aktinfilamentären „Adhäsions-Plaques" stehen und an der Ausbildung von Stressfasern und Kontraktilitätsveränderungen von Zellen beteiligt sind (51). Offenbar bestehen aber auch Verbindungen zwischen Rho-Proteinen und Mikrotubulus-Systemen. So wurden in neueren Studien MT-Interaktionen zur Rho-Signalkaskade beschrieben mit Zunahmen von Kontraktilität und Stressfaserbildung nach MT-Depolymerisation (51, 70, 159). Neueste Studien beschreiben das MT-gebundene Protein GEF-H1, welches die MT-induzierte Interaktion mit Rho-Proteinen und F-Aktin reguliert (65). GEF-H1 wird demnach bei MT-Depolymerisation freigesetzt und aktiviert, wodurch die Rho-Kaskade mit aktinfilamentären Kontraktilitätszunahmen und Stressfaserbildung in Gang gesetzt wird.

Die endotheliale Barriere setzt in ihrer Funktion ein intaktes Zytoskelett voraus, das aus einem komplexen, in sich verwobenen Netzwerk dreier Filamentgruppen (MT, MF, IF) besteht. Diese stehen über assozierte Proteine miteinander in Wechselwirkung (7, 18, 44, 56, 103, 113, 151). Mit Hilfe von dynamischen MaPs können Organellen entlang der MT in anterograde oder retrograde Zielrichtungen [Seite 84↓] bewegt werden. MaPs können dabei auch Aktin- und Intermediärfilamente binden, bewegen und beispielsweise Kreuzbrücken aufbauen (7, 18, 19, 44, 103, 113). Ingber berichtet in seinem mechanischen Ansatz zur Erläuterung der Zytoskelettfunktion von „Zugseilen und Haltestricken“, die die zelluläre Formstabilität im Gleichgewicht halten. Die röhrenförmigen Mikrotubulus-Filamente wirken in diesem Zusammenhang als steife Streben, die Kontraktionen des mikrofilamentären Zellkortex und Druckkräften von außen entgegenwirken können (56). Die in dieser Arbeit beschriebenen Sekundärreaktionen nach MT-Depolymerisation (F-Aktinumverteilung, Stressfaserbildung, Zellretraktionen, Zelllückenbildung) sollten somit auch mechanisch erklärbar sein: Über die stabilen MT-Leitschienen werden F-Aktinfilamente via Filament-assoziierter Proteine (z.B. MaP Kinesin) nach außen zur Zellmembran bewegt, wo diese als periphere Aktinbänder Adhäsionskomplexe über Bindeproteine bilden und zur Barrierefunktion beitragen. Nach MT-Depolymerisation fällt der nach außen gerichtete mikrotubuläre Druck ab und MT-MaP-MF-Bindungen lösen sich (Schema 5-B). Es überwiegen nach innen gerichtete Zugkräfte (z.B. durch Zellkortex und Intermediärfilamente), die F-Aktin aus der Peripherie ins Zytoplasma führen. Die Adhäsionsbindungen lösen sich partiell, es entstehen interzelluläre Lücken, die zur Barrierestörung führen. In diesem Zusammenhang ist auch eine gesteigerte F-Aktinsynthese denkbar (Schema 5-C), da F-Aktin über Bindungsverluste von Capping-Proteinen (MaP) am „barbed-end" frei wird und eine MF-Neupolymerisation einsetzen kann. F-Aktin bleibt in interzellulären Brücken bestehen und Kontakte zwischen Nachbarzellen erhalten. Hierbei bestehen möglicherweise entweder besonders stabile mikrofilamentäre Adhäsionskontakte oder das durch Zell-Retraktion reduzierte Kräfteverhältnis reicht nun nicht mehr aus, um weitere Adhäsionen zu lösen (Schema 5-D).


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Schema 5: Modellvorstellung zur MT-MF-Interaktion über MaP zur Aufrechterhaltung junktionaler Adhäsionsverbindungen zwischen Zellen und mögliche Ereignisse nach MT-Depolymerisation. 5-A : Mikrotubuli stabilisieren junktionale Adhäsionsverbindungen. Über MT-Leitschienen durch MaP verknüpft (z.B. Kinesin) erfolgt der F-Aktin-Transport in den Zellmembranbereich. Der nach außen gerichtete mikrotubuläre Druck stabilisiert die Verbindungen von F-Aktin und Integrinen mit Nachbarzellen. 5-B : MT-Depolymerisation führt zu einem Verlust der nach außen gerichteten Druckkräfte und der MT-MaP-MF-Verbindungen. 5-C : Das Überwiegen intrazellulärer Zugkräfte führt zur Destabilisation junktionaler Adhäsionen. Es bilden sich interzelluläre Lücken. 5-D : F-Aktin-Zellbrücken stabiler Adhäsionsverbindungen überbrücken interzelluläre Lücken.

Der beschriebene mechanische Ansatz morphologischer Veränderungen nach MT-Abbau kann zusätzlich durch die oben beschriebene Aktivierung biochemischer Signalwege verstärkt bzw. ergänzt werden. Durch Freisetzung von GEF-H1 nach MT-Depolymerisation können Rho-Proteine aktiviert werden, die ihrerseits zu Stressfaserbildung führen und über MLC-Phosphorylierung zu einer Zellkontraktilitäts-Zunahme beitragen (65). Dies würde eine entstehende Barriere-funktionsstörung verstärken. Die beschriebenen Resultate stehen in Einklang mit den Studien von Verin et al, die nach MT-depolymerisierenden Substanzen eine EC-Barrierestörung und nach Vorinkubation durch Paclitaxel einen signifikant


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schwächeren Effekt beobachteten (151). Die Untersuchungen mit der MT-stabilisierenden Substanz Paclitaxel zeigte in der vorgelegten Arbeit im Vergleich zur MT-Depolymerisation ebenso deutlich abgeschwächte Effekte. Paclitaxel fördert die Bildung anormaler, ungewöhnlich stabiler Mikrotubuli (8, 26, 90). Nach Applikation der Substanz waren keine signifikanten Permeabilitätszunahmen festzustellen. Morphologisch zeigten sich betonte MT-Strukturen, die zu keiner wesentlichen Veränderung des F-Aktins führten. Auch zeigten sich keine interendothelialen Lücken. Offenbar werden durch die stabilisierten MT-Systeme Voraussetzungen erfüllt, die für eine funktionierende Barrierefunktion erforderlich sind. Nach dem oben beschriebenen Modell (Schema 5) und dem Erklärungsansatz von Ingber (56) bleiben die durch Paclitaxel künstlich stabilisierten MT-Streben einschließlich der MT-MaP-MF-Verbindungen erhalten, und tragen zur Zellkonfluenz bei.

Die Kombinationsexperimente der vorgelegten Arbeit mit depolymerisierenden (Vincristin) und stabilisierenden MT-Toxinen (Paclitaxel) unterstreichen die enge Wechselbeziehung der beiden dynamischen Filamentsysteme MT und Aktin. Ein Überwiegen von depolymerisierten MT gegenüber stabilen MT führte direkt zu einer F-Aktin-Umverteilung, konsekutiv mit Zellretraktionen und Zelllückenbildung. Umgekehrt zeigte sich bei höherdosierten Paclitaxel-Konzentrationen ein Übergewicht an stabilen MT gegenüber depolymerisierten MT mit einer deutlich geringer ausgeprägten Retraktions- und Zelllücken-Bildung.

4.2 Stabilisation von Adhäsionsverbindungen pulmonaler Endothelzellen durch MT-Systeme nach F-Aktinverlust durch Cytochalasin D und TcdB-10463

Cytochalasin D wirkt mit hoher Affinität am schnell wachsenden Plus-Ende von F-Aktin („barbed end“) und hemmt dadurch die weitere Polymerisation der Mikrofilamente. Am entgegengesetzten „pointed end" erfolgt die Abdissoziation von G-Monomeren und es entsteht eine Verkürzung des Polymers (12, 13, 15, 114). [Seite 88↓] Cytochalasin D reduziert signifikant den endothelialen F-Aktin-Gehalt (123) und „zerteilt“ Aktinfilamente in kürzere Abschnitte (15). Permeabilitätsmessungen ergaben nach Cytochalasin D-Bolus-Gabe einen raschen und reversiblen Anstieg der hydraulischen Konduktivität. Morphologisch zeigte sich die Wirkung des Pilzmetabolites in einer massiven intrazellulären F-Aktin-Fragmentierung. Die Zell/Zellkontakte waren großflächig aufgelöst und die EC-Monolayer zeigten ausgeprägte Zell-Retraktionen mit großen interzellulären Lücken und interzellulären MT-Brücken. Verantwortlich für die deutlichen Permeabilitätszunahmen und die morphologischen Veränderungen der EC-Monolayer ist primär der Abbau des F-Aktins. Die Mikrofilamente sind wesentlich an der Aufrechterhaltung der endothelialen Barriere und der Zellform beteiligt (21, 24, 74, 116). Die Untersuchung der Mikrotubulus-Strukturen nach Cytochalasin D-Gabe zeigte in stark retrahierten Zellen filamentäre MT, Zentrosomen und Mitose-Spindeln als Zeichen intakter MT-Systeme. Darüber hinaus zeigten die Zellen trotz fulminanter Retraktion und großer Zelllücken eine deutlich ausgebildete Zellbrückenbildung. In diesen Zellbrücken waren Mikrotubulus-Filamente erkennbar, die über größere Distanzen, mit den Nachbarzellen verbunden, Zell/Zellkontakte bildeten. Interessanterweise bestanden die „Brückenköpfe", mit denen die Mikrotubuli verknüpft waren, aus F-Aktin. Die morphologischen Ergebnisse nach CD-Stimulation geben somit Anlass zu der Annahme, dass MT-Systeme in Verbindung mit F-Aktin junktionale Adhäsionsverbindungen bilden können (vgl. Schema 6). Diese Annahme steht in Einklang mit Studien, die Verknüpfungen zwischen MT und fokalen Adhäsionen sowie eine beschleunigte fokale Kontaktentwicklung durch MT beschreiben (6, 23, 70, 97, 105). Darüber hinaus scheinen intakte MT-Systeme für die Wiederherstellung retrahierter Zellen von großer Bedeutung zu sein. Die Reversibilität der Barrierestörung, die bei Permeabilitätsmessungen nach CD-Applikation festzustellen ist (15, 51, 124), könnte über das intakte MT-System erklärt werden. Nach Beendigung der „barbed end"-Blockade und nach Beginn erneuter F-Aktin-Polymerisation könnten MF, die mit MT-Strukturen verknüpft sind, ein rasches


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Schema 6: Modellvorstellung zur MT-MF Interaktion nach F-Aktin-Zerstörung durch Cytochalasin D und TcdB-10463. 6-A : Die massive Fragmentierung der MF führt zur Auflösung junktionaler F-Aktin-Integrinbindungen. 6-B : MT führen im Verbund mit F-Aktinfragmenten zu einer Stabilisierung lokaler Adhäsionsbindungen. In den Bereichen der Adhäsions-Verluste kommt es durch einwärtsgerichtete Zugkräfte zu großen Zelllücken (Gaps) und es entstehen interzelluläre MT-Brücken.

„Wiederaufspannen" der retrahierten Zellen bewirken und folglich zur Wiederherstellung der Barrierefunktion der EC führen. Diese Erklärungsansätze stehen in Einklang mit Ingber, der in seinen Ausführungen zum Aufbau und zur Funktion eines intakten Zytoskeletts F-Aktin mit „zellulären Zugseilen“ und das MT-System mit „druckresistenten stabilen Streben“ verglich und für Lösungen vieler


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Fragen bezüglich MT, MF und der Zellformbildung auf ihre lokalen Verknüpfungen innerhalb der „3-dimensionalen Architektur“ hinwies (56).

Das Toxin B von Clostridium difficile ist ein einkettiges 270-kDa Molekül, welches über Endozytose in die Zellen aufgenommen wird. Innerhalb der Zellen glukosyliert das Toxin Rho-Proteine am Threonin in Position 35/37, die dadurch inaktiviert werden (51, 60, 61). Die Hemmung der Rho-Proteine führt zu einem Verlust von F-Aktin und der endothelialen Barrierefunktion (51). Messungen des endothelialen F- Aktins nach Stimulation mit 100 ng/ml TcdB zeigten einen Verlust des F-Aktins von bis zu 50% (51). Die in der vorgelegten Arbeit dokumentierten morphologischen Untersuchungen von MT und MF nach TcdB-10463-Stimulation zeigen, dass insbesondere das Mikrofilamentsystem von der Toxin-Wirkung betroffen wird. Grobe und feingranulierte F-Aktin-Fragmentierungen waren so stark ausgeprägt, dass Zellen ihre fokalen Kontakte verloren und retrahierten. Dabei entstanden große Interzellularlücken im Bereich der Endothelzellmonolayer, die die gemessene Hyperpermeabilität erklären. Das MT-System zeigte dagegen keinen Hinweis auf TcdB-10463-induzierte Schäden. Nach 240 Minuten Einwirkungszeit waren neben feingliedrigen MT-Filamenten und Zentrosomen auch Mitosevorgänge mit der Ausbildung mikrotubulärer Spindeln zu beobachten. Das Mikrotubulus-System wurde durch die ausgeprägten Zellformveränderungen aber passiv in seiner Form verändert. In retrahierten Endothelzellen zeigten sich filamentäre MT in langen Zellbrücken zwischen den Nachbarzellen. Die Ergebnisse ähneln den Resultaten nach Cytochalasin D-Inkubation. Das intakte MT-System trägt über die Brücken zu Verbindungen mit Nachbarzellen bei (vgl. Schema 6-B). Das setzt eine Verknüpfung zwischen dem MT-System und fokalen Adhäsionsbindungen voraus.


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4.3  Granulozytäre Wirkstoffe führen zu einer endothelialen Barrierestörung durch Stressfaser- und Zelllücken-Bildung

Humane neutrophile Elastase (HNE) gilt in bezug auf ihre breite Substratspezifität und ihre Proteolysekinetik als hochpotente granulozytäre Protease (134). Studien sprechen HNE eine wichtige PMN-mediierte Rolle zur Veränderung endothelialer Zell-Funktionen zu. Smedly et al. beschrieben HNE als den wesentlichen Faktor der Neutrophilen-initiierten Endothelverletzungen (127). Darüber hinaus wurden HNE-abhängige Zunahmen transendothelialer Albuminpassagen beschrieben (93). Permeabilitätsmessungen an pulmonalen Endothelzellen ergaben eine 10-20fache Zunahme der Wasserflussrate nach HNE-Stimulation (138). Die Ursache der endothelialen Schrankenstörung ist jedoch weitgehend unklar. Es werden unterschiedliche Wirkmodi diskutiert. HNE könnte enzymatisch zu einer Endothelzellschädigung mit Schrankenstörung führen oder nicht-enzymatisch als Kation-Protein wirken (93, 138). Die morphologischen Untersuchungen auf HNE-induzierte Veränderung des Mikrotubulus-Systems erbrachten keine eindeutigen Hinweise. Die MT-Systeme zeigten in allen Protease-Konzentrationen feingliedrige Filamente und Zentrosomen. Vielmehr schien das F-Aktinsystem in HNE-assoziierte zytoskelettäre Änderungen involviert zu sein. Mit zunehmendem Volumen der PMN-Überstände zeigten sich massiv ausgeprägte Stressfasern, F-Aktinverdichtungen, lokale Zellretraktionen mit interzellulären Gaps sowie diskrete F-Aktin-Fragmentierungen. Ein deutlicher Mikrofilamentabbau, der durch ausgeprägtere F-Aktin-Fragmentierungen sichtbar würde (vgl. Cytochalasin D und TcdB-10463, Kap. 4.2), war hierbei aber nicht zu beobachten. Die Endothelzellen zeigten deutlich ausgeprägte Formveränderungen. Darüber hinaus waren Zelllücken erkennbar, die die Zunahme der Wasserflussrate erklären können. Die beschriebenen Barrierestörungen beruhen wahrscheinlich auf einer Aktivierung kontraktiler zytoskelettärer Komponenten, wie dem Aktomyosin, das über komplexe Stoffwechselwege gesteuert wird. Durch entstehende Zellkontraktionen und die Ausbildung von Stressfasern könnten Adhäsionsbindungen gelöst werden. Suttorp et al. (138) diskutierten in [Seite 92↓] diesem Zusammenhang direkte Schädigungen der interendothelialen Verbindungen und der subendothelialen Matrix, die zur Ausbildung von Zelllücken und Barrierestörungen führen.

Von PMN sezernierte Sauerstoffradikale können zu einer akuten Zellschädigung führen (4, 132). Die Exposition von pulmonalen Endothelzellen mit H2O2 kann schwerwiegende metabolische und funktionelle Störungen zur Folge haben. Die Aktivierung der Arachidonsäurekaskade, DNA-Strangbrüche, ATP-, cAMP- und NAD-Reduktionen sowie die Hemmung der Glykolyse und Proteolysereaktionen wurden in diesem Zusammenhang beschrieben (110, 132, 154, 155, 156). Als Auswirkung der Zellschädigung gegenüber pulmonalen Endothelzellen mit Destruktion des Zytoskeletts wurde eine Permeabilitätszunahme gegenüber Wasser und Albumin festgestellt (4, 50, 143, 154). H2O2 führte zeit- und dosisabhängig zu einem Anstieg der hydraulischen Konduktivität endothelialer Monolayer (143, 154). Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten morphologischen Veränderungen des endothelialen Zytoskeletts ergaben nach niedriger H2O2-Exposition (10 µM) sowohl bei den Mikrotubulus- als auch bei den Mikrofilamenten Veränderungen: MT zeigten, bei weitgehendem Erhalt ihrer Filamente, Hinweise für Neusynthese oder Depolymerisation. Das F-Aktin blieb in seiner filamentären Struktur, zeigte aber eine ausgeprägte Umverteilung und Verdichtung mit massiver Stressfaserbildung. Innerhalb der EC-Monolayer waren Zellretraktionen und die Bildung kleiner Interzellularlücken auffällig. Die beschriebenen morphologischen F-Aktin-Veränderungen nach niedriger H2O2-Dosierung stimmen mit den Beschreibungen von Barnard et al. überein (4). Hier wurde die H2O2-Applikation mit vermehrten peripheren Aktinfilamenten und Zelllückenbildungen assoziiert. Ursächlich wurden intrazelluläre Signalwege, wie die Aktivierung der Proteinkinase C beschrieben, die zu einer mikrofilamentären Reorganisation mit Zelllücken und Barrierestörung führte. Aber auch eine MLCK-abhängige Zellkontraktions-Zunahme mit Zelllückenbildung wird im Zusammenhang mit H2O2-induzierter Endothelpermeabilitätsstörungen gesehen (110, 137, 143). Umverteilung und die Verdichtung von F-Aktin nach H2O2-[Seite 93↓]Applikation wurden auch in der Arbeit von Roth bestätigt (110). Dabei wurde der Übergang einer frühen F-Aktin-Depolymerisationsphase in eine spätere Polymerisationsphase mit signifikant erhöhtem F-Aktingehalt beschrieben (110). Ausgeprägte morphologische Veränderungen der EC-Monolayer wurden bei höheren H2O2-Konzentrationen (100 µM, 1 mM) festgestellt. Hier waren mikrotubulär und mikrofilamentär deutliche Destruktionen der zytoskelettären Komponenten erkennbar. Die Zentrosomen waren nicht mehr als Zeichen einer intakten MT-Synthese zu beobachten. Die beschriebenen Veränderungen entsprechen dabei am ehesten proteolytischen Reaktionen. Nach Barnard et al. führt eine höhere H2O2-Konzentration, auf dem Boden oxidativer Zellschäden, zu einer PKC-unabhängigen Barrierestörung (4). Höhere H2O2-Konzentrationen zeigten als Zeichen des irreversiblen Verlustes der Zellintegrität die Freisetzung von LDH und 51Cr (110, 132, 142, 153, 155). In niedriger H2O2-Konzentration können die Veränderungen der Endothelien noch reversibel sein, da zum einen keine erhöhte LDH-Freisetzung auf eine Zytolyse hinweist (4) und zum anderen über ein weitgehend intaktes MT- und F-Aktin-System zelluläre Reorganisationsmechanismen möglich erscheinen.

4.4 Kombinierte MT- und F-Aktinalteration durch Staphylococcus aureusα -Toxin führen zu einer endothelialen Barrierestörung

Staphylococcus aureus α -Toxin ist ein porenbildendes Exotoxin, das von pathogenen Staphylokokkenstämmen sezerniert wird (31). Das Toxin wird als ein hydrophiles 3S Molekül freigesetzt. Nach Kontakt mit Zellmembran-Lipid-Bilayern führt die Bildung ringförmiger transmembranöser Kanäle zu einem Einstrom extrazellulärer Ca2+-Ionen. Diese können Kaskaden von Signalwegen (u.a. den Arachidonsäure-Metabolismus) in Gang setzen. In hohen Dosen kann α -Toxin zur Zytolyse führen (120, 136, 140, 141). Das Toxin erhöhte rasch und potent die Permeabilität der Endothelzellmonolayer für Wasser und Albumin (136). Morphologisch zeigten sich nach der Stimulation mit α -Toxin dosisabhängige Mikrotubulus- und F-Aktin Veränderungen. In niedrigerer [Seite 94↓] Konzentration war ein leicht deformiertes MT-System mit betonten Zentrosomen festzustellen, welches auf eine MT-Störung mit aktiver Neusynthese hinwies. Morphologisch erschienen die Filamente wie „verklebt". Das F-Aktin zeigte sich dabei verdichtet. Bei den Endothelzellen waren Zellretraktionen mit Ausbildung kleiner Zelllücken zu beobachten. Für die Befunde könnten die vorbeschriebenen MT-Veränderungen verantwortlich sein. In der vorliegenden Arbeit konnten wir demonstrieren, dass MT-Schäden zu F-Aktinumverteilungen und Zellretraktionen mit Lücken-Bildung führen. Eine andere denkbare Ursache für mögliche Kontraktionen und die Zelllücken-Bildung nach α -Toxin-Gabe könnte der Einstrom extrazellulärer Ca2+-Ionen sein (31, 136). Ca2+ würde in Gegenwart von Calmodulin zur Aktivierung der MLCK und zu auf Aktomyosin basierenden Kontraktionen führen (136). In höherer α -Toxin-Konzentration wurden deutliche destruktive Veränderungen der MT-Strukturen, der F-Aktin-Systeme sowie der EC-Monolayer beobachtet. Basierend auf dem mechanischen Ansatz dieser Arbeit und den Studien Ingbers lassen sich die Beobachtungen der höheren α -Toxin-Konzentration auch mechanisch erklären (56): Durch die fehlende Stabilisation sowohl der MT-Strukturen als auch der F-Aktin-Systeme kommt es zu einem Verlust der nach außen gerichteten Druckkräfte und zu einer Auflösung fokaler Adhäsionen. Dies führt konsekutiv zu schweren Zellformveränderungen mit großer Lückenbildung und Zellkollaps einzelner Endothelzellen mit massiver endothelialer Barrierestörung.

4.5 Tabellarischer Überblick

Tabelle 1 gibt einen Überblick über die Wirkungsweise der in dieser Arbeit verwendeten Substanzen in bezug auf die Permeabilitätsdynamik und die Veränderung bzw. Schädigung der untersuchten zytoskelettären Filamentarten MT und F-Aktin. Weiterhin wird das Vorhandensein bzw. Nicht-Vorhandensein des MT-Keimbildungszentrums (Zentrosom) dargestellt. Mit Ausnahme der MT-stabilisierenden Substanz Paclitaxel führten alle applizierten Substanzen zu einer [Seite 95↓] signifikanten Hyperpermeabilität. Bezüglich der Zunahme der Wasserflussrate zeigte sich ein deutlicher Unterschied zwischen MT-depolymerisierenden Substanzen und F-Aktin-wirksamen Toxinen. Die Permeabilitätszunahme war bei direkter F-Aktinschädigung wesentlich deutlicher ausgeprägt als bei MT-Depolymerisation. Die Zunahme der Wasserflussrate erfolgt dabei im Vergleich schneller und stärker. Die MT-Depolymerisation führte zu sekundären F-Aktinveränderungen (F-Aktin-Umverteilung, Stressfaser-, Zelllücken-Bildung) und folglich zu einer sekundären Barrierestörung mit Hyperpermeabilität. Die Zentrosomen waren dabei auch in höheren Toxinkonzentrationen erkennbar und eine MT-Neusynthese nach Beendigung der Toxinwirkung wahrscheinlich. Substanzen, die schädigend auf das F-Aktin wirken, aber zu keiner MT-Zerstörung führten (dementsprechend auch kein Zentrosomverlust), verdeutlichen einen möglichen Zusammenhang zwischen Zellschäden auf dem Boden von F-Aktinabbau, dem Vorhandensein von MT und Zentrosomen sowie der Möglichkeit zur Reversibilität der Ereignisse und Wiederherstellung des 3-dimensionalen Zytoskeletts. Cytochalasin D und Toxin B von Clostridium difficile führten zu einem massiven Abbau von F-Aktinstrukturen ohne MT- und Zentrosomverlust. Eine rasche Reversibilität der Barrierestörung ist für Cytochalasin D (15, 123) beschrieben worden und wurde auch in den Versuchen der vorgelegten Arbeit festgestellt. Die vielseitigen Zellfunktionen der Mikrotubulus-Systeme erlauben es möglicherweise den Endothelzellen, den durch massiven F-Aktinverlust entstandenen Zellschaden teils zu stabilisieren und sowohl die Regeneration von F-Aktin als auch die Wiederherstellung der Barrierefunktion einzuleiten. Schwerste Zellschäden waren bei den Wirkstoffen H2O2 und Staphylococcus aureusα-Toxin zu beobachten, bei denen es in höheren Konzentrationen zu einem kombinierten F-Aktin-, Mikrotubulus- und Zentrosom-Verlust kam. Hierbei zeigte sich ein schwerwiegender Stabilitätsverlust in den Zellformen mit zum Teil zellkollaptischer Ausprägung. Ferner waren Zentrosomen nicht mehr erkennbar und damit eine MT-Neusynthese eher unwahrscheinlich. Das Vorhandensein von Zentrosomen mit der Möglichkeit zur raschen Neusynthese funktionsfähiger Mikrotubulusfilamente scheint für die zelluläre Regenerations-[Seite 96↓] fähigkeit nach zelltoxischen Ereignissen unterschiedlicher Pathoäthiologie von wesentlicher Bedeutung zu sein.

Tabelle 1 : Vergleich der Filtrationsrate (y x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1) der verwendeten Substanzen nach 30, 60 und 120 Minuten in bezug auf Mikrotubulusschädigung, Zentrosomverlust und F-Aktin-Schäden.

Substanz

30'

60'

120'

MT

ZentrosomVerlust

F-Aktin

Colchicin 10-4 M

0,7

1,7

4,0

++

-

-/+

Vinca-Alkaloide 10-5 M

0,5

0,7

1,5

++

-

-/+

Paclitaxel 10-5 M

0,3

0,3

0,5

+/-

-

-

HNE 33 x

106 PMN

2,8

5,0

>7,0

-

-

+

H2O2

1mM

0,7

2,0

>5,0

+

+

+

TcdB-

10463

100 ng/ml

0,7

1,3

4,8

-

-

++

Cytoch.D 1 µg/ml

>9,0

./.

./.

-

-

++

α-Toxin

(S.aureus) 40 µg/ml

6,0

6,2

6,0

+

+

+


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HTML-Version erstellt am:
29.01.2004