Aus der Medizinischen Klinik m.S. Infektiologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Das Zytoskelett der Endothelzelle: Bedeutung des Mikrotubulus- und Mikrofilamentsystems für die Regulation der Endothelpermeabilität

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Hans-Werner Mühle

aus Bochum

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. N. Suttorp
2. Prof. Dr. med. H.-J. Schnittler
3. Prof. Dr. med. vet., PhD H. Augustin

Datum der Promotion: 16.01.2004

Zusammenfassung

F-Aktin spielt eine wichtige Rolle bei der Steuerung der endothelialen Barrierefunktion. In dieser Arbeit verwendeten wir Colchicin, Vinca-Alkaloide (Vinblastin, Vincristin) und Paclitaxel um Mikrotubulussysteme (MT) auszulenken und den Effekt auf die Permeabilität zu untersuchen. Endothelzellen wurden auf Polycarbonatfiltermembranen gepflanzt und einem kontinuierlichen hydrostatischen Druck von 10 cm H2O ausgesetzt.

Die Exposition von Endothelzell-Monolayern gegenüber Colchicin und Vinca-Alkaloiden führte innerhalb von 60 – 100 Minuten zeit- und dosisabhängig zu einem fünf–zehnfachen Anstieg der hydraulischen Konduktivität. Dagegen war nach MT-Stabilisation durch Paclitaxel keine Permeabilitätszunahme festzustellen.

Doppelimmunfluoreszenz-Mikroskopie zeigte, dass die MT-Depolymerisation durch Colchicin und Vinca Alkaloide zu F-Aktin-Umverteilung, Stressfaserbildung und Zellretraktionen mit ausgeprägter parazellulärer Lücken-Bildung führt. Diese Phänomene wurden durch Kombinationen von Vinblastin und Paclitaxel deutlich abgeschwächt.

Die fluorometrische Messung des intrazellulären F-Aktins nach MT-Depolymerisation durch Vinblastin resultierte in einer signifikanten Zunahme der Aktinfilamente.

Auf der anderen Seite resultierte F-Aktin Abbau durch Cytochalasin D und Clostridium difficile (TcdB-10463) morphologisch nicht in einer Veränderung von MT-Strukturen. Dabei zeigten in Interzellularbrücken gelegene MT-Filamente Kolokalisation mit F-Aktin Fragmenten.

Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass MT-Systeme an der Regulation der endothelialen Barriere beteiligt sind. Darüber hinaus verdeutlichen die Resultate eine enge Bindung von MT- und Aktin-Filamenten innerhalb endothelzellulärer Adhäsionskontakte.

Eigene Schlagworte: Permeabilität pulmonaler Endothelzellen, Adhäsionskontakte, Mikrotubuli, Aktinfilamente

Abstract

The endothelian cytosceleton plays an important role in the regulation of endothelial permeability via cellular actin filaments. We tested the effect of agents known to perturb cellular microtubules on the permeability of endothelial cell monolayers. The agents chosen were colchicine, the vinca alkaloids vinblastine and vincristine and paclitaxel. Cell monolayers were prepared on polycarbonate filter membranes and exposed to a continuous hydrostatic pressure of 10 cm H2O.

Colchicine and the vinca alkaloids caused a five to tenfold increase in the hydraulic conductivity of the monolayers within 60–100 min. The effect was dose and time dependent. The microtubule stabilizer paclitaxel caused no increase in permeability.

Double-immunofluorescence microscopy showed that microtubule depolymerisation was associated with certain morphological features such as inter-endothelial gaps, cell retraction, f-actin reorganisation and some stressfibre appearance. These phenomena were significantly reduced when vinblastine and paclitaxel were combined.

Measurement of intracellular f-actin following microtubule inhibition with vinblastine showed a significant increase in endothelial actin filaments.

No changes in microtubule structures were seen when actin filaments were perturbed with cytochalasin D and Clostridium difficile (TcdB-10463). However, in this case the intercellular bridges showed that microtubules were co-localised with fragments of actin filaments from neighbouring cells.

Our data demonstrate that microtubules are important for the regulation of endothelial permeability. Moreover, our results support evidens of binding between microtubules and actin filaments within endothelial cell adhesion contacts.

Keywords: permeability of pulmonary endothelial cells, adhesion contacts, microtubules, actin filaments

Inhaltsverzeichnis

  • 4  Diskussion
  • 5  Zusammenfassung
  • Liste der verwendeten Abkürzungen
  • Literaturverzeichnis
  • Danksagung
  • Lebenslauf
  • Erklärung an Eides Statt
  • Tabellen

    Bilder



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    29.01.2004