2  Material und Methoden

Die immunhistochemische Analyse wurde retrospektiv an Tumormaterial der Routinediagnostik erstellt, für die das Einverständnis der Patientinnen für wissenschaftliche Nutzung des Restgewebes vorlag. Die Gewebeproben der dem Kollektiv zugrundeliegenden Patientinnen mit der Diagnose eines primären Mammakarzinoms zwischen Juni 1991 und Juni 1996 entstammen dem Archiv des Institutes für Pathologie der Charité Berlin. Fälle mit Fernmetastasen zum Diagnosezeitpunkt, bilaterale Karzinome oder ausschließlich nicht-invasive Karzinome wurden ausgeschlossen. Alle Patientinnen mit Wohnsitz in und außerhalb Berlins
(221 Patientinnen, 77% der Gewebeproben) wurden in die Studie einbezogen. Die Überlebensdaten wurden unter Einhaltung der Richtlinien des Datenschutzes am örtlichen Landeseinwohneramt erfragt. Die Summe verschiedener postoperativer Therapieverfahren und Kontrolluntersuchungen ergab die Nachbeobachtungszeit. Klinische Daten hinsichtlich des Auftretens von Rezidiven entstammen den Akten der Tumornachsorge der Charité und waren für 169 der 221 Patientinnen (76%) verfügbar. Das rezidivfreie Überleben wurde definiert als Zeit zwischen der Diagnosestellung und dem Auftreten von lokalen oder fernen Rezidiven, die klinisch oder histologisch diagnostiziert werden konnten. Das Gesamtüberleben wurde definiert als Zeit zwischen der Diagnose und dem Tod.

Das Patientenkollektiv (Tabelle 3) gliedert sich wie folgt auf: Das durchschnittliche Alter der Patientinnen zum Zeitpunkt der Diagnose betrug 60 Jahre (28-88 Jahre). Die Karzinome der vorliegenden Untersuchungsgruppe verteilen sich bezüglich der zugehörigen Histologie wie folgt: 179 (81%) duktale Karzinome, 28 (13%) lobuläre Karzinome, 14 (6%) Fälle anderer Histologie. Somit ist die Zusammensetzung dieses Kollektivs mit der in epidemiologischen Studien erfaßten Aufteilung der histologischen Subtypen (Kapitel 1.1.1) vergleichbar. Von den 221 Patientinnen wurden 164 (74%) von demselben Operateur in der Klinik für Allgemein-, Visceral-, Gefäß- und Thoraxchirurgie der Charité Berlin operiert. Informationen über adjuvante Therapien waren für 119 Patientinnen (53%) verfügbar. Von diesen erhielten 50 Frauen (42%) eine Hormontherapie. Zum Vergleich der Cyclooxygenaseexpression im gesunden Gewebe wurden 7 Fälle mit fibrozystischer Mastopathie untersucht, die nicht mit in die [Seite 19↓]statistische Analyse eingeschlossen wurden.

Tabelle 3: Charakteristik des Patientenkollektivs

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Die Gewebeproben wurden in 4% Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und anschließend in 5 µm dünne Präparate geschnitten. Für die histopathologische Untersuchung wurden die Proben routinemäßig mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Der Differenzierungsgrad der vorliegenden Mammakarzinome wurde nach dem Bloom-Richardson Grading, modifiziert von Elston und Ellis [22], festgelegt. Bezüglich des Nodalstatus sind im Mittel 18 Lymphknoten beurteilt worden (Range 1-55). Bei den als pN0 diagnostizierten Fällen wurden mindestens 6 Lymphknoten untersucht (Median 17, Range 6-37). Bei 8 Fällen waren weniger als 10 Lymphknoten nachweisbar. Für diese Studie wurde der Nodalstatus nach der 6. TNM-Klassifizierung [23] eingeteilt.

Die folgenden Parameter wurden den pathologischen Diagnosen entnommen: Östrogenrezeptorstatus, c-erbB2 Status sowie MIB1-Index.

Die Gefäßinvasion wurde durch alleinige lichtmikroskopische Untersuchungen beurteilt, in fraglichen Fällen mittels CD34-Darstellung der Gefäßendothelien.

Das Paraffin der Schnitte wurde durch dreimaliges Waschen zu je 5 min in Xylol sowie in absteigender Ethanolreihe (2 x 100%, 2 x 96%, 80%, 70% Ethanol für jeweils 5 min) entfernt. Anschließend sind die Proben in Aqua dest. gewässert worden. Daraufhin wurden sie im leicht sauren Milieu des Citratpuffers erhitzt und 5 min im Schnellkochtopf bei Überdruck gekocht, um die Epitope für den Antikörper besser zugänglich zu machen.

Bis zur Applikation dessen verweilten die Gewebsschnitte in TBS-Pufferlösung.
[Seite 30↓]Bei Anfärbung der COX-1 wurde danach zusätzlich ein Proteinblocker verwendet.

Anschließend wurden die Proben über Nacht bei 4°C mit dem primären monoklonalen Antikörper in Verdünnung von 1:1000 (COX-2) bzw. 1:200 (COX-1) in der Antikörper-Verdünnungslösung inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit TBS/Tween erfolgte daraufhin die Inkubation mit dem Zweitantikörper und der alkalischen Phosphatase des Biotin Streptavidin Amplified Detection Systems für je 20 min bei Raumtemperatur. Die Färbung erfolgte mit Hilfe der naphtholhaltigen Färbetabletten unter jeweiligem Vergleich mit einer Positiv- und Negativkontrolle. Zur Kontrastierung der in einem positiven Fall vorliegenden roten Färbung des Zytoplasmas wurden die Zellkerne zuletzt für ca. 15 sec in Hämalaunlösung nach Mayer gegengefärbt und abschließend nochmals gewässert. Am Ende sind die Schnitte mit geringen Mengen Aquatex und entsprechenden Deckgläschen eingedeckt worden.

Die Spezifität des COX-2 Antikörpers wurde durch Verwendung eines COX-2 blocking peptids (Abb. 25) kontrolliert.

2.3.3  Quantifizierung der immunhistochemischen Färbung

Das für die vorliegende Studie verwandte Punktesystem basiert auf der Intensität der Anfärbung multipliziert mit der prozentualen Anzahl positiver Zellen und ergibt einen immunreaktiven Score (IRS) zwischen 0 und 12. Dieses System ist identisch mit dem für die Untersuchung des Hormonrezeptorstatus des Mammakarzinoms [24].

Tabelle 4: Quantifizierung der immunhistochemischen Färbung

Bei Betrachtung der univariaten Überlebensanalysen nach Kaplan-Meier zeigte sich, daß die Graphen der Tumoren mit einem COX-2 IRS von 0-6 sowie mit einem IRS von 7-12 in zwei getrennten Gruppen verliefen. Aus diesem Grund wurde in dieser Einteilung die Trennung zwischen Negativität (IRS 0-6) und Positivität (IRS 7-12) festgelegt, die so für die gesamte Auswertung verwendet wurde. Die Auswertung der COX-1 erfolgte analog, um eine möglichst objektive Vergleichbarkeit zwischen beiden Isoenzymen zu erhalten. Die hier angewandte Quantifizierung der immunhistochemischen Färbung der Cyclooxygenasen wurde in ähnlicher Art bereits in anderen Studien [25] [26] [27] [28] verwendet.

Die Korrelation zwischen der Expression von COX-1 oder COX-2 und verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern wurde definitionsgemäß mit Hilfe des zweiseitigen Fisher Tests oder des chi² Tests beurteilt. Das rezidivfreie Überleben und das Gesamtüberleben wurden in der univariaten Überlebensanalyse mittels der Kaplan-Meier Methode berechnet. Da das mittlere Gesamtüberleben nicht in allen Untergruppen erreicht wurde, ist weiterhin die rezidivfreie Überlebensrate innerhalb von 5 Jahren und die gesamte 5-Jahres-Überlebensrate angegeben worden. Der Vergleich verschiedener Überlebenskurven erfolgte mit dem log rank Test. Die multivariate Analyse wurde anhand des Cox proportional hazard regression Models erstellt, in welchem alle in der univariaten Analyse als signifikant mit dem Überleben korrelierenden Variablen berücksichtigt worden sind. In dieser Analyse wurde das Alter der Patientinnen als ein zusätzlicher Parameter einbezogen.

Als signifikant wurden p-Werte kleiner als 0,05 betrachtet. Für die statistische Analyse wurde die SPSS Software Version 10.0 verwendet.

Die humanen Mammakarzinomzellinien MCF7 und SK-BR-3 wurden in 75 (25) cm²-Zellkulturflaschen in Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium (DMEM) mit 10% FCS und 2% L-Glutamin in wassergesättigter Atmosphäre bei 37°C und einem 5%igen [Seite 32↓]Volumenanteil CO₂ ^kultiviert. Sämtliche Versuche wurden innerhalb von 10 Passagen durchgeführt. Die Zellkulturarbeiten liefen unter einer sterilen Werkbank sowie Verwendung steriler Materialien und Lösungen ab. Die Trypsin-Lösung wurde zusätzlich bei der Zugabe filtriert.

Der Austausch des Kulturmediums fand alle 3-4 Tage statt. Bei ca. 80%iger Konfluenz wurden die Zellen wie folgt passagiert: Zunächst wurde das verbrauchte Medium abgesaugt und die Zellen mit 2 ml Trypsin gespült. Nach erneutem Absaugen wurde
1 ml frisches Trypsin über den gesamten Flaschenboden verteilt. Im Anschluß erfolgte die Inkubation bei 37°C, bis sich unter mikroskopischer Kontrolle alle Zellen vom Untergrund gelöst und vereinzelt hatten. Die Trypsinwirkung wurde durch Zugabe von 9 ml Medium gestoppt. Von der resultierenden Zellsuspension wurden abhängig der Zellinie 0,25 ml bis 5 ml in der Kulturflasche belassen und diese mit Medium auf 10 ml aufgefüllt.

Die aus der Passagierung zur Verfügung stehende Zellsuspension wurde je nach Bedarf mit Medium verdünnt und gleichmäßig in 40 mm große Petrischalen ausgesät. Nach der Ergänzung von Medium auf ein Volumen von jeweils 4 ml folgte die Inkubation im Brutschrank für 2-3 Tage. Nach dem Erreichen von mind. 70%iger Konfluenz wurde das Medium durch 4 ml serumfreies Medium ausgetauscht.

Am folgenden Tag erfolgte die Stimulation mit 10ng/ml IL-1ß bzw. TPA. Hierbei wurde pro Versuchsreihe eine bis auf diese Zugabe gleich behandelte Kontrolle mitgeführt.

Zu Beginn wurden je 2 ml Medium der Petrischalen abgenommen und 5 min bei
5000 U/min zentrifugiert. Von den dabei anfallenden Überständen sind danach je 1 ml für weitere Versuche in Eppendorfgefäße überführt und bei –20°C tiefgefroren worden. Im Anschluß daran sind die Schalen mit je 1 ml PBS gespült worden. Als nächstes wurden die subkonfluenten Zellinien auf Eis mit je 100 μl Proteinlysispuffer lysiert.
[Seite 33↓]Das Lysat wurde durch mehrmaliges Aufziehen in eine Insulinspritze mechanisch degradiert und bei –20°C gelagert.

Die Proteinkonzentrationsbestimmung wurde mit Hilfe des BCA-Kit nach Pierce durchgeführt. In diesem wird Cu²⁺ durch die Proteine reduziert, die reduzierten Cu⁺-Ionen bilden anschließend mit Bicinchoninsäure einen farbigen Komplex. Die als Maß des Reaktionsumfanges entstehende Farbintensität wird in einem ELISA-Reader bei 562 nm gemessen. Das Procedere erfolgte nach Anweisungen des Herstellers, wobei die Proben 1 h inkubiert wurden. Zusätzlich wurde eine Protein-Standardreihe unter gleichen Versuchsbedingungen mitgeführt, mit dessen Hilfe die Proteinkonzentrationen berechnet werden konnten.

Die Proteinproben wurden vor dem Auftragen mit Lysepuffer auf 20 μl aufgefüllt und für 10 min der heißen Lyse bei 95 °C unterzogen.

Daran schloß die Auftrennung der Proben und eines Längenmarkers in einem 10% Polyacrylamidgel mittels SDS-PAGE bei 100 V für 2 Stunden an. Daraufhin wurden die Proteine in einem Semi-Dry-System mit einer Stromstärke von 100 mA für 90 min auf eine Nitrozellulosemembran geblottet. Im folgenden sind unspezifische Bindungsstellen durch die Inkubation der Membran im Blockingpuffer für 30 min bei Raumtemperatur blockiert worden.

Die monoklonalen Primärantikörper banden, jeweils in einer Verdünnung von 1:1000 im Blockingpuffer, über Nacht bei 4 °C an die Proteine. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer erfolgte die Inkubation mit dem sekundären goat-anti-mouse Antikörper, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase, in einer Verdünnung von 1:5000 im Blockingpuffer für 45 min bei Raumtemperatur. Nach erneutem dreifachen Waschen im Waschpuffer und 4minütigem Waschen in Assaypuffer reagierte das hinzugefügte CDP-Star RTU Lumineszenzsystem für 5 min mit den gebundenen Antikörpern und ein Hyperfilm konnte belichtet werden.