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1  Einleitung

1.1 Das Mammakarzinom

1.1.1  Epidemiologie, Histologie und Therapie

Das Mammakarzinom ist mit 46.000 bis 50.000 Neuerkrankungen pro Jahr in Deutschland die häufigste bösartige Tumorerkrankung der Frau. In Berlin betrug in den Jahren 1997-1998 die altersstandardisierte Inzidenz je 100.000 mit der Europabevölkerung als Altersstandard 82,2 [1]. In den USA rechnet man für das Jahr 2002 mit 203.500 Neuerkrankungen [2]. Schätzungsweise jede zehnte Frau bekommt im Laufe ihres Lebens einen solchen Tumor. Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 63,5 Jahren.

Am Mammakarzinom sterben pro Jahr in Deutschland 19.000 Frauen. Im Alter zwischen 35 und 55 Jahren ist er die häufigste Tumortodesursache im weiblichen Geschlecht überhaupt. Bezüglich der Sterblichkeit an Tumorerkrankungen nimmt das Mammakarzinom in Deutschland mit 18% aller Todesfälle an bösartigen Tumoren den dritten Platz nach den Bronchial- und kolorektalen Karzinomen ein. Die
5-Jahres-Überlebensrate beträgt etwa 73%.

Ergebnisse globaler epidemiologischer Studien zeigen, daß die Inzidenz des Mammakarzinoms ein Häufigkeitsmaximum in den USA und ein Minimum in Japan aufweist und somit eine unterschiedliche geographische Verteilung zeigt.

Histologisch unterteilt man die Mammakarzinome in intraduktale (nicht-invasive) und invasive Tumoren. Letztere gliedern sich in duktale, lobuläre und seltenere Varianten (tubuläre, papilläre, muzinöse, medulläre, adenoidzystische und apokrine). Das invasiv-duktale Karzinom ist mit 80% der häufigste Karzinomtyp der Brustdrüse [3] [4] [5].

Die Therapie ist u.a. abhängig von Tumorgröße, histologischem Typ, Multifokalität und insbesondere bei der operativen Therapie (brusterhaltend oder Ablatio) vom Wunsch der Patientin. Als Alternative zur offenen Lymphonodektomie wird heute die alleinige Exstirpation des Sentinel Lymph Node angestrebt. Eine primär systemische Chemotherapie soll präoperativ eine Verkleinerung der Tumoren >3 cm bewirken sowie bereits das Ansprechen der Chemotherapie zeigen. Standardtherapie bei Patientinnen mit positivem Hormonrezeptorstatus ist eine tägliche Einnahme von Tamoxifen über
[Seite 7↓]5 Jahre, alternativ mit Aromataseinhibitoren. Aus den verschiedenen Chemotherapeutika war und ist das CMF-Schema (Cyclophosphamid, Methotrexat, 5-Fluorouracil) Standard. Weiterhin besteht die Möglichkeit einer adjuvanten Strahlentherapie sowie innerhalb einer palliativen Behandlung einer Immuntherapie mit dem monoklonalen Antikörper Trastuzumab (Herceptin®) [6].

1.1.2 Risikofaktoren

Ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung eines Mammakarzinoms ist das Alter. So liegt die altersspezifische Inzidenz zwischen 50 und 70 Jahren um den Faktor 5 höher als im Alter zwischen 35 und 40 Jahren. Die familiäre Belastung ist ein weiterer starker Risikofaktor. Das Auftreten eines Mammakarzinoms bei einer Verwandten ersten Grades (Mutter oder Schwester) steigert das persönliche Risiko um den Faktor
3-4. Ferner erhöht bei diesen Frauen eine Keimbahnmutation im BRCA-1 Gen (Chromosomenlokus: 17q21) das Risiko gegenüber einer familiär nicht belasteten Frau um das 7-8fache. Es wird geschätzt, daß in 60-70% aller erblichen Mammakarzinome eine Mutation im BRCA-1 oder BRCA-2 Gen vorliegt. Frauen mit Mutationen dieser Gene haben ein 50-80%iges Risiko, hieran ein Karzinom zu entwickeln. Keimbahnmutationen im Tumorsuppressorgen p53 sind ebenso mit einem erhöhten Risiko, insbesondere bei jüngeren Frauen, assoziiert. Ein weiterer Risikofaktor ist ein in der Vergangenheit aufgetretenes Mammakarzinom, welches ein 5fach höheres Rezidivrisiko zur Folge hat.

1.2  Zusammenhang zwischen Entzündungen und malignen Tumoren

Bereits Rudolf Virchow vermutete 1863 anhand leukozytenreicher Infiltrate in malignen Tumoren einen Zusammenhang zwischen diesen und Entzündungen; insbesondere der Bildung von Karzinomen an Orten, die vorher Sitz einer Entzündung waren [7]. Dvorak verglich 1986 die inflammatorischen Prozesse in Tumoren mit denen einer gestörten Wundheilung [8]. Bis heute ist die Rolle der Entzündung für das Karzinomwachstum noch nicht vollständig geklärt.


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Einen großen Anteil an den entzündlichen Stromainfiltraten einiger maligner Tumore (z.B. Mammakarzinom, Kolorektales Karzinom) bilden Tumor-assoziierte Makrophagen, welche von zirkulierenden monozytären Vorläuferzellen abstammen. Verantwortlich für die Akkumulation dieser Makrophagen sind bestimmte chemotaktische Mediatoren (z.B. MCP-1 [monocyte chemoattractant protein]), welche von den Tumorzellen produziert werden. Die Fähigkeiten der Makrophagen sind vielfältig, u.a. können sie Wachstumsfaktoren und Proteasen (Modulation der extrazellulären Matrix durch z.B. Matrixmetalloproteinasen) produzieren, die Tumorproliferation anregen sowie die Angiogenese und Invasion fördern. Weiterhin tragen Makrophagen durch Produktion verschiedener Gerinnungsfaktoren zur Fibrinpolymerisation im Tumorstroma bei.

Untersuchungen zeigten, daß viele Tumorzellinien selbst proinflammatorische Zytokine produzieren können. So konnte in Ovarialkarzinomzellinien mit Hilfe eines Matrix-Invasionsassays die Förderung der Invasion durch IL-1β und TNFα nachgewiesen werden. Interessanterweise wirken diese Mediatoren in anderen Zellinien als Wachstumsfaktoren. Eine mögliche Erklärung für diese Unterschiede liegt wahrscheinlich im Auslösen bestimmter Signaltransduktionswege (z.B. p38 MAPK) durch die proinflammatorischen Zytokine [7] [9].

In diesem Zusammenhang wirken auch weitere Entzündungsprozesse als neue Ziele der Tumorforschung. So stellt die Cyclooxygenase, deren Expression in der vorliegenden Arbeit untersucht wurde, ein wichtiges Element innerhalb inflammatorischer Prozesse dar. Besonders die Expression der Cyclooxygenase-2 als möglicher interessanter Prognoseparameter erwies sich in verschiedenen vorangegangenen Untersuchungen spezifisch für maligne Tumore.

1.3 Entdeckung der Cyclooxygenase in Beziehung zu den NSAIDs

Schon im antiken Griechenland, wo Rindenextrakte aus Pappeln oder Weiden als Therapeutikum Verwendung fanden, liegen die Ursprünge für die Verwendung acetylsalicylsäurehaltiger Verbindungen als Antipyretikum und Analgetikum. Auch Hippocrates beschrieb die analgetischen Wirkungen der Säfte der Pappel bei Augenleiden und die antipyretischen Effekte der Weidenrinde bei Fieber.
[Seite 9↓]Im Jahr 30 n. Chr. definierte Celsius die vier klassischen Entzündungszeichen (rubor, calor, dolor und tumor) und benutzte zu deren Behandlung ebenfalls Extrakte der Weidenrinde. Auch in Asien, Nordamerika und Südafrika machte man sich zu dieser Zeit die genannten antipyretischen Effekte zu Nutze. Im Mittelalter wurden die Anwendungsgebiete dieser Extrakte weiter ausgedehnt. Über erste „klinische Versuche“ mit den Auszügen der Weidenrinde wurde im Jahre 1763 durch Reverend Edward Stone aus Oxfordshire berichtet, welcher beeindruckt von der erfolgreichen therapeutischen Wirkung zu weiteren Versuchen aufrief, um weltweit von diesem Wirkstoff zu profitieren.

Die aktive und bittere Komponente des Baumextraktes der Weißen Weide (Salix alba vulgaris) ist 1829 durch den Franzosen Leroux als Salicin, einem Glykosid des Salicylates, identifiziert worden. Acetylsalicylsäure wurde zum ersten Mal 1853 von Charles Gerhardt synthetisiert, dessen Produkt jedoch vorerst keine weitere Verbreitung fand.

In Deutschland konnte Salicylsäure erstmals 1874 von Kolbe und Lautemann aus Phenol und Carbondioxid hergestellt werden. Acetylsalicylsäure als wohlschmeckendere Form wurde wenig später von Felix Hoffmann der Bayer Company hergestellt und 1899 von Heinrich Dreser als „Aspirin“ bezeichnet, wobei das „a“ im Namen an die Acetylgruppe und das „spirin“ an die botanische Spiraea erinnern soll, aus welcher Salicylat extrahiert werden kann.

Zum Beginn des 20. Jahrhunderts folgte die Entwicklung weiterer Medikamente, die vergleichbare klinische Effekte mit dem Aspirin erzielten, so z.B. Phenylbutazon, Naproxen und Indomethacin. Aufgrund dieser ähnlichen therapeutischen Wirkungen wurden sie „Aspirin-like drugs“ genannt. Wegen der deutlichen Unterschiede zu den in inflammatorischen Prozessen ebenso eingesetzten Glukokortikoiden folgte die Bezeichnung „non-steroidal anti-inflammatory drugs“ (NSAIDs). Der genaue Wirkmechanismus dieser Pharmazeutika blieb bis zur Entdeckung der Prostaglandine unbekannt. Piper und Vane konnten dann den ersten Zusammenhang zwischen der Prostaglandinproduktion und der Wirkungsweise aspirinähnlicher Medikamente zeigen und veröffentlichten diese Ergebnisse im Jahre 1971 [10]. Die Basis ihrer Hypothese hinsichtlich der inflammatorischen Prozesse stellte die Rolle der lokalen Prostaglandinproduktion in diesen dar. Trotz ihres unterschiedlichen chemischen [Seite 10↓]Aufbaus ist das Hauptziel aller NSAIDs die Inhibition der Cyclooxygenase und der Prostaglandinproduktion.

Eine gereinigte und enzymatisch aktive Form der Cyclooxygenase (oder Prostaglandin Endoperoxid Synthase), heute die COX-1, wurde 1976 isoliert. Im Jahre 1990 wiesen Experimente auf die Existenz weiterer Isoformen hin. Die cDNA der Cyclooxygenase-2 (Mitogen-induzierbare Prostaglandin G/H Synthase oder PGH Synthase 2) wurde 1991 isoliert und sequenziert [11] [12].

1.4 Rolle der Cyclooxygenasen im Arachidonsäurestoffwechsel

Die Cyclooxygenase katalysiert die Umwandlung von Arachidonsäure in
Prostaglandin H2 über die Bildung von Prostaglandin G2 als Übergangsform. Sie beinhaltet 2 katalytische Funktionen: eine Oxidase und eine Peroxidase (Abb. 1).

Abb. 1: Der Arachidonsäurestoffwechsel


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PGH2 ist das unmittelbare Substrat für eine Reihe zellspezifischer Prostaglandin- und Thromboxansynthasen. Prostaglandine werden in verschiedenen Geweben synthetisiert und dienen als auto- oder parakrin wirkende Mediatoren. Welche Prostaglandine gebildet werden, hängt von der enzymatischen Ausstattung der jeweiligen Zelle ab [13].

Die Signale dieser Moleküle werden hauptsächlich über 2 verschiedene Wege weitergeleitet. So interagiert ein Teil der Prostaglandine mit Zellrezeptoren, die der Gruppe der G-Protein gebundenen Rezeptoren zuzuordnen sind. Diese sind wiederum an zytosolische Signalwege gekoppelt, welche in diversen physiologischen Antworten (z.B. Relaxation/Kontraktion glatter Muskelzellen, Plättchenaggregation, Gefäßpermeabilität) resultieren. Desweiteren können G-Protein gekoppelte Signalwege chronische Prozesse wie Angiogenese induzieren. Studien zeigten, daß der EP2-Subtyp des PGE-Rezeptors in den GS/cAMP/Proteinkinase A-Signalweg involviert ist, welcher vermutlich zu einer höheren VEGF-Transkription beiträgt.

Im Gegensatz dazu interagieren andere Prostaglandine wie PGJ2 oder PGA2 mit nukleären Rezeptoren. Diese „peroxisome proliferator-activated receptors“ (PPARs) bilden mit dem 9-cis-Retinoidsäurerezeptor (RXR) ein Heterodimer, binden als solches an ein sequenzspezifisches Response-Element und induzieren somit direkt im Nucleolus die Transkription.

Die Aktivität der Peroxidase ist für die hohe enzymatische Synthese der Prostaglandine verantwortlich. Sie dient weiterhin u.a. zum Aktivieren redoxabhängiger Signalwege und zur Stimulation der NFκB-Aktivität.

1.5  Unterschiede zwischen COX-1 und COX-2

Die Proteine der beiden im luminalen Kompartiment des endoplasmatischen Retikulums und an der nukleären Membran lokalisierten Isoformen sind in der Aminosäuresequenz zu ca. 60% identisch [14].

Während die Cyclooxygenase-1 als sogenanntes „house keeping gene“ konstitutiv ubiquitär exprimiert wird, ist die Expression der mit einem größeren aktiven Zentrum versehenen Cyclooxygenase-2 abhängig von der Induktion durch bestimmte [Seite 12↓]Wachstumsfaktoren, Tumorpromotoren, Zytokine (z.B. IL-1) und Onkogene
(z.B. HER-2/neu).

Tabelle 1: Unterschiede zwischen beiden Isoenzymen der Cyclooxygenase nach Taketo (1998) [12]

 

COX-1

COX-2

Genlokus

9q32-q33.3

1q25.2-q25.3

Gengröße

22 kb

11 Exone

8 kb

10 Exone

Größe der m-RNA

2,8 kb

4,0 kb

Molekulargewicht

der Proteine

85.000 Da

72.000 Da

Eine erhöhte COX-2 Expression findet sich in bestimmten Regionen des Gehirns, der Niere, in aktivierten Makrophagen, Synoviozyten, Entzündungsprozessen und malignen epithelialen Zellen. Untersuchungen an COX-2 knockout Mäusen zeigen, daß diese Isoform wichtig für die postnatale Entwicklung der Niere und für verschiedene weibliche Reproduktionsprozesse (Ovulation, Fertilisation, Implantation und Dezidualisierung) ist [15].

Im Gegensatz dazu weisen COX-1 knockout Mäuse im Vergleich zu Wildtypmäusen keine auffällige gastrale Pathologie sowie weniger Indomethacin-induzierte Ulzerationen im Gastrointestinaltrakt auf. Desweiteren zeigen die Tiere neben einer reduzierten Thrombozytenaggregationsfähigkeit eine verringerte inflammatorische Antwort auf Arachidonsäure [16].

Konventionelle NSAIDs wie Aspirin oder Ibuprofen inhibieren in unterschiedlichem Ausmaß beide Isoformen der Cyclooxygenase (Tabelle 2 ). Die Blockade der COX-1 z.B. ist für deren gastrale Nebenwirkung verantwortlich, wohingegen die therapeutisch [Seite 13↓]erwünschten antiinflammatorischen Effekte vorwiegend auf Blockierung der COX-2 beruhen.

Acetylierung der COX-1 durch Aspirin inaktiviert die Aktivität der in Abb. 1 dargestellten Oxidase, jedoch nicht die der Peroxidase. Im Gegensatz dazu modifiziert die Acetylierung der COX-2 durch Aspirin deren Oxidase-Aktivität und produziert 15R-Hydroxyeicosatetranoidsäure (15R-HETE).

Selektive COX-2 Inhibitoren wie Celecoxib (Celebrex®: Pharmacia GmbH, Heumann, SEARLE, Pfizer, Mack, Illert., Parke-Davis) und Rofecoxib (Vioxx®: MSD) wurden entwickelt und zeigten in verschiedenen Studien eine mit nichtselektiven NSAIDs vergleichbare antiinflammatorische, jedoch innerhalb des Gastrointestinaltraktes verträglichere Wirkung [17].

Tabelle 2: Relative Potenz einiger analgetisch/antipyretisch/antiphlogistischer Wirkstoffe hinsichtlich der Hemmung von COX-1 und COX-2 im humanen Vollblutassay [18]

Substanz

COX-1/COX-2 – IC50-Verhältnis

Ibuprofen

0,50

Naproxen

0,56

Indometacin

1,90

Piroxicam

3,10

Nimesulid

17,70

Diclofenac

18,90

Celecoxib

>100

Rofecoxib

>200


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1.6 Kolonkarzinom und COX-2 Expression

1.6.1 Zusammenhang zwischen Kolonkarzinogenese und COX-2

Vermutungen über eine mögliche Beteiligung der COX an der Entstehung kolorektaler Karzinome ergaben sich aus der Beobachtung, daß viele maligne Tumore erhöhte Prostaglandinkonzentrationen aufwiesen. Diese konnten in den ersten Studien besonders in Kolonkarzinomen nachgewiesen werden.

Der Zusammenhang zwischen dem Einfluß der COX und der Kolonkarzinogenese wurde weiterhin auf molekulargenetischer Ebene untersucht. Eine durch chemische Mutagene erzeugte dominante Mutation, Min, wurde auf dem homologen APC-Gen der Maus gefunden und als Ursache für die Polyposis im gastrointestinalen Trakt und andere dortige Läsionen angesehen. Die Anzahl der Polypen in APC-mutierten und heterozygoten COX-2 knockout Mäusen war auf 34% bzw. 14% (homozygot COX-2 knockout) bezogen auf die Kontrollgruppe reduziert. Zusätzlich war die Größe der Polypen signifikant kleiner als in der Kontrollgruppe. Somit konnte der Einfluß der COX-2 auf die Bildung der Polypen auch auf genetischer Ebene gezeigt werden [16].

1.6.2 Positive Wirkungen der NSAIDs in der Therapie intestinaler Tumoren

Durch die in mehreren epidemiologischen Studien aufgedeckte Korrelation zwischen einer verringerten Inzidenz von Kolonkarzinomen und der regelmäßigen Einnahme von NSAIDs über einen längeren Zeitraum ergab sich mit der Aussicht auf ein Tumortherapeutikum aus der Gruppe der NSAIDs ein interessanter Forschungsansatz. In den meisten Studien konnte eine dosis- und/oder dauerabhängige Reduktion des Risikos der Entwicklung eines Kolonkarzinoms gezeigt werden. Ausgehend von diesem folgten gezielte Untersuchungen hinsichtlich einer erhöhten COX-2 Expression in verschiedenen malignen Tumoren.

Die familiäre adenomatöse Polyposis (FAP), als Präkanzerose des kolorektalen Karzinoms, ist charakterisiert durch multiple adenomatöse Polypenbildung im Kolon und Rektum. Der günstige Einfluß von NSAIDs auf Reduktion der Tumoren in Größe und Anzahl wurde auch an FAP Patienten festgestellt. So konnten Phillips et al. [19] in [Seite 15↓]einer randomisierten, doppelblinden, Placebo kontrollierten Studie an 83 Patienten mit FAP eine signifikante (p=0,033) Reduktion der duodenalen Polypen unter der Einnahme vom selektiven COX-2 Inhibitor Celecoxib (400 mg/2mal pro Tag über 6 Monate) im Vergleich zur Placebogruppe aufzeigen.

1.7  Protektive Effekte der NSAIDs in der Prävention des Mammakarzinoms

Epidemiologische Studien bezüglich des Mammakarzinoms zeigten unterschiedliche Ergebnisse hinsichtlich der Einnahme nichtsteroidaler Antiphlogistika und der Inzidenz dieses Karzinoms. Die Ursache hierfür könnte in einer unterschiedlichen Bioverfügbarkeit der einzelnen Medikamente im drüsigen Gewebe der Mamma liegen. Weiterhin könnte eine erhöhte Expression der Cyclooxygenase-2 auf einen bestimmten Subtyp des Mammakarzinoms beschränkt sein [15].

Khuder et al. [20] erstellten eine Metaanalyse aus 6 Kohorten- und 8 Fall-Kontroll-Studien. Das kombinierte geschätze relative Risiko für die Entwicklung eines Mammakarzinoms betrug 0,82 {95% CI = 0,75-0,89}. Es beinhaltete das RR der Kohortenstudien von 0,78 {95% CI = 0,62-0,99} sowie das RR der Fall-Kontroll-Studien von 0,87 {95% CI = 0,84-0,91}. Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, daß die Einnahme von NSAIDs mit einem verringerten Risiko der Entwicklung eines Mammakarzinoms assoziiert ist.

Die folgende Abbildung gibt einen grafischen Überblick der Metaanalyse.


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Abb. 2: Reduktion des Mammakarzinomrisikos unter Einnahme von NSAIDs

Johnson TW et al. [21] zeigten in einer prospektiven Kohorte von postmenopausalen Frauen (n = 27.616) über 6 Jahre Nachbeobachtungszeit bei Einnahme von Aspirin oder anderen NSAIDs ebenso eine Reduktion der Entwicklung eines Mammakarzinoms
(RR = 0,80; 95% CI = 0,67 – 0,95).


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1.8 Zielstellung

Die folgenden Fragen sollten mit dieser immunhistologischen Studie geklärt werden:

  1. Wie ist die Expression der COX-1 und –2 im nicht malignen Mammagewebe?
  2. Wie ist die Expression der COX-1 und –2 im Mammakarzinom?
  3. Besteht eine Korrelation zwischen dem Expressionsmuster und ausgewählten Tumorparametern?
  4. Welche prognostische Relevanz haben beide Isoenzyme?
  5. Welche Expression der Cyclooxygenasen zeigen Mammakarzinomzellen in vitro?


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der Humboldt-Universität zu Berlin
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27.05.2005