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5  Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurde die Bedeutung des Zytoskeletts für die Regulation endothelialer Permeabilität untersucht. Dabei wurden insbesondere die Wirkung und Wechselwirkung von Mikrotubulus- und F-Aktinsystemen auf die Endothelbarriere und deren Morphologie betrachtet. Hierfür wurden Toxine eingesetzt, die direkt oder indirekt am Mikrotubulus- oder am Mikrofilamentsystem wirken (Colchicin, Vinca-Alkaloide, Paclitaxel, Cytochalasin D, Toxin B-10463 von Clostridium difficile , α -Toxin von Staphylococcus aureus , H2O2, humane neutrophile Elastase). Als experimentelles Modell zur Permeabilitätsmessung dienten auf Polycarbonatfiltern gewachsene Endothelzellen, die unter einem hydrostatischen Druck von 10 cm Wassersäule den unterschiedlichen Substanzen ausgesetzt wurden. Die morphologischen Untersuchungen des endothelialen Zytoskeletts (MT, MF) erfolgten durch Doppelimmunfluoreszenz-Mikroskopie. Ferner wurde der endotheliale intrazelluläre F-Aktin-Spiegel mittels TRITC-Phalloidin fluorometrisch quantifiziert. F-Aktin übt eine Hauptfunktion bei der Regulation der Endothelpermeabilität aus. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Mikrotubulus-Systeme in enger Verbindung mit F-Aktin stehen und einen wesentlichen Beitrag zur endothelialen Barrieresteuerung leisten. Die eingesetzten Mikrotubulus-Hemmer führten zeit- und dosisabhängig zu einer 5-10fachen Permeabilitäts-Zunahme. Morphologisch zeigten sich dabei Stressfaserbildungen, zelluläre F-Aktin-Umverteilungen und Zelllücken-Bildung. Ferner konnte eine Zunahme des intrazellulären F-Aktins nach MT-Depolymerisation gemessen werden. Die Stabilisierung der MT-Systeme durch den MT-Hemmer Paclitaxel führte zu keiner signifikanten Barrierefunktionsstörung. Die in der vorgelegten Arbeit erzielten Resultate verdeutlichen, dass MT-Systeme im Verbund mit F-Aktin fokale Adhäsionen formieren und stabilisieren. Ferner unterstreichen sie sowohl biochemische als auch mechanische Studien zum Thema Zellretraktion nach MT-Abbau. Die Depolymerisation von MT und die Freisetzung von MaPs führen zu einer Aktivierung von intrazellulären Signalkaskaden (GEF-H1-, Rho-, MLCK-Aktivierung) und konsekutiv zu einer erhöhten Zellkontraktilität (51, [Seite 98↓] 65, 70, 159). Durch den Verlust der nach außen gerichteten MT-Stabilisation führen zusätzlich zelluläre und F-Aktin-assoziierte Zugkräfte zu Zellretraktionen und Zelllücken-Bildung. Die MT- und Zellmorphologie nach primärem F-Aktinabbau war Gegenstand weiterer Untersuchungen der vorgelegten Arbeit. Cytochalasin D und TcdB-10463 bewirken eine massive F-Aktinfragmentierung, die zu einer 10-20fachen Permeabilitätszunahme endothelialer Monolayer führte. Die Untersuchungen zeigten, dass MT-Systeme nach MF-Abbau intakt bleiben können. Darüber hinaus verdeutlichten diese Versuche, dass MT-Systeme mit F-Aktin interzelluläre Verbindungen bilden und zur Ausprägung und Aufrechterhaltung junktionaler Adhäsionsverbindungen beitragen. Somit sind MT-Systeme wesentlich an der Steuerung der Endothelbarriere beteiligt. Keine deutlichen, destruktiven MT- oder F-Aktinveränderungen zeigten dagegen granulozytäre Proteasen (HNE). Die 10-20fachen Zunahmen der endothelialen Wasserflussrate erklären sich dabei am ehesten durch eine morphologisch erkennbare massive Zelltonuszunahme mit ausgeprägter Stressfaser- und Zelllücken-Bildung. H2O2 führte zu einer 5-10fachen Zunahme der hydraulischen Konduktivität. Eine interendotheliale Lückenbildung mit deutlicher Stressfaser-Bildung zeigte niedrig dosiertes H2O2. MT- und MF blieben hierbei intakt. Als ursächlich werden intrazelluläre Signalwege mit Aktivierung der Proteinkinase C diskutiert (4). In höherer Dosierung zeigten sich im Rahmen oxidativer Zellschädigungen (4) sowohl beim MT- als auch beim F-Aktin-System erhebliche Destruktionen. Eine kombinierte destruktive Veränderung sowohl des MT- als auch des MF-Systems zeigte auch α -Toxin von Staphylococcus aureus , dessen Applikation zu einer 10-20fachen Permeabilitätszunahme der endothelialen Monolayer führte. Intrazelluläre Stabilitätsverluste und interzelluläre Bindungsverluste führten dabei zum Zellkollaps einzelner Endothelzellen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass beide zytoskelettären Komponenten, Mikrotubulus- und F-Aktin, in direkter Wechselwirkung stehen und zur Zellform und Stabilität und damit auch wesentlich zur Regulation der endothelialen Barrierefunktion beitragen.


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29.01.2004