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4  Diskussion

In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der Einfluß beider Isoformen der Cyclooxygenase auf die Prognose des Mammakarzinoms untersucht. Es konnten deutliche Unterschiede sowohl in Korrelationen mit klinisch-pathologischen Parametern als auch in Überlebenswahrscheinlichkeiten zwischen der COX-1 und der COX-2 festgestellt werden.

Die vorliegenden Ergebnisse kennzeichnen die COX-2 als einen Prognosefaktor. Die COX-1 erlangt in dieser Studie jedoch keine prognostische Relevanz.

Zusätzlich wurde in dieser Arbeit die Expression der Cyclooxygenase in zwei humanen Mammakarzinomzellinien mit Hilfe des Western Blots untersucht. Sowohl MCF7 als auch SK-BR-3 zeigten in der vorliegenden Arbeit eine basale Expression der COX-2, die durch IL-1β und TPA stimulierbar war. TPA und IL-1β sind bereits für andere Zellinien als Induktoren der Cyclooxygenase beschrieben worden. Der Phorbolester TPA stimuliert die Proteinkinase C durch Imitation der Effekte des Diacylglycerols und erhöht auf diesem Weg das intrazelluläre cAMP. IL-1β induziert die Transkription der Cyclooxygenase u.a. durch Aktivierung von NF-κB [29].

4.1 Korrelationen der COX-2 mit prognostisch ungünstigen Faktoren

Eine erhöhte COX-2 Expression korreliert in der vorliegenden Arbeit signifikant mit duktalen Karzinomen, einer Tumorgröße >20 mm, einem positiven Lymphknotenstatus, einer fortgeschrittenen histologischen Entdifferenzierung, einer positiven Gefäßinvasion sowie einem negativen Östrogenrezeptorstatus, welche größtenteils mit einer schlechteren Prognose für die Patienten assoziiert sind.

Die Expression der COX-2 im Mammakarzinom wurde neben den eigenen Untersuchungen [30] auch in verschiedenen Studien anderer Autoren untersucht.
Tabelle 10 faßt diese zusammen.

[Seite 61↓]Tabelle 10: Häufigkeit der COX-2 Expression im primären Mammakarzinom

Autor

Material

COX-2 Expression (%)

Korrelationen der COX-2 mit klinisch-pathologischen Parametern

Soslow et al. [31], 2000

16 invasiv-duktale Karzinome,

1 invasiv-lobuläres Karzinom,

3 DCIS

insgesamt: 56% positiv

nicht untersucht

Costa et al. [32], 2002

46 invasiv-duktale Karzinome

17,4% positiv

Gefäßinvasion, Lymphknotenmetastasierung, Apoptose-Index, Sialyl-Tn

Half et al. [25], 2002

42 invasive Karzinome,

zusätzlich 16 DCIS

43% mittel/hoch

62,5% mittel/hoch

keine Korrelationen feststellbar

Ristimäki et al. [26], 2002

1576 invasive Karzinome

37,4% mittel/hoch

Lymphknotenmetastasierung, Differenzierungsgrad, Tumorgröße, histologischer Tumortyp, Ki-67, p53,

Her-2/neu; Östrogenrezeptorstatus (invers)

Spizzo et al. [33], 2003

148 invasiv-duktale Karzinome,

45 invasiv-lobuläre Karzinome,

19 andere Karzinome

insgesamt 48,6% positiv

histologischer Tumortyp, Menopausaler Status,

Ep-CAM

Davies et al. [34], 2003

80 invasive Karzinome

insgesamt 79% positiv,

54% stark positiv

CD 31

Lim [35], 2003

128 invasiv-duktale Karzinome

41% positiv

Differenzierungsgrad, Lymphknotenmetastasierung, Tumorgröße, VEGF,

Cyclin D1

Wülfing et al. [36], 2003

192 invasive Karzinome

40,6% moderat bis stark positiv

Tumorgröße, Her-2/neu, Gefäßinvasion, MIB-1, Differenzierungsgrad; Östrogen- und Progesteronrezeptorstatus (inverse Korrelation)


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Anhand dieser Studien wird deutlich, daß die Häufigkeit der COX-2 Expression in den einzelnen Arbeiten teilweise unterschiedlich beurteilt wird. Eine Ursache für die abweichenden Ergebnisse experimenteller Untersuchungen auf erhöhte Expression dieses Enzyms könnte in den unterschiedlichen Sensitivitäten der verwendeten Methoden (Western Blot, RT-PCR, Immunhistochemie) liegen.

Zusammenfassend ist jedoch erkennbar, daß die meisten der o.g. Arbeiten bei denen Immunhistochemie verwendet wurde, eine COX-2 Expression in ca. 40% der untersuchten Proben feststellen konnten.

Bezüglich der in Tabelle 10 aufgeführten Studien wird an dieser Stelle hinsichtlich Gemeinsamkeiten und Unterschiede zur vorliegenden Arbeit detaillierter auf die Studie von Ristimäki et al. eingegangen. Die Daten dieser großen Multicenter Studie entstammen dem nationalen finnischen Krebsregister. Für die Analyse der COX-2 Expression wurden Gewebemicroarrays verwendet. Somit unterscheidet sich der Ansatz dieser Studie deutlich von dem der vorliegenden immunhistochemischen Arbeit, in welche alle 221 Fälle dem Mammazentrum der Charité entstammen. Der größte Teil der Patientinnen wurde in diesem vom selben Chirurgen operiert.

Trotz allem gibt es zwischen den Ergebnissen beider Studien Ähnlichkeiten. Beide stellten eine moderate bis starke COX-2 Expression in einem Drittel der invasiven Mammakarzinome fest. Weiterhin konnten beide Arbeiten signifikante Zusammenhänge zwischen der COX-2 Expression und dem Lymphknotenstatus, der Tumorgröße, dem invasiv-duktalen Karzinom, dem histologischen Differenzierungsgrad und dem negativen Östrogenrezeptorstatus darlegen. Zusätzlich zu unserer Arbeit wurden weitere signifikante Korrelationen mit einer hohen Ki-67 Expression, einer hohen p53-Expression sowie einer HER-2 Amplifikation festgestellt. Gemeinsamkeiten und Unterschiede bezüglich der prognostischen Relevanz werden ausführlicher im folgenden Kapitel erläutert.

Im Gegensatz zur Expression der COX-2 konnte in unserer Studie eine signifikant erhöhte COX-1 Expression in kleineren (≤20 mm) und nicht metastasierten (pN0) Tumoren festgestellt werden.


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4.2 COX-2 als prognoserelevanter Überlebensparameter

Zusätzlich zu möglichen Korrelationen mit klinisch-pathologischen Parametern untersuchten wir die prognostische Relevanz einer COX-2 Expression für das rezidivfreie Überleben und das Gesamtüberleben mit Hilfe der univariaten Überlebensanalyse. In dieser zeigten wir, daß die COX-2 in beiden Erfassungszeiträumen einen prognostischen Einfluß besitzt, der im rezidivfreien Überleben noch deutlicher hervortritt.

Auch andere Studien haben den Einfluß der COX-2 Expression auf das Überleben untersucht. Hierbei wurden in den verschiedenen Arbeiten unterschiedliche Endpunkte für die Überlebensanalyse verwendet. So wurde z.B. das rezidivfreie Überleben bei Ristimäki et al. als Zeit zwischen der Diagnosestellung und dem Auftreten von Fernrezidiven außerhalb des betroffenen Primärkarzinomgebietes oder dem Tod am Mammakarzinom definiert. Costa et al. dagegen grenzten das rezidivfreie Überleben als Zeit zwischen der Diagnosestellung und dem Tod ab. Trotz dieser Unterschiede fand sich inklusive unserer Untersuchungen in 4 von 6 Studien ein prognostischer Effekt der COX-2 (Tabelle 11).

Tabelle 11: COX-2 Expression als prognoserelevanter Überlebensparameter im Mammakarzinom

Autor

rezidivfreies Überleben
(log rank test)

Gesamtüberleben
(log rank test)

Ristimäki et al., 2002

p<0,0001

nicht untersucht

Costa et al., 2002

p=0,033

nicht untersucht

Spizzo et al., 2003

p=0,02

p=0,04

Wülfing et al., 2003

nicht signifikant

nicht signifikant

Lim, 2003

nicht signifikant

nicht signifikant


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In der multivariaten Überlebensanalyse fanden wir heraus, daß die COX-2 Expression innerhalb des rezidivfreien Überlebens mit einem relativen Risiko von 1,9 und einem 95% Konfidenzintervall von 1,00 bis 3,59 (p=0,049) korreliert. Trotz des für diese Schätzungen geringen Stichprobenumfanges deuten diese Ergebnisse an, daß die
COX-2 Expression innerhalb unseres Kollektivs ein unabhängiger Prognoseparameter für einen ungünstigen Krankheitsverlauf beim primären Mammakarzinom ist.

Ristimäki et al. konnten in ihrer Analyse dagegen nur die Unabhängigkeit der Anzahl positiver Lymphknoten, der Tumorgröße, eines negativen Progesteronrezeptorstatus, einer mäßigen bis fehlenden histologischen Differenzierung und einer HER-2 Amplifikation nachweisen.

Auch Spizzo et al. zeigten die Unabhängigkeit der Anzahl positiver Lymphknoten, die Tumorgröße, die Überexpression von Ep-CAM in beiden untersuchten Überlebenszeiträumen sowie zusätzlich für das Gesamtüberleben die histologische Differenzierung. Die COX-2 Expression erwies sich auch hier nicht als unabhängiger Faktor.

Eine mögliche Erklärung für die Ergebnisse der vorliegenden Studie liefert die Homogenität unseres Kollektivs, die durch denselben Operateur für die Mehrzahl der Fälle entstanden ist. Weitere Studien sind notwendig, um zu klären, ob die COX-2 auch in diesen ein unabhängiger Prognosemarker ist.

Eine prognostische Relevanz der COX-2 konnte auch für andere Tumoren festgestellt werden, so z. B. Ovarialkarzinom (Denkert et al. [37], 2002; p=0,04), Kolonkarzinom (Masunaga et al. [38], 2000; p=0,037) und Gliom (Shono et al. [39]; p<0,0001).

4.3 Unterstützende Ergebnisse aus Tier- und Zellkulturmodellen

Jacoby RF et al. [40] stellten im APC-mutierten Min Mouse Model die Effekte des NSAIDs Piroxicam denen des selektiven COX-2 Inhibitors Celecoxibs gegenüber. Celecoxib verursachte eine deutliche (p<0,01) Reduktion in Inzidenz und Größe der Tumoren in einer dosisabhängen Weise. Weiterhin traten die bei NSAIDs bekannten Nebenwirkungen wie Ulzerationen oder Blutungen im Gatrointestinaltrakt unter diesem Medikament im Gegensatz zur Einnahme von Piroxicam nicht auf.


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Harris et al. [41] untersuchten den Einfluß von Celecoxib auf Mammakarzinome in insgesamt 120 Ratten. Diese wurden gleichmäßig auf 3 Gruppen verteilt und mit einem Standard-Tierfutter ohne Zusätze (Kontrollgruppe), mit 1500 mg/kg Celecoxib bzw. 1500 mg/kg Ibuprofen als Zusatz gefüttert. Nach 7 Tagen wurde jedem Tier eine intragastrische Dose von 15 mg DMBA verabreicht und die jeweilige Fütterung für weitere 105 Tage fortgesetzt. Die Ratten der Celecoxib-Gruppe zeigten eine deutliche Reduktion in Inzidenz, Vielfalt und Volumen der entwickelten Mammakarzinome im Bezug zur Kontrollgruppe (68%, 86%, 81%; p<0,001). Auch Ibuprofen erzielte signifikante Effekte in den oben genannten Kategorien, die jedoch deutlich geringer verglichen mit der Celecoxib-Gruppe ausfielen (40%, 52%, 57%; p<0,001). Somit zeigte der selektive COX-2 Inhibitor in dieser Studie das größte chemopräventive Potential gegen das Mammakarzinom.

Eine deutliche Inhibierung der Anzahl vorhandener Tumore in verschiedenen Tiermodellen durch NSAIDs konnte u.a. in folgenden Studien festgestellt werden:

Tabelle 12: Wirkung von NSAIDs in intestinalen Tumoren
(nach Howe LR et al., 2000)

Autor

Tier

Tumortyp

Pharmakon

Inhibierung

Kawamori et al., 1998

Ratte

Kolonkarzinom

Celecoxib

97%

Fukutake et al., 1998

Maus

Kolonkarzinom

Nimesulide

81%

Nakatsugi et al., 1997

Maus

Adenom

Nimesulide

48%


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Zur Untersuchung der COX-2 Expression in Zellkulturen wurde in der vorliegenden Arbeit insbesondere auf MCF7 und SK-BR-3 eingegangen.

Liu et al. [42] fanden bei Untersuchung der östrogenabhängigen und nicht metastasierenden Zellinie MCF7 ähnliche Ergebnisse wie die der vorliegenden Arbeit: eine kaum erkennbare basale, jedoch stimulierbar durch TPA eine vorübergehend erhöhte Expression der COX-2. Sie konnten jedoch zusätzlich eine verhältnismäßig hohe basale Expression der COX-1 in dieser Zellinie nachweisen.

Dagegen zeigten Half et al. in ihrer Studie, daß MCF7 keine basale Expression der COX-2 aufwies. Ebenso wenig exprimierte auch SK-BR-3 als wenig invasive und östrogenabhängige Zellinie die COX-2. Weiterhin untersuchten sie den möglichen Einfluß von HER-2 auf die COX-2 Expression. Dafür transfizierten sie MCF7 Zellen mit HER-2 und stellten im Fall der Transfektanten eine positive COX-2 Expression fest. Die These einer möglichen COX-2 Induktion durch HER-2 wird auch in weiteren Arbeiten belegt.

4.4 Mögliche Erklärungen für eine präferente Expression der COX-2

Wie in Kapitel 1.1 bereits ausführlicher beschrieben wurde, gibt es enge Zusammenhänge zwischen der Tumorgenese und inflammatorischen Prozessen. Die Expression der COX-2 ist in diesem Zusammenhang u.a. induzierbar durch inflammatorische Zytokine, wie Interleukin1-ß oder Tumor Nekrose Faktor. Die COX-1 wird dagegen konstitutiv exprimiert.

PGE2, ein Prostaglandin mit proinflammatorischen Eigenschaften (Vasodilatation, Hyperalgesie), wird hauptsächlich durch die COX-2 gebildet. Die COX-1, als „housekeeping gene“, erzeugt hingegen v.a. Prostaglandine mit entsprechenden physiologischen Funktionen (plättchenabhängige Homöostase, Regulation der Nierendurchblutung, Integrität der Mukosa des Magens) [43]. Eine erhöhter Gehalt an Prostaglandinen konnte in vielen malignen Tumoren festgestellt werden. Diese tragen über verschiedene Mechanismen zur Tumorgenese bei. So stimulieren PGE1 und PGE2 in Gegenwart von EGF die Proliferation von epithelialen Zellen der Mamma [15]. Huang et al. zeigten in ihrer Arbeit die immunsupprimierenden Eigenschaften des PGE2 am Beispiel des nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinoms auf [44]. Auf diese Weise [Seite 67↓]könnte sich der Tumor der Überwachung durch das Immunsystems entziehen.

Auch strukturelle Unterschiede zwischen den beiden Isoenzymen können die Ursache für eine vermehrte Expression der COX-2 in malignen Tumoren sein. So verfügt die COX-2 aufgrund eines veränderten Aminosäurerestes um ein größeres aktives Zentrum und ist somit für alternative Substrate empfänglich [12]. Bezüglich der Transkriptionsebene lassen sich ebenso Unterschiede feststellen. Der COX-2 Promoter beinhaltet mehrere Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, so z.B. das cAMP response element (CRE), NF-IL6 oder NF-κB. Über diese kann eine vermehrte Transkription der COX-2 induziert werden, die anschließend über die aufgeführten Prozesse fördernd auf die Tumorgenese wirken können.

4.5 Mechanismen der COX-2 in der Tumorgenese

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß eine erhöhte COX-2 Expression signifikant mit prognostisch ungünstigen Faktoren wie einer Metastasierung in Lymphknoten, einer Tumorgröße >20 mm oder einer positiven Gefäßinvasion korreliert. Dies spricht für ein erhöhtes tumorförderndes Potential der COX-2.

Die Invasionsfähigkeit maligner Tumoren ist wichtig für ihre Ausbreitung in entfernte Organe. Dabei ist die Proteolyse der Basalmembran, insbesondere des Kollagen Typ IV, einer der ersten wichtigsten Schritte. Viele Studien versuchten, einen möglichen Zusammenhang zwischen der COX-2 und dem invasiven Potential zu klären.
So zeigten COX-2 stark positive intestinale Zellen der Ratte beispielsweise eine erhöhte Adhäsion zur extrazellulären Matrix, waren resistenter gegenüber induzierter Apoptose und verweilten länger in der G1-Phase des Zellzyklus [45] [46]. Tsujii et al. [47] konnten in ihrer Arbeit mit der COX-2 transfizierten Kolonkarzinomzellinie Caco-2 diese Zusammenhänge ebenso besonders deutlich darstellen. So wies diese Zellinie folglich eine höhere Produktion von Prostaglandinen, eine vergrößerte Aktivität der MMP-2 sowie eine durch Sulindac inhibierbare erhöhte Invasivität im Invasionsassay auf. Ähnliche Ergebnisse bezüglich der Induktion von Membrantyp-1 Metalloproteinase durch Cyclooxygenasen konnten durch Takahashi et al. [48] auch in der Mammakarzinomzellinie Hs578T gemacht werden.

Die Angiogenese, definiert als Entwicklung neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden, [Seite 68↓]wird als wichtiger Schritt bezogen auf Tumorwachstum, Invasion und Metastasierung angesehen. Davies et al. konnten in der in Tabelle 10 beschriebenen Untersuchung eine signifikante Korrelation zwischen der COX-2 Expression und CD 31, einem endothelialen Zellmarker der Angiogenese, darstellen. Dies bekräftigten weitere Arbeiten, so z.B. die Korrelation der Expression von COX-2 und VEGF (vascular endothelial growth factor) [49] [50]. Die COX-2 scheint direkt zu der Produktion von proangiogenetischen Faktoren wie VEGF, bFGF (basic fibroblast growth factor), transforming growth factor-1 u.a. beizutragen. Eine Gabe von NS-398, einem selektiven COX-2 Inhibitor, zu COX-2 positiven Zellinien des Kolorektalen Karzinoms führte zu einer verringerten Sekretion dieser Faktoren und somit zu verringerten endothelialen tubulären Formationen in vitro [51]. Williams et al. [52] zeigten in COX-2 knockout Fibroblasten von Mäusen eine 94% Reduktion an der VEGF-Produktion im Vergleich zu den Wildtypfibroblasten. Selektive COX-2 Inihibitoren reduzierten auch in verschiedenen anderen in vivo Modellen (z.B. Kornea von Mäusen [53]) die Angiogenese. Ergänzend zur COX-2 scheint ebenso die COX-1 zur Angiogenese beizutragen. Jones et al. [54] machten in ihrer Studie ferner auf die Gemeinsamkeiten von selektiven und nicht selektiven NSAIDs bezüglich der Inhibierung derAngiogenese aufmerksam. Dies wird über verschiedene Mechanismen (z.B. Inhibierung von MAP-Kinase-Aktivität, Prostaglandin-abhängige und –unabhängige Mechanismen) erreicht.

Desweiteren stellte sich der Zusammenhang zwischen COX-2 Expression und verringerter Apoptose als interessanter Forschungsansatz zur Klärung des tumorfördernden Potentials der COX-2 dar. Eine verminderte Apoptose begünstigt das Überleben von mutierten Zellen, welches einen anderen wichtigen Aspekt der Tumorgenese darstellt. Sheng et al. [55] legten in ihrer Studie die Apoptoseinhibierung durch PGE2 dar. Diese war begleitet durch eine Induktion von Bcl-2. In mehreren Arbeiten wurde die Fähigkeit von bestimmten NSAIDs zur Induktion der Apoptose gezeigt. Diese Beobachtungen konnten jedoch teilweise auch auf Zellen übertragen werden, die keine Expression der COX-2 aufwiesen. Dies führte zu der Annahme, daß NSAIDs die Apoptose über COX-abhängige und –unabhängige Mechanismen stimulieren können [56].

Obwohl die aufgeführten Studien mehrere Erklärungsansätze zur Rolle der COX-2 in der Tumorentwicklung bieten, sind weitere Studien nötig, um diese zu untersuchen.


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4.6 Therapeutischer Ausblick

Nach den vielfältigen Ergebnissen epidemiologischer Studien (Kapitel 1.1) und den tierexperimentellen Studien haben nun gezielte klinische Studien mit selektiven COX-2 Inhibitoren an Tumorpatienten begonnen. Nach Informationen von Pharmacia oncology, einem Anbieter von Celebrex®, werden derzeit die in Tabelle 13 aufgeführten klinischen Studien mit Celecoxib als Therapeutikum im Mammakarzinom durchgeführt (Stand: Oktober 2002).

Tabelle 13: Klinische Studien mit Celebrex®

Name der Studie;
Anzahl der Probanden

Charakterisierung des Patientenkollektivs

Zusätzliche medikamentöse Therapie

Weitere Charakterisierung der Studie

Ginecor-Gercor trial; n=346

menopausale Frauen mit metastasiertem Mammakarzinom

Exemestane

  • randomisiert
  • Multicenter
  • doppelblind
  • Phase III

Royal infirmary phase III trial; n=210

Frauen mit metastasiertem Mammakarzinom

keine

  • randomisiert
  • Placebo-kontrolliert

FNCLCC phase II trial; n=210

Frauen mit metastasiertem Mammakarzinom und kompletter oder partieller Regression oder unverändertem Tumor nach first-line Chemotherapie

keine

  • randomisiert
  • Placebo-kontrolliert

CRLCC Gauducheau Nantes-Atlantic phase II trial; n=124

Postmenopausale Frauen mit operablem Mammakarzinom

Exemestane (neoadjuvant)

  • randomisiert
  • Multicenter

Spanish phase II neoadjuvant trial; n=30

Frauen >65 Jahre mit Tumoren >3 cm

Exemestane (neoadjuvant)

 

Desweiteren veranlaßte dasselbe Pharmaunternehmen diverse präklinische Studien (z.B. UK multicenter trial in DCIS) mit Celebrex®.


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Im Vergleich der Therapieeffizienz selektiver COX-2 Inhibitoren beim Mammakarzinom mit anderen malignen Tumoren muß die möglicherweise unterschiedliche Anzahl der COX-2 Expression in diesen berücksichtigt werden. So exprimieren Kolonkarzinome in einem höheren Anteil die COX-2 und könnten folglich in einem größeren Prozentsatz auf selektive COX-2 Inhibitoren ansprechen.

Selektive COX-2 Inhibitoren könnten in Zukunft eine Indikation in vielfältiger Weise erlangen. Als adjuvante Therapeutika könnten sie z.B. aufgrund ihrer Prostaglandin-vermittelten Stimulierung der Aromataseaktivität mit Aromataseinhibitoren kombiniert werden. Weiterhin bieten sich selektive COX-2 Inhibitoren zur Prophylaxe bei Hochrisikopatientinnen an.

Durch weitere Studien sollte der Einfluß von Prostaglandin-abhängigen und
–unabhängigen Mechanismen der NSAIDs untersucht werden, um auch die Rolle dieser Medikamente in der Therapie des Mammakarzinoms genauer zu klären.


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27.05.2005