Aus der Medizinischen Klinik m.S. Infektiologie
der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

Dissertation

Das Zytoskelett der Endothelzelle: Bedeutung des Mikrotubulus- und Mikrofilamentsystems für die Regulation der Endothelpermeabilität

Zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt der Medizinischen Fakultät Charité
der Humboldt-Universität zu Berlin

von

Hans-Werner Mühle

aus Bochum

Dekan: Prof. Dr. Joachim W. Dudenhausen

Gutachter:
1. Prof. Dr. med. N. Suttorp
2. Prof. Dr. med. H.-J. Schnittler
3. Prof. Dr. med. vet., PhD H. Augustin

Datum der Promotion: 16.01.2004

Zusammenfassung

F-Aktin spielt eine wichtige Rolle bei der Steuerung der endothelialen Barrierefunktion. In dieser Arbeit verwendeten wir Colchicin, Vinca-Alkaloide (Vinblastin, Vincristin) und Paclitaxel um Mikrotubulussysteme (MT) auszulenken und den Effekt auf die Permeabilität zu untersuchen. Endothelzellen wurden auf Polycarbonatfiltermembranen gepflanzt und einem kontinuierlichen hydrostatischen Druck von 10 cm H₂O ausgesetzt.

Die Exposition von Endothelzell-Monolayern gegenüber Colchicin und Vinca-Alkaloiden führte innerhalb von 60 – 100 Minuten zeit- und dosisabhängig zu einem fünf–zehnfachen Anstieg der hydraulischen Konduktivität. Dagegen war nach MT-Stabilisation durch Paclitaxel keine Permeabilitätszunahme festzustellen.

Doppelimmunfluoreszenz-Mikroskopie zeigte, dass die MT-Depolymerisation durch Colchicin und Vinca Alkaloide zu F-Aktin-Umverteilung, Stressfaserbildung und Zellretraktionen mit ausgeprägter parazellulärer Lücken-Bildung führt. Diese Phänomene wurden durch Kombinationen von Vinblastin und Paclitaxel deutlich abgeschwächt.

Die fluorometrische Messung des intrazellulären F-Aktins nach MT-Depolymerisation durch Vinblastin resultierte in einer signifikanten Zunahme der Aktinfilamente.

Auf der anderen Seite resultierte F-Aktin Abbau durch Cytochalasin D und Clostridium difficile (TcdB-10463) morphologisch nicht in einer Veränderung von MT-Strukturen. Dabei zeigten in Interzellularbrücken gelegene MT-Filamente Kolokalisation mit F-Aktin Fragmenten.

Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass MT-Systeme an der Regulation der endothelialen Barriere beteiligt sind. Darüber hinaus verdeutlichen die Resultate eine enge Bindung von MT- und Aktin-Filamenten innerhalb endothelzellulärer Adhäsionskontakte.

Eigene Schlagworte: Permeabilität pulmonaler Endothelzellen, Adhäsionskontakte, Mikrotubuli, Aktinfilamente

Abstract

The endothelian cytosceleton plays an important role in the regulation of endothelial permeability via cellular actin filaments. We tested the effect of agents known to perturb cellular microtubules on the permeability of endothelial cell monolayers. The agents chosen were colchicine, the vinca alkaloids vinblastine and vincristine and paclitaxel. Cell monolayers were prepared on polycarbonate filter membranes and exposed to a continuous hydrostatic pressure of 10 cm H₂O.

Colchicine and the vinca alkaloids caused a five to tenfold increase in the hydraulic conductivity of the monolayers within 60–100 min. The effect was dose and time dependent. The microtubule stabilizer paclitaxel caused no increase in permeability.

Double-immunofluorescence microscopy showed that microtubule depolymerisation was associated with certain morphological features such as inter-endothelial gaps, cell retraction, f-actin reorganisation and some stressfibre appearance. These phenomena were significantly reduced when vinblastine and paclitaxel were combined.

Measurement of intracellular f-actin following microtubule inhibition with vinblastine showed a significant increase in endothelial actin filaments.

No changes in microtubule structures were seen when actin filaments were perturbed with cytochalasin D and Clostridium difficile (TcdB-10463). However, in this case the intercellular bridges showed that microtubules were co-localised with fragments of actin filaments from neighbouring cells.

Our data demonstrate that microtubules are important for the regulation of endothelial permeability. Moreover, our results support evidens of binding between microtubules and actin filaments within endothelial cell adhesion contacts.

Keywords: permeability of pulmonary endothelial cells, adhesion contacts, microtubules, actin filaments

Inhaltsverzeichnis

• 1  Einleitung
  • 1.1 Das Akute Respiratorische Distress-Syndrom (ARDS)
  • 1.2 Pulmonale Endothelzellen
  • 1.3 Das Aktinfilamentsystem
    • 1.3.1  Aufbau des Aktinfilamentsystems
    • 1.3.2 F-Aktin-assoziierte Proteine
    • 1.3.3 Funktion des F-Aktin-Systems
      • 1.3.3.1 Zellkortex und Mikrofilamente
      • 1.3.3.2  Junktionale F-Aktin-Verbindungen
      • 1.3.3.3 Mikrofilamentäre Stressfasern
  • 1.4 Mikrotubulussystem der Zelle
    • 1.4.1 Aufbau des Mikrotubulussystems
    • 1.4.2 Mikrotubulus-assoziierte Proteine
    • 1.4.3 Funktion des Mikrotubulus-Systems
  • 1.5 Interaktionen von Mikrotubulus- und Aktinfilament-Systemen
  • 1.6 Endothel-Permeabilität
    • 1.6.1 In vitro Modell zur Messung endothelialer Permeabilität
  • 1.7 Toxine, die in die Regulation des Mikrotubulussystems eingreifen
    • 1.7.1 Colchicin
    • 1.7.2 Vinca-Alkaloide
    • 1.7.3  Paclitaxel
  • 1.8 Toxine mit direkter oder indirekter Wirkung auf das endotheliale Zytoskelett
    • 1.8.1  Cytochalasin D
    • 1.8.2 Toxin B von Clostridium difficile
    • 1.8.3  Staphylococcus aureusα -Toxin
    • 1.8.4 Granulozytäre Wirkstoffe
      • 1.8.4.1 Wasserstoffperoxid (H2O2)
      • 1.8.4.2 Humane neutrophile Elastase
  • 1.9 Fragestellung
• 2  Methodik und Material
  • 2.1 Isolation und Kultivierung von pulmonalarteriellen Endothelzellen des Schweins
  • 2.2 Quantifizierung der endothelialen Permeabilität
    • 2.2.1 Vorbereitung der Polycarbonatfiltermembranen
    • 2.2.2  Bepflanzen der Filtermembranen mit Endothelzellen
    • 2.2.3  Messung der endothelialen Permeabilität
    • 2.2.4 Versuchsprotokoll für Permeabilitätsmessung
    • 2.2.5 Berechnung der hydraulischen Konduktivität
  • 2.3 Untersuchung der Morphologie von pulmonalarteriellen Endothelzellen
    • 2.3.1 Bepflanzung von Glass-Chamber-Slides mit Endothelzellen
    • 2.3.2  Doppelimmunfluoreszenz: Untersuchung des Mikrotubulus- und Aktinfilament-Systems pulmonalarterieller Endothelzellen
      • 2.3.2.1 Methodische Grundlagen
      • 2.3.2.2 Versuchsdurchführung
      • 2.3.2.3 Filme und Fotos
  • 2.4 Fluorometrische Bestimmung von F-Aktin
    • 2.4.1 Methodische Grundlagen
    • 2.4.2 Versuchsdurchführung
    • 2.4.3 Bestimmung des Zellproteins
  • 2.5 Isolierung von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMN)
    • 2.5.1 Stimulation von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten
  • 2.6 Material
    • 2.6.1 Kulturmedien und Pufferlösungen
    • 2.6.2 Toxine
    • 2.6.3 Antikörper und fluoreszierende Substanzen
    • 2.6.4  Sonstige Reagenzien
    • 2.6.5 Zubehör
    • 2.6.6 Geräte
  • 2.7  Statistische Auswertung
• 3  Ergebnisse
  • 3.1 Morphologie von Mikrotubulus-, Aktin- und Intermediärfilamenten in unstimulierten kultivierten Endothelzellen (Kontrollzellen)
  • 3.2 Barrierefunktionsstörungen pulmonaler Endothelzellen durch Mikrotubulus-Toxine
    • 3.2.1.1 Colchicin erhöht die Permeabilität pulmonaler Endothelzellen
    • 3.2.1.2 MT-Depolymerisation nach Colchicin-Gabe führt zu einer vermehrten Stressfaserbildung und zur endothelialen Zell-Retraktion mit interendothelialer Lückenbildung
    • 3.2.1.3  Colchicin erhöht intrazelluläres F-Aktin
    • 3.2.2.1  Vinblastin erhöht die Permeabilität pulmonaler Endothelzellen
    • 3.2.2.2 MT-Hemmung nach Vinblastin-Gabe führt zu einer vermehrten Stressfaserbildung und endothelialer Retraktion mit interendothelialer Lückenbildung
    • 3.2.2.3  Vinblastin erhöht intrazelluläres F-Aktin
    • 3.2.3.1  Vincristin erhöht die Permeabilität pulmonaler Endothelzellen
    • 3.2.3.2 MT-Hemmung nach Vincristin-Gabe führt zu einer vermehrten Stressfaserbildung und zur endothelialen Retraktion mit interendothelialen Lücken
    • 3.2.4.1  MT-Stabilisation durch Paclitaxel führt zu keiner Permeabilitätszunahme pulmonaler Endothelzellen
    • 3.2.4.2 Konfluente Endothelzellmonolayer nach MT-Stabilisierung durch Paclitaxel
• 3.3  Barrierefunktionsstörungen pulmonaler Endothelzellen durch granulozytäre Wirkstoffe
  • 3.3.1 HNE und H2 O2 erhöhen die Permeabilität pulmonaler Endothelzellen
  • 3.3.2 Zellretraktionen, Stressfaser- und Lücken-Bildung nach Applikation humaner neutrophiler Elastase
  • 3.3.3  Zellretraktionen, Stressfaser- und Lücken-Bildung nach H2O2-Applikation
• 3.4  Barrierefunktionsstörungen pulmonaler Endothelzellen durch F-Aktin-wirksame Toxine
  • 3.4.1 Cytochalasin D und Clostridium difficile- Toxin B-10463: Massive Permeabilitätszunahmen pulmonaler Endothelzellen
    • 3.4.1.1 Intakte MT-Systeme bilden interzelluläre Verbindungen bei massiver Cytochalasin D-induzierter F-Aktin-Fragmentierung
    • 3.4.1.2  F-Aktin-Fragmentierung und intakte MT-Systeme pulmonaler Endothelzellen nach Applikation von Clostridium difficile- Toxin B-10463
• 3.5  Barrierefunktionsstörungen pulmonaler Endothelzellen durch bakterielle Toxine
  • 3.5.1  Staphylococcus aureus-α -Toxin erhöht die Permeabilität pulmonaler Endothelzellen
  • 3.5.2  Destruktion von MT-Filamenten und F-Aktin nach Applikation von Staphylococcus aureus-α -Toxin
• 3.6  Auswirkungen von Kombinationen Mikrotubulus-stabilisierender und MT-destabilisierender Substanzen auf das Zytoskelett pulmonaler Endothelzellen
  • 3.6.1 Retraktionen, Stressfaser- und Lücken-Bildung pulmonaler Endothelzellen korrelieren mit MT-Stabilisation bzw. Destabilisation

Tabellen

• Tabelle 1 : Vergleich der Filtrationsrate (y x 10-5 cm x s-1 x cm H2O-1) der verwendeten Substanzen nach 30, 60 und 120 Minuten in bezug auf Mikrotubulusschädigung, Zentrosomverlust und F-Aktin-Schäden.

Bilder

• Schema 1: Modellvorstellung des F-Aktin-Gleichgewichtes. Durch Anlagerung von G-Aktin-Molekülen am „barbed end" und Abdissoziation am „pointed end" des Aktinfilaments entsteht ein dynamisches Gleichgewicht.
• Schema 2: Schematische Darstellung der Polymerisation und der Depolymerisation von MT-Systemen. GTP-gebundene Tubulin-Dimere lagern sich vornehmlich an die Plus-Enden existierender MT an. Nach dem Einbau erfolgt die GTP-Hydrolyse zu GDP. MT, die eine GTP-Kappe tragen, sind stabiler und können weitere GTP-Tubuline anlagern. MT, die eine GDP-Kappe tragen, sind instabiler und können rasch depolymerisieren.
• Schema 3: Modellvorstellung zur selektiven Stabilisierung von Mikrotubuli. Durch das Fixieren der schnellwachsenden mikrotubulären Plus-Enden (grün dargestellt) an prädisponierten Stellen in der Zellmembran durch Capping-Proteine werden die mikrotubulären Filamente stabilisiert (schwarz dargestellt), und die Zelle wird von einer unpolarisierten (A) in eine polarisierte Form (B) überführt. Auswachsende Mikrotubuli, die nicht stabilisiert wurden, werden instabil (dynamische Instabilität) und zerfallen in Tubulineinzelmoleküle (rot-gestrichelt dargestellt).
• Schema 4: Schematische Darstellung der Versuchsanlage zur Messung endothelialer Permeabilität. Eine mit Endothelzellen bepflanzte Polycarbonatfiltermembran wurde in die Messkammer eingelegt. Über einen Zugang zur luminalen Seite erfolgte die kontinuierliche Applikation eines Druckes von 10 cm Wassersäule. Über ein zweiten Zugang (sideport) wurden die Stimulantien appliziert. Unterhalb der Membran wurde durch eine Rollerpumpe (P) eine Zirkulation von 10 ml Pufferlösung 37°C aufrechterhalten. Die durch die Endothelzell-Filtermembran filtrierte Flüssigkeitsmenge addierte sich messbar zu dem zirkulierenden Gesamtvolumen und konnte an einer skalierten Glaskapillare abgelesen werden.
• Abb. 1-A: Mikrotubulus-System. Mikrotubuli von ruhenden Endothelzellen sind als System von Einzelfasern zu erkennen, die sternförmig vom paranukleären Zentrosom, dem Mikrotubulus-Keimbildungszentrum (Pfeile), in die Zellperipherie ausstrahlen.
• Abb. 1-B: F-Aktin (Mikrofilamente). Aktinfilamente sind Proteinverbindungen, die sich innerhalb des ruhenden Endothelzellverbandes als quervernetzte Geflechte und Bänder darstellen, die, in der Peripherie angeordnet, ein typisches wabenartiges Relief bilden (peripheral dense bands).
• Abb. 1-C: Intermediärfilamente (Vimentin). Intermediärfilamente sind kräftige und dauerhafte Proteinfilamente, die sich in gleichmässig gebogenen Anordnungen vom Kern bis zum Zellrand erstrecken.
• Abb. 2: Zunahme der endothelialen Permeabilität nach Zugabe von Colchicin. Zum Zeitpunkt t=0 Min. wurde auf die gesealten Monolayer Colchicin in Konzentrationen von 1 µM, 10 µM und 100 µM für 170 Minuten gegeben. Es zeigte sich ein zeit- und dosisabhängiger Anstieg der Wasserfiltration. Die Permeabilität ist als hydraulische Konduktivität (x 10-5cm x s-1 x cm H2O-1) aufgezeichnet. Unstimulierte Kontrollfilter blieben im Versuchszeitraum stabil und reagierten prompt auf Pertubation mit 10 µg/ml Staphylococcus aureusα -Toxin. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM von jeweils 6 unabhängigen Experimenten.
• Abb. 3: Mikrotubulus-und Aktinfilamente nach Stimulation mit Colchicin für 120 Minuten. A-B : unbehandelte Kontrollzellen; C-D : 1 µM Colchicin, D : Zellretraktionen, zytoplasmatische F-Aktinverdichtung und Stressfasern, Pfeile zeigen Gaps; E : Doppelbelichtung von Kontrollzellen; F : Doppelbelichtung 0,1 µM Colchicin: zunehmende MT-Depolymerisation führt zu zytoplasmatischer F-Aktinumverteilung (Pfeile) und Zelllückenbildung (Pfeilköpfe); Grüne Färbung: Mikrotubulus-System; Rote Färbung: F-Aktin; (*): Gleicher Bildausschitt. Typische Ausschnitte aus 4 Versuchen.
• Abb. 4: Konzentrations- und zeitabhängige Veränderung des endothelialen F-Aktin-Gehaltes bei Stimulation mit Colchicin. A : 0,1 µM; B : 1 µM; C : 10 µM; D : 100 µM und Positivkontrolle Cytochalasin D 1 µg/ml. - Die Zweiwegvarianzanalyse zeigte einen geringen F-Aktin-Anstieg bei 1 µM, 10 µM und 100 µM. Ein signifikanter F-Aktin-Abfall lies sich für Cytochalasin D nachweisen. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte (± SEM) aus 4 unabhängigen Versuchen.
• Abb. 5: Permeabilitätszunahme von Endothelzellmonolayer nach Vinblastingabe. Zum Zeitpunkt t=0 Min. wurde auf die gesealten Monolayer Vinblastin in Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM, und 10 µM als Bolus mit anschließend kontinuierlicher Zuführung für 180 Minuten gegeben. Es zeigte sich ein zeit- und dosisabhängiger Anstieg der Wasserfiltration nach Vinblastin-Applikation. Kontrollzellmonolayer reagierten prompt mit einem Filtrationsanstieg auf Staphylococcus aureusα -Toxin. Die Permeabilität ist als hydraulische Konduktivität (10-5cm x s-1 x cm H2O-1) aufgezeichnet. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM aus 4 separaten Experimenten.
• Abb. 6: Mikrotubulus- und Aktinfilamente nach Stimulation mit Vinblastin für 120 Minuten. A-B : unbehandelte Kontrollen; C-D : 0,1 µM Vinblastin: C : trotz MT-Depolymerisation werden MT synthetisiert (Pfeil markiert Zentrosom); D : Pfeile markieren F-Aktin-Umverteilung im Zytoplasma; Pfeilköpfe markieren Gap-Bildung. E : 100 µM Vinblastin: Doppelbelichtung zeigt MT-Depolymerisation mit maximaler Fragmentierung und Zellretraktion mit F-Aktin-Brücken (Pfeil). Grüne Färbung: Mikrotubulus-System; Rote Färbung: F-Aktin. Repräsentative Bildausschnitte aus 5 Versuchen.
• Abb. 7: Konzentrations- und zeitabhängiger Verlauf des endothelialen F-Aktin nach Stimulation mit Vinblastin. A : 0,1 µM; B : 1 µM; C : 10 µM D : 100 µM. Die Zweiwegvarianzanalyse zeigte einen signifikanten F-Aktin-Anstieg nach 1µM und 10 µM Vinblastin. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardfehler der Mittelwerte (± SEM) aus 5 separaten Versuchen.
• Abb. 8: Permeabilitätszunahme von Endothelzellmonolayer nach Vincristin-Applikation. Zum Zeitpunkt t=0 Min. wurde auf die gesealten Monolayer Vincristin in Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM, und 10 µM als Bolus mit anschließend kontinuierlicher Zuführung gegeben. Vincristin führte zeit- und dosisabhängig zu einer Zunahme der Wasserflussrate gesealter Endothelzellmonolayer. Gezeigt sind Mittelwerte ± SE aus 4 separaten Experimenten.
• Abb. 9: Verteilung von Mikrotubulus-und Aktinfilamenten nach Stimulation mit Vincristin über 120 Minuten. A-B : unbehandelte Kontrollen; C-D : 1 µM Vincristin; C : MT-Depolymerisation mit Ausbildung parakristalliner MT-Aggregate (Pfeile). D : zytoplasmatische F-Aktin-Umverteilung, Pfeile markieren Gap-Bildung. Grüne Färbung: Mikrotubulus-System; Rote Färbung: F-Aktin. Repräsentative Bildausschnitte aus 3 separaten Versuchen.
• Abb. 10: Permeabilität pulmonaler Endothelzellmonolayer nach Paclitaxel-Exposition. Zum Zeitpunkt t=0 Min. wurde auf die gesealten Monolayer Paclitaxel in Konzentrationen von 0,1 µM, 1 µM, und 10 µM als Bolus mit anschließend kontinuierlicher Zuführung gegeben. Paclitaxel führte zu keiner signifikant erhöhten Wasserflussrate pulmonaler Endothelzellmonolayer. Die Filtration der unbehandelten Kontrollfilter betrug während des Untersuchungszeitraumes weniger als 0,5 x 10-5cm x s-1 x cm H2O-1 und die Kontrollzellen reagierten mit einem raschen Filtrationsanstieg auf Staphylococcus aureusα-Toxin. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM aus 6 separaten Experimenten.
• Abb. 11: Mikrotubulus- und Aktinfilamente nach Stimulation mit Paclitaxel über 180 Minuten. A-B: unstimulierte Kontrollzellen; C-D : 1 µM Paclitaxel; C : Pfeile markieren anormale MT in der Zellperipherie. D : Trotz anormaler MT-Strukur zeigten sich konfluente EC-Monolayer. Grüne Färbung: Mikrotubulus-Systeme; Rote Färbung: F-Aktin. (*): identischer Bildausschnitt. Repräsentative Bildausschnitte aus 3 separaten Experimenten.
• Abb. 12: Endotheliale Barrierefunktion nach Applikation von humaner neutrophiler Elastase und H 2 O 2 . Pulmonalarterielle Endothelzellen reagierten nach Stimulation mit proteasehaltigen Überständen (HNE) von 33 x 106 polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten und 1 mM H2 O2 mit signifikanten Zunahmen der Wasserflussrate. (∗) kennzeichnet die Boluszugabe zum Zeitpunkt t=0 Minuten. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM aus 4 separaten Experimenten.
• Abb. 13: Mikrotubulus- und Aktinfilamente nach Stimulation mit proteasehaltigen PMN-Überständen für 120 Minuten. A-B : unstimulierte Kontrollzellen; C-D : 400 µl PMN-Überstand: D : Sterne markieren Zelllücken; Pfeile zeigen F-Aktin-Stressfasern, Pfeilköpfe demonstrieren F-Aktin-Fragmentierung. Grüne Färbung zeigt MT-Systeme, die rote Färbung zeigt F-Aktin. Typische Bildausschnitte aus 2 unabhängigen Versuchen. (*): identischer Bildausschnitt.
• Abb. 14: Mikrotubulus- und Aktinfilamente nach Stimulation mit H 2 O 2 für 120 Minuten. A-B : unbehandelte Kontrollzellen; C-D : 10 µM, C : MT ungleichmässig angeordnet, Zytoplasma-Grünfärbung bei MT-Depolymerisation oder MT-Neusynthese; D : massive Stressfaserbildung, Pfeile markieren Gaps; Grüne Färbung: Mikrotubulus-System; Rote Färbung: F-Aktin. (*): identischer Bildausschnitt. Repräsentative Bildausschnitte aus 3 separaten Versuchen.
• Abb. 15 Permeabilitätszunahme pulmonaler Endothelien nach Bolus-Zugabe von Cytochalasin D und Clostridium difficile- Toxin B. (∗ ) kennzeichnet Boluszugabe zum Zeitpunkt t=0 Minuten. Zum Zeitpunkt t=0 wurde auf die gesealten Monolayer 1µg/ml CD und 100 ng/ml TcdB-10463 als Bolus gegeben. Es zeigte sich bei CD ein rascher und reversibler Anstieg der Permeabilität mit einem Maximum nach 20 Minuten und im weiteren Verlauf eine stetig abfallende hydraulische Konduktivität. 100 ng/ml TcdB-10463 führte zu einer kontinuierlichen, signifikanten Zunahme der Wasserflussrate. Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM aus 3 separaten Experimenten.
• Abb. 16: Mikrotubulus- und Aktin-Filamente nach Stimulation mit Cytochalasin D für 30 Minuten. A-B : unstimulierte Kontrollzellen; C-D : 0,5 µg, C : MT-System intakt, D : massive F-Aktin-Fragmentierung mit ausgeprägten Zellretraktionen; E-F-G : 2 µg, E : Optisch intaktes MT-System, F : fragmentiertes F-Aktin; G : Doppelimmunfluoreszenz zeigt ausgeprägte Zellretraktionen mit interzellulärer MT-Brückenbildung. Pfeile markieren MT-MF-Kolokalisationen. - (*): identischer Bildausschnitt. Repräsentative Bildausschnitte aus 3 separaten Experimenten.
• Abb. 17: Mikrotubulus- und Aktin-Filamente nach Stimulation mit Clostridium difficile- Toxin B-10463. A-B : unbehandelte Kontrollzellen; C-D : 100 ng/ml, C : Intaktes MT-System mit MT-Mitose-Spindel (Pfeil), Pfeilköpfe markieren Zentrosomen; D : Abrundungen von Endothelzellen bei ausgepägter F-Aktin-Fragmentierung, Pfeile markieren fragmentiertes F-Aktin in Interzellulärbrücken; Grüne Färbung: Mikrotubulus-Systeme; Rote Färbung: F-Aktin. Typische Bildausschnitte aus 3 separaten Experimenten.
• Abb. 18: Permeabilitätszunahme pulmonaler Endothelzellen nach Bolus-Gabe von Staphylococcus aureus- α -Toxin. (∗ ) kennzeichnet Boluszugabe zum Zeitpunkt t=0 Minuten. Zum Zeitpunkt t=0 wurde auf die gesealten Monolayer 10 µg/ml α -Toxin als Bolus gegeben. Staphylococcus aureusα -Toxin zeigte einen raschen Anstieg der Wasserflussrate mit Plateauphase . Gezeigt sind Mittelwerte ± SEM aus 3 separaten Experimenten.
• Abb. 19: Mikrotubulus- und Aktin-Filamente nach Stimulation mit Staphylococcus aureus- α -Toxin für 60 Minuten. A-B : Kontrollzellen; C-D : 10 µg/ml, C : Pfeile markieren optisch betonte Zentrosomen, D : Pfeile markieren Gaps, Pfeilköpfe markieren F-Aktin-Fragmentierung; E-F : 40 µg/ml, E: anormale und destruierte MT-Strukturen, F : Zytolyse, Destruktion von F-Aktin, Pfeil markiert Zellkollaps, Stern markiert geschädigte Endothelzelle mit feingranuliertem F-Aktin; (*): identischer Bildausschnitt. Typische Bildausschnitte aus 3 separaten Experimenten.
• Abb. 20: Mikrotubulus- und Aktin-Filamente nach Stimulation pulmonaler Endothelzellen mit 100 µM Vincristin bei Paclitaxel-Vorinkubation. A-B : Paclitaxel 0,1 µM, A : Überwiegen von Vincristin-induzierter MT-Depolymerisation und MT-Aggregatbildung; B : F-Aktin-Umverteilung und Gap-Bildung (Pfeile); C-D : Paclitaxel 1 µM, C : Überwiegen stabilisierter MT-Systeme, D : Moderate F-Aktin-Umverteilung und reduzierte Gap-Bildung im Vergleich zu 10-B; (*): identischer Bildausschnitt.
• Schema 5: Modellvorstellung zur MT-MF-Interaktion über MaP zur Aufrechterhaltung junktionaler Adhäsionsverbindungen zwischen Zellen und mögliche Ereignisse nach MT-Depolymerisation. 5-A : Mikrotubuli stabilisieren junktionale Adhäsionsverbindungen. Über MT-Leitschienen durch MaP verknüpft (z.B. Kinesin) erfolgt der F-Aktin-Transport in den Zellmembranbereich. Der nach außen gerichtete mikrotubuläre Druck stabilisiert die Verbindungen von F-Aktin und Integrinen mit Nachbarzellen. 5-B : MT-Depolymerisation führt zu einem Verlust der nach außen gerichteten Druckkräfte und der MT-MaP-MF-Verbindungen. 5-C : Das Überwiegen intrazellulärer Zugkräfte führt zur Destabilisation junktionaler Adhäsionen. Es bilden sich interzelluläre Lücken. 5-D : F-Aktin-Zellbrücken stabiler Adhäsionsverbindungen überbrücken interzelluläre Lücken.
• Schema 6: Modellvorstellung zur MT-MF Interaktion nach F-Aktin-Zerstörung durch Cytochalasin D und TcdB-10463. 6-A : Die massive Fragmentierung der MF führt zur Auflösung junktionaler F-Aktin-Integrinbindungen. 6-B : MT führen im Verbund mit F-Aktinfragmenten zu einer Stabilisierung lokaler Adhäsionsbindungen. In den Bereichen der Adhäsions-Verluste kommt es durch einwärtsgerichtete Zugkräfte zu großen Zelllücken (Gaps) und es entstehen interzelluläre MT-Brücken.